ES2923526T3 - Biosensor bioluminiscente para la detección y cuantificación de biomoléculas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un biosensor bioluminiscente y al uso de dicho biosensor bioluminiscente para proporcionar una estrategia de biosensor genérica que permite la detección directa de biomoléculas (p. ej., anticuerpos) o ligandos (p. ej., moléculas pequeñas) directamente en solución. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biosensor bioluminiscente para la detección y cuantificación de biomoléculas

Campo de la invención

La invención se refiere a un biosensor y un método de detección, en donde el biosensor se usa para detectar y cuantificar biomoléculas (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, proteínas, etc.) o ligandos (por ejemplo, moléculas pequeñas, biomarcadores basados en proteínas, etc.). En particular, esta invención se refiere a un biosensor bioluminiscente y a un método de detección, en donde el biosensor bioluminiscente se usa para detectar y cuantificar anticuerpos. La invención se refiere además a un biosensor y un método de detección, en donde el biosensor es un biosensor conjugado de biomoléculas (por ejemplo, un anticuerpo) que detecta y cuantifica ligandos, tales como moléculas pequeñas o biomarcadores basados en proteínas.

Antecedentes de la invención

El reconocimiento molecular basado en anticuerpos desempeña un papel dominante en las ciencias de la vida, desde aplicaciones en diagnóstico e imágenes moleculares hasta la terapia y la administración de fármacos dirigidos. Los anticuerpos son biomarcadores importantes en una amplia gama de enfermedades, y especialmente importantes para el diagnóstico y vigilancia de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes y alergias. Además, las terapias farmacológicas basadas en anticuerpos constituyen una clase importante de fármacos biomoleculares. Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos se aplican clínicamente en la terapia anticancerosa y antiinflamatoria. La respuesta inicial y las velocidades de eliminación de los anticuerpos terapéuticos varían según el paciente individual y se correlacionan con la eficacia del tratamiento y la progresión de la enfermedad, lo que sugiere que la monitorización del fármaco terapéutico (TDM, por sus siglas en inglés) específica del paciente permitiría una mayor eficacia al prevenir tanto la sobredosificación como la infradosificación. La detección y cuantificación de anticuerpos permanece como una necesidad importante en las pruebas de diagnóstico analítico inmediato. Si bien se ha desarrollado una amplia variedad de estrategias de detección de anticuerpos sensibles, muchas de ellas vienen con limitaciones intrínsecas, tal como el requisito de múltiples etapas de incubación que consumen mucho tiempo (ELISA y otros ensayos heterogéneos tipo sándwich), múltiples reactivos y/o sofisticados equipo (por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales).

Serían ideales nuevas estrategias de detección de anticuerpos genéricos en las que el reconocimiento molecular y la generación de señales se integren dentro de una única proteína, en particular para aplicaciones de cribado de alto rendimiento y en el diagnóstico analítico inmediato. Desde la perspectiva de la ingeniería de proteínas, la pregunta clave es cómo puede traducirse la unión de anticuerpos en un cambio de señal fácilmente detectable.

Un enfoque es hacer uso de epítopos marcados con fluorescencia cuyas propiedades de fluorescencia cambian con la unión del anticuerpo. Sin embargo, debido a la falta de la etapa de amplificación de la enzima, la sensibilidad de estos métodos está limitada por la concentración de sonda fluorescente que puede detectarse de forma confiable. Un inconveniente adicional es el requisito de instrumentación especializada que es particularmente problemático si el diagnóstico se requiere en áreas de bajos recursos o fuera de los centros médicos.

Varios grupos han informado sobre el desarrollo de enzimas indicadoras de anticuerpos alostéricos mediante la inserción de epítopos peptídicos en sitios permisivos dentro de la enzima informadora (ver: Brennan, y otros Protein Eng., 1994, 7, 509; Benito, y otros J. Biol. Chem., 1996, 271, 21251; y Ferrer-Miralles, y otros Journal of Biological Chemistry, 2001, 276, 40087). Sin embargo, estas enzimas híbridas están catalíticamente comprometidas y la unión del analito a menudo da como resultado una mayor disminución de la actividad. Una estrategia de diseño diferente es hacer uso de la oligomerización inducida por anticuerpos de enzimas indicadoras o la complementación de enzimas indicadoras divididas (ver: Geddie, y otros J. Mol. Biol., 2007, 369, 1052; De las Heras, y otros Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, 370, 164; y Fry, y otros Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, 372, 542). Estos enfoques utilizan la naturaleza bivalente de los anticuerpos para unir dos proteínas (o dominios de proteínas) para formar una enzima activa. Sin embargo, la actividad enzimática reconstituida es típicamente baja (solo 1-2 %) en comparación con su enzima original. Un inconveniente adicional es que el rendimiento del sensor depende de las concentraciones del sensor y, por tanto, es menos robusto que un solo sensor de proteína.

En lugar de usar anticuerpos para unir un sistema indicador de dos componentes, la unión de anticuerpos también puede usarse para interrumpir la interacción entre dos dominios. La ventaja de esta estrategia es que los dos dominios pueden ser parte de una sola construcción de proteína. La prueba de principio fue proporcionada por el grupo de Merkx (Golynsky, y otros ChemBioChem, 2010, 11, 2264) en el diseño de un sensor de anticuerpos basado en proteínas basado en el principio de transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET). Se unieron dos proteínas fluorescentes mediante un enlazador semiflexible que contenía dos epítopos idénticos adyacentes a los dominios fluorescentes. El enlazador contenía dos bloques a-helicoidales para garantizar un enlace eficiente de la distancia de aproximadamente 10 nm entre los dominios de unión al antígeno del anticuerpo diana. Debido a que las proteínas fluorescentes contenían mutaciones que promueven la autoasociación, formaron una interacción de dominio intramolecular en ausencia de anticuerpo. La unión bivalente de un anticuerpo a los epítopos en el enlazador interrumpió la interacción entre los dominios fluorescentes, lo que resultó en una disminución de FRET. La limitación de detección para este sensor FRET fue que la detección dependía de iluminación externa y carecía de una etapa de amplificación de señal. El grupo usó el mismo principio de cambio molecular para controlar una interacción intramolecular entre una enzima indicadora y su proteína inhibidora, lo que permitió la detección amplificada por enzimas de las concentraciones de anticuerpos picomolares directamente en la solución (Banala, y otros ACS Chem. Biol., 2013, 8, 2127). Sin embargo, la enzima indicadora mostró una actividad atenuada en el suero y carecía de la calibración intrínseca proporcionada por el sistema FRET de dos colores. El grupo utilizó además el mismo principio para diseñar un formato de sensor (llamado LUMABS) basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) (Arts, y otros Anal. Chem., 2016, 88, 4525). La luciferasa emisora de luz azul (por ejemplo, NanoLuc; también conocida como 'NLuc') se usó como donante y se conectó a través de un enlazador semiflexible a la proteína aceptora fluorescente verde (por ejemplo, mNeonGreen) y se introdujo un dominio auxiliar para unirlos en estrecha proximidad. La unión bivalente de un anticuerpo que flanqueaba el enlazador interrumpió la interacción entre los dominios auxiliares, lo que provocó una disminución de la BRET y, por lo tanto, un cambio del color de la luminiscencia de verde a azul. Una ventaja clave de los sensores bioluminiscentes es que no requieren excitación externa y, por lo tanto, no sufren de dispersión ni fluorescencia de fondo, lo que permite una detección sensible de la señal del sensor contra un fondo esencialmente oscuro. Más recientemente, el grupo de Merkx informó sobre la construcción de sensores LUMABS dirigidos específicamente a los anticuerpos terapéuticos trastuzumab y cetuximab que contienen epítopos de péptidos cíclicos que contienen disulfuro (Van Rosmalen, y otros Anal. Chem., 2018, DOI: 10,1021/acs.analchem.8b00041) y el desarrollo de LUMABS semisintéticos en los que la introducción del aminoácido no natural p-azidofenilalanina permitió la conjugación de antígenos no peptídicos (Arts, y otros ACS Sens., 2017, 2, 1730).

NanoLuc, una luciferasa modificada genéticamente derivada de un camarón de aguas profundas, es una proteína pequeña (19 kDa) pero estable que produce una luminiscencia aumentada y sostenida en comparación con otras luciferasas (Hall, M.P., y otros ACS Chem Biol, 2012, 7, 1848). Por lo tanto, NanoLuc representa un donante atractivo para los ensayos basados en la BRET. El sensor LUMABS desarrollado por el grupo de Merkx (Arts, y otros Anal. Chem., 2016, 88, 452) utilizó NanoLuc como donante y mNeonGreen como aceptor cuyos picos de emisión están separados por solo 56 nm. La gran superposición de los espectros de emisión significa que parte de la intensidad observada en el pico de emisión de mNeonGreen se origina en NanoLuc, lo que limita la respuesta radiométrica máxima. Un aceptor fluorescente más desplazado hacia el rojo sería una buena alternativa debido a la mayor separación entre los espectros de emisión y, por lo tanto, podría lograrse un gran cambio en la relación de emisión entre el estado libre de anticuerpos y el unido. Sin embargo, el reemplazo de mNeonGreen por dominios de proteínas fluorescentes rojas produjo sensores LUMABS con un rango dinámico deficiente, como resultado de la BRET ineficiente entre NanoLuc y el aceptor fluorescente desplazado al rojo (Hall, y otros ACS Chem. Biol., 2012, 7, 1848).

La luciferasa dividida es una herramienta efectiva para el examen de las interacciones entre proteínas y para la detección de analitos tanto in vivo e in vitro. Para analizar analitos, generalmente se inserta un dominio o una proteína intacta en una luciferasa fragmentada internamente, lo que da como resultado la unión del ligando, lo que provoca un cambio en las señales emitidas. Recientemente, NanoLuc se dividió en dos fragmentos, un fragmento grande de 18 kDa (LBiT) y un fragmento pequeño de 1,3 kDa (SBiT) y se diseñó como un indicador de complementación (llamado NanoBiT o NB) para el estudio de las interacciones de proteínas (Dixon, y otros ACS Chem. Biol., 2016, 11, 400). El ensayo de complementación de proteínas NanoBiT (NB) se ha utilizado para el análisis de las interacciones de proteínas G (Christopher, y otros Anal. Biochem., 2017, 522, 10) y entrada y liberación viral (Sasaki, y otros Virus Res., 2018, 243, 69). Recientemente se desarrolló un sistema de complementación NanoBiT de tres partes basado en dos pequeñas fusiones de péptidos para inmunoensayo homogéneo (Dixon, y otros Sci Rep., 2017, 7, 8186).

La presente invención proporciona un formato de sensor bioluminiscente diferente que permite la detección directa de analitos en particular anticuerpos en solución basada en la complementación de luciferasa dividida intramolecular mutuamente excluyente y aborda muchas de las limitaciones descritas anteriormente.

Resumen de la invención

Dentro de esta invención, presentamos un nuevo enfoque que permite la detección de biomoléculas en una sola etapa (por ejemplo, anticuerpos, proteínas, antígenos, aptámeros o similares) o de ligandos específicos de biomoléculas (por ejemplo, moléculas pequeñas, biomarcadores de proteínas o similares) directamente en solución mediante el uso de la complementación intramolecular de la luciferasa dividida. La presente invención proporciona, en este caso, un biosensor, preferiblemente un biosensor radiométrico, que incluye un enlazador que comprende un primer extremo y un segundo extremo, en donde el primer extremo del enlazador se fusiona a un extremo de un primer dominio de luciferasa a través de un primer dominio de unión y el segundo extremo del enlazador se fusiona a un segundo dominio de luciferasa a través de un segundo dominio de unión. El biosensor comprende opcionalmente un tercer dominio de luciferasa fusionado al otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador. Los dominios de unión del biosensor están configurados para unirse a una biomolécula, en donde el biosensor existe en al menos dos conformaciones, en las que el segundo o tercer dominio de luciferasa se une al primer dominio de luciferasa para formar una luciferasa complementada. Al proporcionar un biosensor en donde los dominios de luciferasa segundo y tercero se unen al primer dominio de luciferasa para formar una luciferasa complementada, y en donde un fluoróforo se conjuga junto a uno de los dominios de luciferasa segundo o tercero, se proporciona una transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) eficiente entre la luciferasa y el fluoróforo en sólo una de las dos conformaciones. Se observa que el tercer dominio de luciferasa puede fusionarse con el primer dominio de luciferasa, sin embargo, alternativamente, puede estar presente como un componente, por ejemplo, en una solución que comprende el biosensor de la invención.

El término "biomolécula" o "molécula biológica", como se usa en la presente se refiere a una molécula que está presente en los organismos, esencial para algún proceso típicamente biológico, tal como la división celular, la morfogénesis o el desarrollo, y puede incluir, pero no se limita a, macromoléculas grandes tales como anticuerpos, antígenos, aptámeros, proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos (fragmentos de ARN y ADN), así como también pequeñas moléculas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Las biomoléculas generalmente son endógenas, pero también pueden ser exógenas. Por ejemplo, los fármacos pueden ser productos naturales o semisintéticos (biofarmacéuticos) o pueden ser totalmente sintéticos.

El término "ligando", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que forma un complejo con una biomolécula para cumplir un propósito biológico. En la unión proteína-ligando, el ligando es típicamente una molécula que produce una señal al unirse a un sitio en una proteína diana. En los estudios de la unión DNA-ligando, el ligando puede ser una molécula pequeña, un ion, una proteína o similar. Típicamente, la unión entre el ligando y la biomolécula se produce por fuerzas intermoleculares, tales como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. La asociación de acoplamiento es en realidad reversible a través de la disociación.

El término "a través de" (como, por ejemplo, se usa en el contexto de "a través de un primer dominio de unión") como se usa en la presente se refiere a una configuración en donde una primera parte del biosensor se fusiona con una segunda parte del biosensor con la interposición de (a través de) una tercera parte del biosensor, en donde esa tercera parte del biosensor en sí está conectada tanto a la primera como a la segunda parte del biosensor o en donde esa tercera parte está conectada a una parte de enlace del biosensor que enlaza la primera y la segunda parte del biosensor.

El término "dominio de luciferasa", como se usa en la presente, se refiere a enzimas oxidativas, incluidos restos o fragmentos de las mismas que producen bioluminiscencia. Los ejemplos incluyen (pero no se limitan a) luciferasa de luciérnaga dividida y NanoLuc, una luciferasa modificada genéticamente derivada de un camarón de aguas profundas. El dominio de luciferasa puede comprender fragmentos de una luciferasa, preferiblemente fragmentos de una luciferasa dividida, cuyos fragmentos complementados forman una luciferasa complementada que tiene actividad de luciferasa. Un ejemplo de dichos fragmentos incluye el fragmento de luciferasa grande dividido NanoLuc y el fragmento de luciferasa pequeño dividido NanoLuc.

Opcionalmente, los dominios de luciferasa son dominios proteicos o polipéptidos capaces de autoensamblarse en un complejo bioluminiscente. Opcionalmente, los dominios de luciferasa son fragmentos de NanoLuc divididos. Opcionalmente, el primer dominio de luciferasa es un dominio de luciferasa grande, preferiblemente un fragmento de luciferasa grande dividido. Además, opcionalmente, los dominios de luciferasa segundo y tercero son dominios de luciferasa pequeños, preferiblemente fragmentos de luciferasa pequeños divididos.

Opcionalmente, el primer dominio de luciferasa se selecciona de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.

Opcionalmente, cada uno de los dominios de luciferasa segundo y tercero se selecciona del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

En una modalidad de la invención, la afinidad del segundo y tercer dominio de luciferasa por el primer dominio de luciferasa es diferente. Preferentemente, el segundo dominio de luciferasa tiene una mayor afinidad en comparación con la afinidad del tercer dominio de luciferasa.

Opcionalmente, la afinidad del segundo dominio de luciferasa tiene una afinidad que es al menos 5 veces mayor, preferentemente entre 10 y 1500 veces mayor, entre 10 y 1000 veces mayor, entre 10 y 100 veces mayor o entre 10 y 50 veces mayor en comparación con la afinidad del tercer dominio de luciferasa.

En una modalidad de la invención, el tercer dominio de luciferasa se fusiona al otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador.

Los términos "enlazador" y "espaciador" como se usa en la presente se refieren a un enlazador adecuado para enlazar el segundo dominio de luciferasa y, opcionalmente, el tercer dominio de luciferasa al primer dominio de luciferasa. La longitud del enlazador y el espaciador opcional depende de la posición de enlace del enlazador y el espaciador opcional con el primer dominio de luciferasa (ya sea que esté enlazado al extremo N o al extremo C del primer dominio de luciferasa) en combinación con el posición del sitio de unión del primer dominio de luciferasa. El contenido del enlazador y el espaciador opcional depende de la flexibilidad deseada del enlazador y el espaciador opcional. La flexibilidad deseada puede variar según el biosensor y el propósito.

Opcionalmente, el espaciador es un polipéptido o fragmento de polipéptido y puede incluir al menos cuatro, al menos seis, al menos ocho o al menos diez repeticiones GGS. Sin embargo, se observa que el número de repeticiones de GGS puede variar en dependencia del propósito y el diseño del biosensor. Incluso el contenido del enlazador puede variar y no está necesariamente restringido al uso de repeticiones GGS.

Opcionalmente, el enlazador es un enlazador semiflexible tal como un polipéptido o un fragmento de polipéptido y puede incluir al menos un bloque flexible de (GSG)6. Además, opcionalmente, el enlazador incluye además al menos un bloque a-helicoidal. Aún más opcionalmente, el enlazador incluye además al menos un bloque a-helicoidal que tiene seis repeticiones EAAAK. Aún más opcionalmente, el enlazador incluye además dos bloques a-helicoidales, cada uno de los cuales tiene seis repeticiones EAAAK. En general, se observa que el enlazador semiflexible se elige de manera que el enlazador tenga suficiente flexibilidad para cambiar el estado del biosensor, es decir, cambiar la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo en las dos conformaciones.

Opcionalmente, el enlazador semiflexible se selecciona de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.

Opcionalmente, el fluoróforo es un compuesto químico fluorescente que puede emitir luz roja tras la excitación de la luz. Además, opcionalmente, el fluoróforo es Cy3.

Opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor adyacente al segundo dominio de luciferasa. Además, opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor entre el enlazador y el segundo dominio de luciferasa. Alternativamente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor adyacente al tercer dominio de luciferasa.

Opcionalmente, la biomolécula puede comprender un anticuerpo, antígeno, proteína o aptámero. Preferentemente, la biomolécula es un anticuerpo.

En un primer aspecto de la invención, ambos dominios de unión están configurados para unirse con la biomolécula, es decir, para unirse competitivamente a uno o más sitios de unión de la biomolécula. Aunque los dominios de unión pueden ser cualquier tipo de dominio de unión que tenga cierta afinidad con el sitio o los sitios de unión de la biomolécula, se prefiere el uso de un dominio de unión que sea un epítopo. Opcionalmente, ambos dominios de unión comprenden los mismos epítopos, es decir, epítopos configurados para unirse intermolecularmente con ambos paratopos de un anticuerpo.

El término "epítopo", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que se une al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, es decir, el paratopo de un anticuerpo. El término "epítopo" como se usa en la presente no se limita a los epítopos naturales existentes per se. El término "epítopo", como se usa en la presente, puede incluir mimotopos que imitan epítopos o péptidos de unión a anticuerpos similares a epítopos que incluyen meditopos o similares, tales como aptámeros y moléculas pequeñas.

El término "meditopos", como se usa en la presente, se refiere a péptidos que reconocen específicamente un anticuerpo uniéndose a una cavidad en la interfaz entre los dominios constante y variable. Se describen ejemplos de meditopos en, por ejemplo, Van Rosmalen (Anal. Chem., 2018, 90, 3592).

Opcionalmente, el epítopo varía basado en la biomolécula (por ejemplo, anticuerpo) que se va a detectar. Por ejemplo, para la detección de anticuerpos anti-HIV-p17, los dos epítopos pueden seleccionarse de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Alternativamente, para la detección de trastuzumab, los dos epítopos pueden comprender un mimotopo y pueden seleccionarse de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N^o : 5, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Además, alternativamente, para la detección de cetuximab, los dos epítopos pueden comprender un meditopo y pueden seleccionarse de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24. Incluso más alternativamente, para la detección del anticuerpo anti-proteína C reactiva (CRP), los dos epítopos pueden seleccionarse de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 (para detectar anticuerpos anti-CRP169) o la SEQ ID NO: 18 (para detectar anticuerpos anti-CRP36), o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 18.

En este primer aspecto de la invención, la invención se refiere además a un método de detección de biomoléculas in vitro, que comprende las etapas de:

- poner en contacto una muestra con el biosensor del primer aspecto de la invención;

- determinar el cambio de luminiscencia del biosensor en presencia de una muestra; y

- determinar el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa y/o cualitativa de una biomolécula.

Al proporcionar un biosensor que tiene un primer y un segundo dominio de luciferasa que interactúan además en combinación con un tercer dominio de luciferasa opcionalmente enlazado al primer dominio de luciferasa, el método de la presente invención proporciona la posibilidad de determinar el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra para definir la presencia o ausencia cuantitativa y/o cualitativa de una biomolécula.

Opcionalmente, la invención se refiere a un método en donde, en ausencia de una biomolécula, el biosensor está en un estado libre de biomoléculas (cerrado) en el que al menos parte del primer dominio de luciferasa se complementa con el segundo dominio de luciferasa. En caso de que el fluoróforo esté junto al segundo dominio de luciferasa, en el estado libre de biomoléculas, el fluoróforo está muy cerca de la luciferasa complementada formada por el primer dominio de luciferasa y el segundo dominio de luciferasa.

Opcionalmente, la invención se refiere a un método en donde, en presencia de una biomolécula, la unión entre los dominios de unión del biosensor y la biomolécula cambia el equilibrio entre el estado libre de biomoléculas (cerrado) del biosensor y un estado unido a biomoléculas (abierto) de manera que cambia la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo. En caso de que el fluoróforo esté al lado del segundo dominio de luciferasa, la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo disminuye en el estado unido a la biomolécula en comparación con el biosensor en el estado libre de biomolécula.

En un segundo aspecto de la invención, el primer dominio de unión se configura para formar un sistema conjugado con la biomolécula. En tal configuración, el segundo dominio de unión se configura para unirse a un sitio de unión al ligando de la biomolécula. Opcionalmente, la biomolécula se une covalentemente al primer dominio de unión del biosensor. Además, opcionalmente, la biomolécula comprende un anticuerpo en donde la región Fc del anticuerpo se une covalentemente al primer dominio de unión del biosensor.

Los términos "sistema conjugado", "conjugación", "unión conjugada" y similares, tal como se usan en la presente, se refieren a un estado de unión del biosensor de la invención y la biomolécula en donde la afinidad entre el biosensor y la biomolécula se selecciona de manera que la unión del ligando a la biomolécula y cualquier otro componente presente en la muestra a analizar no compiten con la unión de la conjugación formada entre el biosensor y la biomolécula. Preferentemente, pero no necesariamente, la unión conjugada entre el biosensor y la biomolécula es una unión covalente. Sin embargo, la unión del conjugado entre el biosensor y la biomolécula puede seleccionarse de manera que la afinidad entre el biosensor y la biomolécula sea suficientemente alta en comparación con la afinidad entre el biosensor (segundo dominio de unión) y el sitio de unión al ligando de la biomolécula.

El término "sitio de unión al ligando" como se usa en la presente se refiere a una parte de la biomolécula adecuada para unirse a un ligando específico de biomolécula (por ejemplo, biomarcador basado en proteína o molécula pequeña o similar). Además, el sitio de unión al ligando se une al segundo dominio de unión (unión competitiva) del biosensor de la invención.

Opcionalmente, el sitio de unión al ligando de la biomolécula comprende un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.

Similar al primer aspecto de la invención, en el segundo aspecto de la invención, el segundo dominio de unión del biosensor de la invención puede configurarse para unirse con la biomolécula, es decir, para unirse competitivamente a uno de los sitios de unión de la biomolécula. Aunque el segundo dominio de unión puede ser cualquier tipo de dominio de unión que tenga cierta afinidad con uno o más sitios de unión de la biomolécula, se prefiere el uso de un dominio de unión que sea un epítopo.

En este segundo aspecto de la invención, la invención se refiere además a un método de detección de ligandos in vitro, que comprende las etapas de:

- poner en contacto una muestra con el biosensor del segundo aspecto de la invención;

- determinar el cambio de luminiscencia del biosensor en presencia de una muestra; y

- determinar el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa y/o cualitativa de un ligando.

Opcionalmente, la invención se refiere a un método en donde, en ausencia de un ligando, la biomolécula se une al segundo dominio de unión e interrumpe la interacción del segundo dominio de luciferasa con el primer dominio de luciferasa. En caso de que el fluoróforo esté al lado del segundo dominio de luciferasa, en el estado unido a la biomolécula, el fluoróforo no está muy cerca de la luciferasa complementada formada por el primer dominio de luciferasa y el tercer dominio de luciferasa, lo que da como resultado una BRET bajo entre la luciferasa complementada y el fluoróforo.

Opcionalmente, la invención se refiere a un método en donde, en presencia de un ligando, el biosensor se encuentra en un estado unido al ligando, lo que permite que al menos parte del primer dominio de luciferasa se complemente con el segundo dominio de luciferasa. En caso de que el fluoróforo esté al lado del segundo dominio de luciferasa, la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo aumenta en el estado unido al ligando en comparación con el biosensor en el estado unido a la biomolécula.

En un tercer aspecto de la invención, la invención se refiere a un estuche de partes que comprende el biosensor de la invención (tanto el primer como el segundo aspecto de la invención) en donde el biosensor comprende un primer dominio de luciferasa fusionado con un segundo dominio de luciferasa a través de un enlazador semiflexible que contiene dos dominios de unión en los extremos del enlazador, y en donde el estuche de partes comprende además un tercer dominio de luciferasa.

Opcionalmente, el estuche de partes está en forma de una solución que comprende al menos el biosensor y el tercer dominio de luciferasa. Además, opcionalmente, la concentración del tercer dominio de luciferasa es significativamente mayor en comparación con la concentración del biosensor presente en la solución.

Opcionalmente, el estuche de partes comprende un material inerte con el biosensor y el tercer dominio de luciferasa unido al mismo. El material inerte puede ser cualquier tipo de material adecuado para el propósito previsto de detectar biomoléculas o ligandos en solución. La configuración de la unión del biosensor de la invención y el tercer dominio de luciferasa puede ser de manera que el tercer dominio de luciferasa esté muy cerca del sitio de unión del primer dominio de luciferasa del biosensor.

La descripción detallada de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Dentro de esta invención, presentamos un nuevo enfoque que permite la detección en una sola etapa de biomoléculas (o dianas analíticas, como anticuerpos) directamente en solución mediante el uso de la complementación intramolecular de luciferasa dividida. El diseño del sensor es altamente modular e incluye un gran fragmento de luciferasa fusionado con dos pequeños fragmentos de luciferasa. Un pequeño fragmento de luciferasa se fusiona a un extremo del fragmento grande de luciferasa a través de un enlazador de repeticiones GGS flexible. Otro fragmento pequeño de luciferasa se fusiona al otro extremo del fragmento grande de luciferasa a través de un enlazador semiflexible que contiene dos epítopos de unión a anticuerpos en los extremos del enlazador. Este interruptor de proteína puede existir en dos conformaciones, en las que el fragmento pequeño N- o el C-terminal se unen al dominio grande de luciferasa dividido grande y complementa la actividad de la luciferasa. Un colorante aceptor fluorescente (también conocido como 'fluoróforo') se conjuga junto a uno de los dos dominios de luciferasa pequeños, lo que da como resultado una BRET eficiente en solo una de las dos conformaciones. La unión bivalente de un anticuerpo a dos secuencias de epítopos que flanquean el enlazador semiflexible interrumpe la interacción de los pequeños dominios de luciferasa marcados con fluorescencia, lo que permite la complementación de la actividad de la luciferasa con el fragmento de luciferasa pequeño no marcado con fluorescencia, lo que da como resultado una disminución de la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo que puede monitorearse mediante el uso de lecturas luminiscentes simples. Mediante el uso del anticuerpo anti-HIV1 p17 como una diana ilustrativa, la afinidad intramolecular de los fragmentos de luciferasa divididos se optimizó para producir un sensor bioluminiscente cuyo rango dinámico alcanzó el 493 % en presencia de concentraciones pM del anticuerpo diana (kd=10 pM). Puede obtenerse un sensor que se dirige a un anticuerpo completamente diferente simplemente al reemplazar la secuencia del epítopo, con la posibilidad de personalizar aún más el rendimiento de este sensor al ajustar las afinidades intramoleculares de las partes divididas.

La invención se refiere a un método de detección en el que se usa un biosensor para detectar biomoléculas (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, proteínas, etc.). En particular, esta invención se refiere a un método de detección en el que se usa un biosensor para detectar anticuerpos. El biosensor es un fragmento de luciferasa grande dividido enlazado a dos fragmentos de luciferasa pequeños divididos a través de un enlazador de repeticiones GGS flexible y un enlazador semiflexible que tiene dos epítopos en los extremos del enlazador.

Se observa que la longitud y el contenido exactos de estos enlazadores dependen de la conformación y configuración del biosensor como tal. Tanto el enlazador semiflexible como el enlazador flexible deben ser lo suficientemente largos y flexibles para permitir la complementación intramolecular. En este caso, la flexibilidad de los enlazadores puede variarse para optimizar aún más los sistemas específicos de biosensores.

Aquí se proporciona un método de detección de anticuerpos in vitro. El método implica poner en contacto una muestra con un biosensor. El biosensor incluye un fragmento grande de luciferasa, dos fragmentos pequeños de luciferasa, al menos un colorante aceptor fluorescente, un enlazador de repeticiones GGS flexible y un enlazador semiflexible que contiene dos epítopos con afinidad por el anticuerpo. El método implica además determinar el cambio de luminiscencia del biosensor en presencia de una muestra, y atribuir el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa o cualitativa de un anticuerpo. En ausencia del anticuerpo, el biosensor se encuentra en un estado libre de anticuerpos (estado cerrado) en el que al menos algunos de los fragmentos de luciferasa grandes divididos se complementan con fragmentos de luciferasa pequeños divididos conectados a través del enlazador semiflexible que contiene dos epítopos y el fluoróforo está espaciado cerca (muy cerca) de la luciferasa complementada. En otras palabras, hay una BREt relativamente alta entre la luciferasa y el fluoróforo y el biosensor muestra una relación de emisión de luminiscencia relativamente alta de fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a luciferasa (por ejemplo, luz azul). Una unión bivalente entre dos dominios de unión a antígeno presentes en el anticuerpo y los dos epítopos presentes en los extremos del enlazador semiflexible cambia el equilibrio entre el estado libre de anticuerpos y un estado unido a anticuerpos (estado abierto) del biosensor de manera que la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo disminuye y el biosensor muestra una relación de emisión de luminiscencia de luz roja a azul relativamente baja.

También se describe un método de detección de anticuerpos in vitro. En este método, una muestra se pone en contacto con un biosensor que puede desplazarse entre un estado libre de anticuerpos (cerrado) y un estado unido a anticuerpos (abierto). El biosensor incluye tres fragmentos de la luciferasa divididos (por ejemplo, pero no limitado a NanoLuc), dos epítopos que tienen afinidad por el anticuerpo, al menos un fluoróforo (por ejemplo, pero no limitado a Cy3), un enlazador semiflexible que separa los dos epítopos y un enlazador de repeticiones GGS flexible. Este método implica además determinar la luminiscencia de la luciferasa y el fluoróforo en presencia de la muestra, y atribuir la luminiscencia de la luciferasa y el fluoróforo en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa o cualitativa del anticuerpo. En el estado libre de anticuerpos (cerrado), existe una alta BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo y, por lo tanto, una alta proporción de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a la luciferasa (por ejemplo, luz azul). La unión de un anticuerpo a los dos epítopos cambia el equilibrio entre el estado libre de anticuerpos y el estado unido a anticuerpos del biosensor, lo que hace, de esta manera, que el biosensor pase del estado libre de anticuerpos al estado unido a anticuerpos, de manera que la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo disminuye y se observa una baja relación de emisión de luminiscencia de luz roja a azul.

También se describe un biosensor desplazable entre un estado libre de biomoléculas (cerrado) y un estado unido a biomoléculas (abierto). El biosensor incluye un fragmento de luciferasa grande dividido, dos fragmentos de luciferasa pequeños divididos, al menos un fluoróforo, dos epítopos, un enlazador semiflexible que separa los dos epítopos y un enlazador de repeticiones GGS flexible.

El término "desplazable", como se usa en la presente, se refiere a la adecuación del biosensor para tener diferentes conformaciones (estados). La capacidad de desplazamiento del biosensor se refiere a la libertad de los fragmentos de luciferasa pequeños divididos para unirse al fragmento de luciferasa grande dividido o para colocarse a cierta distancia del sitio de unión del fragmento de luciferasa grande dividido, en donde la distancia está determinada por el enlazador. (enlazador semiflexible o flexible) fusionado con el respectivo fragmento de luciferasa pequeño dividido. Opcionalmente, en ausencia del anticuerpo, el biosensor está en estado cerrado. Además, opcionalmente, en ausencia de un anticuerpo, el biosensor está en el estado cerrado, de manera que al menos algunos de los fragmentos grandes de luciferasa se complementan con el fragmento pequeño de luciferasa conectado a través del enlazador que contiene dos epítopos y el fluoróforo está espaciado cerca de la luciferasa complementada. Aún más opcionalmente, en el estado cerrado, el fluoróforo está espaciado cerca de la luciferasa complementada, de manera que hay una alta BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo y una alta relación de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a luciferasa (por ejemplo, luz azul).

Opcionalmente, la unión de un anticuerpo a los dos epítopos cambia el equilibrio entre el estado cerrado (anticuerpo libre) y abierto (anticuerpo unido) del biosensor, lo que, de esta manera, lleva al biosensor del estado cerrado al estado abierto, de manera que la BRET entre el fluoróforo y la luciferasa complementada disminuye y se observa una baja relación de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a luciferasa (por ejemplo, luz azul).

Opcionalmente, en presencia de un anticuerpo, el biosensor está en estado abierto. Además, opcionalmente, en presencia de un anticuerpo, una unión bivalente entre dos dominios de unión a antígeno presentes en dicho anticuerpo y los dos epítopos presentes en los extremos del enlazador en el biosensor conduce al biosensor al estado abierto. Aún más opcionalmente, en el estado abierto, el fluoróforo está separado de la luciferasa complementada, lo que, de esta manera, da como resultado la disminución de la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo y una relación de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a luciferasa (por ejemplo, luz azul).

Opcionalmente, la relación de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a la luciferasa (por ejemplo, luz azul) es proporcional a la presencia o ausencia cuantitativa o cualitativa del anticuerpo.

Opcionalmente, los fragmentos de luciferasa grandes y pequeños divididos son dominios proteicos o polipéptidos capaces de autoensamblarse en un complejo bioluminiscente. Opcionalmente, los fragmentos de luciferasa divididos son fragmentos de NanoLuc divididos.

Opcionalmente, el fragmento de luciferasa grande dividido se selecciona de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.

Opcionalmente, cada uno de los fragmentos de la luciferasa pequeños divididos se selecciona del grupo de secuencias de aminoácidos que cosiste de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

En un ejemplo, la afinidad de los dos fragmentos de luciferasa pequeños divididos por el fragmento de luciferasa grande dividido difiere. Preferentemente, el fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el fragmento de luciferasa grande dividido a través del enlazador semiflexible flanqueado por los dos epítopos tiene una mayor afinidad en comparación con la afinidad del fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el fragmento de luciferasa grande dividido a través del enlazador de repeticiones GGS flexible.

Opcionalmente, la afinidad del fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el fragmento de luciferasa grande dividido a través del enlazador semiflexible flanqueado por los dos epítopos tiene una afinidad que es al menos 5 veces mayor, preferentemente entre 10 y 1500 veces mayor, entre 10 y 1000 veces mayor, entre 10 y 100 veces mayor o entre 10 y 50 veces mayor en comparación con la afinidad del fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el fragmento de luciferasa grande dividido a través del enlazador de repeticiones GGS flexible.

Opcionalmente, los dos epítopos son polipéptidos o fragmentos de polipéptidos que tienen afinidad por el anticuerpo y que pueden unirse, opcionalmente unirse selectivamente, al anticuerpo, opcionalmente a los fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo.

Opcionalmente, el enlazador semiflexible es un polipéptido o fragmento de polipéptido que incluye al menos un bloque flexible de (GSG)6. Además, opcionalmente, el enlazador incluye además al menos un bloque a-helicoidal. Aún más opcionalmente, el enlazador incluye además al menos un bloque a-helicoidal que tiene seis repeticiones EAAAK. Aún más opcionalmente, el enlazador incluye además dos bloques a-helicoidales, cada uno de los cuales tiene seis repeticiones EAAAK. En general, se observa que el enlazador semiflexible se elige de manera que el enlazador tenga suficiente flexibilidad para cambiar el estado del biosensor, es decir, desde un estado libre de la biomolécula diana en donde el fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el enlazador semiflexible está unido al fragmento de luciferasa grande dividido, a un estado unido a la biomolécula en donde los epítopos que flanquean el enlazador semiflexible están unidos al sitio o sitios de unión de la biomolécula (por ejemplo, sitio de unión a antígeno de un anticuerpo).

Opcionalmente, cada epítopo está ubicado en cada extremo respectivo del enlazador semiflexible. Además, opcionalmente, el fragmento de luciferasa grande dividido y uno de los fragmentos de luciferasa pequeño dividido se ubican en cada extremo respectivo del enlazador. Aún más óptimamente, un primer epítopo y el fragmento de luciferasa grande dividido se ubican en un primer extremo del enlazador, y un segundo epítopo y el fragmento de luciferasa pequeño dividido se ubican en un segundo extremo opuesto del enlazador.

Opcionalmente, el enlazador flexible es un polipéptido o un fragmento de polipéptido que incluye al menos diez repeticiones GGS. Sin embargo, se observa que el número de repeticiones de GGS puede variar. Incluso el contenido del enlazador puede variar y no está necesariamente restringido al uso de repeticiones GGS. El contenido y la longitud del enlazador dependen de la configuración del fragmento de luciferasa grande dividido y de la posición de enlace del fragmento de luciferasa pequeño dividido fusionado con el enlazador flexible, con el fragmento de luciferasa grande dividido (en dependencia de qué terminal del fragmento de luciferasa grande dividido se usa para vincular el enlazador flexible).

Opcionalmente, el fluoróforo es un compuesto químico fluorescente que puede emitir luz roja tras la excitación de la luz. Además, opcionalmente, el fluoróforo es Cy3.

Opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor. Además, opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor adyacente al fragmento de luciferasa pequeño dividido que se conecta a través del enlazador semiflexible. Además, opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor entre el enlazador semiflexible y el fragmento de luciferasa pequeño dividido. Alternativamente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor adyacente al fragmento de luciferasa pequeño dividido que se conecta a través del enlazador flexible. En dicha configuración alternativa, se observa que en un estado libre de anticuerpos, la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo disminuye y se observa una baja relación de emisión de luminiscencia del fluoróforo (por ejemplo, luz roja) a luciferasa (por ejemplo, luz azul), mientras que en un estado unido al anticuerpo, el fluoróforo junto al fragmento de luciferasa pequeño dividido que se conecta a través del enlazador flexible está muy cerca de la luciferasa complementada, lo que da como resultado un aumento de la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo.

En un ejemplo, el fluoróforo se incorpora en el biosensor a través de un acoplamiento de maleimida al grupo tiol libre de la cisteína en el biosensor. Opcionalmente, el fluoróforo se incorpora en el biosensor entre el fragmento de luciferasa pequeño dividido y el enlazador semiflexible a través de un acoplamiento de maleimida al grupo tiol libre de la cisteína en el biosensor. En otras palabras, la posición del fluoróforo en el biosensor, es decir, antes (entre el enlazador semiflexible y el fragmento de luciferasa pequeño dividido) y/o después del fragmento de luciferasa pequeño dividido, está controlada por la introducción de la cisteína en la secuencia de aminoácidos del biosensor.

En otro ejemplo, el fluoróforo se incorpora en el biosensor a través de un acoplamiento de alquino al grupo azida del aminoácido no canónico para-azidofenilalanina (pAzF) en el biosensor. Opcionalmente, el fluoróforo se incorpora en el biosensor entre el fragmento de luciferasa pequeño dividido y el enlazador semiflexible a través de un acoplamiento alquino al grupo azida de la para-azidofenilalanina en el biosensor. Opcionalmente, la paraazidofenilalanina se incorporó bioortogonalmente en el biosensor en las posiciones deseadas mediante el uso del codón de parada ámbar (TAG). En otras palabras, la posición del fluoróforo en el biosensor, es decir, antes (entre el enlazador semiflexible y el fragmento de luciferasa pequeño dividido) y/o después del fragmento de luciferasa pequeño dividido, está controlada por la introducción del codón de parada ámbar (TAG) en la secuencia de aminoácidos del biosensor.

Además de la detección de anticuerpos, el biosensor de la presente invención así como también el método de detección de la presente invención pueden aplicarse igualmente a la detección de otras biomoléculas. Por ejemplo, el uso del sensor de forma competitiva permite la detección de antígenos, moléculas pequeñas y otros biomarcadores (por ejemplo, proteína c reactiva).

También dentro de esta invención, presentamos un nuevo enfoque que permite la detección en una sola etapa de moléculas pequeñas, biomarcadores basados en proteínas o similares directamente en solución mediante el uso de la complementación intramolecular de luciferasa dividida en donde el biosensor se conjuga con una biomolécula (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, proteína, aptámero, etc.) en donde la biomolécula comprende un sitio de unión para unir un ligando (por ejemplo, molécula pequeña, biomarcador basado en proteínas o similar). El biosensor es altamente modular e incluye un enlazador, por ejemplo, el enlazador semiflexible de la presente invención, que comprende un primer extremo y un segundo extremo, en donde el primer extremo del enlazador está fusionado con un extremo de un primer dominio de luciferasa, tal como el dominio de luciferasa grande (dividido) de la presente invención, a través de un primer dominio de unión, y en el que el segundo extremo del enlazador se fusiona a un segundo dominio de luciferasa, como el dominio de luciferasa pequeño (dividido) de la presente invención, a través de un segundo dominio de unión. El biosensor podría comprender opcionalmente un tercer dominio de luciferasa, como el dominio de luciferasa pequeño (dividido) de la presente invención, fusionado con el otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador, por ejemplo, el enlazador de repeticiones GGS flexible de la presente invención. El primer dominio de unión se configura para formar un sistema conjugado con la biomolécula (por ejemplo, un anticuerpo), mientras que el segundo dominio de unión se configura para unirse al sitio de unión al ligando de la biomolécula (por ejemplo, el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo). El biosensor existe en dos conformaciones, en las que el segundo dominio de luciferasa o, en caso de estar presente, el tercer dominio de luciferasa se une al primer dominio de luciferasa para formar una luciferasa complementada y complementa la actividad de la luciferasa. Además, se conjuga un colorante aceptor fluorescente (fluoróforo) junto a uno de los dominios de luciferasa segundo o tercero, por ejemplo, uno de los dos dominios de luciferasa pequeños de la presente invención, lo que da como resultado una transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) eficiente entre la luciferasa y el fluoróforo en una sola de las dos conformaciones.

En ausencia de un ligando (por ejemplo, molécula pequeña o biomarcador basado en proteínas), la biomolécula se conjuga con el primer dominio de unión y el sitio de unión del ligando de la biomolécula se une al segundo dominio de unión e interrumpe la interacción del segundo dominio de luciferasa con el primer dominio de luciferasa y por lo tanto permite la interacción del tercer dominio de luciferasa, en caso de estar presente, con el primer dominio de luciferasa. En caso de que el segundo dominio de luciferasa sea el dominio de luciferasa marcado con fluorescencia, la complementación de la actividad de luciferasa por el tercer dominio de luciferasa no marcado con fluorescencia da como resultado una disminución en la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo que puede monitorearse mediante el uso de lecturas luminiscentes simples. Alternativamente, en caso de que el tercer dominio de luciferasa sea el dominio de luciferasa marcado con fluorescencia, la complementación de la actividad de la luciferasa por el tercer dominio de luciferasa marcado con fluorescencia da como resultado un aumento en la BRET entre la luciferasa complementada y el fluoróforo que puede monitorearse mediante el uso de lecturas luminiscentes simples.

En la presencia de un ligando, se interrumpe la unión de la biomolécula (por ejemplo, un anticuerpo) al segundo dominio de unión del biosensor, lo que permite que el segundo dominio de luciferasa interactúe con el primer dominio de luciferasa. En caso de que el segundo dominio de unión sea el dominio de luciferasa marcado con fluorescencia, la complementación de la actividad de la luciferasa por el segundo dominio de luciferasa marcado con fluorescencia da como resultado un aumento en la BRET entre la luciferasa y el fluoróforo que puede monitorearse mediante el uso de lecturas luminiscentes simples.

En una modalidad de la invención, se proporciona un biosensor conjugado con anticuerpos. El biosensor conjugado con anticuerpo que incluye un enlazador, por ejemplo, el enlazador semiflexible de la presente invención, que comprende un primer extremo y un segundo extremo, en donde el primer extremo del enlazador está fusionado con un extremo de un primer dominio de luciferasa, tal como el dominio de luciferasa grande (dividido) de la presente invención, a través de un dominio de unión que se conjuga con el anticuerpo, y en donde el segundo extremo del enlazador se fusiona con un segundo dominio de luciferasa, tal como el dominio de luciferasa pequeño (dividido) de la presente invención, a través de un epítopo de unión a anticuerpo. El biosensor podría comprender opcionalmente un tercer dominio de luciferasa, como el dominio de luciferasa pequeño (dividido) de la presente invención, fusionado con el otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador, por ejemplo, el enlazador de repeticiones GGS flexible de la presente invención. El dominio de unión que se conjuga con el anticuerpo se configura para formar un sistema conjugado con un anticuerpo, mientras que el epítopo de unión a anticuerpo se configura para unirse al sitio de unión del anticuerpo (por ejemplo, uno de los paratopos del anticuerpo). El biosensor existe en dos conformaciones, en las que el segundo dominio de luciferasa o el tercer dominio de luciferasa (ya sea enlazado al primer dominio de luciferasa o presente como componente, por ejemplo, en una solución que comprende el biosensor conjugado con anticuerpo) se une al primer dominio de luciferasa para formar una luciferasa complementada y complementar la actividad de la luciferasa. Además, se conjuga un colorante aceptor fluorescente (fluoróforo) junto a uno de los dominios de luciferasa segundo o tercero, por ejemplo, uno de los dos dominios de luciferasa pequeños de la presente invención, lo que da como resultado una transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) eficiente entre la luciferasa y el fluoróforo en una sola de las dos conformaciones. Preferentemente, el fluoróforo se conjuga junto al segundo dominio de luciferasa.

Opcionalmente, el primer dominio de unión o el dominio de unión que se conjuga con el anticuerpo comprenden ligandos de afinidad de la región Fc del anticuerpo. Los ligandos de afinidad de la región Fc del anticuerpo pueden seleccionarse del grupo que consiste en proteínas de unión a inmunoglobulina (naturales), productos derivados de inmunoglobulina, tales como versiones modificadas genéticamente de proteínas de unión a inmunoglobulina, proteínas de unión artificiales, péptidos (cortos), aptámeros y compuestos sintéticos de bajo peso molecular. Los ejemplos de dichos ligandos de afinidad de la región Fc del anticuerpo se describen, por ejemplo, en Kruljec, y otros (Bioconjugate Chem. 2017, 28, 2009). Opcionalmente, el primer dominio de unión o el dominio de unión que se conjuga con el anticuerpo es una proteína de unión a inmunoglobulina. Además, opcionalmente, el primer dominio de unión o el dominio de unión que conjuga con el anticuerpo es un dominio derivado de proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.

El término "ligandos de afinidad de la región Fc del anticuerpo" como se usa en la presente se refiere a ligandos que tienen afinidad por al menos el sitio de unión de la región Fc de un anticuerpo. Preferentemente, los ligandos de afinidad de la región Fc del anticuerpo de la invención tienen una mayor afinidad por el sitio de unión de la región Fc de un anticuerpo en comparación con la afinidad de los ligandos por otro sitio de unión, por ejemplo, el sitio de unión de la región Fab, de ese mismo anticuerpo.

Opcionalmente, el segundo dominio de unión se configura para proporcionar una competencia entre la unión intermolecular del segundo dominio de unión y el ligando (por ejemplo, biomarcador basado en proteína o molécula pequeña) a un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo específico de ligando. Por tanto, el segundo dominio de unión puede seleccionarse del grupo que consiste en ligandos del sitio de unión al antígeno del anticuerpo que incluyen epítopos, meditopos, mimotopos, proteínas de unión artificiales, péptidos (cortos), análogos de bajo peso molecular o similares. Preferentemente, el segundo dominio de unión comprende un epítopo de unión a anticuerpo o un análogo de bajo peso molecular de unión a anticuerpo.

El término "ligandos del sitio de unión al antígeno del anticuerpo" como se usa en la presente se refiere a ligandos que tienen afinidad por al menos el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Preferentemente, los ligandos del sitio de unión al antígeno del anticuerpo de la invención que tienen una mayor afinidad por el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo en comparación con la afinidad de los ligandos por otro sitio de unión, por ejemplo, sitios de unión de la región Fab o la región Fc, de ese mismo anticuerpo. Para proporcionar competencia entre los ligandos del sitio de unión al antígeno del anticuerpo de la invención y el analito de interés (por ejemplo, biomarcador basado en proteínas o moléculas pequeñas), la unión de los ligandos al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo es reversible.

Opcionalmente, el segundo dominio de unión es un epítopo de unión a anticuerpos. Por ejemplo, el epítopo de unión al anticuerpo puede seleccionarse del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, o que tenga una identidad de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24.

Opcionalmente, el fluoróforo es un compuesto químico fluorescente que puede emitir luz roja tras la excitación de la luz. Además, opcionalmente, el fluoróforo es Cy3.

Opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor. Además, opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor adyacente al segundo dominio de luciferasa. Además, opcionalmente, el fluoróforo se conjuga con el biosensor entre el enlazador y el segundo dominio de luciferasa.

En una modalidad de la invención, el fluoróforo se incorpora en el biosensor a través de un acoplamiento de maleimida al grupo tiol libre de la cisteína en el biosensor. Opcionalmente, el fluoróforo se incorpora en el biosensor entre el segundo dominio de luciferasa y el enlazador a través de un acoplamiento de maleimida al grupo tiol libre de la cisteína en el biosensor. En otras palabras, la posición del fluoróforo en el biosensor, es decir, antes (entre el enlazador y el segundo dominio de luciferasa) y/o después del segundo dominio de luciferasa, está controlada por la introducción de la cisteína en la secuencia de aminoácidos del biosensor.

En otra modalidad de la invención, el fluoróforo se incorpora en el biosensor a través de un acoplamiento de alquino al grupo azida del aminoácido no canónico para-azidofenilalanina (pAzF) en el biosensor. Opcionalmente, el fluoróforo se incorpora en el biosensor entre el segundo dominio de luciferasa y el enlazador a través de un acoplamiento de alquino al grupo azida de la para-azidofenilalanina en el biosensor. Opcionalmente, la paraazidofenilalanina se incorporó bioortogonalmente en el biosensor en las posiciones deseadas mediante el uso del codón de parada ámbar (TAG). En otras palabras, la posición del fluoróforo en el biosensor, es decir, antes (entre el enlazador y el segundo dominio de unión) y/o después del segundo dominio de unión, está controlada por la introducción del codón de parada ámbar (codón TAG) en la secuencia de aminoácidos del biosensor.

Opcionalmente, el fluoróforo es parte del segundo dominio de unión. En particular, en el caso de que el segundo dominio de unión comprenda un análogo de molécula pequeña para unirse al sitio de unión al antígeno del anticuerpo conjugado con el primer dominio de unión del biosensor, el análogo de molécula pequeña puede fusionarse con el enlazador a través del fluoróforo.

Por ejemplo, el segundo dominio de unión puede comprender un análogo de molécula pequeña seleccionado del grupo que consiste en análogos de metotrexato para detectar el fármaco de quimioterapia metotrexato (MTX). Preferentemente, el fluoróforo se usa para conjugar el análogo de metotrexato con la cisteína en el biosensor a través del fluoróforo (Figura 7).

Modalidades ilustrativas de la invención

El biosensor puede contener un fragmento de luciferasa grande dividido (LBiT), dos fragmentos de luciferasa divididos pequeños (SBiT1 y SBiT2) y un fluoróforo sintético. El LBiT se conecta a SBiT2 a través de un enlazador semiflexible largo y el fluoróforo se introduce adyacente al SBiT2, para formar un complejo bioluminiscente complementado en ausencia de su anticuerpo diana con la BRET eficiente entre el complejo bioluminiscente y el fluoróforo (Figura 1). Los epítopos peptídicos específicos del anticuerpo de interés se incluyen en el enlazador semiflexible, uno junto a LBiT y el otro adyacente a SBiT2. El otro terminal de LBiT se fusiona con SBiT1 a través de un enlazador corto y flexible. La unión de un solo anticuerpo a ambos epítopos separa el complejo bioluminiscente complementado y aleja el fluoróforo. Mientras tanto, el LBiT se ensambla con el SBiT1 atado a través del enlazador corto y flexible y forma el complejo bioluminiscente. Esto da como resultado una disminución de la eficiencia de la BRET entre el complejo bioluminiscente y el fluoróforo.

Alternativamente, el biosensor puede conjugarse con una región Fc de un anticuerpo a través de la proteína G incluida en el enlazador semiflexible junto al fragmento grande (LBiT) (Figura 5). El sitio de unión al antígeno del anticuerpo conjugado con el biosensor a través de la proteína G se une a un epítopo peptídico (Figura 5A) o a un análogo de molécula pequeña (Figura 5B) incluido en el enlazador semiflexible adyacente al fragmento pequeño (SBiT2). La unión de un analito de interés (por ejemplo, una molécula pequeña o un biomarcador de proteína) al sitio de unión al antígeno del anticuerpo conjugado con el biosensor permite al fragmento pequeño 2 (SBiT2) formar el complejo bioluminiscente complementado al acercar el fluoróforo al fragmento grande (LBiT). Esto da como resultado un aumento de la eficiencia de la BRET entre el complejo bioluminiscente y el fluoróforo.

La viabilidad de la tecnología de esta invención se demostró mediante el uso de NanoLuc dividida. La afinidad entre LBiT y SBiT se moduló para producir sensores bioluminiscentes de una sola proteína que permiten la detección de concentraciones pM de anticuerpos específicos con un gran cambio de señal o concentraciones mM de biomarcadores de proteínas o moléculas pequeñas con un gran cambio de señal. Además, la arquitectura modular de estos sensores permite cambiar la especificidad de la diana mediante el simple intercambio de secuencias de epítopos y el ajuste sistemático de la respuesta del sensor mediante el ajuste de las afinidades relativas de los fragmentos SBiT.

Descripción de las figuras

La Figura 1A muestra un sensor de anticuerpos basado en la interrupción inducida por anticuerpos de un complejo intramolecular entre fragmentos de luciferasa divididos que da como resultado un cambio en la eficiencia de la BRET. El sensor está marcado con un fluoróforo (estrella). La unión de un anticuerpo a los epítopos en el enlazador semiflexible separa el fluoróforo y la luciferasa y cambia el color de la emisión de rojo a azul.

La Figura 1B muestra una estructura esquemática de la secuencia del sensor de NB-LUMABS-1

La Figura 2A muestra los espectros de luminiscencia del sensor de 1 pM en ausencia (línea roja; •) y presencia (línea azul; ■) de anticuerpo anti-HIV1-p17 1,25 nM. (B) Titulación de anticuerpos a una concentración de sensor de 1 pM. Las barras de error representan la media ± SD (n=3).

La Figura 2B muestra la titulación de anticuerpos a una concentración de sensor de 1 pM. Las barras de error representan la media ± SD (n=3).

La Figura 3 muestra la caracterización de NB-LUMABS-2, -3, -4 (Figura 3A), -5, -6, -7 (Figura 3B) incluidos los espectros de luminiscencia del sensor de 1 pM en ausencia (línea roja; •) y presencia (línea azul; ■) de anticuerpo anti-VIH1-p17 1,25 nM y la titulación del anticuerpo a una concentración de sensor de 1 pM. Las barras de error representan la media ± SD (n=2).

La Figura 4 muestra la caracterización de TRAS-NB-LUMSABS-1, -2 y -3, incluidos los espectros de luminiscencia del sensor de 100 pM en ausencia (línea roja; •) y presencia (línea azul; ■) de trastuzumab 1 pM y la titulación del anticuerpos a una concentración de sensor de 100 pM. Las barras de error representan la media ± SD (n=3).

La Figura 5 muestra sensores pG-NB-LUMABS que permiten la detección bioluminiscente radiométrica de, en principio, cualquier ligando. La Figura 5A muestra la detección de CRP como un ejemplo de un biomarcador de proteína. La Figura 5B muestra la detección de una molécula pequeña. La detección se basa en la competencia entre la unión intermolecular de un epítopo peptídico (Figura 5A) o un análogo de molécula pequeña (Figura 5B) y el ligando a una biomolécula específica de ligando (por ejemplo, anticuerpo monoclonal). La Figura 5C muestra una descripción general esquemática del vector pG-NB-LUMABS pET28a(+), con un marcador de His en N-terminal y un marcador Estreptavidina en C-terminal para la purificación.

La Figura 6 muestra la caracterización de las variantes de CTX-NB-LUMABS. Espectros de luminiscencia del sensor de 100 pM en ausencia (línea roja; •) y presencia (línea azul; ■) de cetuximab 8,3 pM. La titulación de anticuerpos del sensor a 100 pM en tampón PBS (pH 7,4, 1 mg/mL de BSA). Las barras de error representan la media ± SEM (n=3). Las líneas rojas (•) representan ajustes a la ecuación 1.

La Figura 7 muestra un MTX-pG-NB-LUMABS para la detección de la molécula pequeña de metotrexato.

La Figura 8 muestra los espectros de luminiscencia de pG-NB-LUMABS-17 2 nM en presencia y ausencia de péptido 17 sin purificar 0,8 mM (Figura 8A) y la relación de emisión de pG-NB-LUMABS-epítopo 17 a 2 nM al aumentar la concentración de péptido 17.

Diseño de sensores

La Figura 1 muestra el diseño general del sensor. En este ejemplo, se eligió NanoLuc dividida como indicador de complementación porque el complejo complementado es azul luminiscente y hay una variedad de variantes de SBiT disponibles con afinidades entre 0,7 nM y 190 pM hacia LBiT (Dixon, y otros ^a C^s Chem. Biol., 2016, 11, 400; SEQ ID NO: 19).

En un diseño ilustrativo, nos enfocamos en desarrollar un sensor para la detección del anticuerpo anti-HIV1-p17. Varias secuencias de epítopos lineales bien caracterizadas están disponibles para este anticuerpo, lo que lo ha convertido en una opción popular para el desarrollo de nuevos ensayos de detección de anticuerpos homogéneos. El enlazador entre LBiT y SBiT1 tiene bloques flexibles de (GGS)™. El enlazador entre LBiT y SBiT2 inicialmente tiene dos epítopos (SEQ ID NO: 4, K^d=42 nM) específicos para el anticuerpo HIV1-p17 que están separados por tres bloques flexibles de (GSG)⁶ y dos bloques a-helicoidales, cada uno de los cuales tiene seis repeticiones EAAAK (SEQ ID NO: 20). El enlazador también se usó en algunas proteínas sensores referidas basadas en la misma estrategia de cambio (ver: Golynskiy, y otros ChemBioChem, 2010, 11, 2264; Banala, y otros ACS Chem. Biol., 2013, 8, 212; Arts, y otros Anal. Chem., 2016, 88, 4525; Van Rosmalen, y otros Anal. Chem., 2018, DOI: 10,1021/acs.analchem.8b00041; y Arts, y otros ACS Sens., 2017, 2, 1730). Se incluyó un residuo de cisteína adyacente a SBiT2 para la conjugación con fluoróforo.

Se construyó una variante (NB-LUMABS-1; SEQ ID NO: 6) en una modalidad ilustrativa que contiene SBiT1 con K^d de 190 pM (SEQ ID NO: 1) y SBiT2 con K^d de 2,5 pM (S^eQ ID NO: 2), y un residuo de cisteína antes del extremo N-terminal de SBiT2. La proteína sensor se expresó en E. coli BL21 (DE3) y se purificó mediante el uso de un marcador de His N-terminal y un marcador Strep C-terminal. Este protocolo de purificación de dos etapas garantiza el aislamiento de la proteína de longitud completa únicamente, sin una versión truncada del sensor que carezca, por ejemplo, del dominio SBiT. La proteína sensor se conjugó con el fluoróforo sintético Cy3 a través de una reacción de tiol-maleimida.

La exploración bioluminiscente de NB-LUMABS-1 mostró un pico de emisión de Cy3 más alto a 563 nm que la emisión de NanoLuc a 460 nm en ausencia del anticuerpo anti-HIV1-p17, con una relación de emisión de 1,3 que indica una BRET muy eficiente entre NB y Cy3. La adición del anticuerpo anti-HIV1-p17 dio como resultado una disminución significativa del pico de emisión de Cy3, lo que indica una gran disminución de la eficiencia de la BRET.

Los experimentos de titulación arrojaron constantes de disociación aparentes (K^d,app) de 10,0 ± 0,5 pM y un gran rango dinámico de 218 % (Figura 2).

Ajuste del rendimiento del sensor

Para establecer la influencia de la posición del residuo de cisteína, se construyeron dos variantes que contenían un residuo de cisteína después del extremo C-terminal de SBiT2 (NB-LUMABS-2; SEQ ID NO: 7) o dos residuos de cisteína antes del extremo N-terminal de SBiT2 y después del extremo C-terminal de SBiT2 (NB-LUMABS-3; SEQ ID NO: 8). La variante NB-LUMABS-2 mostró una relación de emisión relativamente baja (rojo a azul) en ausencia del anticuerpo anti-HIV1-p17. Esto sugiere que Cy3 está más lejos del sitio de unión al sustrato de la luciferasa. La variante NB-LUMABS-3 también mostró una relación de emisión relativamente baja (rojo a azul) en el estado libre de anticuerpos. Suponemos que la conjugación con dos grupos Cy3 podría afectar el ensamblaje de SBiT2 con LBiT. Para establecer la influencia de la afinidad LBiT-SBiT, se construyeron cuatro variantes que contenían diferentes combinaciones de SBiT. La variante NB-LUMABS-4 (SEQ ID NO: 9) que contenía SBiTI con Kd de 190 pM (SEQ ID NO: 1) y SBiT2 con Kd de 0,18 pM (SEQ ID NO: 3). La variante NB-LUMABS-5 (SEQ ID NO: 10) que contenía dos mismos SBiT con Kd de 190 pM (SEQ ID NO: 1). La variante NB-LUMABS-6 (S^eQ ID NO: 11) que contenía dos mismos SBiT con Kd de 2,5 pM (S^eQ ID NO: 2). La variante NB-LUMABS-7 (SEQ ID NO: 12) que contenía SBiT1 con Kd de 2,5 pM (SEQ ID NO: 2) y SBiT2 con Kd de 0,18 pM (SEQ ID NO: 3). La NB-LUMABS-4 mostró una alta relación de emisión en ausencia de anticuerpos, pero disminuyó moderadamente por la unión de anticuerpos. La NB-LUMABS-5 y la -6 que contienen dos SBiT iguales en una sola proteína sensor mostraron una relación de emisión baja en estado libre de anticuerpos, lo que indica que en estos sensores SBiT1 ya complementan la actividad de NanoLuc en una fracción significativa de las proteínas sensores. Para la NB-LUMABS-7, la relación de emisión alcanzó 1,8 en estado libre de anticuerpos y disminuyó significativamente tras la adición de anticuerpos. El rango dinámico (DR) alcanzó el 493 %. Los experimentos de titulación de anticuerpos arrojaron afinidades aparentes entre 10 y 15 pM para estas cuatro variantes de sensor, que son similares a las obtenidas para NB-LUMABS-1 (Figura 3).

Tabla 1. Pro iedades de varias variantes de NB-LUMABS NB-LUMABS diri idas al anticuer o anti-HIV1-p17.

Ajuste de la selectividad del sensor

Para desafiar la modularidad de nuestro diseño de sensor, probamos si las secuencias de epítopos podían intercambiarse por secuencias de epítopos dirigidas a un anticuerpo diferente. Los sensores dirigidos al anticuerpo terapéutico trastuzumab (TRAS-NB-LUMABS-1, SEQ ID NO: 13; TRAS-NB-LUMABS-1, SEQ ID NO: 14; y TRAS-NB-LUMABS-3, SEQ ID NO: 15) fueron construidos mediante el reemplazo de las secuencias de epítopos presentes en NB-LUMABS-1, -5 y -7 con un mimítopo de unión a trastuzumab QLGPYELWELS (SEQ ID NO: 5). El trastuzumab se usa en el tratamiento de cánceres de mama metastásicos positivos para Her2. La farmacocinética poblacional indica variabilidades en la eliminación entre pacientes y 10 % de pacientes con eliminación rápida, lo que resulta en niveles de fármaco más abajo de la concentración mínimamente efectiva (Bruno, y otros Cancer Chemother. Pharmacol. 2005, 56, 361). La afinidad monovalente del mimítopo por trastuzumab fue de 294 nM. Para estos tres sensores, se observó una BRET eficiente en el estado libre de trastuzumab (Figura 4). La adición de trastuzumab 1 pM a TRAS-NB-LUMABS-1 resultó en una disminución moderada de la BRET, con un rango dinámico del 37 %. Se observó un aumento de la relación de emisión al añadir una gran cantidad de trastuzumab. Posiblemente, dos moléculas de anticuerpo se unen con una molécula de sensor y, por lo tanto, el sensor se restablece en el estado cerrado. TRAS-NB-LUMABS-2 se mantuvo en estado cerrado durante la titulación de anticuerpos. Suponemos que la afinidad entre LBiT y SBiT2 es tan alta que la débil afinidad por el epítopo no logró la unión del anticuerpo bivalente. TRAS-NB-LUMABS-3 mostró un cambio moderado en la relación de emisión al añadir trastuzumab, con un rango dinámico del 36 %. La titulación de trastuzumab dio como resultado Kdapp de 74,0 ± 9,4 nM para TRAS-NB-LUMABS-1 y 85,7 ± 6,3 nM para TRAS-NB-LUMABS-3.

Adicionalmente, se construyeron sensores dirigidos al anticuerpo terapéutico cetuximab (CTX-NB-LUMABS-1, SEQ ID NO: 25; CTX-NB-LUMABS-2, SEQ ID NO: 26; y CTX-NB-LUMABS-3, SEQ ID NO: 27) mediante el reemplazo respectivo de las secuencias de epítopos presentes en NB-LUMABS-1 y -2 con un meditopo de unión a cetuximab CVFDLGTRRLRC (Kd monovalente de 61 nM; SEQ ID NO: 23) y ⁿ B-LUMABS-1 con un meditopo de unión a cetuximab CQFDlSt RRLKC (Kd monovalente de 270 nM; SEQ ID NO: 24). El cetuximab es un anticuerpo terapéutico anticancerígeno clínicamente importante. Dado que cetuximab se une a un epítopo conformacional discontinuo en el marcador de cáncer EGFR, no hay disponibles secuencias de epítopos lineales. No obstante, se identificaron péptidos de meditopos cíclicos unidos por disulfuro con suficiente afinidad por cetuximab y se usaron para construir un sensor LUMABS emisor azul-verde para cetuximab con un cambio relativamente modesto en la relación de emisión (DR ~60 %) (ver: Van Rosmalen, y otros Anal. Chem., 2018, 90, 3592). Como la presencia de residuos de cisteína en los péptidos de meditopo impide el uso de la química de cisteína-maleimida para introducir el colorante Cy3, en su lugar introdujimos el aminoácido no canónico para-azidofenilalanina (pAzF) para permitir la conjugación específica del sitio con un fluoróforo funcionalizado DBCO a través de la química de clic de azidaalquino promovida por cepa (SPAAC). Para incorporar pAzF, se introdujo un codón de parada ámbar TAG antes del extremo N (CTX-NB-LUMABS-1; SEQ ID NO: 25) o después del extremo C de SBiT2 (CTX-NB-LUMABS-2 SEQ ID NO: 26). La coexpresión con el par ortogonal de ARNt sintetasa/ARNt para pAzF permitió la incorporación exitosa de pAzF en las variantes del sensor de cetuximab en la posición deseada. CTX-NB-LUMABS-1 mostró una emisión brillante de Cy3 en ausencia de cetuximab y una disminución significativa en la relación de emisión tras la unión del anticuerpo (Figura 6). Se logró un rango dinámico de 233 ± 12 %, lo que representa una mejora de 4 veces en comparación con los sensores azul-verde CTX-LUMABS (Van Rosmalen, y otros Anal. Chem. 2018, 90, 3592) mientras que una Kd global de 34,7 ± 3,7 nM obtenida al ajustar los datos de titulación resultó ser similar (Figura 6). La introducción de Cy3 en el extremo C-terminal de SBiT2 en CTX-NB-LUMABS-2 disminuyó sustancialmente la eficiencia de la BRET en el estado libre de anticuerpos (Figura 6), lo cual es consistente con los resultados obtenidos para HIV-NB-LUMABS-2. También construimos una variante de sensor (CTX-NB-LUMABS-3) que contiene el meditopo de cetuximab cíclico con una afinidad más débil (SEQ ID NO: 24). Los experimentos de titulación con CTX-NB-LUMABS-3 mostraron una Kd de 189 ± 16 nM, lo que permite que este sensor mida de manera confiable altas concentraciones de cetuximab (Figura 6). La menor afinidad de CTX-NB-LUMABS-3 por cetuximab también resultó en una respuesta más rápida en comparación con CTX-NB-LUMABS-1. Estos resultados demuestran que el formato del sensor NB-LUMABS puede reconfigurarse para detectar anticuerpos que reconocen péptidos cíclicos restringidos por disulfuro, lo que produce dos sensores de cetuximab cuyo régimen de respuesta combinado cubre el rango de concentración de cetuximab clínicamente relevante (25 nM - 2,3 j M).

Estos resultados muestran además que la armazón desarrollada para el anticuerpo ilustrativo anti-HIV1-p17 puede usarse para desarrollar fácilmente un sensor para otros anticuerpos.

Tabla 2. Pro iedades de varias variantes de NB-LUMABS diri idas a anticuer os tera éuticos.

Experimentos

Clonación y mutagénesis

Las secuencias de ADN sintético que codifican NB-LUMABS-1 (SEQ ID NO: 6) se solicitaron a GenScript (Piscataway, EE. UU.). NB-LUMABS-2 (SEQ ID NO: 7), NB-LUMABS-3 (SEQ ID NO: 10), NB-LUMABS-4 (SEQ ID NO: 9), NB-LUMABS-5 (SEQ ID NO: 10), NB-LUMABS-6 (SEQ ID NO: 11) y NB-LUMABS-7 (SEQ ID NO: 12) se construyeron a partir de NB-LUMABS-1 mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de cebadores específicos (Tabla 3). Se usó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Agilent Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para introducir las mutaciones de interés.

Para construir TRAS-NB-LUMABS-1 (SEQ ID NO: 13), TRAS-NB-LUMABS-2 (SEQ ID NO: 14) y TRAS-NB-LUMABS-3 (SEQ ID NO: 15), el gen que codifica el revestimiento semiflexible que incluye el mimítopo de trastuzumab (QLGPYELWEL^s H) se clonó en los plásmidos pET28a que codifican NB-LUMABS-1, -5 o -7 a través de un enfoque de ligazón-restricción mediante el uso de Kpnl y Spel. Todos los resultados de clonación y mutagénesis se confirmaron mediante secuenciación de Sanger (StarSEQ GmbH).

Para construir CTX-NB-LUMABS-1 (SEQ ID NO: 25), CTX-NB-LUMABS-2 (SEQ ID NO: 26) y CTX-NB-LUMABS-3 (SEQ ID NO: 27), los plásmidos pET28a(+) que codifican CTX-LUMABS que se prepararon de acuerdo con el método descrito por Van Rosmalen, y otros (Anal. Chem. 2018, 90, 3592) fueron digeridos con las enzimas de restricción Kpnl-HF y Spel-HF. A continuación, los enlazadores que incluyen el meditopo de cetuximab, es decir CTX-NB-LUMABS-1 y -2 con el meditopo CVFDLGTRRLRC (SEQ ID NO: 23) y CTX-NB-LUMABS-3 con el meditopo CQFDLSTRRLKC (SEQ ID NO: 24) se clonaron en los plásmidos pET28a(+) que codifican NB-LUMABS-1 (SEQ ID NO: 6) mediante un enfoque de ligazón-restricción con Kpnl-HF y Spel-HF. Se eliminó el residuo de cisteína y se introdujo el codón TAG en la posición deseada (Tabla 3) mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de cebadores específicos. Todos los resultados de clonación y mutagénesis se confirmaron mediante secuenciación de Sanger (StarSEQ GmbH).

Tabla 3. Construcción de variantes NB-LUMABS

Expresión y purificación de proteínas.

Las proteínas se expresaron y purificaron mediante el uso de protocolos estándar. Brevemente, el plásmido pET28a apropiado se transformó en E. coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina 30 |jg/mL a 37 °C. La expresión de proteínas se indujo a una OD⁶⁰⁰ de 0,6 mediante el uso de IPTG 0,1 mM a 20 °C durante la noche. Las células se recolectaron y lisaron mediante el uso del reactivo Bugbuster (Novagen). Las proteínas sensores se purificaron mediante el uso de cromatografía de afinidad Ni-NTA seguida de purificación con Strep-Tactin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm mediante el uso del coeficiente de extinción (calculado a partir de la secuencia de proteína). La pureza de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE. Las proteínas purificadas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Los plásmidos pET28a que codifican CTX-NB-LUMABS se cotransformaron en E. coli BL21 (DE3) junto con un vector pEVOL que codifica un par ARNt sintetasa/ARNt para incorporar para-azidofenilalanina (pAzF). El vector pEVOL fue un regalo de Peter Schultz (Addgene plásmido # 31186). Las células se cultivaron en medio 2YT (16 g de peptona, 5 g de NaCl, 10 g de extracto de levadura por litro) que contenía 30 jg/mL de kanamicina y 25 jg/ml de cloranfenicol. La expresión de la proteína se indujo mediante el uso de IPTG 0,1 mM y arabinosa al 0,2 % en presencia de pAzF 1 mM (Bachem, F-3075,0001). Las proteínas sensores se purificaron como se describió anteriormente.

Los plásmidos pET28a que codifican el pG-NB-LUMABS inicial se solicitaron a GenScript, sin la secuencia del epítopo. Además, se ordenaron adicionalmente dos vectores pUC57 de GenScript que codifican las dos secuencias de epítopos (SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24) en el enlazador semiflexible. Estas secuencias epitópicas se clonaron en el vector pET28a+ mediante el uso de clonación por ligazón de restricción mediante el uso de enzimas de restricción Kpnl y Spel, y se ligaron mediante el uso de ligasa T4. Los vectores se amplificaron transformándolos en bacterias E. coli NovaBlue (Novagen) y posterior cultivo. Los vectores se extrajeron mediante el uso de un kit QIAprep spin miniprep (Qiagen). La correcta incorporación de los enlazadores semiflexibles con epítopos fue confirmada por secuenciación de Sanger (StarSeq, Alemania). Los vectores pET28a+ recién obtenidos, incluidos los epítopos, se transformaron en bacterias E. coli BL21 (DE3) de Novagen, junto con un vector pEVOL que codifica la ARNt sintetasa/ARNt para la incorporación de para-benzoilfenilalanina (pBPA) en la proteína G. Este vector pEVOL-pBpF fue un obsequio de Peter Schultz (Addgene plásmido # 31190). Las bacterias se cultivaron en medio lB, luego de la adición de 30 jg/mL de kanamicina y cloranfenicol. La expresión de las proteínas se indujo a una DO de 0,6 mediante IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) 0,1 M y arabinosa al 0,2 %, se añadió simultáneamente el aminoácido no natural pBPA(1 mM) (Bachem, F-2800,0001). Después de la expresión durante la noche a 18 °C, los cultivos se centrifugaron a 10000 xg durante 10 minutos. Las células se lisaron durante 20 minutos a temperatura ambiente mediante el uso de BugBuster (20 mL/L) y Benzonasa (20 pL/L). Las bacterias lisadas se centrifugaron a 16000 xg durante 45 minutos a 4 °C. La purificación del sobrenadante se realizó mediante el uso de cromatografía en columna de afinidad con níquel y Strep-Tactin. La pureza de las proteínas sensores se confirmó mediante el uso de geles SDS-PAGE y Q-ToF-Ms .

Marcaje de proteínas con fluoróforo

La proteína NB-LUMABS purificada se redujo con tris-carboxietilfosfina (TCEP) 1 mM en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 20 min. A continuación, se añadió sulfocianina3 maleimida (Lumiprobe) disuelta en agua (10 mg/mL) en un exceso molar de 30 veces a la solución de proteína y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de una noche de incubación a 4 °C. El colorante que no había reaccionado se eliminó mediante el uso de una columna de desalinización PD10 y el conjugado se concentró mediante el uso de un filtro de centrífuga Amicon de 10 kDa. La relación colorante-proteína se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm y 553 nm y la asunción de coeficientes de extinción de 39,420 M'1 cirr1 y 162,000 M'1 cirr1 para la proteína y el colorante, respectivamente. La proteína NB-LUMABS marcada con Cy3 se confirmó mediante Q-ToF LC-MS. Se conjugó DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, CLK-A140-1) en un exceso molar de 40 veces con CTX-NB-LUMABS a temperatura ambiente durante la noche. El exceso de colorante se eliminó mediante el uso de un filtro de centrífuga Amicon de 10 kDa. La relación de colorante a proteína se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm y 563 nm y mediante el uso del coeficiente de extinción (calculado a partir de la secuencia de la proteína). El producto de reacción se analizó mediante Q-TOF-MS.

Se burbujeó con argón pG-NB-LUMABS puro (50 pM, 800 pL) en TRIS 50 mM pH 7. Se añadieron 10 pl de TCEP (tris-carboxietilfospina) 100 mM, con una concentración final de 1 mM, y se purgaron con argón a temperatura ambiente durante 20 minutos. La sulfo-Cy3-maleimida de Lumiprobe (1 mg) se disolvió en 100 pL de agua MilliQ. El tinte se añadió a la solución de proteína (~15 veces el exceso de tinte) y fue purgado con argón. Este se colocó a temperatura ambiente durante 1 hora y durante la noche a 4 °C. El tinte sin reaccionar se eliminó mediante el uso de una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare). La proteína marcada se concentró con un filtro centrífugo de 0,5 mL Amicon Ultra de 3 kDa. La relación de colorante a proteína se midió mediante el uso de NanoDrop (UV-VIS), absorción a 280 nm y 548 nm.

Fotoconjugación de pG-NB-LUMABS

Las reacciones de fotoconjugación se realizaron mediante el uso de una fuente de luz UV Promed UVL-30 (4x9 vatios). Se usaron 2 pM de anticuerpo (HyTest) y 8 pM de pG-NB-LUMABS en tampón PBS (pH 7,4) para probar la eficiencia de la fotoconjugación. La mezcla se colocó bajo luz ultravioleta (365 nm), en hielo, durante 30, 60 o 90 minutos. Luego, las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE para determinar la eficiencia de la fotoconjugación. El exceso de proteína del sensor no conjugada se eliminó con éxito mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Los espectros de bioluminiscencia muestran una disminución sustancial en la emisión de Cy3 luego de la conjugación de la proteína pG-NB-LUMABS con su anticuerpo, lo que es consistente con la unión anticipada del epítopo peptídico al sitio de unión del antígeno, e interrumpe la interacción LBit-Sbit2. La adición del péptido epítopo dio como resultado un aumento en la relación de la BRET, lo que demuestra la viabilidad del concepto de sensor al mostrar la capacidad del sensor para cambiar reversiblemente entre los estados de BRET bajo y alto como resultado de la unión competitiva (Figura 8B).

Caracterización de sensores

El anticuerpo anti-HIV1-p17 se obtuvo de Zeptometrix (clon 32/1,24,89). Trastuzumab (Herceptin, Roche) y cetuximab (Erbitux, Merck) se obtuvieron a través de la farmacia del hospital Catherina en Eindhoven, Países Bajos. Las titulaciones de anticuerpos para NB-LUMABS se realizaron en 100 pl de PBS (pH 7,4, 1 mg/mL de BSA) en Optiplate de 96 pocillos de color blanco, plano de PerkinElmer mediante el uso de una concentración de sensor de 1 pM. Se usó un sensor de 100 pM para la titulación de trastuzumab y cetuximab. Después de la incubación del sensor y el anticuerpo durante 2 horas, se añadió el sustrato NanoGlo a una dilución final de 1000 veces.

Se tituló el péptido de unión anti-CRP169 a pG-NB-LUMABS conjugado con anticuerpo mediante el uso de una concentración de sensor de 2 nM. Después de la incubación del sensor y el péptido durante 45 minutos, se añadió el sustrato NanoGlo a una dilución final de 500 veces.

Los espectros de luminiscencia se registraron entre 398 nm y 653 nm en un lector de placas Tecan Spark 10M con un tamaño de etapa de 15 nm, un ancho de banda de 25 nm y un tiempo de integración de 1000 ms. Las titulaciones se ajustaron a 1 eq para obtener valor ^aparente.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Biosensor que incluye un enlazador que comprende un primer extremo y un segundo extremo, en donde:

- el primer extremo del enlazador se fusiona con un extremo de un primer dominio de luciferasa a través de un primer dominio de unión; y

- el segundo extremo del enlazador se fusiona con un segundo dominio de luciferasa a través de un segundo dominio de unión,

en donde el biosensor comprende opcionalmente un tercer dominio de luciferasa fusionado con el otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador,

en donde los dominios de unión están configurados para unirse a una biomolécula,

en donde el biosensor existe en dos conformaciones, en las que el segundo o tercer dominio de luciferasa se une al primer dominio de luciferasa para formar una luciferasa complementada, y en donde un fluoróforo se conjuga junto a uno del segundo o tercer dominio de luciferasa lo que da como resultado una Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia (BRET) eficiente entre la luciferasa y el fluoróforo en solo una de las dos conformaciones.

2. Biosensor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tercer dominio de luciferasa se fusiona al otro extremo del primer dominio de luciferasa a través de un espaciador.

3. Biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el primer dominio de luciferasa es un dominio de luciferasa grande, preferentemente un fragmento de luciferasa grande dividido, y en el que el segundo y el tercer dominio de luciferasa son dominios de luciferasa pequeños, preferentemente fragmentos de luciferasa pequeños divididos.

4. Biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador es un enlazador semiflexible.

5. Biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biomolécula comprende un anticuerpo, antígeno, proteína o aptámero.

6. Biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer dominio de unión se configura para formar un sistema conjugado con la biomolécula y en donde el segundo dominio de unión se configura para unirse a un sitio de unión de ligando de la biomolécula.

7. Biosensor de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el sitio de unión a ligando de la biomolécula comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo.

8. Biosensor de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde la biomolécula está unida covalentemente al primer dominio de unión del biosensor.

9. Método de detección de biomoléculas in vitro, que comprende las etapas de:

- poner en contacto una muestra con el biosensor de cualquiera de las reivindicaciones 1-5;

- determinar el cambio de luminiscencia del biosensor en presencia de una muestra; y

- determinar el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa y/o cualitativa de una biomolécula.

10. Método de detección de biomoléculas in vitro de acuerdo con la reivindicación 9, en donde, en ausencia de una biomolécula, el biosensor se encuentra en un estado libre de biomoléculas en el que al menos parte del primer dominio de luciferasa se complementa con el segundo dominio de luciferasa.

11. Método de detección de biomoléculas in vitro de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde la unión entre los dominios de unión del biosensor y la biomolécula cambia el equilibrio entre el estado libre de biomoléculas del biosensor y un estado unido a biomoléculas del biosensor de manera que la BRET entre el la luciferasa y el fluoróforo cambia.

12. Método de detección de ligandos in vitro, que comprende las etapas de:

- poner en contacto la muestra con el biosensor de cualquiera de las reivindicaciones 6-8;

- determinar el cambio de luminiscencia del biosensor en presencia de una muestra; y

- determinar el cambio de luminiscencia en presencia de la muestra a la presencia o ausencia cuantitativa y/o cualitativa de un ligando.

13. Método de detección de ligandos in vitro de acuerdo con la reivindicación 12, en donde, en ausencia de un ligando, la biomolécula se une al segundo dominio de unión e interrumpe la interacción del segundo dominio de luciferasa con el primer dominio de luciferasa.

14. Método de detección de ligando in vitro de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde, en presencia de un ligando, el biosensor está en un estado unido a ligando, lo que permite que al menos parte del primer dominio de luciferasa se complemente con el segundo dominio de luciferasa.

15. Estuche de partes que comprende el biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el biosensor comprende un primer dominio de luciferasa fusionado con un segundo dominio de luciferasa a través de un enlazador semiflexible que contiene dos dominios de unión en los extremos del enlazador, y en donde el estuche de partes comprende además un tercer dominio de luciferasa.