JP2021515216A - 溶液中の生物分子またはリガンドを検出し、定量化する生物発光バイオセンサー - Google Patents

Abstract

本発明は、溶液中の生物分子（例えば抗体）またはリガンド（例えば小分子）の直接的な検出を可能にする包括的なバイオセンサー戦略を提供するための、生物発光バイオセンサーおよびそのような生物発光バイオセンサーの使用に関する。【選択図】図１Ａ

Description

本発明はバイオセンサーおよび検出方法に関する。バイオセンサーは、生物分子（例えば抗体、抗原、タンパク質等）またはリガンド（例えば小分子、タンパク質ベースのバイオマーカー等）を検出し、定量化するのに使用される。特に、本発明は、生物発光バイオセンサーおよび検出方法に関し、生物発光バイオセンサーは、抗体を検出し、定量化するのに使用される。本発明は、バイオセンサーおよび検出方法にさらに関し、バイオセンサーは、小分子またはタンパク質ベースのバイオマーカーなどのリガンドを検出し、定量化する生物分子（例えば抗体）結合バイオセンサーである。

抗体ベースの分子認識は、薬物送達および治療を標的にする診断から分子イメージングの用途にわたるライフサイエンスにおいて大きな役割を果たしている。抗体は、広範囲の疾患の重要なバイオマーカーであり、感染症、自己免疫疾患、およびアレルギーの診断および監視にとって特に重要である。さらに、抗体ベースの薬物治療は、生物分子薬の重要なクラスを構成する。例えば治療抗体は、抗癌および抗炎症治療に臨床適用される。治療抗体の初期応答およびクリアランス率は患者個体ごとに変動し、治療有効性および疾患進行と相関し、これは、患者特有の治療薬モニタリング（ＴＤＭ）が過剰量および不十分な量の薬を投与するのを防ぐことによってより優れた有効性を可能にすることを示唆する。抗体の検出および定量化は、依然としてポイント・オブ・ケア試験で重要なニーズがある。広く様々な感度が高い抗体検出戦略が開発されている一方で、それらの多くには、多大な時間がかかるインキュベーションステップ（ＥＬＩＳＡおよび他の異種のサンドイッチ型アッセイ）、多数の試薬、および／または精巧な装置（例えば表面プラスモン共鳴）を必要とするなどの固有の制限がある。

分子認識およびシグナル世代が単一のタンパク質に統合される新しい包括的な抗体検出戦略が、特にハイスループットスクリーニングおよびポイント・オブ・ケア用途にとって理想的である。タンパク質工学視点から、重要な問題は、どのようにして抗体結合が容易に検出可能なシグナル変化に翻訳できるかである。

いくつかのグループが、ペプチドエピトープをレポーター酵素内の許容部位に挿入することによるアロステリック抗体レポーター酵素の開発を報告している（Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９４，７，５０９；Ｂｅｎｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，２１２５１；およびＦｅｒｒｅｒ−Ｍｉｒａｌｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６，４００８７参照）。しかしながら、これらのハイブリッド酵素は触媒によって低下し、被検物質結合が、多くの場合活性をさらに低下させる。異なる設計戦略は、レポーター酵素の抗体誘導オリゴマー形成またはスプリットレポーター酵素の相補性の使用である（Ｇｅｄｄｉｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３６９，１０５２；Ｄｅ ｌａｓ Ｈｅｒａｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００８，３７０，１６４；およびＦｒｙ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００８，３７２，５４２参照）。これらのアプローチは、ｔｏ２つのタンパク質（またはタンパク質ドメイン）を一緒にして、活性酵素形成する抗体の二価の性質を利用する。しかしながら、再構成した酵素活性は、その親酵素と比較して典型的には低い（１〜２％のみ）。追加の欠点は、センサー性能がセンサー濃度に依存し、それ故に、単一のタンパク質センサーよりあまり長持ちしないことである。

１つのアプローチが、抗体結合により蛍光特性が変化する蛍光標識したエピトープの使用である。しかしながら、酵素増幅ステップを欠くことから、これらの方法の感度は、確実に検出できる蛍光プローブの濃度によって限定される。追加の欠点は、診断が低リソース領域または外部の医療センターで必要とされる場合に特に問題がある特殊計装を要することである。

抗体を用いて２成分レポーターシステムを一緒にする代替として、抗体結合は、２つのドメインの間の相互作用を破壊するのにも使用できる。この戦略の利点は、２つのドメインが、単一のタンパク質コンストラクトの一部であり得ることである。原理は、Ｆｏｒｓｔｅｒ（ｏはウムラウト付き）共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の原理に基づくタンパク質ベースの抗体センサーの設計において、Ｍｅｒｋｘのグループによって証明されている（Ｇｏｌｙｎｓｋｉｙ，ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１０，１１，２２６４）。２つの蛍光タンパク質が、蛍光ドメインに隣接する２つの同一のエピトープを含む半柔軟なリンカーを介して一緒に連結されていた。リンカーは、標的抗体の抗原結合ドメインの間の約１０ｎｍの距離の効率的な橋かけを確実にする２つのαヘリックスブロックを含んでいた。蛍光タンパク質が自己会合促進変異含んでいたことから、それらは、抗体の非存在下で分子内ドメイン相互作用を形成した。リンカーのエピトープへの抗体の二価結合は、蛍光ドメイン野間だの相互作用を破壊し、ＦＲＥＴを低下させた。このＦＲＥＴセンサーでの検出の制限は、検出が外部照明に頼っており、シグナル増幅ステップを欠いていたことであった。同じ分子スイッチ原理が、レポーター酵素とその阻害剤のタンパク質との間の分子内相互作用を制御するグループによって使用され、溶液中で直接のピコモルの抗体濃度の酵素増幅検出を可能にした（Ｂａｎａｌａ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，２１２７）。しかしながら、レポーター酵素は、血清において活性が弱まり、２色ＦＲＥＴシステムによって提供される固有の較正を欠いていた。グループは、さらに同じ原理を利用して、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づくセンサー形式（ＬＵＭＡＢＳと称される）を設計した（Ａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ.，２０１６，８８，４５２５）。青色光放射ルシフェラーゼ（例えばＮａｎｏＬｕｃ；「ＮＬｕｃ」とも称される）をドナーとして使用し、半柔軟なリンカーを介して緑色蛍光受容体タンパク質（例えばｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）に接続し、ヘルパードメインを導入してそれらを近づける。リンカーをフランキングする抗体の二価結合が、ヘルパードメインの間の相互作用を破壊し、ＢＲＥＴを低下させ、発光色を緑色から青色へ変化させた。生物発光センサーの重要な利点は、外部励起を必要とせず、バックグラウンド蛍光および散乱を被ることなく、本質的に暗いバックグラウンドに対するセンサーシグナルの感度が高い検出を可能にすることである。より最近には、Ｍｅｒｋｘのグループは、ジスルフィド含有環状ペプチドエピトープを含む治療抗体トラスツズマブおよびセツキシマブを特異的に標的にするＬＵＭＡＢＳセンサーの構築（Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．８ｂ０００４１）、および非天然のアミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニンの導入によって非ペプチド抗原が抱合された半合成ＬＵＭＡＢＳの開発を報告した（Ａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｅｎｓ．，２０１７，２，１７３０）。

深海エビ由来のルシフェラーゼ設計したであるＮａｎｏＬｕｃは小さいが（１９ｋＤａ）、他のルシフェラーゼと比較して増加しし、持続した発光を生じる安定したタンパク質である（Ｈａｌｌ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２０１２，７，１８４８）。ＮａｎｏＬｕｃは、ＢＲＥＴベースのアッセイにとって魅力的なドナーを表す。Ｍｅｒｋｘのグループによって開発されたＬＵＭＡＢＳセンサー（Ａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８，４５２）は、ドナーとしてＮａｎｏＬｕｃを、発光ピークが５６ｎｍのみによって分かれる受容体としてｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを利用した。発光スペクトルの大きい重複は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発光ピークで観察した強度の一部がＮａｎｏＬｕｃから生じ、最大レシオメトリック応答を制限することを意味する。より赤色にシフトした蛍光受容体は、発光スペクトルの間の分離が増大することから良い代替物であり、抗体がない状態と複合化状態との間の発光率の大きい変化を達成し得る。しかしながら、赤色蛍光タンパク質ドメインによるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの置換は、ＮａｎｏＬｕｃと赤色にシフトした蛍光受容体との間の非効率的なＢＲＥＴの結果、ダイナミックレンジが乏しいＬＵＭＡＢＳセンサーを生じた（Ｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，７，１８４８）。

スプリットルシフェラーゼは、タンパク質相互作用の試験および生体内および生体外の両方の被検物質の検出にとって有効なツールである。被検物質のアッセイのために、ドメインまたは無傷のタンパク質が内部で断片化したルシフェラーゼに通常挿入され、リガンド結合を生じ、発したシグナルの変化を引き起こす。最近、ＮａｎｏＬｕｃが２つの断片、１８ｋＤａラージビット（ＬＢｉＴ）および１．３ｋＤａスモールビット（ＳＢｉＴ）に分割され、タンパク質相互作用研究のための相補性レポーター（ＮａｎｏＢｉＴと称される、またはＮＢ）として設計された（Ｄｉｘｏｎ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１６，１１，４００）。ＮａｎｏＢｉＴ（ＮＢ）タンパク質相補性アッセイがＧタンパク質相互作用（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１７，５２２，１０）およびウイルス侵入および放出（Ｓａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，２０１８，２４３，６９）の分析に利用されている。２つの小さいペプチド融合物に基づく３部分のＮａｎｏＢｉＴ相補性システムが均質のイムノアッセイのために最近開発された（Ｄｉｘｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１７，７，８１８６）。

本発明は、互いに排他的な分子内スプリットルシフェラーゼ相補性に基づいて、溶液中の被検物質、特に抗体の直接検出を可能にし、上記の制限の多くに対処する異なる生物発光センサー形式を提供する。

本発明内で、スプリットルシフェラーゼの分子内相補性を用いて、溶液中の生物分子（例えば抗体、タンパク質、抗原、アプタマー等）または生物分子特異的なリガンド（例えば小さい分子、タンパク質バイオマーカー等）の直接的な一段階検出を可能にする新しいアプローチを提示する。本発明は、第１の末端と第２の末端とを含むリンカーを含むバイオセンサー、好ましくはレシオメトリックバイオセンサーを提供し、リンカーの第１の末端は、第１の結合ドメインを介して第１のルシフェラーゼドメインの１つの末端に融合されており、リンカーの第２の末端は、第２の結合ドメインを介して第２のルシフェラーゼドメインに融合されている。バイオセンサーは、任意選択的に、スペーサーを介して第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合した第３のルシフェラーゼドメインを含む。バイオセンサーの結合ドメインは生物分子に結合するように構成されており、バイオセンサーは少なくとも２つの構造に存在し、第２のまたは第３のルシフェラーゼドメインのいずれかが相補ルシフェラーゼを形成するように第１のルシフェラーゼドメインに結合する。第２のおよび第３のルシフェラーゼドメインが、相補ルシフェラーゼを形成するように第１のルシフェラーゼドメインに結合し、フルオロフォアが第２のまたは第３のルシフェラーゼドメインのうちの１つの次に結合するバイオセンサーを提供することによって、２つの構造のうちの１つのみにおいてルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の効率的な生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）がもたらされる。第３のルシフェラーゼドメインが第１のルシフェラーゼドメインに融合され得るが、代わりに、例えば、本発明のバイオセンサーを含む溶液中の成分として存在し得ることに注目すべきである。

本明細書で「生物分子」または「生体分子」は、細胞分裂、形態形成、または発達などの一部の典型的に生物学的なプロセスに必須の生物に存在する分子を指し、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ断片）などの大きい高分子、並びに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然産物などの小分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。生物分子は通常内因性であるが、外来のものであってもよい。例えば、医薬は、天然の生成物または半合成品（バイオ医薬品）またはすべて合成物であってもよい。

本明細書で「リガンド」は、生物学的目的を果たす生物分子と複合体を形成する物質を指す。タンパク質−リガンド結合において、リガンドは典型的には標的タンパク質上の部位への結合によってシグナルを生産する分子である。ＤＮＡ−リガンド結合の調査では、リガンドは小分子、イオン、タンパク質等であり得る。典型的には、リガンドと生物分子との間の結合は、イオン結合、水素結合およびファンデルワールス力などの分子間力によって生じる。ドッキングの結合は実際には解離を通じて可逆的である。

本明細書で「介して」（例えば「第１の結合ドメインを介して」と関連する使用としての）は、バイオセンサーの第１の部分がバイオセンサーの第３の部分が介在して（介して）バイオセンサーの第２の部分に融合されており、バイオセンサーの第３の部分それ自体がバイオセンサーの第１の部分および第２の部分の療法に接続されているか、または第３の部分がバイオセンサーの第１の部分および第２の部分を結合するバイオセンサーの結合部分に接続されている構成を指す。

本明細書で「ルシフェラーゼドメイン」は、生物発光を生じる酸化酵素（その部分または断片を含む）を指す。例としては、スプリットホタルルシフェラーゼおよびＮａｎｏＬｕｃ（深海エビ由来の設計したルシフェラーゼ）が挙げられる（これらに限定されない）。ルシフェラーゼドメインは、相補断片がルシフェラーゼ活性を有する相補ルシフェラーゼを形成するルシフェラーゼの断片、好ましくはスプリットルシフェラーゼの断片を含み得る。そのような断片の例としては、ＮａｎｏＬｕｃラージスプリットルシフェラーゼ断片およびＮａｎｏＬｕｃスモールスプリットルシフェラーゼ断片が挙げられる。

任意選択的に、ルシフェラーゼドメインは生物発光複合体に自己組織化できるタンパク質ドメインまたはポリペプチドである。任意選択的に、ルシフェラーゼドメインは、スプリットＮａｎｏＬｕｃ断片である。任意選択的に、第１のルシフェラーゼドメインは大きいルシフェラーゼドメイン、好ましくはラージスプリットルシフェラーゼ断片である。さらに任意選択的に、第２のおよび第３のルシフェラーゼドメインは小さいルシフェラーゼドメイン、好ましくはスモールスプリットルシフェラーゼ断片である。

任意選択的に、第１のルシフェラーゼドメインは配列番号１９のアミノ酸配列、または配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。

任意選択的に、第２のおよび第３のルシフェラーゼドメインのそれぞれは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３、または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列の群から選択される。

本発明の一実施形態では、第１のルシフェラーゼドメインに対する第２のおよび第３のルシフェラーゼドメインの親和性が異なる。好ましくは、第２のルシフェラーゼドメインは第３のルシフェラーゼドメインの親和性と比較してより高い親和性を有する。

任意選択的に、第２のルシフェラーゼドメインの親和性は、第３のルシフェラーゼドメインの親和性と比較して少なくとも５倍高い、好ましくは１０〜１５００倍高い、１０〜１０００倍高い、１０〜１００倍高いまたは１０〜５０倍高い親和性を有する。

本発明の一実施形態では、第３のルシフェラーゼドメインはスペーサーを介して第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合されている。

本明細書で「リンカー」および「スペーサー」は、第２のルシフェラーゼドメインおよび、任意選択的に、第３のルシフェラーゼドメインを第１のルシフェラーゼドメインに結合するのに適したリンカーを指す。リンカーおよび任意のスペーサーの長さは、リンカーおよび任意のスペーサーが、第１のルシフェラーゼドメインの結合部位の位置と組み合わせて、第１のルシフェラーゼドメインに結合する位置（第１のルシフェラーゼドメインのＮ末端またはＣ末端のどちらかに結合する）に依存する。リンカーおよび任意のスペーサーの内容は、リンカーおよび任意のスペーサーの望ましい柔軟性に依存する。望ましい柔軟性はバイオセンサーごとに、目的ごとに変動し得る。

任意選択的に、スペーサーはポリペプチドまたはポリペプチド断片であり、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個または少なくとも１０個のＧＧＳ反復を含み得る。しかしながら、ＧＧＳ反復の数は目的およびバイオセンサーの設計に応じて変動し得ることに留意すべきである。さらに、リンカーの内容は変動し得、必ずしもＧＧＳ反復の使用に制限されない。

任意選択的に、リンカーはポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントなどの半柔軟なリンカーであり、（ＧＳＧ）_６の少なくとも１つの柔軟なブロックを含み得る。さらに任意選択的に、リンカーは少なくとも１つのαヘリックスブロックをさらに含む。さらに任意選択的に、リンカーは６個のＥＡＡＡＫ反復を有する少なくとも１つのαヘリックスブロックをさらに含む。また、さらに任意選択的に、リンカーは、それぞれ６個のＥＡＡＡＫ反復を有する２つのαヘリックスブロックをさらに含む。一般に、留意すべきである半柔軟なリンカーは、リンカーがバイオセンサーの状態を変化させる、すなわち２つの構造におけるルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴを変化させるのに十分な柔軟性を有するように選択される。

任意選択的に、半柔軟なリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。

任意選択的に、フルオロフォアは、光励起により赤色光を発することができる蛍光化学的な化合物である。さらに任意選択的に、フルオロフォアはＣｙ３である。

任意選択的に、フルオロフォアは、第２のルシフェラーゼドメインに隣接してバイオセンサーに結合されている。さらに任意選択的に、フルオロフォアは、リンカーと第２のルシフェラーゼドメインとの間でバイオセンサーに結合されている。代替として、フルオロフォアは、第３のルシフェラーゼドメインに隣接してバイオセンサーに結合されている。

任意選択的に、生物分子は抗体、抗原、タンパク質またはアプタマーを含み得る。好ましくは、生物分子は抗体である。

本発明の第１の態様では、両方の結合ドメインが、生物分子と結合する、すなわち生物分子の１つ以上の結合部位に競合して結合するように構成されている。結合ドメインは、生物分子の１つの結合部位または複数の結合部位とある親和性を有するいずれの種類の結合ドメインであり得るが、エピトープである結合ドメインの使用が好ましい。任意選択的に、両方の結合ドメインは、同じエピトープ、すなわち抗体の両方のパラトープと分子間結合するように構成されたエピトープを含む。

本明細書で「エピトープ」は、抗体の抗原結合部位、すなわち抗体のパラトープに結合するポリペプチドを指す。本明細書で「エピトープ」は、天然に存在するエピトープ自体に限定されない。本明細書で「エピトープ」は、エピトープ模倣するミモトープまたはメディトープを含むエピトープ様抗体結合ペプチド等、などのアプタマーおよび小分子を含み得る。

本明細書で「メディトープ」は、不変および可変ドメインの間の界面の空洞における結合によって抗体を特異的に認識するペプチドを指す。メディトープの例は、例えば、Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ.，２０１８，９０，３５９２）にて開示されている。

任意選択的に、エピトープは、検出する生物分子（例えば抗体）に基づいて変化する。例えば、抗ＨＩＶ−ｐ１７抗体の検出では、２つのエピトープが、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され得る。代替として、トラスツズマブの検出では、２つのエピトープはミモトープを含み得、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され得る。さらに代替として、セツキシマブの検出では、２つのエピトープはメディトープを含み得、配列番号２３もしくは配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２３もしくは配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され得る。またさらに代替として、抗Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）抗体の検出では、２つのエピトープは、配列番号１７（抗ＣＲＰ１６９抗体を検出するための）もしくは配列番号１８（抗ＣＲＰ３６抗体を検出するための）のアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択され得る。

本発明のこの第１の態様では、本発明は、生体外の生物分子検出方法にさらに関する。該生物分子検出方法は、
サンプルを本発明の第１の態様のバイオセンサーと接触させるステップと；
サンプルの存在下でバイオセンサーの発光の変化を決定するステップと；

生物分子の定量的なおよび／または定性的な存在または非存在に対する、サンプルの存在下での発光変化を決定するステップと、を含む。

任意選択的に第１のルシフェラーゼドメインに結合している第３のルシフェラーゼドメインとさらに組み合わせて、相互作用する第１のおよび第２のルシフェラーゼドメインを有するバイオセンサーを提供することによって、本発明の方法は、生物分子の定量的なおよび／または定性的な存在または非存在を定めるために、サンプルの存在下での発光変化を決定する可能性をもたらす。

任意選択的に、本発明は、生物分子の非存在下で、バイオセンサーは、第１のルシフェラーゼドメインの少なくとも一部が第２のルシフェラーゼドメインを補完する生物分子がない（閉鎖した）状態にある方法に関する。フルオロフォアが第２のルシフェラーゼドメインの次にある場合、生物分子がない状態で、フルオロフォアは、第１のルシフェラーゼドメインおよび第２のルシフェラーゼドメインによって形成された相補ルシフェラーゼに接近している。

任意選択的に、本発明は、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが変化するように、生物分子の存在下で、バイオセンサーの結合ドメインと生物分子との間の結合が、バイオセンサーの生物分子がない（閉鎖した）状態とバイオセンサーの生物分子と複合化した（開いた）状態との間の平衡を変化させる方法に関する。フルオロフォアが第２のルシフェラーゼドメインの次にある場合、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが、生物分子がない状態のバイオセンサーと比較して生物分子と複合化した状態を減少させる。

本発明の第２の態様では、第１の結合ドメインは生物分子と抱合したシステムを形成するように構成されている。そのような構成では、第２の結合ドメインが生物分子のリガンド結合部位に結合するように構成されている。任意選択的に、生物分子はバイオセンサーの第１の結合ドメインに共役結合している。さらに任意選択的に、生物分子は、抗体のＦＣ領域がバイオセンサーの第１の結合ドメインに共役結合する抗体を含む。

本明細書で「複合体システム」、「抱合」、「複合体結合」および同種のものは、本発明のバイオセンサーおよび生物分子の結合状態を指し、バイオセンサーと生物分子との間の親和性は、分析されるサンプル中に存在する生物分子およびいずれの他の成分へのリガンド結合がバイオセンサーと生物分子との間に形成される抱合の結合と競合しないように選択される。必ずしもではないが、好ましくは、バイオセンサーと生物分子との間の複合体結合は共有結合である。しかしながら、バイオセンサーと生物分子との間の複合体結合は、バイオセンサーと生物分子との間の親和性が、バイオセンサー（第２の結合ドメイン）と生物分子のリガンド結合部位との間の親和性と比較して十分に高いように選択され得る。

本明細書で「リガンド結合部位」は、生物分子特異的なリガンド（例えば小分子またはタンパク質ベースのバイオマーカー等）への結合に適した生物分子の一部を指す。さらに、リガンド結合部位は、本発明のバイオセンサーの第２の結合ドメイン（競合結合）に結合する。

任意選択的に、生物分子のリガンド結合部位は抗体の抗原結合部位を含む。

本発明の第１の態様と同様に、本発明の第２の態様では、本発明の第２のバイオセンサーの結合ドメインは、生物分子と結合する、すなわち生物分子の結合部位のうちの一つに競合して結合するように構成され得る。第２の結合ドメインは、生物分子の１つ以上の結合部位とある親和性を有するいずれの種類の結合ドメインであってもよいが、エピトープである結合ドメインの使用が好ましい。

この本発明の第２の態様では、本発明は、生体外のリガンド検出方法にさらに関する。該方法は、
サンプルを本発明の第２の態様のバイオセンサーと接触させるステップと、
サンプルの存在下でバイオセンサーの発光の変化を決定するステップと、
リガンドの定量的なおよび／または定性的な存在または非存在に対する、サンプルの存在下でサンプルの発光変化を決定するステップと、を含む。

任意選択的に、本発明は、リガンドの非存在下で、生物分子が、第２のルシフェラーゼドメインと第１のルシフェラーゼドメインとの相互作用を破壊する第２の結合ドメイン に結合する方法に関する。フルオロフォアが第２のルシフェラーゼドメインの次にある場合、生物分子と複合化した状態で、フルオロフォアは、第１のルシフェラーゼドメインおよび第３のルシフェラーゼドメインによって形成される相補ルシフェラーゼに接近せず、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の低いＢＲＥＴを生じる。

任意選択的に、本発明は、リガンドの存在下で、バイオセンサーが、第１のルシフェラーゼドメインの少なくとも一部が第２のルシフェラーゼドメインを補完することを可能にするリガンド複合化状態にある方法に関する。フルオロフォアが第２のルシフェラーゼドメインの次にある場合、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが、生物分子と複合化した状態のバイオセンサーと比較して、リガンドが結合した状態を増加させる。

本発明の第３の態様では、本発明は、本発明のバイオセンサー（本発明の第１のおよび第２の態様の両方）を含むパーツキットに関し、バイオセンサーは、２つの結合ドメインを含む半柔軟なリンカーを介して第２のルシフェラーゼドメインに融合した第１のルシフェラーゼドメインをリンカーの末端に含み、パーツキットは第３のルシフェラーゼドメインをさらに含む。

任意選択的に、パーツキットは少なくともバイオセンサーと第３のルシフェラーゼドメインとを含む溶液の形態である。さらに任意選択的に、第３のルシフェラーゼドメインの濃度は溶液に存在するバイオセンサーの濃度と比較して顕著に高い。

任意選択的に、パーツキットは、バイオセンサーおよびそれに結合した第３のルシフェラーゼドメインと共に不活性物質を含む。不活性物質は、溶液中の生物分子またはリガンドを検出する意図した目的に適したいずれの種類の材料であってもよい。本発明のバイオセンサーと第３のルシフェラーゼドメインとの連結の構成は、第３のルシフェラーゼドメインが、バイオセンサーの第１のルシフェラーゼドメインの結合部位に接近するものであり得る。

図１Ａは、ＢＲＥＴ効率の変化を生じるスプリットルシフェラーゼ断片の間の分子内複合体の抗体誘導崩壊に基づく抗体センサーを示す図である。センサーはフルオロフォア（星）で標識されている。半柔軟なリンカーにおけるエピトープへの抗体の結合はフルオロフォアおよびルシフェラーゼを引き離し、赤色から青色へ発光色を変化させる。図１ＢはＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１のセンサー配列の概略構造を示す図である。 図２Ａは、１．２５ｎｍ抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の非存在下（赤線；黒丸）および存在下（青線；黒四角）での１ｐＭセンサーの発光スペクトルを示す図である。（Ｂ）１ｐＭのセンサー濃度での抗体価測定。エラーバーは平均±ＳＤを表す（ｎ＝３）．図２Ｂは１ｐＭのセンサー濃度での抗体価測定を示す図である。エラーバーは平均±ＳＤを表す（ｎ＝３）。 図３Ａは、１．２５ｎｍ抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の１ｐＭセンサー非存在下（赤線；黒丸）および存在下（青線；黒四角）での発光スペクトルおよび１ｐＭのセンサー濃度での抗体価測定を含むＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２、−３、−４のキャラクタリゼーションを示す図である。図３Ｂは、１．２５ｎｍ抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の１ｐＭセンサー非存在下（赤線；黒丸）および存在下（青線；黒四角）での発光スペクトルおよび１ｐＭのセンサー濃度での抗体価測定を含むＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−５、−６、−７（図３Ｂ）のキャラクタリゼーションを示す図である。エラーバーは平均±ＳＤを表す（ｎ＝２）。 １００ｐＭセンサー１μＭトラスツズマブの非存在下（赤線；黒丸）および存在下（青線；黒四角）での発光スペクトルおよび１００ｐＭのセンサー濃度での抗体価測定を含むＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＳＡＢＳ−１、−２および−３のキャラクタリゼーションを示す図である。エラーバーは平均±ＳＤを表す（ｎ＝３）。 原理上いずれのリガンドのレシオメトリック生物発光検出を可能にするｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳセンサーを示す図である。図５Ａは、タンパク質バイオマーカーの例としてＣＲＰの検出を示す図である。図５Ｂは、小分子の検出を示す図である。検出は、リガンド特異的な生物分子（例えばモノクローナル抗体）に対する、ペプチドエピトープ（図５Ａ）または小分子のアナログ（図５Ｂ）とリガンドとの分子間結合の間の競合に基づく。図５Ｃは、精製のためにＮ末端のＨｉｓタグおよびＣ末端のストレプトアビジンタグを有するｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターの概略図である。 ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳバリアントのキャラクタリゼーションを示す図である。８．３μＭセツキシマブの非存在下（赤線；黒丸）および存在下（青線；黒四角）での１００ｐＭセンサーのルミネセンススペクトル。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中１００ｐＭのセンサーに対する抗体価測定。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。赤線（黒丸）は、等式１への適合を示す。 小分子メトトレキサートの検出のためのＭＴＸ−ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳを示す図である。 図８Ａは、０．８ｍＭ未精製ペプチド１７の存在下および非存在下での２ｎＭ ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１７の発光スペクトルを示す図である。図８Ｂは、ペプチド１７の濃度を増加させたときの２ｎｍ ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−エピトープ１７の発光率を示す図である。

本発明内で、スプリットルシフェラーゼの分子内相補性を用いて、溶液中の生物分子（または抗体などの分析の標的）の直接的な一段階検出を可能にする新しいアプローチを提示する。センサー設計は、大きいルシフェラーゼ断片に融合した大きいルシフェラーゼ断片を含む高分子である。１つの小さいルシフェラーゼ断片は、大きいルシフェラーゼ断片の１つの末端に柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介して融合されている。別の小さいルシフェラーゼ断片は、大きいルシフェラーゼ断片の残りの末端にリンカーの末端に２つの抗体結合エピトープを含む半柔軟なリンカーを介して融合されている。このタンパク質スイッチは２つの構造で存在でき、Ｎ末端またはＣ末端の小さい断片のいずれかがラージスプリットルシフェラーゼドメインに結合し、ルシフェラーゼ活性を補完する。蛍光受容体染料（「フルオロフォア」とも称される）が次に２つの小さいルシフェラーゼドメインのうちの１つに結合し、２つの構造のうちの１つのみにおいて効率的なＢＲＥＴを生じる。半柔軟なリンカーをフランキングする２つのエピトープ配列への抗体の二価結合が、蛍光標識小さいルシフェラーゼドメインの相互作用を破壊し、蛍光標識がない小さいルシフェラーゼ断片によるルシフェラーゼ活性の相補を可能にし、単純な発光の読み取りを用いてモニターできるルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴの低下を生じる。標的例として抗ＨＩＶ１ ｐ１７抗体を用いて、スプリットルシフェラーゼ断片の分子内親和性を最適化して、標的抗体のｐＭ濃度（Ｋ_ｄ＝１０ｐＭ）の存在下で、ダイナミックレンジが４９３％に到達した生物発光センサーを得た。完全に異なる抗体を標的にするセンサーが、エピトープ配列を単純に置換することによって得ることができ、このセンサーの性能をスプリット部の分子内親和性をチューニングすることによってさらにカスタマイズできる可能性がある。

本発明は、バイオセンサーが生物分子（例えば抗体、抗原、タンパク質等）を検出するのに使用される検出方法に関する。特に、本発明は、バイオセンサーが抗体を検出するのに使用される検出方法に関する。バイオセンサーは、リンカーの末端に２つのエピトープを有する半柔軟なリンカーおよび柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介して２つのスモールスプリットルシフェラーゼ断片に結合したラージスプリットルシフェラーゼ断片である。

これらのリンカーの正確な長さおよび内容は、バイオセンサーそれ自体の立体構造および構成に依存することに留意すべきである。半柔軟なリンカーおよび柔軟なリンカーの両方とも、分子内相補を可能にするのに十分な長さであり、かつ十分に柔軟であるべきである。ここで、バイオセンサー特異的なシステムをさらに最適化するようにリンカーの柔軟性は変化し得る。

本発明の一実施形態では、生体外の抗体−検出方法が提供される。該方法は、サンプルをバイオセンサーと接触させるステップを必然的に伴う。バイオセンサーは、１つの大きいルシフェラーゼ断片と、２つの小さいルシフェラーゼ断片と、少なくとも１つの蛍光受容体染料と、柔軟なＧＧＳ反復リンカーと、抗体に対する親和性を有する２つのエピトープを含む半柔軟なリンカーとを含む。該方法は、サンプルの存在下でバイオセンサーの発光の変化を決定するステップと、サンプルの存在下での発光変化を抗体の定量的なまたは定性的な存在または非存在に帰するステップとをさらに必然的に伴う。抗体の非存在下で、バイオセンサーは、ラージスプリットルシフェラーゼ断片の少なくとも一部が２つのエピトープを含む半柔軟なリンカーを介して接続されているスモールスプリットルシフェラーゼ断片を補完し、フルオロフォアが相補ルシフェラーゼの近くに間隔を空けている（接近している）抗体がない状態（閉じた状態）である。言い換えると、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の比較的高いＢＲＥＴがあり、バイオセンサーは、ルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）の比較的高いルミネセンス発光率を示す。抗体に存在する２つの抗原結合ドメインと半柔軟なリンカーの末端に存在する２つのエピトープとの間の二価結合が、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが減少するようにバイオセンサーの抗体がない状態と抗体複合化状態（開いた状態）との間の平衡を変化させ、バイオセンサーは、青色光に対する赤色の比較的低いルミネセンス発光率を示す。

生体外の抗体−検出方法も説明する。この方法では、サンプルが、抗体がない（閉鎖した）状態と抗体複合化（開いた）状態との間で置換可能なバイオセンサーと接触する。バイオセンサーは、３つのスプリットルシフェラーゼ（限定されないが、例えばＮａｎｏＬｕｃ）断片と、抗体に対する親和性を有する２つのエピトープと、少なくとも１つのフルオロフォアと（限定されないが、例えばＣｙ３）、２つのエピトープを隔てる半柔軟なリンカーと、柔軟なＧＧＳ反復リンカーとを含む。この方法は、サンプルの存在下でルシフェラーゼおよびフルオロフォアの発光を決定するステップと、サンプルの存在下でのルシフェラーゼおよびフルオロフォアの発光を抗体の定量的なまたは定性的な存在または非存在に帰するステップとをさらに伴う。抗体がない（閉鎖した）状態で、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の高いＢＲＥＴ、およびルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）の高いルミネセンス発光率がある。２つのエピトープへの抗体の結合が、バイオセンサーの抗体がない状態と抗体複合化状態との間の平衡を変化させ、それによって、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが減少し、青色光に対する赤色の低いルミネセンス発光率が見られるように、抗体がない状態から抗体複合化状態へバイオセンサーを駆動する。

生物分子がない（閉鎖した）状態と生物分子複合化（開いた）状態との間で置換可能なバイオセンサーも説明する。バイオセンサーは、ラージスプリットルシフェラーゼ断片と、２つのスモールスプリットルシフェラーゼ断片と、少なくとも１つのフルオロフォアと、２つのエピトープと、２つのエピトープを隔てる半柔軟なリンカーと、柔軟なＧＧＳ反復リンカーとを含む。

本明細書で「置換可能な」は、バイオセンサーが異なる構造（状態）を有するのに適していることを指す。バイオセンサーの置換性は、スモールスプリットルシフェラーゼ断片がラージスプリットルシフェラーゼ断片に自由に結合すること、またはラージスプリットルシフェラーゼ断片の結合部位から特定の距離に自由に位置することに関し、ここで、距離は、各スモールスプリットルシフェラーゼ断片に融合したリンカー（半柔軟なまたは柔軟なリンカー）によって決定される。

任意選択的に、抗体の非存在下で、バイオセンサーは閉じた状態である。さらに任意選択的に、抗体の非存在下で、バイオセンサー閉じた状態であり、それによって、大きいルシフェラーゼ断片の少なくとも一部が２つのエピトープを含むリンカーを介して接続した小さいルシフェラーゼ断片を補完し、フルオロフォアが相補ルシフェラーゼの近くに間隔を空けている。さらに任意選択的に、閉じた状態で、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の高いＢＲＥＴ、およびルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）の高いルミネセンス発光率があるように、フルオロフォアが相補ルシフェラーゼの近くに間隔を空けている。

任意選択的に、２つのエピトープへの抗体の結合は、バイオセンサーの閉鎖した（抗体がない）と開いた（抗体が結合した）状態との間の平衡を変化させ、それによって、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが減少し、ルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）の低いルミネセンス発光率が見られるように、閉じた状態から開いた状態へバイオセンサーを駆動する。

任意選択的に、抗体の存在下で、バイオセンサーは開いた状態である。さらに任意選択的に、抗体の存在下で、前記抗体に存在する２つの抗原結合ドメインと、バイオセンサーのリンカーの末端に存在する２つのエピトープとの間の二価結合が、バイオセンサーを開いた状態に駆動する。さらに任意選択的に、開いた状態で、フルオロフォアが相補ルシフェラーゼから離れて間隔を空けており、それによって、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴおよびルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）のルミネセンス発光率の低下を生じる。

任意選択的に、ルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）のルミネセンス発光率は抗体の定量的なまたは定性的な存在または非存在に比例する。

任意選択的に、ラージおよびスモールスプリットルシフェラーゼ断片は、生物発光複合体へ自己組織化可能であるタンパク質ドメインまたはポリペプチドである。任意選択的に、スプリットルシフェラーゼ断片はスプリットＮａｎｏＬｕｃ断片である。

任意選択的に、ラージスプリットルシフェラーゼ断片は配列番号１９のアミノ酸配列、または配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。

任意選択的に、スモールスプリットルシフェラーゼ断片のそれぞれは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３からなるアミノ酸配列、または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列の群から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、ラージスプリットルシフェラーゼ断片に対する２つのスモールスプリットルシフェラーゼ断片の親和性は異なる。好ましくは、２つのエピトープに挟まれた半柔軟なリンカーを介してラージスプリットルシフェラーゼ断片に融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片は、柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介してラージスプリットルシフェラーゼ断片に融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片の親和性と比較してより高い親和性を有する。

任意選択的に、２つのエピトープに挟まれた半柔軟なリンカーを介してラージスプリットルシフェラーゼ断片に融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片の親和性は、柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介してラージスプリットルシフェラーゼ断片に融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片の親和性と比較して、少なくとも５倍高い、好ましくは１０〜１５００倍高い、１０〜１０００倍高い、１０〜１００倍高いまたは１０〜５０倍高い親和性を有する。

任意選択的に、２つのエピトープは、抗体、任意選択的に抗体の抗原結合断片に結合できる、任意選択的に結合できるポリペプチドまたはポリペプチド断片である。

任意選択的に、半柔軟なリンカーは、（ＧＳＧ）_６の少なくとも１つの柔軟なブロックを含むポリペプチドまたはポリペプチド断片である。さらに任意選択的に、リンカーは、少なくとも１つのαヘリックスブロックをさらに含む。さらに任意選択的に、リンカーは、６個のＥＡＡＡＫ反復を有する少なくとも１つのαヘリックスブロックをさらに含む。さらに任意選択的に、リンカーは、それぞれ６個のＥＡＡＡＫ反復を有する２つのαヘリックスブロックをさらに含む。一般に、半柔軟なリンカーが、バイオセンサーの状態を変化させる、すなわち、半柔軟なリンカーに融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片ラージスプリットルシフェラーゼ断片に結合している生物分子標的がない状態から、半柔軟なリンカーの両側に配置されているエピトープが生物分子の１つ以上の結合部位（例えば抗体の抗原結合部位）に結合している生物分子と複合化した状態へ変化させるのに十分な柔軟性をリンカーが有するように選択されることに留意すべきである。

任意選択的に、それぞれのエピトープは、半柔軟なリンカーの各末端に位置している。さらに任意選択的に、ラージスプリットルシフェラーゼ断片およびスモールスプリットルシフェラーゼ断片のうちの１つは、リンカーの各末端に位置している。さらに最適に、第１のエピトープおよびラージスプリットルシフェラーゼ断片は、リンカーの第１の末端に位置し、第２のエピトープおよびスモールスプリットルシフェラーゼ断片は、リンカーの第２の、反対方向の末端に位置している。

任意選択的に、柔軟なリンカーは、少なくとも１０個のＧＧＳ反復を含むポリペプチドまたはポリペプチド断片である。しかしながら、ＧＧＳ反復の数は変動し得ることに留意すべきである。リンカーの内容も変動し得、ＧＧＳ反復の使用に必ずしも制限されない。リンカーの内容および長さは、に依存するラージスプリットルシフェラーゼ断片の構成、およびラージスプリットルシフェラーゼ断片への柔軟なリンカーに融合したスモールスプリットルシフェラーゼ断片の結合位置（ラージスプリットルシフェラーゼ断片のどの末端が、柔軟なリンカーの結合に使用されるかに依存する）。

任意選択的に、フルオロフォアは光励起により赤色光を発することができる蛍光化学的な化合物である。さらに任意選択的に、フルオロフォアはＣｙ３である。

任意選択的に、フルオロフォアはバイオセンサーに結合されている。さらに任意選択的に、フルオロフォアは、半柔軟なリンカーを介して接続するスモールスプリットルシフェラーゼ断片に隣接してバイオセンサーに結合されている。さらに任意選択的に、フルオロフォアは、半柔軟なリンカーとスモールスプリットルシフェラーゼ断片との間でバイオセンサーに結合されている。代替として、フルオロフォアは、柔軟なリンカーを介して接続するスモールスプリットルシフェラーゼ断片に隣接してバイオセンサーに結合されている。そのような別の構成では、抗体がない状態で、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが減少し、ルシフェラーゼ（例えば青色光）に対するフルオロフォア（例えば赤色光）の低いルミネセンス発光率が見られる一方で、抗体複合化状態では、次に柔軟なリンカーを介してスモールスプリットルシフェラーゼ断片に接続するフルオロフォアは、相補ルシフェラーゼに接近して、相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴが増加することに留意すべきである。

本発明の一実施形態では、フルオロフォアは、バイオセンサーにおけるシステインの遊離チオール基へのマレイミドカップリングを介して組み込まれる。任意選択的に、フルオロフォアは、バイオセンサーにおけるシステインの遊離チオール基マレイミドカップリングを介して、スモールスプリットルシフェラーゼ断片と半柔軟なリンカーとの間でバイオセンサーに組み込まれる。すなわち、バイオセンサーにおけるフルオロフォアの位置、すなわち半柔軟なリンカーとスモールスプリットルシフェラーゼ断片との間の前および／またはスモールスプリットルシフェラーゼ断片の後の位置は、バイオセンサーのアミノ酸配列におけるシステインの導入によって制御される。

本発明の別の実施形態では、フルオロフォアは、バイオセンサーにおける非カノニカルアミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）のアジド基へのアルキンカップリングを介してバイオセンサーに組み込まれる。任意選択的に、フルオロフォアは、バイオセンサーにおけるｐ−アジドフェニルアラニンのアジド基へのアルキンカップリングを介して、スモールスプリットルシフェラーゼ断片と半柔軟なリンカーとの間でバイオセンサーに組み込まれる。任意選択的に、アンバー停止コドン（タグ）を用いてｐ−アジドフェニルアラニンはバイオセンサーに望ましい位置で双直交に組み込まれた。すなわち、バイオセンサーにおけるフルオロフォアの位置、すなわち半柔軟なリンカーとスモールスプリットルシフェラーゼ断片との間の前および／またはスモールスプリットルシフェラーゼ断片の後は、バイオセンサーのアミノ酸配列におけるアンバー停止コドン（タグ）の導入によって制御される。

抗体の検出に加えて、本発明のバイオセンサー並びに本発明の検出方法は、他の生物分子の検出に等しく適用できる。例えば、競合様式でセンサーを用いることで、抗原、小分子および他のバイオマーカー（例えばＣ反応性タンパク質）の検出が可能になる。

また、本発明内で、スプリットルシフェラーゼの分子内相補性を用いて、溶液中の小分子、タンパク質ベースのバイオマーカー等の直接的な一段階検出が可能となり、バイオセンサーは生物分子（例えば抗体、抗原、タンパク質、アプタマー等）に結合しており、生物分子が、リガンド（例えば小分子、タンパク質ベースのバイオマーカー等）を結合する結合部位を含む新しいアプローチを提示する。バイオセンサーは、リンカー、例えば第１の末端と第２の末端とを含む本発明の半柔軟なリンカーを含む高分子であり、リンカーの第１の末端は、本発明の大きい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第１のルシフェラーゼドメインの１つの末端に、第１の結合ドメインを介して融合されており、リンカーの第２の末端は、本発明の小さい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第２のルシフェラーゼドメインに、第２の結合ドメインを介して融合されている。バイオセンサーは、任意選択的に、スペーサー、例えば本発明の柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介して第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合した、本発明の小さい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第３のルシフェラーゼドメインを含んでもよい。第１の結合ドメインは、生物分子と抱合したシステム（例えば抗体）を形成するように構成されている一方で、第２の結合ドメインは、生物分子のリガンド結合部位（例えば抗体の抗原結合部位）に結合するように構成されている。バイオセンサーは２つの構造で存在し、第２のルシフェラーゼドメインまたは、存在する場合、第３のルシフェラーゼドメインのいずれかが、相補ルシフェラーゼを形成するように第１のルシフェラーゼドメインに結合し、ルシフェラーゼ活性を補完する。さらに、蛍光受容体染料（フルオロフォア）が第２のまたは第３のルシフェラーゼドメインのうちの１つの次に、例えば本発明の２つの小さいルシフェラーゼドメインのうちの１つに結合し、２つの構造のうちの１つのみにおいてルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の効率的な生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が生じる。

リガンド（例えば小分子またはタンパク質ベースのバイオマーカー）の非存在下で、生物分子は第１の結合ドメインに結合し、生物分子のリガンド結合部位は、第２のルシフェラーゼドメインと第１のルシフェラーゼドメインとの相互作用を破壊する第２の結合ドメインに結合し、それ故に、第３のルシフェラーゼドメイン（存在する場合）と第１のルシフェラーゼドメインとの相互作用を可能にする。第２のルシフェラーゼドメインが蛍光標識ルシフェラーゼドメインである場合、蛍光標識がない第３のルシフェラーゼドメインによるルシフェラーゼ活性の相補が、単純な発光の読み取りを用いてモニターできる相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴの低下を生じる。代替として、第３のルシフェラーゼドメインが蛍光標識ルシフェラーゼドメインである場合、蛍光標識第３のルシフェラーゼドメインによるルシフェラーゼ活性の相補は、単純な発光の読み取りを用いてモニターできる相補ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴの増加を生じる。

リガンドの存在下で、第２のバイオセンサーの結合ドメインへの生物分子（例えば抗体）の結合が破壊され、第２のルシフェラーゼドメインが第１のルシフェラーゼドメインと相互作用できるようにする。第２の結合ドメインが蛍光標識ルシフェラーゼドメインである場合、蛍光標識第２のルシフェラーゼドメインによるルシフェラーゼ活性の相補が、単純な発光の読み取りを用いてモニターできるルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴの増加を生じさせる。

本発明の一実施形態では、抗体が結合したバイオセンサーが提供される。抗体が結合したバイオセンサーは、リンカー、例えば第１の末端と第２の末端とを含む本発明の半柔軟なリンカーを含み、リンカーの第１の末端は、本発明の大きい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第１のルシフェラーゼドメインの１つの末端に、抗体抱合結合ドメインを介して、融合されており、リンカーの第２の末端は、本発明の小さい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第２のルシフェラーゼドメインに、抗体結合エピトープを介して融合されている。バイオセンサーは任意選択的に、スペーサー、例えば本発明の柔軟なＧＧＳ反復リンカーを介して第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合した、本発明の小さい（スプリット）ルシフェラーゼドメインなどの第３のルシフェラーゼドメインを含み得る。抗体抱合結合ドメインは、抗体と抱合したシステム形成するように構成されている一方で、抗体結合エピトープは、抗体の結合部位（例えば抗体のパラトープのうちの１つ）に結合するように構成されている。バイオセンサーは２つの構造で存在し、第２のルシフェラーゼドメインまたは第３のルシフェラーゼドメインのいずれか（第１のルシフェラーゼドメインに結合しているか、または、例えば、抗体が結合したバイオセンサーを含む溶液中で成分として存在する）が、相補ルシフェラーゼを形成するように第１のルシフェラーゼドメインに結合し、ルシフェラーゼ活性を補完する。さらに、蛍光受容体染料（フルオロフォア）が第２のまたは第３のルシフェラーゼドメインのうちの１つの次に、例えば本発明の２つの小さいルシフェラーゼドメインのうちの１つに結合して、２つの構造のうちの１つのみにおいてルシフェラーゼとフルオロフォアとの間の効率的な生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が生じる。好ましくは、フルオロフォアが次に第２のルシフェラーゼドメインに結合する。

任意選択的に、第１の結合ドメインまたは抗体抱合結合ドメインは、抗体ＦＣ領域親和性リガンドを含む。抗体ＦＣ領域親和性リガンドは、（天然の）イムノグロブリン結合タンパク質、イムノグロブリン由来生成物（設計されたイムノグロブリン結合タンパク質など）、人工結合タンパク質、（短い）ペプチド、アプタマーおよび合成小分子量化合物からなる群から選択され得る。そのような抗体ＦＣ領域親和性リガンドの例は、例えばＫｒｕｌｊｅｃら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１７，２８，２００９）によって説明されている。任意選択的に、第１の結合ドメインまたは抗体抱合結合ドメインはイムノグロブリン結合タンパク質である。さらに任意選択的に、第１の結合ドメインまたは抗体抱合結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するプロテインＧ由来ドメインである。

本明細書で「抗体ＦＣ領域親和性リガンド」は、少なくとも抗体のＦＣ領域結合部位に対して親和性を有するリガンドを指す。好ましくは、本発明の抗体ＦＣ領域親和性リガンドは、同じ抗体の別の結合部位、例えばＦａｂ領域結合部位に対するリガンドの親和性と比較して、抗体のＦＣ領域結合部位に対するより高い親和性を有する。

任意選択的に、第２の結合ドメインが、リガンド特異的な抗体の抗原結合部位に対して、第２の結合ドメインの分子間結合とリガンド（例えば小分子またはタンパク質ベースのバイオマーカー）との間に競合をもたらすように構成されている。したがって、第２の結合ドメインは、エピトープを含む抗体抗原結合部位リガンド、メディトープ、ミモトープ、人工結合タンパク質、（短い）ペプチド、低分子量アナログおよび同種のものからなる群から選択され得る。好ましくは、第２の結合ドメインは抗体結合エピトープまたは抗体結合低分子量アナログを含む。

本明細書で「抗体抗原結合部位リガンド」は、少なくとも抗体の抗原結合部位に対する親和性を有するリガンドを指す。好ましくは、本発明の抗体抗原結合部位リガンドは、同じ抗体の別の結合部位、例えばＦａｂ領域またはＦＣ領域結合部位に対するリガンドの親和性と比較して、より高い抗体の抗原結合部位に対する親和性を有する。本発明の抗体抗原結合部位リガンドと所定の被検物質（例えば小分子またはタンパク質ベースのバイオマーカー）との間に競合をもたらすために、抗体の抗原結合部位へのリガンドの結合は可逆的である。

任意選択的に、第２の結合ドメインはエピトープに結合する抗体である。例えば、抗体結合エピトープは、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３および配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３もしくは配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列の群から選択され得る。

任意選択的に、フルオロフォアは光励起により赤色光を発することができる蛍光化学的な化合物である。さらに任意選択的に、フルオロフォアはＣｙ３である。

任意選択的に、フルオロフォアはバイオセンサーに結合されている。さらに任意選択的に、フルオロフォアは第２のルシフェラーゼドメインに隣接してバイオセンサーに結合されている。さらに任意選択的に、フルオロフォアは、リンカーと第２のルシフェラーゼドメインとの間でバイオセンサーに結合されている。

本発明の一実施形態では、フルオロフォアは、バイオセンサーにおけるシステインの遊離チオール基へのマレイミドカップリングを介してバイオセンサーに組み込まれる。任意選択的に、フルオロフォアは、第２のルシフェラーゼドメインとリンカーとの間でバイオセンサーにおけるシステインの遊離チオール基へのマレイミドカップリングを介してバイオセンサーに組み込まれる。すなわち、バイオセンサーにおけるフルオロフォアの位置、すなわち、リンカーと第２のルシフェラーゼドメインとの間の前および／または第２のルシフェラーゼドメインの後は、バイオセンサーのアミノ酸配列におけるシステインの導入によって制御される。

本発明の別の実施形態では、フルオロフォアは、バイオセンサーにおける非カノニカルアミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）のアジド基へのアルキンカップリングを介してバイオセンサーに組み込まれる。任意選択的に、フルオロフォアは、第２のルシフェラーゼドメインとリンカーとの間に、バイオセンサーにおけるｐ−アジドフェニルアラニンのアジド基へのアルキンカップリングを介してバイオセンサーに組み込まれる。任意選択的に、ｐ−アジドフェニルアラニンは、アンバー停止コドン（タグ）を用いて、バイオセンサーに望ましい位置で双直交に組み込まれる。すなわち、バイオセンサーにおけるフルオロフォアの位置、すなわち、リンカーと第２の結合ドメインとの間の前および／または第２の結合ドメインの後は、バイオセンサーのアミノ酸配列におけるアンバー停止コドン（タグコドン）の導入によって制御される。

任意選択的に、フルオロフォアは、第２の結合ドメインの一部である。特に第２の結合ドメインが、バイオセンサーの第１の結合ドメインに結合した抗体の抗原結合部位に結合するための小分子アナログを含む場合、小分子アナログは、フルオロフォアを介してリンカーに融合し得る。

例えば、第２の結合ドメインは、化学療法薬メトトレキサート（ＭＴＸ）を検出するためのメトトレキサートアナログからなる群から選択される小分子アナログを含み得る。好ましくは、フルオロフォアは、フルオロフォアを介してバイオセンサーにおけるシステインにメトトレキサートアナログを結合するのに使用される（図７）。

バイオセンサーは、１つのラージスプリットルシフェラーゼ断片（ＬＢｉＴ）と、２つのスモールスプリットルシフェラーゼ断片（ＳＢｉＴ１およびＳＢｉＴ２）と、合成フルオロフォアとを含み得る。ＬＢｉＴは、長い半柔軟なリンカーを介してＳＢｉＴ２に接続されており、フルオロフォアはＳＢｉＴ２に隣接して導入され、生物発光複合体とフルオロフォアとの間の効率的なＢＲＥＴで、その標的抗体の非存在下で相補生物発光複合体を形成する（図１）。所望の抗体に特異的なペプチドエピトープには、半柔軟なリンカーが含まれており、１つはＬＢｉＴの次にあり、残りはＳＢｉＴ２に隣接している。ＬＢｉＴの残りの末端は短い柔軟なリンカーを介してＳＢｉＴ１に融合されている。両方のエピトープへの単一抗体の結合は、相補生物発光複合体を分離し、フルオロフォアを押しのける。他方で、ＬＢｉＴは、短い柔軟なリンカーを介して連結したＳＢｉＴ１と共に集まり、生物発光複合体を形成する。これは、生物発光複合体とフルオロフォアとの間のＢＲＥＴ効率の低下を生じる。

代替として、バイオセンサーは、Ｌａｒｇｅ Ｂｉｔ（ＬＢｉＴ）の次に半柔軟なリンカーに含まれるプロテインＧを通じて抗体のＦＣ領域に結合できる（図５）。プロテインＧを通じてバイオセンサーに結合した抗体の抗原結合部位は、ＳｍａｌｌＢｉｔ２（ＳＢｉＴ２）に隣接して半柔軟なリンカーに含まれるペプチドエピトープ（図５Ａ）または小分子アナログ（図５Ｂ）に結合する。バイオセンサーに結合した抗体の抗原結合部位への所望の被検物質（例えば小分子またはタンパク質バイオマーカー）の結合は、ＳｍａｌｌＢｉｔ２（ＳＢｉＴ２）が、フルオロフォアをＬａｒｇｅ Ｂｉｔ（ＬＢｉＴ）に接近させる相補生物発光複合体を形成できるようにする。これは、生物発光複合体とフルオロフォアとの間のＢＲＥＴ効率の増加を生じさせる。

本発明の技術の実現可能性は、スプリットＮａｎｏＬｕｃを用いて実証された。ＬＢｉＴとＳＢｉＴとの間の親和性は、大きいシグナル変化での特異的な抗体のｐＭ濃度の検出、または大きいシグナル変化での小分子またはタンパク質バイオマーカーのｍＭ濃度の検出を可能にする単一タンパク質生物発光センサーを得るように調節された。また、これらのセンサーのモジュール方式は、エピトープ配列の単純な交換による標的特異性の変化、およびＳＢｉＴ断片の相対親和性のセンサー応答のチューニングによる系統的なチューニングを可能にする。

センサー設計
図１は、センサーの一般的な設計を示す。この例では、スプリットＮａｎｏＬｕｃが、相補複合体が青色発光であり、ＳＢｉＴバリアントの多様性がＬＢｉＴに対する０．７ｎＭ〜１９０μＭの親和性で利用可能であることから相補性レポーターとして選択された（Ｄｉｘｏｎ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１６，１１，４００；配列番号１９）。

典型的な設計において、抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の検出のためのセンサーの開発に焦点を置いた。いくつかのよく特徴付けられた直線のエピトープ配列がこの抗体に利用可能であり、新しい均質の抗体検出アッセイの開発にとってよく知られている選択肢である。ＬＢｉＴとＳＢｉＴ１との間のリンカーは、（ＧＧＳ）_１０の柔軟なブロックを有する。ＬＢｉＴとＳＢｉＴ２との間のリンカーは、最初に、（ＧＳＧ）_６の３つの柔軟なブロックおよびそれぞれ６個のＥＡＡＡＫ反復を有する２つのαヘリックスブロック（配列番号２０）によって分けられるＨＩＶ１−ｐ１７−抗体に特異的な２つのエピトープ（配列番号４、Ｋ_ｄ＝４２ｎｍ）を有する。また、リンカーは、同じスイッチング戦略に基づくいくつかの報告されたセンサータンパク質でも使用された（Ｇｏｌｙｎｓｋｉｙ，ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１０，１１，２２６４； Ｂａｎａｌａ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，２１２； Ａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８，４５２５； Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．８ｂ０００４１； ａｎｄ Ａｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｅｎｓ．，２０１７，２，１７３０参照）。１個のシステイン残基が、フルオロフォア抱合のためのＳＢｉＴ２に隣接して含まれる。

１つのバリアント（ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１；配列番号６）を、Ｋ_ｄが１９０μＭであるＳＢｉＴ１（配列番号１）と、Ｋ_ｄが２．５μＭであるＳＢｉＴ２（配列番号２）と、ＳＢｉＴ２のＮ末端の前にシステイン残基とを含む典型的な実施形態で構築した。センサータンパク質をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現し、Ｎ末端のＨｉｓ−ｔａｇおよびＣ末端のＳｔｒｅｐタグを用いて精製した。この２段階精製プロトコールによって、例えばＳＢｉＴドメインを欠く短縮したセンサーがない、十分な長さのタンパク質のみの単離が確実となる。センサータンパク質を、チオール−マレイミド反応を介して合成フルオロフォアＣｙ３と抱合した。

ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１の生物発光スキャンは、発光率１．３で、抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の非存在下での４６０ｎｍでのＮａｎｏＬｕｃ発光より高い５６３ｎｍでのＣｙ３発光ピークを示し、この発光率は、ＮＢとＣｙ３との間の非常に効率的なＢＲＥＴを示す。抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の追加によって、Ｃｙ３発光ピークが顕著に低下し、これは、ＢＲＥＴ効率の大きい低下を示す。抗体価測定実験によって、１０．０±０．５ｐＭの見かけの解離定数（Ｋ_{ｄ，ａｐｐ}）および２１８％の大きいダイナミックレンジが得られた（図２）。
チューニングセンサー性能

システイン残基位置の影響を確立するために、ＳＢｉＴ２（ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２；配列番号７）のＣ末端の後のいずれか１つのシステイン残基、またはＳＢｉＴ２のＮ末端の前、およびＳＢｉＴ２（ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３；配列番号８）のＣ末端の後の両方の２つのシステイン残基を含む２つのバリアントを構築した。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２は、抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体の非存在下で比較的低い発光率（青色に対する赤色）を示した。これは、Ｃｙ３がルシフェラーゼの基質結合部位より遠いことを示唆する。また、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３は、抗体がない状態で比較的低い発光率（青色に対する赤色）を示した。２つのＣｙ３基での抱合が、ＳＢｉＴ２とＬＢｉＴとの集合に影響を与えうることが予想される。

ＬＢｉＴ−ＳＢｉＴ親和性の影響を確立するために、ＳＢｉＴの異なる組み合わせを含む４つのバリアントを構築した。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−４（配列番号９）は、Ｋ_ｄが１９０μＭであるＳＢｉＴ１（配列番号１）およびＫ_ｄが０．１８μＭであるＳＢｉＴ２（配列番号３）を含んでいた。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−５（配列番号１０）は、Ｋ_ｄが１９０μＭである２つの同じＳＢｉＴ（配列番号１）を含んでいた。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−６（配列番号１１）は、Ｋ_ｄが２．５μＭである２つの同じＳＢｉＴを（配列番号２）含んでいた。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−７（配列番号１２）は、Ｋ_ｄが２．５μＭであるＳＢｉＴ１（配列番号２）と、Ｋ_ｄが０．１８μＭであるＳＢｉＴ２（配列番号３）とを含んでいた。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−４は、抗体の非存在下で高い発光率を示したが、抗体結合によって穏やかに減少した。２つの同じＳＢｉＴを単一のセンサータンパク質に含むＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−５および−６は、抗体がない状態で低い発光率を示し、これは、これらのセンサーにおいて、ＳＢｉＴ１は、かなりの割合のセンサータンパク質にてＮａｎｏＬｕｃ活性を既に補完することを示す。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−７では、発光率は抗体がない状態で１．８に到達し抗体の添加により顕著に減少した。ダイナミックレンジ（ＤＲ）は４９３％に到達した。抗体価測定実験によって、これらの４つのセンサーバリアントについて見かけの親和性１０〜１５ｐＭが得られ、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１について得られたものと類似していた（図３）。

表１．抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体を標的にする種々のＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ（ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ）バリアントの特性。

センサー選択性のチューニング
センサー設計のモジュール方式に挑むために、エピトープ配列が、異なる抗体標的にするエピトープ配列に交換できるかどうか試験した。治療抗体トラスツズマブ（ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１、配列番号１３；ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１、配列番号１４；およびＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３、配列番号１５）を標的にするセンサーを、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１、−５および−７に存在するエピトープ配列をトラスツズマブ結合ミミトープＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳ（配列番号５）で置換することによって構築した。トラスツズマブはＨｅｒ２陽性転移性乳房癌の治療に使用される。集団薬物動態は、クリアランスにおいて患者間のばらつきを示し、１０％の患者で速いクリアランスがあり、薬のレベルが最小有効濃度より下となる（Ｂｒｕｎｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５，５６，３６１）。トラスツズマブに対するミミトープの一価親和性は２９４ｎＭであった。これらの３つのセンサーについて、効率的なＢＲＥＴが、トラスツズマブがない状態で見られた（図４）。１μＭトラスツズマブをＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１に追加すると、穏やかなＢＲＥＴの低下が生じ、ダイナミックレンジは３７％であった。大量のトラスツズマブを添加した際に、発光率の増加が見られた。場合により、抗体の２つの分子がセンサーの１つの分子と結合し、センサーが閉じた状態として回復した。ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２は抗体価測定の間、閉じた状態で保たれた。ＬＢｉＴとＳＢｉＴ２との間の親和性は、弱いエピトープ親和性が二価抗体結合をもたらすことができないほど高いと予想される。ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３は、トラスツズマブの添加により発光率の穏やかな変化を示し、ダイナミックレンジが３６％であった。トラスツズマブの抗体価測定の結果、ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１についてのＫ_{ｄ，ａｐｐ}が７４．０±９．４ｎｍであり、ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３については８５．７±６．３ｎｍであった。

さらに、治療抗体セツキシマブ（ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１、配列番号２５；ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２、配列番号２６；およびＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３、配列番号２７）を標的にするセンサーを、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１および−２に存在するエピトープ配列を、セツキシマブ結合メディトープＣＶＦＤＬＧＴＲＲＬＲＣ（６１ｎＭの一価Ｋ_ｄ；配列番号２３）で、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１に存在するエピトープをセツキシマブ結合メディトープＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＣ（２７０ｎＭの一価Ｋ_ｄ；配列番号２４）で、それぞれ置換することによって構築した。セツキシマブは臨床的に重要な抗癌治療抗体である。セツキシマブは癌マーカーＥＧＦＲ上の不連続の立体構造エピトープに結合することから、直線のエピトープ配列が利用できない。それにもかかわらず、ジスルフィド結合環状メディトープペプチドがセツキシマブに対する十分な親和性を持つことが特定され、発光率（ＤＲ−６０％）の比較的控えめな変化を有するセツキシマブのための青色−緑色放射ＬＵＭＡＢＳセンサーを構築するのに使用された（Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，９０，３５９２参照）。メディトープペプチドのシステイン残基の存在が、Ｃｙ３染料を導入するのにシステイン−マレイミド化学を使用できないようにすることから、実際には、非カノニカルアミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）導入して、歪み促進アジド-アルキンクリック化学（ＳＰＡＡＣ）によって、ＤＢＣＯ−官能化フルオロフォアとの部位特異的な抱合を可能にした。ｐＡｚＦを組み込むために、タグのアンバー停止コドンを、Ｎ末端（ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１；配列番号２５）の前またはＳＢｉＴ２のＣ末端の後（ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２；配列番号２６）のいずれかに導入した。ｐＡｚＦのための直交ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対での共発現によって、ｐＡｚＦのセツキシマブセンサーバリアントへの望ましい位置での組み込みが成功した。ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１はセツキシマブの非存在下で明るいＣｙ３発光を示し、抗体結合により発光率の顕著な低下を示した（図６）。２３３±１２％のダイナミックレンジを達成し、これは青色−緑色ＣＴＸ−ＬＵＭＡＢＳセンサーと比較して４倍の向上を表し（Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，９０，３５９２）、一方で、抗体価測定データのフィッティングから得られた３４．７±３．７ｎＭの全体のＫ_ｄは同様であると見られた（図６）。ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２のＳＢｉＴ２のＣ末端でのＣｙ３の導入は、抗体がない状態でＢＲＥＴ効率を実質的に減少させ（図６）、これは、ＨＩＶ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２について得られた結果と一致している。より弱い親和性（配列番号２４）を有する環状セツキシマブメディトープを含むセンサーのバリアント（ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３）を構築した。ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３による抗体価測定実験は、１８９±１６ｎＭのＫ_ｄを示し、このセンサーが高いセツキシマブ濃度を確実に測定できるようにするものであった（図６）。セツキシマブに対するＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３のより低い親和性も、ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１のものと比較してより迅速な応答を生じた。これらの結果は、を実証するｔｈａｔＮＢ−ＬＵＭＡＢＳセンサー形式が、ジスルフィド拘束環状ペプチドを認識する抗体を検出するために再構成でき、２つのセツキシマブセンサーが得られそれらの組み合わせた応答療法は臨床関連セツキシマブ濃度範囲（２５ｎＭ〜２．３μＭ）をカバーする。

これらの結果は、典型的な抗ＨＩＶ１−ｐ１７抗体のために開発されたフレームワークが、他の抗体ためのセンサーを容易に開発するのに使用できることをさらに示す。

表２．治療抗体を標的にする種々のＮＢ−ＬＵＭＡＢＳバリアントの特性。

実験
クローニングおよび変異誘発
ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１をコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号６）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）に発注した。ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２（配列番号７）、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３（配列番号１０）、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−４（配列番号９）、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−５（配列番号１０）、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−６（配列番号１１）およびＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−７（配列番号１２）は、特異的なプライマーを用いる部位特異的な変異誘発によってＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１から構築した（表３）。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して、所望の変異を導入した。

ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１（配列番号１３）、ＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２（配列番号１４）およびＴＲＡＳ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３（配列番号１５）を構築するために、トラスツズマブミミトープ（ＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ）を含む半柔軟なリンカーをコードする遺伝子を、制限−ライゲーションアプローチによって、ＫｐｎＩおよびＳｐｅＩを用いて、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１、−５または−７をコードするｐＥＴ２８ａプラスミドにクローニングした。すべてのクローニングおよび変異誘発結果は、サンガー配列決定（ＳｔａｒＳＥＱ ＧｍｂＨ）によって確認した。

ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１（配列番号２５）、ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−２（配列番号２６）およびＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３（配列番号２７）を構築するために、Ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎらによって開示された方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８，９０，３５９２）に従って調製したｐＥＴ２８ａ（＋）ＣＴＸ−ＬＵＭＡＢＳをコードするプラスミドをＫｐｎＩ−ＨＦおよびＳｐｅＩ−ＨＦ制限酵素で消化した。その後、セツキシマブメディトープを含むリンカー、すなわちメディトープＣＶＦＤＬＧＴＲＲＬＲＣ（配列番号２３）を有するＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１および−２、並びにメディトープＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＣ（配列番号２４）を有するＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−３を、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ−１（配列番号６）をコードするｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドに、ＫｐｎＩ−ＨＦおよびＳｐｅＩ−ＨＦを用いて、制限−ライゲーションアプローチによってクローニングした。システイン残基を除去し、タグコドンを、特異的なプライマーを用いる部位特異的な変異誘発によって、望ましい位置（表３）に導入した。すべてのクローニングおよび変異誘発結果をサンガー配列決定（ＳｔａｒＳＥＱ ＧｍｂＨ）によって確認した。
表３．ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳバリアントの構築

タンパク質発現および精製
標準プロトコールを用いて、タンパク質を発現し、精製した。簡単に述べると、適切なｐＥＴ２８ａプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。細胞を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で培養した。タンパク質発現を、０．６のＯＤ_６００で０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２０℃で一晩誘導した。細胞を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。センサータンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した後、製造者の説明書従ってＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ精製を行った。タンパク質濃度を、減衰係数（タンパク質配列から計算）を用いて、２８０ｎｍでの吸光度で測定することによって決定した。タンパク質純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。精製したタンパク質を−８０℃で使用まで保存した。

ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）を組み込むために、ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳをコードするｐＥＴ２８ａプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に、ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をコードするｐＥＶＯＬベクターと共に形質転換した。ｐＥＶＯＬベクターはＰｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１８６）から贈られた。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２ＹＴ培地で（１６ｇ ペプトン、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ 酵素抽出物／Ｌ）細胞を培養した。１ｍＭ ｐＡｚＦ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ−３０７５．０００１）の存在下で、０．１ｍＭ ＩＰＴＧおよび０．２％アラビノースを用いて、タンパク質発現を誘導した。センサータンパク質を上記の通り精製した。

エピトープ配列がない最初のｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳをコードするｐＥＴ２８ａプラスミドをから発注した。さらに、半柔軟なリンカーにおいて２つのエピトープ配列（配列番号２３および配列番号２４）をコードする２つのｐＵＣ５７ベクターをさらにＧｅｎＳｃｒｉｐｔから発注した。これらのエピトープ配列を、ＫｐｎＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を用いる制限ライゲーションクローニングを用いてｐＥＴ２８ａ＋ベクターにクローニングし、Ｔ４リガーゼを用いてライゲーションした。ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｏｖａＢｌｕｅ細菌（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、その後培養することによって増幅した。ベクターを、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。エピトープの半柔軟なリンカーの正しい組み込みを、サンガー配列決定（ＳｔａｒＳｅｑ，ドイツ）によって確認した。エピトープを含む新しく得られたｐＥＴ２８ａ＋ベクターを、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢＰＡ）のプロテインＧへの組み込みのためのｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼをコードするｐＥＶＯＬベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。このｐＥＶＯＬ−ｐＢｐＦベクターはＰｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚから贈られた（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１９０）。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよびクロラムフェニコールの添加後、細菌をＬＢ培地で培養した。タンパク質の発現を０．６のＯＤで０．１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および０．２％アラビノースによって誘導し、非天然アミノ酸ｐＢＰＡ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ−２８００．０００１）を同時に添加した（１ｍＭ）。１８℃で一晩発現後、培養を１００００ｘｇで１０分間遠心した。細胞を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（２０ｍｌ／Ｌ）およびベンゾナーゼ（２０μＬ／Ｌ）を用いて、２０分間室温で溶解した。溶解した細菌を１６０００ｘｇで４５分間、４℃で遠心した。上清の精製をニッケル−アフィニティーおよびＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムクロマトグラフィーを用いて行った。センサータンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＱ−ＴｏＦ−ＭＳを用いて確認した。

タンパク質のフルオロフォア標識
精製したＮＢ−ＬＵＭＡＢＳタンパク質を５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中１ｍＭトリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）で、室温で２０分間還元した。その後、水（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解したスルホ−シアニン３マレイミド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）を３０倍モル過剰でタンパク質溶液に添加し、１時間室温でインキュベーションした後、４℃で一晩インキュベーションした。反応しなかった染料をＰＤ１０脱塩カラムを用いて除去し、複合体を１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ遠心分離濾過フィルターを用いて濃縮した。染料：タンパク質比を２８０ｎｍおよび５５３ｎｍでの吸光度を測定し、タンパク質について３９，４２０Ｍ−^１ｃｍ−^１、染料について１６２，０００Ｍ−^１ｃｍ−^１の減衰係数を仮想するによって決定した。Ｃｙ３標識ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳタンパク質をＱ−ＴｏＦ ＬＣ−ＭＳによって確認した。

ＤＢＣＯ−スルホ−Ｃｙ３（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＬＫ−Ａ１４０−１）を、４０倍モル過剰でＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳに室温で一晩結合させた。過剰の染料を１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ遠心分離濾過フィルターを用いて除去した。染料：タンパク質比を、２８０ｎｍおよび５６３ｎｍでの吸光度を測定し、減衰係数（タンパク質配列から計算）を用いることによって決定した。反応生成物をＱ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。

５０ｍＭ トリス ｐＨ７中の純粋なｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ（５０μＭ、８００μＬ）をアルゴンでバブリングした。１０μＬの１００ｍＭ ＴＣＥＰ（トリス−カルボキシエチルホスフィン）を、最終濃度１ｍＭで添加し、室温で２０分間アルゴンでフラッシュした。スルホ−Ｃｙ３−マレイミド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）（１ｍｇ）を１００μＬ ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。染料をタンパク質溶液（染料の〜１５ｘ倍過剰）に添加し、アルゴンでフラッシュした。これを室温で１時間、４℃で一晩置いた。未反応染料をＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて除去した。標識したタンパク質を３ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５ｍＬ遠心濾過フィルターで濃縮した。染料：タンパク質比を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＵＶ−ＶＩＳ）を用いて、２８０ｎｍおよび５４８ｎｍでの吸収で測定した。

ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳの光共役化
Ｐｒｏｍｅｄ ＵＶＬ−３０ＵＶ光源（４×９ｗａｔｔ）を用いて光共役化反応を実施した。ＰＢＳ緩衝液中の（ｐＨ７．４）の２μＭの抗体（ＨｙＴｅｓｔ）および８μＭのｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳを光共役化効率試験に使用した。混合物をＵＶ光下（３６５ｎｍ）に、氷上で、３０、６０、または９０分間置いた。その後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで移動させて、光共役化効率を決定した。

過剰の非複合化センサータンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてうまく除去した。生物発光スペクトルは、ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳタンパク質のその抗体への抱合の後にＣｙ３の顕著な低下を示し、ペプチドエピトープの抗原結合部位への予期した結合と一致し、ＬＢｉｔ−Ｓｂｉｔ２相互作用を破壊する。エピトープペプチドの追加によって、ＢＲＥＴ比率が増加し、競合結合の結果として低いＢＲＥＴ状態と高いＢＲＥＴ状態との間で可逆的に切り替えるセンサーの能力を示すことによってセンサーコンセプトの実現可能性を証明した（図８Ｂ）。

センサーキャラクタリゼーション
抗−ＨＩＶ１−ｐ１７抗体をＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ（クローン３２／１．２４.８９）から入手した。トラスツズマブ（ハーセプチン、Ｒｏｃｈｅ）およびセツキシマブ（エルビタックス、Ｍｅｒｃｋ）を、Ｃａｔｈｅｒｉｎａ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を介して入手した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｆｌａｔ ｗｈｉｔｅ９６−ｗｅｌｌ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅにおいて、１００μＬ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で、１ｐＭのセンサー濃度を用いて、ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳに対する抗体価測定を実施した。１００ｐＭのセンサーをトラスツズマブおよびセツキシマブ抗体価測定のために使用した。２時間のセンサーおよび抗体のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質を１０００倍の最終希釈で添加した。

抗ＣＲＰ１６９結合ペプチドを、抗体複合化ｐＧ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳに対して、２ｎＭのセンサー濃度を用いて抗体価測定した。センサーおよびペプチドの４５分間のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質を５００倍の最終希釈で添加した。
３９８ｎｍ〜６５３ｎｍのルミネセンススペクトルを、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーで１５ｎｍのステップサイズ、２５ｎｍの帯域幅、１０００ｍｓの積分時間で記録した。抗体価測定を等式１に適合させ、見かけのＫ_ｄ ｖａｌｕＥを得た。

Ｐ１は発光率（ＥＲ）の最大変化であり、Ｐ２は被検物質の非存在下での発光率である。ダイナミックレンジ（ＤＲ）は等式２で計算した。

デジタルカメラを用いるシグナル記録
白色９６ウェルプレートに、１００ｐＭ ＣＴＸ−ＮＢ−ＬＵＭＡＢＳ、異なる濃度のセツキシマブおよび１μＬ ＮａｎｏＧｌｏ基質を含む２００μＬ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を添加した。プレートを暗室内のＳｔｙｒｏｆｏａｍ ｂｏｘに置いて、周囲の光を除いた。血液血漿測定のために、試料を、５ｎｍセンサーを用いて２００μＬ 未希釈血液血漿にて調製した。ホールｉｎｂｏｘを用いてＳＯＮＹ ＤＳＣ−ＲＸ１００デジタルカメラを用いて、暴露時間１０〜３０ｓ、１．８のＦ値および１６００〜６４００のＩＳＯ値でｂｏｘ内のホールを通じて画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪを用いて画像を分析して、青色と赤色チャネルとの平均強度間の比率値を計算した。

Claims (15)

1. 第１の末端と第２の末端とを含むリンカーを含むバイオセンサーであって、
   前記リンカーの前記第１の末端は、第１の結合ドメインを介して第１のルシフェラーゼドメインの１つの末端に融合されており、
   前記リンカーの前記第２の末端は、第２の結合ドメインを介して第２のルシフェラーゼドメインに融合されており、
   前記バイオセンサーは、任意選択的にスペーサーを介して前記第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合した第３のルシフェラーゼドメインを含み、
   結合ドメインは生物分子に結合するように構成されており、
   バイオセンサーは２つの構造で存在し、前記２つの構造は、前記第２のルシフェラーゼドメインまたは前記第３のルシフェラーゼドメインのいずれかが相補ルシフェラーゼを形成するように前記第１のルシフェラーゼドメインに結合する構造、およびフルオロフォアが前記第２のルシフェラーゼドメインまたは前記第３のルシフェラーゼドメインのうちの１つの次に結合する構造であり、前記２つの構造のうちの１つのみにおいてルシフェラーゼと前記フルオロフォアとの間の効率的な生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が生じることを特徴とするバイオセンサー。
2. 前記第３のルシフェラーゼドメインがスペーサーを介して前記第１のルシフェラーゼドメインの他の末端に融合されている１に記載のバイオセンサー。
3. 前記第１のルシフェラーゼドメインが大きいルシフェラーゼドメイン、好ましくはラージスプリットルシフェラーゼ断片であり、前記第２のおよび第３のルシフェラーゼドメインが小さいルシフェラーゼドメイン、好ましくはスモールスプリットルシフェラーゼ断片である１または２に記載のバイオセンサー。
4. 前記リンカーが半柔軟なリンカーである１〜３のいずれかに記載のバイオセンサー。
5. 前記生物分子が抗体、抗原、タンパク質またはアプタマーを含む１〜４のいずれかに記載のバイオセンサー。
6. 第１の結合ドメインが前記生物分子と抱合したシステム形成するように構成されており、第２の結合ドメインが生物分子のリガンド結合部位に結合するように構成されている１〜５のいずれかに記載のバイオセンサー。
7. 前記生物分子のリガンド結合部位は抗体の抗原結合部位を含む６に記載のバイオセンサー。
8. 前記生物分子が前記バイオセンサーの前記第１の結合ドメインに共役結合している６または７に記載のバイオセンサー。
9. サンプルを請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセンサーと接触させるステップと、
   サンプルの存在下で前記バイオセンサーの発光の変化を決定するステップと、
   生物分子の定量的なおよび／または定性的な存在または非存在に対する、サンプルの存在下での発光変化を決定するステップと、を含む生体外の生物分子検出方法。
10. 生物分子の非存在下で前記バイオセンサーが、前記第１のルシフェラーゼドメインの少なくとも一部が前記第２のルシフェラーゼドメインを補完する生物分子がない状態である９に記載の生体外の生物分子検出方法。
11. 前記バイオセンサーの結合ドメインと前記生物分子との間の結合が、ルシフェラーゼとフルオロフォアとの間のＢＲＥＴ変化するように、生物分子がないバイオセンサーの状態と生物分子と複合化したバイオセンサーの状態との間の平衡を変化させる９または１０に記載の生体外の生物分子検出方法。
12. サンプルを請求項６〜８のいずれかに記載のバイオセンサーと接触させるステップと、
    サンプルの存在下でバイオセンサーの発光の変化を決定するステップと、
    リガンドの定量的なおよび／または定性的な存在または非存在に対するサンプルの存在下での発光変化を決定するステップと、を含むことを特徴とする生体外のリガンド検出方法。
13. リガンドの非存在下で生物分子が、前記第２のルシフェラーゼドメインと前記第１のルシフェラーゼドメインとの相互作用を破壊する第２の結合ドメインに結合する請求項１２に記載の生体外のリガンド検出方法。
14. リガンドの存在下で前記バイオセンサーが、前記第１のルシフェラーゼドメインの少なくとも一部が前記第２のルシフェラーゼドメインを補完することを可能にするリガンド複合化状態である請求項１２または１３に記載の生体外のリガンド検出方法。
15. 請求項１〜８のいずれかに記載のバイオセンサーを含むパーツキットであって、前記バイオセンサーは、２つの結合ドメインを含む半柔軟なリンカーを介して第２のルシフェラーゼドメインに融合した第１のルシフェラーゼドメインをリンカーの末端に含み、前記パーツキットは第３のルシフェラーゼドメインをさらに含むことを特徴とするパーツキット。

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