CN116256505A - 基于qd-lumabs的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒 - Google Patents

基于qd-lumabs的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于QD‑LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。本发明通过链霉亲和素‑生物素体系实现LUMABS与量子点(QD)自组装，在特定抗原识别表位‑LUMABS探针中引入QD，使BRET(生物发光能量共振转移)对的受体荧光发射波长红移，可与供体荧光光谱充分分离开，使受体荧光信号免受供体荧光信号干扰，提高检测灵敏度，还能够实现同一样品的多通道检测和同一样品中多组分均相检测。

Description

基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及 其试剂盒
技术领域
本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。
背景技术
近几年发展起来的mNeonG-LUMABS探针抗体检测技术，主要由催化发蓝光的荧光素酶(BRET供体)、绿色荧光蛋白mNeonGreen(受体)和两个抗原识别表位构成。由于探针N端与C端序列的相互作用，表达的探针处于“close”状态时，荧光素酶与绿色荧光蛋白空间位置被拉近发生高效的BRET；当有探针对应的特异性抗体存在时，探针呈“open”状态， BRET效率降低，实现对抗体的定量检测。现有的以BRET方式检测的 LUMABS探针，都是以催化发蓝光的荧光素酶(Nanoluc)为供体，绿色荧光蛋白(GFP、mNeonGreen、Clover4等)为受体，二者的发射主峰仅相距约40nm，峰图部分重叠，供体信号对受体信号造成干扰，且荧光蛋白的最大激发波长与最大发射波长仅相差约10nm，导致检测的灵敏度不高，而且荧光素酶-荧光蛋白的BRET对仅能做单一组分的检测。因此目前亟需一种检测灵敏度高并且能实现同一样品的多通道检测和同一样品中多组分均相检测的抗体定量检测方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。本发明通过链霉亲和素- 生物素体系实现LUMABS与量子点(QD)自组装，在特定抗原识别表位 -LUMABS探针中引入QD。
本发明提供一种基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法，包括如下步骤：
S1：设计并表达带有BirATag的特定抗原识别表位-LUMABS融合蛋白；所述BirATag为生物素连接酶可特异性识别的一段15个氨基酸的序列；所述生物素连接酶为BirA；
S2：将S1的融合蛋白加上生物素标记；
S3：将S2得到的带有生物素标记的融合蛋白与量子点-链霉亲和素化合物反应，得到量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针；
S4：将S3得到的所述量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针和梯度浓度的所述特定抗原识别表位的抗体反应，加入LUMABS探针底物，检测溶液的供体通道和受体通道荧光强度，计算获得BRET效率(受体通道信号/供体通道信号)，建立特定抗体浓度-BRET效率工作曲线。
进一步的，所述步骤S1的所述融合蛋白由N端到C端具体为 SH3-BirATag-特定抗原识别表位-helix-helix-特定抗原识别表位-荧光素酶 -sp1。
进一步的，所述荧光素酶为Nanoluc。Nanoluc催化底物所发荧光强度高，效果更好；同时其分子量较其他荧光素酶更小，对蛋白结构的影响小，更利于融合蛋白的表达。
进一步的，所述特定抗原识别表位为HIV的抗原识别表位。HIV的抗原表位为常用的抗原表位，用其成功建立曲线说明本发明的方法有效，但是本发明的特定抗原识别表位并不限于HIV的抗原表位，任何抗原表位都可以用来构建LUMABS探针，建立相应的曲线，来测定特定抗原识别表位对应的抗体的浓度。
进一步的，所述量子点-链霉亲和素化合物为QD655-SA。QD655-SA 为市售可以直接买到的产品。QD655为常用的QD，但是本发明可使用的 QD可为任意一种QD。
本发明还提供一种使用所述的曲线建立方法所获得的特定抗体浓度 -BRET效率工作曲线来进行抗体定量检测的方法，包括如下步骤：
将未知浓度的特定抗体与所述量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针反应，检测溶液的供体通道和受体通道荧光强度，并计算获得BRET效率，根据已建立的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线计算出所述特定抗体的浓度。
进一步的，所述反应的温度为37℃。反应温度为抗体识别抗原表位的最适温度。
进一步的，所述反应的时间为20-40min，优选为30min。
本发明还提供一种抗体定量检测试剂盒，包括量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针。除此之外，还可以包括双蒸水等常用的试剂。
本发明还提供所述的检测试剂盒在抗体定量检测中的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的方法将LUMABS中SH3的C端插入BirATag，BirA将单个生物素定点标记到LUMABS上，带生物素的LUMABS通过与链霉亲和素的高亲和力连接上QD。
2.本发明的检测方法中QD作为供体具有高量子产率，可以用单一光源激发。
3.同样以催化发蓝光的荧光素酶为供体时，本发明通过链霉亲和素- 生物素体系实现LUMABS与QD自组装，在特定抗原识别表位-LUMABS 探针中引入QD，使BRET(生物发光能量共振转移)对的受体荧光发射波长红移，可与供体荧光光谱充分的分离开，使受体荧光信号免受供体荧光信号干扰，提高检测灵敏度。
4.本发明的检测方法中同一抗体的LUMABS探针可组装上不同发射波长的QD，实现同一样品的多通道检测。
5.本发明的检测方法可构建多个带BirATag的含不同抗原识别表位的 LUMABS，分别与不同发射波长的QD-链霉亲和素组装，实现同一样品中多组分均相检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的工作曲线建立方法的流程示意图。
图2为本发明的检测抗体示意图。
图3为本发明的方法检测HIV抗体的标准曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
量子点(QD)是一种半导体纳米材料，因其具有高量子产率、可调发射波长、发射峰窄、大斯托克斯位移等特点，适用于生物标记物的多组分荧光检测，可缩短分析所需的时间，节省检测试剂，降低分析成本，成为荧光生物传感器开发领域的重要前沿。QD可以用单一光源激发，大大的简化多色荧光检测对多种光源的依赖性；QD还可以完全不受制于外部激发光源，在能量转移分析方法中是非常理想的能量受体。
生物素连接酶BirA可特异性识别一段15aa的氨基酸序列(BirATag)，并将生物素(Biotin)标记到其中的赖氨酸上。链霉亲和素(SA)和Biotin 有极强的结合能力，非共价结合力的Kd达到10-15mol/L，能够应用于化学发光、免疫层析、生物分子纯化、单克隆抗体制备、酶联免疫吸附实验等生物技术领域。用BirATag序列取代LUMABS受体位置上的荧光蛋白序列，经 BirA催化后带Biotin的LUMABS即可与QD-SA进行自组装，将QD作为该 LUMABS探针的受体。
本发明通过链霉亲和素-生物素体系实现LUMABS与QD自组装，在特定抗原识别表位-LUMABS探针中引入QD，使BRET(生物发光能量共振转移) 对的受体荧光发射波长红移，可与供体荧光光谱充分分离开，使受体荧光信号免受供体荧光信号干扰，提高检测灵敏度。
本发明通过设计带BirATag的特定抗原识别表位-LUMABS融合蛋白，即(N端)SH3-BirATag-HIV epitopes-helix-helix-HIV epitopes-Nanoluc-sp1(C端)，经BirA催化后带Biotin的特定抗原识别表位-LUMABS即可与SA-QD进行自组装，形成QD-特定抗原识别表位-LUMABS探针。将探针放入含有特定抗原识别表位的抗体的样品中，探针由“close”状态转变成“open”状态，BRET效率降低，通过测定不同抗体浓度样品中的BRET效率建立标准曲线，流程如图1所示，原理如图 2所示，实现对抗体的定量检测。
以下实施例中特定抗原识别表位以HIV为例，荧光素酶以Nanoluc 为例，QD-SA化合物以QD655-SA为例，来展示本发明的曲线建立方法和抗体定量检测方法，本领域技术人员可以推及使用其他的抗原识别表位、荧光素酶和QD-SA化合物均能实现本发明的技术效果。
实施例1本发明的曲线建立方法
在pCold I质粒中插入融合蛋白(N端)SH3-BirATag-HIV epitopes-helix-helix-HIV epitopes-Nanoluc-sp1(C端)的编码序列，将重组质粒经热激转化入BL21感受态细胞中。转化后筛选出的阳性克隆菌经扩增培养后，按1：100 接种到200ml含Amp的LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600＝0.6，加入0.1mM IPTG在15℃200rpm条件下诱导表达融合蛋白。SH3-BirATag-HIV epitopes-helix-helix-HIV epitopes-Nanoluc-sp1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。BirA tag中加粗的K为Biotin标记位点。融合蛋白经镍柱纯化， 10K超滤管纯化，保存在1×PBS缓冲液中。对制备得到的融合蛋白进行生物素标记，之后按摩尔比1：1混合融合蛋白和QD655-SA，室温反应30min 制备QD655-HIV-LUMABS探针。在100μL工作体积中加入100pM QD655-HIV-LUMABS探针和梯度浓度的HIV抗体，37℃反应30min，检测溶液的供体通道和受体通道荧光强度，计算获得BRET效率(受体通道信号 /供体通道信号)，建立HIV抗体浓度-BRET效率工作曲线，如图3所示，该工作曲线的R2＝0.999，表明拟合度非常好，本发明的曲线建立方法有效。
实施例2通过构建好的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线进行抗体定量检测
将未知浓度的特定抗体与量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针反应，检测溶液的荧光强度，获得BRET效率，根据已经建立的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线计算出所述特定抗体的浓度。
此外，本发明的检测方法中同一抗体的LUMABS探针可组装上不同发射波长的QD，实现同一样品的多通道检测。还可构建多个带BirATag的含不同抗原识别表位的LUMABS，分别与不同发射波长的QD-链霉亲和素组装，实现同一样品中多组分均相检测。
实施例3本发明的抗体定量检测的试剂盒
所述试剂盒包括量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针。使用时，在100μL工作体积中加入100pM试剂盒中的量子点-特定抗原识别表位 -LUMABS探针和梯度浓度的特定抗原识别表位的抗体，37℃反应30min，建立工作曲线；随后将未知浓度的特定抗体与量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针反应，检测溶液的荧光强度，获得BRET效率，根据已经建立的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线计算出所述特定抗体的浓度。特定抗原识别表位为实际中常用的特定抗原识别表位，其对应的抗体为经常使用的需要进行定量测定的抗体。
综合以上实施例，本发明公开了一种基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。本发明通过链霉亲和素-生物素体系实现LUMABS与量子点(QD)自组装，在特定抗原识别表位-LUMABS 探针中引入QD，使BRET(生物发光能量共振转移)对的受体荧光发射波长红移，可与供体荧光光谱充分分离开，使受体荧光信号免受供体荧光信号干扰，提高检测灵敏度，还能够实现实现同一样品的多通道检测和同一样品中多组分均相检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1：
SH3-BirA tag-HIV epitope-helix-helix-HIV epitope-Nluc-sp1
MASDDNFIYKAKALYPYDADDDDAYEISFEQNEILQVSDIEGRWWKARRANGETGIIPSNYVQLID GPEEMHRGGSGLNDIFEAQKIEWHESGGSGGELDRWEKIRLRPGGSGGSGGSGGSGGSGGSGAEA AAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAGSGGSGGSGGSGGSGGSGAEAAAKEAAAKEAAA KEAAAKEAAAKEAAAKAGSGGSGGSGGSGGSGGSGGELDRWEKIRLRPGGSVFTLEDFVGDWR QTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKV VYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPD GSLLFRVTINGVTGWRLCERILASSGGGSIRSKPLPPLPVTG。

Claims (10)

1.一种基于QD-LUMABS的抗体定量检测的曲线建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：设计并表达带有BirATag的特定抗原识别表位-LUMABS融合蛋白；所述BirATag为生物素连接酶可特异性识别的一段15个氨基酸的序列；所述生物素连接酶为BirA；
S2：将S1的融合蛋白加上生物素标记；
S3：将S2得到的带有生物素标记的融合蛋白与量子点-链霉亲和素化合物反应，得到量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针；
S4：将S3得到的所述量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针和梯度浓度的所述特定抗原识别表位的抗体反应，加入LUMABS探针底物，检测溶液的供体通道和受体通道荧光强度，计算获得BRET效率，建立特定抗体浓度-BRET效率工作曲线。
2.根据权利要求1所述的曲线建立方法，其特征在于，所述步骤S1的所述融合蛋白由N端到C端具体为SH3-BirATag-特定抗原识别表位-helix-helix-特定抗原识别表位-荧光素酶-sp1。
3.根据权利要求2所述的曲线建立方法，其特征在于，所述荧光素酶为Nanoluc。
4.根据权利要求2所述的曲线建立方法，其特征在于，所述特定抗原识别表位为HIV的抗原识别表位。
5.根据权利要求1所述的曲线建立方法，其特征在于，所述量子点-链霉亲和素化合物为QD655-SA。
6.一种使用权利要求1所述的曲线建立方法所获得的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线来进行抗体定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将未知浓度的特定抗体与所述量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针反应，检测溶液的供体通道和受体通道荧光强度，并计算获得BRET效率，根据权利要求1建立的特定抗体浓度-BRET效率工作曲线计算出所述特定抗体的浓度。
7.根据权利要求6所述的抗体定量检测的方法，其特征在于，所述反应的温度为37℃。
8.根据权利要求6所述的抗体定量检测的方法，其特征在于，所述反应的时间为20-40min。
9.一种抗体定量检测试剂盒，其特征在于，包括量子点-特定抗原识别表位-LUMABS探针。
10.权利要求9所述的检测试剂盒在抗体定量检测中的应用。
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