KR0137420B1

KR0137420B1 - 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신진단장치

Info

Publication number: KR0137420B1
Application number: KR1019940025307A
Authority: KR
Inventors: 이종욱; 고인영; 전재현; 차정학; 장진동
Original assignee: 김태훈; 주식회사 유한양행
Priority date: 1994-10-04
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 1998-05-15
Also published as: KR960014935A

Abstract

본 발명은 고상 면역 크로마토그래피를 이용한 진단 장치(kit)를 제공한다.

본 발명에 따른 진단 장치는 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(anti-HCG-MAb-1)가 고정된 밴드인 결과판독선(5)와 항-쥐 IgG 복합클론 항체가 고정된 밴드인 반응종료선(6)이 구비된 박충 고상(4), 상기 anti-HCG-MAb-1과는 다른 부위에서 항원과 결합하는 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(anti-HCG-MAb-2)가 결합된 유색 라텍스 입자를 함유하는 라텍스 점적막(2), 상기 라텍스 점적막(2)로부터 상기 박충 고상(4)에 전개시켜 상기 결과판독선(5) 및 반응종료선(6)에서의 발색여부를 각각 관찰할 수 있는 결과판독창(7) 및 반응종료창(8), 흡수지(3),(9) 및 흡수막대(1)를 구비한 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치(kit)에 있어서, 상기 박충 고상(4)이 유색 라텍스 입자크기의 15~25배의 공극 크기를 갖는 나이트로셀룰로오스막이고, 차단제로서 카제인 0.1~1%, 소혈청알부민 0.05~5%및 보레이트 완충용액(pH 7.0~9.0) 0.05~0.5M의 혼합용액을 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 장치는 특히 항체로서 융모성선 자극 호르몬에 대한 단일클론 항체를 사용하므로써 임신 진단에 사용할 수 있으며, 종래의 장치에 비해 신속하고 정확하게 임신 여부를 판정할 수 있게 한다.

Description

고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신진단장치

제 1(A)도는 본 발명에 의한 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치의 외부 모형도이고, 제 1(B)도는 동일 장치의 수직 단면도이다.

제 2도는 샌드위치법에 의한 유색 라텍스의 반응성에 미치는 NaCl의 효과를 보여주는 그래프이다.

제 3도는 본 발명의 실시예 6의 임신 진단장치를 이용하여 임신 여부를 판정한 결과를 보여주는 사진이다.

* 도면의 주요 부호에 대한 설명 *

1 : 흡수 막대 2 : 라텍스 점적막

3 : 흡수지 4 : 박충 고상

5 : 결과 판독선 6 : 반응 종료선

7 : 결과 판독창 8 : 반응 종료창

9 : 흡수지

본 발명은 고상 면역 크로마토그래피법을 이용한 임신 진단장치에 관한 것이다.

임산부 뇨에 존재하는 융모성선 자극호로몬(Human Chorionic Gonadotropin : HCG)은 임신중 영양막 세포에 의해 생성되는 당단백 호르몬으로 92개의 아미노산을 갖는 α-서브유니트와 145개의 아미노산으로 구선된 β-서브유니트가 비공유결합으로 결합되어 생리적 활성을 나타내며 여성의 임신여부의 진단에 사용될 수 있는 호르몬으로 알려져있다.

과거에는 임신여부를 진단하기 위한 목적으로 융모성선 자극호르몬 존재를 확인하기 위해 래트에 시료를 피하주사한 후 난소무게의 증감여부를 판단하였으나, 근래에는 면역학적 측정방법이 사용되고 있다.

면역학적 방법을 이용한 초기 HCG 측정방법은 라텍스 응집억제 반응으로, 이 방법에서는 항원인 HCG를 결합시킨 일정한 크기의 라텍스 입자를 항원인 HCG를 토끼에 주사하여 얻은 다클론항체와 반응시켜 응집반응의 유무를 확인한다. 이때 시료중 HCG가 다클론항체와 먼저 반응하면 응집원인 HCG 결합 라텍스가 비응집 상태로 되어 HCG의 존재 여부를 판단할 수 있게 된다.

그러나 위와 같은 라텍스 응집억제 반응에 사용된 다클론 항체는 HCG에 반응할 뿐만 아니라 황체화호르몬(LH), 난포자극호르몬(FSH) 및 갑상선자극호르몬(TSH)와의 교차 반응가능성이 매우 높아 잘못된 양성반응이 나올 수 있으며, HCG가 일정농도 이상 (1IU/ml - 3IU/ml)이 되어야만 감지할 수 있다는 문제점이 있었다.

최근들어 하이브리도마 기술의 발전으로 황체화 호르몬(LH), 난포자극 호르몬(FSH) 및 갑상선자극 호르몬(TSH)과의 특이성일 높은 HCG의 β-서브유니트에 대한 단일클론 항체를 얻을 수 있게 되었고, 이러한 단일클론 항체를 이용하여 HCG를 감지함으로서 교차반응성의 문제점을 해결하게 되었다. 또한 단일클론 항체를 생성하는 세포 선별과정중 항원결합성이 높은 단일클론 항체를 선책 사용하여 낮은 농도의 HCG를 감지할 수 있게 되었다.

단일클론 항체를 이용한 면역학적 정성 및 정량분석방법은 항체에 결합된 표지 물질이 어떠한 것인가에 따라 방사선 면역측정법(Radio Immuno Assay; RIA), 효소 면역측정법(Enzyme Immuno Assay; EIA)으로 분류될 수 있으며, 이들 방법은 항원(HCG)에 대한 결합부위가 다른 두가지 이상의 단일클론 항체를 이용한 샌드위치 방법에 의한 측정방법이다. 즉, 첫번째 단일클론 항체를 고체에 결합시킨뒤 HCG가 포함된 시료를 넣어 일정시간 반응시키고, 이어 적당한 완충액으로 항체-HCG결합체를 제외한 나머지 시료를 세척한 후 방사선 물질 또는 효소로 표지된 두번째 단일클론 항체를 넣어 일정시간 동안 반응시키고, 동일한 방법으로 세척하고 표지물의 활성을 측정함으로서 HCG를 정량적으로 분석할 수 있다.

그러나 상기한 측정방법은 최종 결과를 관찰하기까지 오랜시간(8~16시간)이 소요되며 그 측정단계가 복잡함과 동시에, 표지 물질로서 방사선동위원소로 사용하였을 때에는 사용자의 세심한 주의를 요하는 등 여러 단점을 가지고 있다. 또한 RIA나 EIA 방법은 일정한 시설이 갖추어져 있는 실험실에서만 실시가 가능하여, 일반인이 실험실이 아닌 장소에서 간편하게 알아내는 것을 불가능하였다.

한편 최근에 항체에 방사선물질이나 효소를 표지하지 않고 유색의 폴리스티렌 입자를 결합시켜 HCG를 감지하는 고상 면역 크로마토그라피법이 등장하게 되었는데, 이것은 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(이하 anti-HCG-MAb-1이라 한다)를 박충 고상에 공유 또는 비공유 결합으로 고정시키고 상기 anti-HCG-MAb-1이 결합하는 부위와는 다른 부위에서 항원과 결합하는 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(이하 anti-HCG-MAb-2라 한다)를 박충 고상을 따라 이동할 수 있는 유색의 미세한 폴리스티렌 입자에 결합시킨 다음, 항원(HCG)이 포함된 시료를 혼합하여 박충 고상에 전개시키면 박충 고상에 고정된 anti-HCG-MAb-1과 HCG를 매개로 유색의 폴리스티렌 입자가 고정되어 색이 출현하게 하고, 이 색의 출현여부로 HCG의 존재여부를 판단하는 방법이다. 이 방법은 두가지 이상의 단일클론 항체를 이용한 방법으로 특이성이 높고 낮은 농도의 HCG도 감지할 수 있어 조기 임신진단에 매우 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 장점을 갖는 고상 면역 크로마토그라피법을 이용한 임신 진단장치를 제공하고자 하는 목적으로 최적의 조건을 연구하였고 그 결과로서 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(anti-HCG-MAb-1)가 고정된 밴드인 결과판독선(5)와 항-쥐 IgG 복합클론 항체가 고정된 밴드인 반응종료선(6)이 구비된 박충 고상(4), 상기 anti-HCG-MAb-1과는 다른 부위에서 항원과 결합하는 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체('anti-HCG-MAb-2)가 결합된 유색 라텍스 입자를 함유하는 라텍스 점적막(2), 상기 라텍스 점적막(2)로부터 상기 박충 고상(4)에 전개시켜 상기 결과판독선(5) 및 반응종료선(6)에서의 발색여부를 각각 관찰할 수 있는 결과판독창(7) 및 반응종료창(8), 흡수지(3),(9) 및 흡수막대(1)를 구비한 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치(kit)에 있어서, 상기 박충 고상(4)이 유색 라텍스 입자크기의 15~25배의 공극 크기를 갖는 나이트로셀롤로오스막이고, 차단제로서 카제인 0.1~1%, 소혈청알부민 0.05~5% 및 보레이트 완충용액(pH 7.0~9.0) 0.05~0.5M의 혼합용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단징치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 라텍스 점적막(2)이 anti-HCG-MAb-2가 결합된 유색 라텍스를 1~4%의 소혈청 알부민을 함유하는 0.05~0.5M 보레이트 완충용액(pH7.0~9.0)에 현탁시켜 제조한 현탁용액을 폴리에틸렌 시이트에 가하여 제조한 것임을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 라텍스 점적막(2)의 폴리에틸렌 시이트가 20~40㎛의 공극크기를 가지며, 차단제로서 2~4%의 소혈청알부민을 함유하는 친수성의 것임을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

고상 면역 크로마토그래피를 이용한 임신 진단장치(kit)는 제 1(A) 및 1(B)도에 나타낸 바와 같이, 감작되어 건조된 유색 라텍스 입자가 뇨에 의해 쉽게 녹아 고정상으로 전달될 수 있도록 설계된 라텍스 점적막(2), 건조후에도 소수성 라텍스 입자의 이동이 용이하도록 포면처리된 박충 고상(4), 흡수지(3), (9), 항-HCG-MAb-1이 고정되어 있는 결과판독선(5), 항-쥐 IgG 복합클론항체가 고정되어 있는 반응종료선(6), 결과판독창(7), 반응종료창(8) 및 흡수막대(1)를 구비하고 있다.

박충 고상(2)에는 뇨속의 HCG와 반은 결과에 따라 샌드위치법에 의해 이동이 멈춰지도록 anti-HCG-MAb-1, 항-쥐 IgG 복합클론 항체가 고정되어 있으며, 이들 항체가 고정되어 있는 밴드를 각각 결과판독선(5) 및 반응종료선(6)이라 한다. 이때 후술하는 바와 같이 항체 용액에 NaCl을 첨가하는 고정화 조건이 중요하다. 박층 고상에 고정되는 anti-HCG-MAb-1은 라텍스에 결합되는 anti-HCG-MAb-2와는 다른 에피토우프를 가져야 한다. anti-HCG-MAb-1은 HCG의 α-서브유니트 또는 β-서브유니트에 대한 단일클론 항체이고, anti-HCG-MAb-2는 HCG의 β-서브유니트에 대한 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 anti-HCG-MAb-1으로서 α-서브유니트에 대한 단일클론 항체를, 그리고 anti-HCG-MAb-2로서 β-서브유니트에 대한 단일클론 항체를 사용하였지만, anti-HCG-MAb-1으로서 서브유니트에 대한 단일클론 항체를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

박충 고상(4)에 사용되는 재료로는 나이트로셀룰로오스막, 나일론막, 유리섬유 등이 사용될 수 있지만, 일반적으로 막이 건조된 경우 흡수성이 매우 높고 유색 라텍스의 이동성이 없어지는 점을 고려할 때 흡수성이 떨어지고 점적된 유색 라텍스에 대한 흡착성이 적은 나이트로셀룰로오스막이 바람직하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 나이트로셀룰로오스막은 바람직하게는 유색 라텍스 입자크기의 15~25배의 공극 크기를 갖는 것이다. 그리고 임신 여부의 판정시에 각 장치의 구성요소들의 조립을 용이하게 하고 뇨에 의해 박충 고상이 젖을 경우에도 유색 라텍스의 색깔대비를 높여 결과가 뚜렷하게 나타날 수 있도록 흰색의 소수성 폴리비닐클로라이드 접착시이트에 접착시켜 사용할 수 있다.

니이트로셀룰오소스막은 PBS완충액으로 적신 후 건조시켜 사용하며, 0.5~2M NaCl이 첨가된 항-HCG-MAb-1(1㎍/㎕)를 2~5㎕/cm의 양으로 점적하고, 50~100 militorr, 상온에서 1~2hr 동안 진공건조하여 항체를 고정화시켜 사용한다. 단일클론 항체용액에 NaCl을 첨가함에 있어 Nacl의 농도가 증가될수록 동일한 HCG 농도에서도 감작된 유색 라텍스와 강한 반응성을 보이는데, 이는 염 농도의 증가가 단일클론 항체와 막이 표면전하를 중화시켜 줌으로써 둘 사이의 소수성 친화력(hudrophobic attraction)을 중대시켜 단일클론 항체의 고정화 효율을 향상시킨 결과로 생각된다.

박충 고상(4)으로 사용하기 위하여 상기와 같이 anti-HCG-MAb-1을 고정화시킨 막은 건조 후에도 적절한 친수성을 유지하여 라텍스의 이동이 방해받지 않도록 하기 위하여 차단제로 표면처리하여야 한다. 이러한 목적을 위하여 본 발명에서 바람직하게 사용되는 차단제는 0.1~1%의 카제인, 0.05~0.5%의 소혈청알부민 및 0.05~0.5M의 보레이트 완충액(pH 7.0~9.0)의 혼합물이다.

상기 나이트로셀룰로오스 박충 고상(4)에 고정되어 결과판독선(5)의 역할을 하게 될 항-HCG-MAb-1은 공지의 방법으로 제조할 수 있으며, 이는 후술하는 라텍스 입자에 결합되는 항-HCG-MAb-2와는 다른 에피토프를 가질 것이 요구된다.

피검 시료중의 호르몬과 반응을 일으키게 할 목적으로 라텍스 점적막(2)에 점적하게 될 anti-HCG-MAb-2가 결합된 라텍스는 통상의 방법으로 제조할 수 있지만, 본 발명에서 바람직하게 사용되는 것은 단일클론 항체와 소혈청 알부민을 혼합한 후 여기에 라텍스를 첨가하여 반응시켜 제조한 것이며, 상세한 제조방법은 후술하는 실시예에 나타낸 일예에 설명되어 있다. 단일클론 항체-결합 라텍스는 바람직하게는 0.05~0.5M의 보레이트 완충액(pH 7.0~9.0)과 1~4%의 소혈청알부민의 혼합물에 용해시킨 현탁액의 형태로 사용한다.

단일클론 항체-결합 라텍스를 점적하기 위한 점적막(2)은 바람직하게는 친수성이 높고 20~40㎛의 공극 크기를 갖는 친수성 폴리에틸렌 시이트이며, 이것은 2~4%의 소혈청 알부민으로 차단하는 것이 필요하다.

시험용 뇨를 최초로 흡수하게 되는 흡수막대(1)로는 흡수력이 강하고 고분자의 생체물질과의 반응성이 적은 다공성 폴리에스터로 된 것을 사용하는 것이 바람직히다.

이하 본 발명의 진단장치의 각 구성요소를 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예1. 박충 고상(4) 재료의 결정

박충 고상(4)에 사용되는 재료를 선정하기 위하여 나이트로셀룰로오스막과 나일론막, 유리섬유 등의 특성을 비교하였다. 초기 선별과정에는 건조된 막의 경우 흡수성이 매우 떨어지고 점적된 유색 라텍스의 이동성이 없어지는 점을 고려하여 흡수성이 높고 유색라텍스에 대한 흡착성이 적은 것을 선별기준으로 삼았다. 표 1은 세 종류의 막의 특성을 비교한 결과이다.

주: 1) 차단제 : BSA 2%, PBS 1×

2) BSA 2%, borate 완충용액에 현탁된 유색락텍스를 보레이트 완충용액(pH 9.0, 0.1M)으로 전개시킴

표 1에서와 같이 차단된 나이트로셀룰로오스막이 흡수성과 이동성이 있어서 복합전하를 띤 나일론막보다 우수하였다. 유리섬유의 경우 차단되지 않은 상태에서도 흡수성과 이동성이 뛰어났으나 막에 단일클론 항체를 고정시켜야 하는 문제점과 이동속도가 지나치게 빨라서 항원-항체 결합반응에 부정적 효과를 나타냈다.

날일론은 단백질 흡착능에서 나이트로셀룰로오스보다 우수하여 단일클론항체 고정화시 유리할 수 있으나 사용된 나일론막의 경우 pI 값이 6.5를 나타냄으로써 단일클론 항체의 pI값에 따라 고정화 효율이 크게 변화될 가능성이 있어, 흡수성, 라텍스 이동성, 단일항체 고정화효율을 종합하여 나이트로셀룰로오스로 결정하였다.

실시예 2. 박충 고상 표면에 항체의 고정

β-HCG 소단위는 임신상태가 아닌 영양막 종양(trophoblastic tumor)에 의해서도 뇨로 분비될 수 있어 결과 판독선(5)에 고정화될 단일클론 항체로는 라텍스에 감작된 β-HCG 특이적 단일클론 항체(anti-HCG-MAb-2)와는 달리 α-HCG 특이적 단일클론 항체(anti-HCG-MAb-1)을 사용하였다.

PBS완충액으로 적신 후 건조시킨 나이트로셀룰로오스 막(4)에 1M NaCl이 첨가된 항-α-HCG 단일클론 항체(1㎛/㎕)를 4㎕/cm로 점적하고 80militorr, 상온에서 1.5시간 동안 진공건조하여 고정화시켰다.

실시예 3. 박충 고상 차단제의 제조

나이트로셀룰로오스막의 경우 수용액의 여과에 적합하게 친수성 표면을 갖도록 제조되어 있으나 진공건조 후에는 흡수성이 현저하게 감소되어 고상 면역크로마토그래피에는 적합하지 못하게 된다. 또한 소수성인 감작라텍스가 건조된 막 표면을 이동할때 막이 지나치게 소수성인 특성을 가질 경우 라텍스 사이에 엉김현상이 발생하여 이동이 불가능해 질 수 있다. 따라서 막의 표면은 건조 후에도 적절한 친수성이 유지되어 흡수성이 보존되면서도 라텍스 이동을 방해하지 않을 만큼의 친수성을 가져야 한다. 이러한 기준에 따라 각종 차단제의 종류에 변화를 측정하고, 결과를 표 2에 나타내었다.

주 : 1) 1 : 카제인 0.25% + 보레이트(pH 9.0, 0.1M)

2 : BSA(=소혈청알부민) 0.25% + Borate(pH 9.0, 0.1M)

3 : BSA 0.25% + PBS(1X, pH7.4)

4 : BSA 0.25% + 글리세롤 0.1% + PBS(1X, pH7.4)

5 : BSA 0.25% + Tween 20 0.05% + PBS(1X, pH7.4)

6 : BSA 0.25% + Triton X-100 0.1% + PBS(1X, pH7.4)

흡수성의 경우 청정제(detergent)가 첨가되거나 보레이트 완충용액을 사용할 경우 눈에 띄게 증가되었다. 라텍스 이동속도의 경우 Tween 20을 0.05%, 첨가하거나 BSA 대신 카제인이 들어간 경우에서 크게 향상되었고, 고정된 단일클론 항체, HCG, 감작된 유색라텍스의 샌드위치법에 의한 반응성은 라텍스의 이동속도가 비교적 느린 경우에 증대되는 것으로 보아 라텍스의 이동속도와 연관되어 있는 것으로 나타났다.

청정제를 첨가할 경우 흡수성은 좋았으나 청정제의 전하특성(Tween 20 : 음전하, triton X-100 : 비전하)에 따라 라텍스 이동에 큰 영향을 주었으며, 특히 Tween 20은 라텍스 이동속도를 지나치게 강하게 만들어 반응성을 약하게 하는 경향을 보였다. 뿐만 아니라 막에 고정된 단일클론 항체가 차단시 첨가된 청정제에 의해 씻겨나가는 현상도 나타나 차단제로 적합하지 못하였다.

막 차단시 일반적으로 사용되는 BSA의 경우 차단효율이 높고 라텍스의 이동속도를 낮춰 강한 반응성을 유도하였으나 라텍스 끌림 현상을 일으켜 선명한 결과를 보여 주어야 하는 진단장치 특성에 부적합하였다. 카제인은 흡수성, 라텍스 이동성 등에서 뛰어났으나 라텍스 이동속도가 빨라 반응성이 BSA의 경우보다 약하게 나타나는 경향이 있어 표 3에 나타낸 것과 같이 BSA를 적당량 첨가하여 그 이동속도를 조절하였다.

실시예 4. 항체가 결합된 라텍스 현탁액의 제조

단일클론 항체로 감작된 유색 라텍스의 이동성은 막(4)의 차단상태에 영향을 받을뿐만 아니라 이 라텍스를 최종적으로 어떤 상태에 현탁하느냐에도 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 표 4는 BSA 2%, PBS 1X, 또는 BSA 2%, 글리세롤 1%, PBS 1×로 각기 차단된 나이트로셀룰로오스막에서 각기 다른 조성의 완충용액으로 현탁된 라텍스를 사용했을 시 그 이동성의 변화를 나타낸 것이다.

주: 1) 막 I : Blocked w/BSA 2% + PBS 1X

막 II : Blocked w/BSA 2% + PBS 1X + 글리세롤 1%

현탁용 완충용액의 소수성을 변화시키기 위해 첨가한 BSA, 트리톤 X-100, 글리세롤중 BSA 만이 양쪽 막에서 뛰어난 이동성을 보여주었다. 표5는 현탁용 완충액의 BSA양에 따른 이동성 변화를 본 것으로 보레이트 완충용액을 사용할 시 BSA 4%에서 우수하였다. 완충용액의 경우 PBS 보다는 보레이트완충용액이 비교적 우수하였다.

위와 같은 결과를 토대로 할 때, 단일클론 항체로 감작된 라텍스 입자는 0.05~0.5M 보레이트 완충용액(pH7.0~9.0) 및 1~4% BSA의 혼합용액에 녹여 현탁액을 제조하는 것이 바람직하며, 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 항-β-HCG 단일클론 항체를 MES(2-(N-모르폴리노)에탄 설폰산) 완충액 600㎕에 넣어 항체의 최종 농도가 100㎍이 되게 준비한다. 준비된 단일클론 항체 용액에 2% 폴리스티렌 용액 200㎕을 서서히 첨가하여 25℃에서 2시간 이상 반응시킨 다음 22,000g로 원심분리하여 인산염 완충액으로 4회 세척하고 최종입자량 1%가 되게 0.1M 보레이트 완충용액(pH8.0) 및 2%BSA의 혼합용액으로 희석하여 단일클론 항체로 감작된 라텍스의 현탁액을 제조한다.

또는 단일클론 항체를 라텍스에 결합시키는 반응을 소혈청 알부민의 존재하에 실시하므로써 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 항체-감작 라텍스의 현탄액은 다음과 같이 제조할 수 있다: 항-β-HCG 단일클론 항체를 2mg의 소guf청알부민이 포함된 MES완충액 600㎕에 넣어 항체의 최종 농도가 100㎍이 되게 준비한다. 준비된 소혈청알부민과 단일클론 항체의 혼합 용액에 2% 폴리스티렌 용액 200㎕을 서서히 첨가하여 25℃에서 2시간 이상 반응시킨 다음 22,000g로 원심분리하여 인산염 완충액으로 4회 세척하고 최종입자량 1%가 되게 보레이트완충액으로 희석하여 단일클론 항체로 감작된 라텍스를 제조한다.

실시예 5. 라텍스 점적막(2)의 제조

셀룰로오스 섬유와 유리섬유 그리고 폴리에틸렌 시이트를 BSA 2%, PBS 1X로 충분히 차단시키고 진공건조한 후 5~10㎕의 1% 유색 라택스용액을 가하고 50~100militorr, 상온에서 2~3시간 동안 건조하여 사용하였다. 셀룰로오스 섬유의 경우 임신뇨로 전개시킨 후 잔존 라텍스가 없는 점에서 약간의 흡착성을 보이는 유리섬유보다 우수하였으나 시이트(sheet) 형태로의 사용이 어려워 대량 제작시 번거로운 측면이 있다. 따라서 과량의 라텍스 점적이 용이하고 건조후에도 뇨에 의한 용출이 원활한 친수성 폴리에틸렌 시이트로 결정하였다.

실시예 6. 진단장치 제조(A)

실시예 1~5에 의거하여 PBS 1×로 10분 동안 적신 나이트로셀룰로오스막(4)을 70militorr에서 1시간 동안 건조시켰다. PBS 1×에 녹인 항-α-HCG 단일클론 항체와 항-쥐 IgG 복합클론 항체를 각각 1g/㎖의 양으로 전자는 셀룰로오스막(4)의 한쪽 말단으로부터 0.9cm되는 위치에, 그리고 후자는 막(4)의 다른 쪽 말단으로부터 0.6cm되는 위치에 점적하고 2.5시간 동안 건조시켰다. 단일클론 항체가 점적된 밴드(5)는 결과판독선의 역할을 하고, 복합클론 항체가 점적된 밴드(6)는 반응종료선의 역할을 한다. 카제인 0.25%, BSA 0.1% 및 보레이트 완충용액(pH8.0, 0.1M)로 1시간동안 차단시킨 후 12시간 건조시켜 결과판독선(5) 및 반응종료선(6)이 구비된 박충 고상(4)을 준비하였다.

한편 폴리에틸렌 시이트를 0.7×0.5cm로 자른 조각을 BSA 4%, PBS 1×용액으로 차단하고 2시간 건조시켰다. 건조된 조각에 상기 실시예 4에서 제조한 단일클론 항체-감작된 유색 라텍스 용액을 조각당 30㎕씩 점적하고 12시간 건조시켜 라텍스 점적막(2)을 준비하였다.

위에서 준비된 장치 및 폴리에스터 흡수막대(1), 셀룰로오수 흡수지(3), (9)를 제 1(B)도에서와 같은 위치로 접착성 폴리비닐클로라이드 시이트에 붙이고 이를 플라스틱 용기에 넣어 임신진단장치를 완성하였다. 완성된 진단장치를 이용하여 임산부 뇨와 비임산부 뇨를 시험한 결과 결과는 제 3도와 같았다. 제 3도에서 좌측은 비임신부의 뇨에 대한 실험결과이고, 우측은 임신부의 뇨에 대한 실험결과이다.

실시예 7. 진단장치 제조(B)

실시예 1~5에 의거하여 PBS 1× 로 10분 동안 적신 나이트로셀룰로오스막(4)을 80militorr에서 1시간 동안 건조시켰다. PBS 1× 및 NaCl 1M의 혼합용액에 녹인 항-α-HCG 단일클론 항체와 항-쥐 IgG 복합클론항체를 1.5g/㎖의 양으로 전자는 셀룰로오스막의 한쪽 말단으로부터 0.9cm되는 위치에, 그리고 후자는 막의 다른 쪽 말단으로부터 0.6cm 되는 위치에 점적하고 2.5시간 동안 건조시켰다. 단일클론 항체가 점적된 밴드(5)는 결과판독선의 역할을 하고, 복합클론 항체가 점적된 밴드(6)는 반응종료선의 역할을 한다. 카제인 0.25%, BSA 0.1% 및 보레이트 완충용액(pH9.0, 0.1M)의 혼합액으로 1시간 동안 차단시킨 후 12시간 건조시켜 박층 고상(4)을 준비하였다.

한편 셀룰로오스 섬유조각을 BSA 4% 및 PBS 1× 용액으로 차단하고 2시간 건조시켰다. 건조된 조각에 상기 실시예 4에서 제조한 단일클론 항체-감작 유색 라텍스 용액을 조각당 35㎕씩 점적하고 12시간 건조시켜 라텍스 점적막(2)을 준비하였다.

위에서 준비된 장치 및 폴리에스터 흡수막대(1), 셀룰로오스 흡수지(3), (9)를 제1도에서와 같은 위치로 접착성 폴리비닐클로라이드 시이트에 붙이고 이를 플라스틱 용기에 넣어 임신 진단장치를 완성하였다. 완성돤 진단장치를 이용하여 임산부 뇨와 비임산부 뇨를 시험한 결과 실시예 6에서와 동일한 결과를 얻었다.

Claims

항-융모선 자극 호르몬-단일클론 항체(anti-HCG-MAb-1)가 고정된 밴드인 결과판독선(5)와 항-쥐 IgG 복합클론 항체가 고정된 밴드인 반응종료선(6)이 구비된 박충 고상(4), 상기 anti-HCG-MAb-1과는 다른 부위에서 항원과 결합하는 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체(anti-HCG-MAb-2)가 결합된 유색 라텍스 입자를 함유하는 라텍스 점적막(2), 상기 라텍스 점적막(2)로부터 상기 박충 고상(4)에 전개시켜 상기 결과판독선(5) 및 반응종료선(6)에서의 발색여부를 각각 관찰할 수 있는 결과판독창(7) 및 반응종료창(8), 흡수지(3),(9) 및 흡수막대(1)를 구비한 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단 장치(kit)에 있어서, 상기 박충 고상(4)이 유색 라텍스 입자크기의 15~25배의 공극 크기를 갖는 나이트로셀룰로어스막이고, 차단제로서 카제인 0.1~1%, 소혈청알부민 0.05~5% 및 보레이트 완충용액(pH 7.0~9.0) 0.05~0.5M의 혼합용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치.
제 1 항에 있어서, 박충 고상(4)인 나이트로셀룰로오스 막은 접착성이 있는 소수성 폴리비닐클로라이드 시이트에 접착시켜져 있음을 특징으로 하는 고상면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치.
제 1 항에 있어서, 라텍스 점적막(2)이 anti-HCG-MAb-2가 결합된 유색 라텍스를 1~4%으 소혈청 알부민을 함유하는 0.05~0.5M 보레이트 완충용액(pH 7.0~9.0)에 현탁시켜 제조한 현탁용액을 폴리에틸렌 시이트에 가하여 제조한 것임을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치.
제 3항에 있어서, 폴리에틸렌 시이트가 20~40㎛의 공극크기를 가지며, 차단제로서 2~4%의 소혈청알부민을 함유하는 친수성의 것임을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치.
제 1항에 있어서, 흡수 막대(1)는 다공성 폴리에스터인 것을 특징으로 하는 고상 면역 크로마토그래피에 의한 임신 진단장치.