KR960014644B1 - 면역측정법을 이용한 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

면역측정법을 이용한 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지 제조방법

제1도는 특이반응성 단일클론항체를 이용한 인체태반성 홀몬 측정용 멤브레인의 나열도이고,

제2도는 인체태반성 홀몬 검출지의 시료반응 모양(실시예 1)을 나타낸 것이고,

제3도는 특이반응 항체를 이용한 인체태반성 홀몬 측정용 멤브레인의 나열도이고,

제4도는 인체태반성 홀몬 검출지의 시료반응 모양(실시예 2)을 나타낸 거이다

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

M1 : 착색고상형 항체가 일시적으로 결합된 멤브레인(0.5×0.5㎝)

M1' : 착색고상형 항원이 일시적으로 결합된 멤브레인(0.5×0.5㎝)

M2 : 제한된 양의 특이항체가 일정한 부위(B)에 영구적으로 결합된 멤브레인(3.5×0.5㎝)

M3 : 시료분리 및 흡수패드(0.5×0.5㎝)

M4 : 반응이 끝난 시료의 흡수저장패드(1.5×0.5㎝)

A : 착색고상형 단일클론항체(KW)가 일시적으로 결합되어 있는 부분

A' : 착색고상형 항원이 일시적으로 결합되어 있는 부분

B : hCG특이 단일클론항체(C10C) 또는 베타-소단위 분자에 대한 다클론항체가 결합되어 있는 부분

B' : 제한된 양의 hCG 특이 단일클론항체(KW) 또는 다클론항체가 영구히 결합되어 있는 부분

C : 동물항체(Rabbit anti-mouse IgG)가 영구히 결합되어 있는 부분

본 발명은 반응특이성이 우수한 단일클론항체와 크로마토그라피 면역측정법을 이용하여 인체태반성 성선자극홀몬(Human Chorionic Gonadotropin 이하, hCG라 함) 분자를 높은 감도로서 간편하게 측정할 수 있는 hCG 측정용의 간이시험지 제조방법에 관한 것이다.

인체태반의 영양배엽세포에서 분리되는 당단백 홀몬인 인체태반성 성선 자극 홀몬은 임신초기에 임신여부를 진단하는 중요한 표지물질로 사용되고 있다. 또한 임신이 아닌 각종 융모성 질환환자의 뇨와 혈청에도 다량 존재하므로 융모성 질명(trophoblastic disease)의 조기 진단과 그 치료과정의 추적에 응용되는 중요한 진단표지물질로 이용되고 있다(G.D. Branstein j.Rasor, d.Alder, H. Hanser, M.E. Wade(1976) : Am. J. Obstet. Gynecol. 126,678/R. Randesman, B.B.Saxena(1976)Fertil. Steril. 27,557/B. Frances(1980) : Fertil. Steril. 34,1).

이러한 인체태반성 홀몬을 측정하는 공지의 면역측정법으로 효소를 이용한 효소 면역측정법, 방사선 물질을 이용한 방사선 면역측정법, 형광물질을 이용한 형과 면역측정법 및 라텍스입자를 이용한 면역측정법 등의 실용화되고 있다.

이중 효소를 이용한 면역측정법은 고가의 효소를 사용해야 한다는 단점이 있으며, 방사선 물질을 이용한 면역측정법도 인체 및 환경에 유해한 방사선 물질을 사용해야 하며 분석방법이 복잡하고 고가의 분석기기와 고도의 분석기술이 요구되는 전문요원을 필요로 하며 분석시간이 길다는 단점이 있다.

또한, 라텍스입자를 이용한 응집반응법은 방사성 물질을 사용하지 않아도 된다는 점, 특정한 기기가 필요하지 않으며, 휴대가 간편하고 반응결과가 빠른 시간내에 나타난다는점 및 육안으로 판정이 가능하다는 점 때문에 보편적으로 이용되고 있으나, 기존의 실용화된 간접응집법을 이용한 라텍스 응집반응법은 구성물로 항원이 결합된 라텍스입자와 항혈청, 완충액 및 기타 부자재가 필요하므로 휴대가 불편하고 보존성이 떨어지고, 직접응집법을 이용한 라텍스 응집반응법도 구성물로서 항체가 결합된 라택스입자와 완충액이 필요하므로 휴대하기가 불편한 단점이 있다.

이에 따라 최근에 hCG 측정용의 건식간이시험지법이 새로 개발되어 간이 임신진단약으로 실용화되고 있는데, 이 방법의 기술특징은 항원 및 단일클론항체의 반응 특성원리를 응요하여 다른 보조시약이 필요없이 검체를 직접 시험지에 적용하여 10분이내에 결과를 육안으로 판독할 수 있는 것으로서 간이용의 자가진단약으로 상품화되고 있다.

이와같은 시험지법의 장점은 운반과 보관이 간편하고 측정결과가 장기간 유지될 수 있으며 1회용의 자가진단약으로 전문적인 측정기술없이 사용자가 현장에서 직접 진단하기가 간편하다는 이점을 가지고 있다(UK Patent Application GB 2204398A ; Unileven PLC, Application No. 8809867, Filing Date : Apr. 26,1988/G. Osikowicz, M. Beggs, P. Brookhart, D.Caplan, S. Ching, P. Eck, J. Gordon, R. Richerson, S. Sampedro, D.Stimpson, F. Walsworth(1990) : One-step chromatographic immunoassay for qualitative determinating chorionic gonadotropin in urine, Clin Chem. 36, 1586-1587).

그러나 기존의 시험지법에 의한 hCG 측정기술은 제조방법에 있어 여러 단계를 거쳐야 하는 까닭에 공정이 복잡하고 제조시간이 길며, 또한 육안으로 판독되는 반응색이 흐리고 반독시간이 10분으로 감도와 안정성이 떨어지는 단점을 가지고 있다. 즉, 이 기술방법을 상세히 설명하면, 착색라택스입자를 미리 완충액으로 여러번 세척한 후 항체를 혼합하여 20시간 정도 상온에서 반응시키고 소형청알부민으로 반응을 고정시킨 다음 30분간 방치한 후 세척하고 현탁시켜 일시 고정 멤브레인에 처리하는 복잡한 과정이 필요하다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 종래 방법의 문제점을 극복하고자 노력한 결과 기존의 복잡한 제조방법을 단순화하고 시험지 제품의 품질면에서 측정감도(0.2 IU/ml)가 높고 교차반응이 없으며, 육안으로 판독하기 쉽게 반응색을 예민하게 나타나게 하는 시험지 제조방법을 발명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 제조방법이 간단하고 측정감도가 높으며 판독이 용이한 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 미립자에 항체를 결합시켜 멤브레인에 처리하여 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지를 제조하는데 있어서, 상기 멤브레인을 2개로 구성하되, 베타-소단위 분자에 특이성을 갖는 항체 또는 항원자체(hCG)를 착색된 미립자와 혼합하여 고상형 항체 또는 항원을 제조하고 이를 완축액과 서당으로 전처리된 멤브레인에 일시고정시켜 제조된 멤브레인과 성선자극 홀몬에 특이성을 갖는 단일클론항체나 베타-소단위 분자에 특이성을 갖는 다클론항체를 완충액과 서당으로 전처리된 멤브레인에 영구고착시켜 제조된 멤브레인으로 이루어지며, 시료 흡수패드와 상기 고상형 항체가 고착된 멤브레인은 5°각도로 경사지게 하여 제조하는 것을 그 특징으로 한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 반응특성이 우수한 단일클론항체와 크로마토그라피 면역측정법을 이용하여 인체태반성 성선자극 홀몬 분자를 높은 감도로서 간편하게 측정할 수 있는 간이시험지의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 멤브레인의 특성에 따라 미립자의 이동성이 다르다는 점에 착안하여 두종류의 멤브레인을 완충액과 서당으로 전처리하고, 여기에 항체-항원을 각각 일시고정 및 영구고정시킨다. 이때, 항원-항체를 일시고정시키기 위한 멤브레인으로는 글라스화이버 멤브레인을 사용하고, 영구 고정시키기 위한 멤브레인으로는 항체고착성이 우수한 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용한다. 여기서, 멤브레인의 전처리는 멤브레인 위에서의 미립자의 이동을 빠르게 촉진하기 위한 것이고, 또한 시료의 이동을 빠르게 하기 위하여 보조 흡수패드를 사용하여 최종적으로 고상형 항체 또는 항원을 일시 고정시킨 멤브레인과의 처리 각도를 5°경사지게 고정되도록 하였다. 이때, 보조흡수패드로는 셀룰로오스 멤브레인을 사용한다. 만일, 멤브레인 처리각도가 상기 범위를 벗어나면 반응시간이 충분치 않는 문제가 있다.

또한, 본 발명에서는 반응이 끝난 시료를 흡수보존할 수 있도록 흡수저장 패드를 항원-항체를 영구고착시킨 멤브레인의 상부에 결합시키는 바, 이때 흡수저장 패드로는 셀룰로오스 멤브레인을 사용한다.

또한, 인체태반성 홀몬의 각 소단위분자(subunit)에 대한 단일클론항체(대한민국 특허 제52169호)들의 에피토프(epitope)가 특이한 점을 이용하여 첨부도면 제1도 및 제3도에 나타낸 바와같이 착색미립자에 hCG의 베타-소단위분자(β-subunit)에 특이한 단일클론항체를 결합시켜 착색미립자 고상형 항체를 만들고, 이를 미립자의 이동성이 우수한 멤브레인(Mi)에 일시적으로 고정건조시켰으며, 항체고착성이 큰 멤브레인(M2)에 hCG에 특이한 단일클론항체나 베타-소단위 분자에 특이한 다클론항체(polyclonal antibody)를 결합시켜 제조하였다.

이때, M1과 M2의 결합은 M1을 뒤집어 M2에 접하도록 하고 M1에서 착색미립자가 처리되지 않은 면에 시료를 주입할 수 있도록 할 수도 있다.

또한, 본 발명은 시료중 hCG 분자가 다른 시약의 보존없이 항원을 결합시켜 제조된 고상형 항체이 고정 건조된 멤브레인 M2상을 이동하면서 멤브레인상의 단일클론항체나 단일클론항체가 결합된 부위에서 일어나는 항원-항체 반응을 착색미립자의 반응색에 의해 hCG만을 특이하게 높은 감도로서 검출할 수 있도록 고안한 것으로, 착색미립자 고상형 항원을 M1'에 일시적으로 고정건조시키고 M2에 hCG에 특이성을 갖는 단일클론항체나 베타-소단위 분자에 특이성을 갖는 다클론항체를 영구고착시킨 후 시료중에 존재하는 hCG분자와 고상형 항원이 단일콜론항체나 다클론항체 고착부위에서 경쟁성이 반응을 일으켜 hCG만을 특이하게 높은 감도로서 검출할 수 있도록 한 것이다.

이와같은 본 발명에 의해 제조된 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지는 제조방법이 간단하고 측정감도가 높으며 또한, 교차반응이 없고 다른 보조시약없이 육안으로도 판독하기가 용이하여 누구라고 쉽게 진단할 수 있어 임시자가진단용으로 널리 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 발명자들이 사용한 단일클론항체인 KW(KCTC 8432P)과 C10C(KCTC 8433P)의 특성 및 친화상수를 다음 표 1에 나타내었다.

* N/D : 측정안됨

먼저 상기 단일클론항체중 KW를 착색미립자에 결합시켜 착색미립자 고상형 항체를 제조하는 방법을 설명하면 다음과 같다.

정제된 KW 1mg 을 청색폴리스타이렌 미립자(10% 용액) 100μl와 글라이신(Glycine) 완충액과 함께 혼합한다. 실온에서 3시간동안 반응시킨 후 원심분리한다. 침전액을 글라이신완충액으로 2회 세척한 후 0.5ml에 잘현탁시켜 청색폴리스타이렌 미립자 고상형 항체를 만든다. 여기에 혈청알부민 1mg, 서단 0.2g 을 가하여 혼합시킨 후 냉장보관한다. 상기한 착색미립자는 그 직경이 0.3~0.5μm 정도이다.

이와같이 제조된 착색미립자 고상형 항체를 글라스화이버 멤브레인에 일시 고정 건조시키기 위하여 글라스화이버를 알부민과 형청을 계면활성체(Tween 20)가 포함된 붕산완충액(pH 8.5)으로 건조시킨 다음 여기에 30% 서당액을 분무건조시켜 착색고상형 항체가 일시적으로 결합된 멤브레인(0.5×0.5㎝)(첨부도면 제1도, A, M1)을 제조한다.

그런 다음 hCG의 알파-소단위 분자에 특이한 단일클론항체(C10C)나 베타-소단위분자에 대한 다클론항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인 영구 고정시키는 방법을 설명하면 다음과 같다.

니트로셀룰로오스(8-12μm pore size)를 카제인이 함유된 구연산완충액(pH 6.0)에 15분간 담구어 기포를 제거한 후 40℃ 항온건조기에서 건조시킨다. 건조된 니트로셀룰로오스중 C10C나 다클론항체(첨부도면 제1도, B), 생쥐 IgG의 항체(첨부도면 제1도, C)가 처리될 부분을 제외한 부분을 30% 서당액으로 분무처리한다. 멤브레인 하단에서 2㎝되는 곳에 C10C나 다클론항체를 고착 처리하고(첨부도면 제1도, B), 하단에서 3㎝되는 곳에는 토끼의 항체(Rabbit Anti-mouse IgG)를 고착 처리하면(C) hCG 특이항체가 일정부위에 영구적으로 결합된 멤브레인(3.5×0.5㎝)(첨부도면 제1도, M2)이 된다.

그후 시료의 불순물을 제거하고 동시에 착색고상형 항체의 이동속도를 높이기 위해 흡습력을 유지하고 또한 반응이 끝난 시료를 흡수보존할 수 있는 흡수 저장패드(1.5×0.5㎝)(첨부도면 제1도, M4)로 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 처리하였다.

상기에서 제조된 멤브레인들을 상기 규격으로 잘라 제1도와 같이 조립하였는데 M1 멤브레인중 착색미립자 고상형 항체를 M2 멤브레인면과 접하게 하고, M1,M2 및 M4의 멤브레인이 시료분리 및 흡수패드(0.5×0.5㎝)(M3)에 대하여 5°경사지게 하여 본 발명의 간이시험지를 제조하였다.

이와같이 제조된 간이시험지에 뇨시료를 적용했을 때 그 반응결과는 제2도와 같다. 즉 hCG의 측정감도는 (0.2IU-0.5IU/ml)로서 hCG만을 측정할 수 있으며, 유사당 단백질과의 교차반응은 다음 표 2와 같이 전혀 없었다.

* 교차반응성(5)=

실시예 2

착색미립자에 항원(hCG)과 동물항체를 반응시켜 착색고상형 항원을 제조하는 방법은 상기 실시예 1의 착색미립자 고상형 항체의 제조방법과 동일하다. 이때 사용한 hCG 양은 100mIU이고, IgG의 양은 500μg이다.

상기에서 제조한 착색미립자 고상형 항원(첨부도면 제3도, A') 을 글라스화이버 멤브레인에 일시고정 건조시키는 방법은 상기 실시예1의 M1 제조와 동일하다(0.5×0.5㎝)(첨부도면 제3도, M1').

또한, 상기 실시예 1의 단일큰론항체(KW)나 베타소단위분자에 대한 다클론항체(첨부도면 제3도, B')를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 영구 고정시키는 방법과 동물항체(첨부도면 제3도, C)를 영구고정시키는 방법은 상기 실시예 1의 M2의 제조방법과 동일하다(3.5×0.5㎝)(첨부도면 제3도, M2).

그런 다음 시료의 불순물을 제거하고 동시에 시료 흡습력을 높여 멤브레인상에서 착색고상형 항원의 이동속도를 높일 수 있는 흡수패드(0.5×0.5㎝)(첨부도면 제3도, M3)와 또한 반응이 끝난 시료를 잘 흡수하여 보존할 수 있는 패드(1.5×0.5㎝)(첨부도면 제3도, M4)로 셀룰로오스 멤브레인을 사용하였다.

상기에서 제조한 멤브레인들을 상기 규격으로 잘라 나열하여 제3도와 같이 조립했으며 이와같이 제조된 간이시험지에 뇨시료를 적용했을 때 그 결과는 제4도와 같다.

즉, hCG만을 측정할 수 있었으며 유사 당단백질 홀몬과의 교차반응은 다음 표 3과 같이 전혀 없었다.

Claims (4)

1. 미립자에 항체를 결합시켜 멤브레인에 처리하여 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지를 제조하는데 있어서, 상기 멤브레인을 2개로 구성하되, 베타-소단위 분자에 특이성을 갖는 항체 또는 항원자체(hCG)를 착색된 미립자와 혼합하여 고상형 항체 또는 항원을 제조하고 이를 완충액과 서당으로 전처리된 멤브레인에 일시고착시켜 제조된 멤브레인과, 성선자극 홀몬에 특이성을 갖는 단일클론항체나 베타-소단위 분자에 특이성을 갖는 다클론항체를 완충액과 서당으로 전처리된 멤브레인에 영구 고착시켜 제조된 멤브레인으로 구성하며, 상기 고상형 항체가 일시 고착된 멤브레인은 그 하부에 접하여 조립되는 시료 흡수패드와 5°각도로 경사지도록 제조하는 것을 특징으로 하는 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 착색미립자 고상형 항체 또는 항원자체가 일시 고착된 멤브레인으로는 글라스화이버 멤브레인을 사용하는 것을 특징으로 하는 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 착색미립자 고상형 항체 또는 항원자체가 일시 고착된 멤브레인과 단일클론항체나 다클론항체가 영구 고착된 멤브레인에 시료를 흡수처리하도록 셀룰로오스 시험지를 접합시키는 것을 특징으로 하는 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 착색미립자 항체 또는 항원자체가 고착된 멤브레인을 뒤집어 단일클론항체나 다클론항체가 영구고착된 멤브레인과 접하도록 하고 착색미립자가 처리되지 않은 면에 시료를 주입하도록 구성하는 것을 특징으로 하는 인체태반성 홀몬 측정용 간이시험지의 제조방법.