KR102650014B1 - 근접 단백질가수분해 반응에 기반한 표적물질 검출방법 - Google Patents

근접 단백질가수분해 반응에 기반한 표적물질 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)에 기반한 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 제1결합제 및 제2결합제가 표적물질에 결합하면, 제1결합제에 연결된 ssDNA 및 프로테아제(protease)에 연결된 ssDNA가 혼성화하고, 제2결합제에 연결된 ssDNA 및 효소원(zymogen)에 연결된 ssDNA가 혼성화함으로써, 프로테아제 및 효소원의 근접 단백질가수분해 반응에 의해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 표적물질 검출방법은 근접 단백질가수분해 반응을 이용하여, 신속하고 간편하다. 또한, 표적물질이 나노 몰 이하의 농도인 경우에도 검출이 가능하므로 높은 민감도를 나타낸다. 또한, 결합제는 프로테아제 및 효소원에 직접적으로 결합하는 대신 2개의 ssDNA를 통해 연결되므로, 샘플과 혼합하기 전에 프로테아제-제1결합제 및 효소원-제2결합제 접합제를 제조할 필요가 없다는 장점이 있다. 따라서, 동일한 ssDNA-프로테아제 접합제 및 ssDNA-효소원 접합제를 반복적으로 사용하고, 결합제만 달리하여 다양한 바이오마커를 검출함으로써, 질병 진단 및 약물 농도 모니터링 등의 분야에서 활용이 가능하고 범용성이 뛰어난 기술이라는 점에서 의의가 있다. 또한, 단백질의 번역 후 변형이나 특정 위치에서 염색체의 후성적 변형을 검출하는 데 사용될 수 있다.

Description

근접 단백질가수분해 반응에 기반한 표적물질 검출방법{Target Analytes Detection Method based on Proximity Proteolysis Reaction}
본 발명은 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)에 기반한 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 제1결합제 및 제2결합제가 표적물질에 결합하면, 제1결합제에 연결된 ssDNA 및 프로테아제(protease)에 연결된 ssDNA가 혼성화하고, 제2결합제에 연결된 ssDNA 및 효소원(zymogen)에 연결된 ssDNA가 혼성화함으로써, 프로테아제 및 효소원의 근접 단백질가수분해 반응에 의해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.
핵산, 단백질, 소분자를 포함한 다양한 생물학적 분자는 유기체의 생리적 상태를 나타내며 질병의 바이오마커 역할을 한다. 이들을 검출하거나 정량화하기 위한 분석은 임상 분야에서 매우 중요하며, 다양한 분석방법이 개발되어 왔다(Wu, L. & Qu, X. Chem Soc Rev 44, 2963-2997, doi:10.1039/c4cs00370e (2015); Sanavio, B. & Krol, S. Front Bioeng Biotechnol 3, 20, doi:10.3389/fbioe.2015.00020 (2015)). Watson-Crick base pairing 원리에 기반한 DNA 가닥의 특정 하이브리드화를 활용하여 핵산에 대한 간단한 동종 분석(homogeneous assays)이 개발되어 병원체 및 비정상 세포의 조기 발견에 기여하였다. 반면에, 효소결합 면역흡착측정법(ELISA) 및 이의 변형된 버전과 같은 고체 표면을 포함하는 이종 분석(heterogenous assay)은 수십 년 동안 단백질 및 소분자를 검출하는 데 표준이었다(Zhang, S., et al., Analyst 139, 439-445, doi:10.1039/c3an01835k (2014)). 이런 방법은 견고성, 감도 및 특이성과 같은 진단 도구의 필수 기능을 충족하지만, 이러한 분석의 일반적인 절차에는 표적과의 결합 및 비특이적 상호작용의 제거를 위한 여러 단계가 포함되며, 일반적으로 훈련된 인력이나 자동화된 기기가 필요하고, 하루 이상의 시간이 소요된다는 한계점이 있다. 따라서, 이종 분석은 현장진단 방법으로서 적합하지 않으므로, 최근에는 자원이 제한된 환경에서 질병의 조기 진단에 기여하는 현장진단(point-of-care) 테스트를 개발하기 위한 연구 노력이 이루어지고 있다.
대표적으로, 현장진단에 최적화된 방법은 동종 단계(homogeneous phase)에서 수행되는 분석이다. 표적분자 존재 시 분자 조립을 유도하는 것을 포함하여 단백질 및 소분자를 검출하기 위한 동종 분석을 설계하기 위한 다양한 전략이 제안되어 있다(Liu, H. et al. Theranostics 6, 54-64, doi:10.7150/thno.13159 (2016); Hwang, B. B., et al., Commun Biol 3, 8, doi:10.1038/s42003-019-0723-9 (2020)). 센서의 공동위치측정(colocalization)은 감지 가능한 신호를 생성하여 최소한의 배경 신호로 액체 상태에서 분석을 수행할 수 있다. Fφrster 공명 에너지 전달 쌍 및 분할 단백질은 분자 상호작용을 모니터링하는 데 사용되었다. 이들 분자가 분자의 독립적인 영역을 표적으로 하는 2개의 결합제에 공유 또는 물리적으로 연결될 때, 생성된 분자는 동종 단계에서 표적을 검출할 수 있다. 반응물을 서로 가깝게 배치하여 그들의 효과적인 농도를 증가시킴으로써 반응 속도를 향상시킬 수 있다. 이러한 근접성에 의한 반응 향상 원리는 단백질, 항체, 핵산과 같은 다양한 분자 및 분자 상호작용을 분석하기 위한 화학적 반응 및 생물학적 반응을 고안하는 데 적용되었다.
이와 관련하여, 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction; PPR)이라는 새로운 근접-강화 반응에 기반한 핵산 분석을 위한 간단하고 민감도가 높은 방법이 공지되어 있으나(Park, H. J. & Yoo, T. H. ACS Sens 3, 2066-2070, doi:10.1021/acssensors.8b00821 (2018)), 근접 단백질가수분해 반응을 이용하여 단백질 및 소분자와 같은 표적물질을 검출하는 방법에 대해서는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 단백질 및 소분자와 같은 표적물질을 적은 농도에서도 높은 민감도로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 표적물질에 결합하는 제1결합제 및 제2결합제와 상기 각각의 결합제와 ssDNA 간의 혼성화를 통하여 연결된 프로테아제 및 자이모겐의 근접 단백질가수분해 반응을 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 나노 몰 이하의 표적물질 농도에서도 표적물질을 간편하고 신속하게 검출할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 단백질 및 소분자와 같은 표적물질을 높은 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 신규한 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 제1DNA와 제1결합제가 결합되어 있는 제1DNA-제1결합제 접합체; ii) 제1DNA에 상보적인 서열을 갖는 제1DNA'와 프로테아제(protease)가 결합되어 있는 제1DNA'-protease 접합체; iii) 제2DNA와 제2결합제가 결합되어 있는 제2DNA-제2결합제 접합체; iv) 제2DNA에 상보적인 서열을 갖는 제2DNA'와 효소원(zymogen)이 결합되어 있는 제2DNA'-zymogen 접합체; 및 v) 상기 효소원에 특이적인 기질을 포함하는 표적물질 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 조성물에 표적물질을 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; (b) 상기 표적물질을 제1DNA-제1결합제 접합체의 제1결합제 및 제2DNA-제2결합제 접합체의 제2결합제에 결합시킨 다음, 상기 제1결합제에 연결된 제1DNA를 프로테아제(protease)에 연결된 제1DNA'와 혼성화(hybridization)시키고, 상기 제2결합제에 연결된 제2DNA를 효소원(zymogen)에 연결된 제2DNA'와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 제1결합제의 제1DNA와 혼성화된 제1DNA'-protease 접합체 및 제2결합제의 제2DNA와 혼성화된 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)에 의해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 항-소분자 항체를 추가로 포함하는 조성물에 소분자를 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; (b) 상기 제1결합제에 연결된 제1DNA를 프로테아제(protease)에 연결된 제1DNA'와 혼성화(hybridization)시키고, 상기 제2결합제에 연결된 제2DNA를 효소원(zymogen)에 연결된 제2DNA'와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화된 제1DNA'-protease 접합체와 상기 혼성화된 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)의 유발 유무를 기반으로 소분자의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 소분자(small molecules)의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표적물질 검출방법은 근접 단백질가수분해 반응을 이용하여, 4개의 접합체(제1DNA-제1결합제 접합체, 제1DNA'-protease 접합체, 제2DNA-제2결합제 접합체, 제2DNA'-효소원(zymogen) 접합체) 및 상기 효소원에 특이적인 기질을 샘플에 동시에 첨가하는 원스텝(one-step)으로 이루어지므로 신속하고 간편하다. 또한, 표적물질이 나노 몰 이하의 농도인 경우에도 검출이 가능하므로 높은 민감도를 나타낸다. 또한, 결합제는 프로테아제 및 효소원에 직접적으로 결합하는 대신 2개의 ssDNA를 통해 연결되므로, 샘플과 혼합하기 전에 프로테아제-제1결합제 및 효소원-제2결합제 접합제를 제조할 필요가 없다는 장점이 있다. 따라서, 동일한 ssDNA-프로테아제 접합제 및 ssDNA-효소원 접합제를 반복적으로 사용하고, 결합제만 달리하여 다양한 바이오마커를 검출함으로써, 질병 진단 및 약물 농도 모니터링 등의 분야에서 활용이 가능하고 범용성이 뛰어난 기술이라는 점에서 의의가 있다. 또한, 단백질의 번역 후 변형이나 특정 위치에서 염색체의 후성적 변형을 검출하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 전형적인 PPR 기반 동종 분석의 개략도를 도시한다. 도 1a 는 다양한 표적물질을 검출하기 위한 PPR 기반 동종 분석의 개략도이다. 조작된 b-lactamase 자이모겐(BLZ)은 tobacco etch virus protease(TEVP)에 의해 활성화될 수 있다. TEVP는 제1DNA'(DNA1') 및 제1DNA(DNA1) 사이의 혼성화를 통해 제1결합제(Binder1)에 연결되었고, BLZ는 제2DNA'(DNA2') 및 제2DNA(DNA2) 사이의 혼성화를 통해 제2결합제(Binder2)에 연결되었다. 도 1b는 전형적인 PPR 기반 동종 분석을 위한 절차를 도시한다. 4개의 접합체 (TEVP-제1DNA ', BLZ-제2DNA', 제1결합제-제1DNA 및 제2결합제-제2DNA)와 b-lactamase에 대한 발색성 기질(CENTATM)을 원-스텝 형식으로 샘플과 혼합하고 405 nm 에서의 흡광도의 변화는 37 ℃에서 1 시간 후 측정되었다.
도 2는 용액에서 HER2의 엑토도메인(ectodomain)의 검출을 도시한다. 도 2a는 HER2의 엑토도메인을 검출하기 위한 PPR 기반 동종 분석의 개략도를 도시한다. Trastuzumab-제1DNA 및 pertuzumab-제2DNA 접합체는 HER2의 엑토도메인에 대한 결합제로 사용되었다. 도 2b는 상보적 ssDNA 간의 혼성화를 사용하여 각각 TEVP 및 BLZ의 trastuzumab 및 pertuzumab 에 대한 단백질 가수분해 쌍의 연결을 도시한다. trastuzumab-제1DNA과 pertuzumab-제2DNA를 모두 포함하는 샘플 만이 TEV-제1DNA' 및 BLZ-제2DNA'에서 흡광도 신호가 크게 증가한 것으로 나타났다. (T : trastuzumab, P : pertuzumab, T-D1 : trastuzumab-제1DNA, P-D2 : pertuzumab-제2DNA). 도 2c는 반응 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 10 mM DTT, 40 mM MgCl2, 0.5% (w/v) BSA; pH 7.4)에서 4개의 ssDNA 접합체(TEVP-제1DNA': 20 nM, BLZ-제2DNA': 20 nM, trastuzumab-제1DNA: 5 nM, pertuzumab-제2DNA: 5 nM) 및 400mM CENTATM를 사용한 HER2의 엑토도메인 농도에 대한 405nm에서의 흡광도 신호의 시간 경과 곡선을 도시한다. 도 2d는 HER2 검출에 대한 분석 결과로서, 흡광도 신호와 HER2 농도 사이의 관계를 도시한다. 삽입된 그래프는 HER2의 ectodomain의 0-1.25 nM 범위에서 선형 관계를 나타낸다.
도 3은 세포막에서 HER2의 검출을 도시한다. 도 3a는 세포막에서 HER2 검출의 개략도를 도시한다. 4 개의 접합체(TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', trastuzumab-제1DNA, pertuzumab-제2DNA) 및 CENTATM 를 부유세포가 있는 용액에 첨가하고 1 시간 후 흡광도 신호를 측정했다. 도 3b는 HER2에 대한 PPR 기반 동종 분석에 의해 측정된 HER2-발현세포에 대한 신호를 도시한다. 도 3c는 유세포분석을 사용한 HER2-발현세포의 분석을 도시한다. 세포를 trastuzumab과 함께 배양한 다음 형광염료(Alex Fluor 488)와 접합된 염소 항-인간 IgG로 표지했다. 도 3d는 HER2에 대한 PPR 기반 동종 분석을 사용하여 수득한 흡광도 신호와 BT-474 세포 수 간의 관계를 도시한다.
도 4는 cTnI의 검출을 도시한다. 도 4a는 cTnI 검출의 개략도를 도시한다. 도 4b는 흡광도 신호와 cTnI 농도 사이의 관계를 도시한다. 삽입된 그래프는 0-5.0nM 범위의 cTnI에 대한 선형관계를 나타낸다. 분석은 HER2에 대한 것과 동일한 ssDNA 접합체 농도를 사용하여 수행되었다: TEVP-제1DNA', 20 nM; BLZ-제2DNA', 20 nM cTnI Ab1-제1DNA, 5 nM; cTn1 Ab2-제2DNA, 5 nM.
도 5는 트롬빈의 검출 및 PPR 기반 동종 분석의 특이성을 도시한다. 도 5a는 트롬빈 검출을 위한 PPR 기반 동종 분석의 개략도를 도시한다. Aptamer1은 트롬빈의 섬유소원-인식 엑소사이트에 결합하고, Aptamer2는 헤파린-결합 엑소사이트에 결합한다. 도 5b는 흡광도 신호와 트롬빈 농도 사이의 관계를 도시한다. 삽입된 그래프는 0-1.25nM 범위의 cTnI에서 선형관계를 나타낸다. 분석은 20 nM TEVP-제1DNA', 20 nM BLZ-제2DNA', 40 nM Aptamer1-제1DNA, 및 40 nM Aptamer2-제2DNA로 수행되었다. 도 2c는 세 가지 PPR 기반 동종 분석의 특이성을 도시한다. 10 nM 농도의 표적 단백질(HER2, cTnI 또는 트롬빈)을 각 분석 방법에 대한 최적화된 조건 하에서 분석하였다.
도 6은 디곡시게닌(digoxigenin)의 검출을 도시한다. 도 6a는 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)을 검출하기 위한 PPR 기반 경쟁적 동종 분석의 개략도를 도시한다. 항-Dig 항체와의 단백질 가수분해 반응은 Dig의 존재에 의해 억제되며, 신호 감소 정도는 Dig 농도에 비례한다. 도 2b는 디곡신(digoxin) 및 Dig의 구조를 도시한다. 도 2c는 흡광도 신호와 Dig 농도 사이의 관계를 도시한다. 삽입된 그래프는 1/DAbs와 0-10.0nM 범위의 Dig 농도 간의 선형관계를 나타낸다. 분석은 10 nM TEVP-제1DNA', 10 nM BLZ-제2DNA', 2.5 nM Dig-제1DNA, 2.5 nM Dig-제2DNA, 및 2.5 nM 항-Dig 항체로 수행되었다.
도 7은 항체의 검출을 도시한다. 도 7a는 항-Dig 항체를 검출하기 위한 PPR 기반 면역 분석의 개략도를 도시한다. 도 7b는 흡광도 신호와 항-Dig 항체 농도 사이의 관계를 도시한다. 삽입된 그래프는 항-Dig 항체의 0-10.0nM 범위에서 선형 관계를 나타낸다. 이 분석은 20 nM TEVP-제1DNA', 20 nM BLZ-제2DNA', 10 nM Dig-제1DNA, 및 10 nM Dig-제2DNA로 수행되었다. 도 7c는 항-인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 항체를 검출하기 위해 PPR 기반 면역 분석을 사용하여 수득한 결과를 도시한다. 흡광도 신호와 항-hCG 농도 간의 관계를 나타내었다. 이 분석은 20 nM TEVP-제1DNA', 20 nM BLZ-제2DNA', 5 nM hCG-제1DNA, 및 5 nM hCG-제2DNA로 수행되었다.
도 8은 β-Lactamase zymogen (BLZ) 및 tobacco etch virus protease (TEVP)에 의한 그의 활성화를 도시한다. BLZ는 TEVP에 의해 절단될 수 있는 링커를 통해 원형 치환된 β-lactamase (BLA) 와 그 억제제 단백질인 β-lactamase inhibitory protein (BLIP)의 융합을 통해 구축되었다. BLIP 단백질은 BLA에 대해 매우 약한 결합 친화도를 갖도록 설계되었으며, TEVP에 의한 절단 반응은 분자 내 상호작용을 방지하여 BLZ를 활성화했다. BLA는 다양한 발색성 기질을 가지고 있으며, 본 발명의 실시예에서는 BLA에 의한 가수분해를 통해 강한 노란색(405nm에서)을 생성하는 CENTATM 를 사용하였다.
도 9는 BLZ 및 제2DNA'(DNA2')의 접합을 도시한다. 도 9a는 4-azido-l-phenylalanine (AzF)이 혼입된 β-lactamase zymogen (BLZ) 및 아민-변형된 제2DNA'의 이중기능성 링커(N-hydroxysuccinimide ester-(polyethylene glycol)4-dibenzocyclooctyne; DBCO-PEG4-NHS ester)를 통한 접합을 도시한다. DNA2'-아민은 먼저 아민과 NHS 에스테르의 반응을 통해 링커와 반응한 후, 생성된 DNA2'-링커는 BLZ의 azide 그룹과 링커의 DBCO 그룹 사이의 변형-촉진 아지드-알킨 반응(strain-promoted azide-alkyne reaction)에 의해 BLZ에 접합되었다. 도 9b는 BLZ 및 BLZ-DNA2'의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 10은 TEV-DNA1'(제1DNA') 접합체의 제조를 도시한다. 도 10a는 제1단계로서, 4-azido-l-phenylalanine (AzF)이 혼입된 SpyCatcher 및 아민-변형된 제1DNA'의 이중기능성 링커(N-hydroxysuccinimide ester-(polyethylene glycol)4-dibenzocyclooctyne; DBCO-PEG4-NHS ester)를 통한 접합을 도시한다. DNA1'-아민은 먼저 아민과 NHS 에스테르 사이의 반응을 통해 링커와 반응하고, 생성된 DNA1'-링커는 SpyCatcher의 azide 그룹과 링커의 DBCO 그룹 사이의 변형-촉진 아지드-알킨 반응(strain-promoted azide-alkyne reaction)에 의해 SpyCatcher에 접합되었다. 도 10b는 제2단계로서, SpyCatcher와 SpyTag 간의 자발적인 이소펩티드 형성 반응을 통한 SpyCatcher-DNA1' 및 SpyTag-TEVP의 접합을 도시한다. 도 10c는 SpyCatcher, SpyCatcher-DNA1', SpyTag-TEVP 및 TEVP-DNA1'의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 11은 trastuzumab-DNA1(제1DNA) 및 pertuzumab-DNA2(제2DNA) 접합체의 제조를 도시한다. 도 11a는 bis-N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테르 링커를 통한 trastuzumab 또는 pertuzumab 및 아민-변형된 ssDNA(각각 DNA1-아민 또는 DNA2-아민)의 접합을 도시한다. 아민-변형된 ssDNA를 먼저 과량의 Bis-NHS 에스테르 링커와 반응시킨 다음, NHS 에스테르기를 보유한 생성물을 항체의 아민기에 접합시켰다. 도 11b는 trastuzumab, trastuzumab-DNA1, pertuzumab 및 pertuzumab-DNA2의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 도 11c는 ssDNA 대 항체의 비율을 도시한다.
도 12는 반응 조건의 최적화를 도시한다. 도 12a는 반응 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 10 mM DTT, 및 0.5% (w/v)의 BSA; pH 7.0)에서 MgCl2 농도가 1 및 0nM HER2 ectodomain 사이의 흡광도 신호 차이에 미치는 영향을 도시한다. ΔΔAbs = ΔAbs(1nM HER2) - ΔAbs(0nM HER2). 흡광도 신호(DAbs)는 1분 및 60분 사이의 405nm에서의 흡광도 차이로 정의된다. 도 12b는 반응 버퍼에서 CENTA 농도의 최적화를 도시한다. 도 12c는 TEVP-DNA1 ', BLZ-DNA2', trastuzumab-DNA1 및 pertuzumab-DNA2의 농도 최적화를 도시한다. 명확성을 위해 주황색 색상의 양은 표시된 값에 해당한다.
도 13은 항-cTnI 항체 접합체의 제조를 도시한다. 도 13a는 cTnI-Ab1, cTnI Ab1-DNA1, cTnI Ab2 및 cTnI Ab2-DNA2의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 2개의 항-cTnI 항체(cTnI-Ab1 및 cTnI-Ab2)는 항-HER2 항체 및 ssDNA의 접합체에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 각각 DNA1 및 DNA2에 접합되었다. 도 13b는 ssDNA 대 항체의 비율을 도시한다.
도 14는 트롬빈 검출을 위한 반응 구성성분의 농도의 최적화를 도시한다. 도 14a는 트롬빈, Apatmer1 및 Aptamer2의 복합체 구조를 도시한다. 또한, 트롬빈과 트롬빈-결합 압타머(15-mer 및 27-mer, Protein Data Bank [PDB] ID: 5ew2)의 복합체 구조를 도시한다. 도 14b는 TEVP-DNA1 ', BLZ-DNA2', Aptamer1-DNA1 및 Aptamer2-DNA2의 농도 최적화를 도시한다. ΔΔAbs는 1과 0nM 트롬빈 사이의 흡광도 신호 차이로 정의된다: ΔΔAbs = ΔAbs (1 nM thrombin) - ΔAbs (0 nM thrombin). 흡광도 신호(DAbs)는 1분 및 60분 사이의 405nm에서의 흡광도 차이로 정의된다.
도 15는 Dig 검출을 위한 반응 구성성분의 농도의 최적화를 도시한다. 도 15a는 digoxigenin-N-hydroxysuccimide (Dig-NHS) 에스테르와 ssDNA-amine (DNA1 또는 DNA2)의 접합을 도시한다. 도 15b는 digoxigenin-ssDNA 접합체 및 anti-digoxigenin 농도 최적화를 도시한다. TEVP-DNA1' 및 BLZ-DNA2'의 농도는 10nM이다. ΔΔAbs = ΔAbs (1 nM digoxigenin) - ΔAbs (0 nM digoxigenin). 도 15c는 다양한 농도의 디곡시게닌에 대한 시간-의존적 흡광도 반응을 도시한다.
도 16은 항-Dig 항체 검출을 위한 반응 구성성분의 농도의 최적화를 도시한다. digoxigenin-ssDNA 접합체 및 효소-ssDNA 접합체의 농도의 최적화를 도시한다.ΔΔAbs = ΔAbs (2 nM 항-Dig 항체) - ΔAbs (0 nM 항-Dig 항체).
도 17은 hCG 및 ssDNA 접합체(hCG-DNA1 및 hCG-DNA2)의 제조를 도시한다. 도 17a는 항-hCG 항체 검출을 도시한다. 도 17b는 bis-N-hydroxysuccimide (NHS) 에스테르 링커를 통한 hCG 및 아민-변형된 ssDNA(DNA1-amine 또는 DNA2-amine)의 접합을 도시한다. 아민-변형된 ssDNA를 과량의 Bis-NHS 에스테르 링커와 먼저 반응시킨 다음, NHS 에스테르기를 보유한 생성물을 hCG의 아민기에 접합시켰다(PDB ID: 1hcn). 도 17c는 hCG, hCG-DNA1 및 hCG-DNA2의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 도 17d는 ssDNA 대 hCG의 비율을 도시한다. 도 17e는 hCG-ssDNA 접합체 및 효소-ssDNA 접합체의 농도 최적화를 도시한다. ΔΔAbs = ΔAbs (2 nM 항-hCG 항체) - ΔAbs (0 nM 항-hCG 항체).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 표적물질에 결합하는 제1결합제 및 제2결합제에 각각 제1DNA 및 제2DNA를 연결시키고, 상기 제1DNA 및 제2DNA와 상보적인 서열을 갖는 제1DNA' 및 제2DNA'를 프로테아제 및 자이모겐에 연결시킨 후, 상기 4개의 ssDNA-접합체 및 상기 효소원에 특이적인 기질을 포함하는 조성물을 이용하여 표적물질을 검출하였다(실시예 1).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 i) 제1DNA와 제1결합제가 결합되어 있는 제1DNA-제1결합제 접합체; ii) 제1DNA에 상보적인 서열을 갖는 제1DNA'와 프로테아제(protease)가 결합되어 있는 제1DNA'-protease 접합체; iii) 제2DNA와 제2결합제가 결합되어 있는 제2DNA-제2결합제 접합체; iv) 제2DNA에 상보적인 서열을 갖는 제2DNA'와 효소원(zymogen)이 결합되어 있는 제2DNA'-zymogen 접합체; 및 v) 상기 효소원에 특이적인 기질을 포함하는 표적물질 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 서로 동일 또는 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합제는 상기 표적물질에 결합할 수 있는 항체, 압타머, 항원, 소분자(small molecules) 또는 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 또는 항-cTnI 항체이며; 상기 항원은 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 또는 인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적물질은 항원, 항체, 소분자(small molecules) 또는 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항원은 HER2, cTnI 또는 트롬빈(thrombin)이며; 상기 항체는 항-디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 항체 또는 항-인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 항체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 HER2인 경우, 상기 제1결합제는 트라스투주맙(trastuzumab)이고, 상기 제2결합제는 퍼투주맙(pertuzumab)인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 2, 3).
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I; cTnI)인 경우, 상기 제1결합제는 제1 항-cTnI 항체이고, 상기 제2결합제는 제2 항-cTnI 항체인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 4).
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 트롬빈(thrombin)인 경우, 상기 제1결합제는 트롬빈과 결합할 수 있는 제1압타머이고, 상기 제2결합제는 트롬빈과 결합할 수 있는 제2압타머인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 5).
본 발명에 있어서, 상기 제1압타머는 서열번호 7로 표시되고, 상기 제2압타머는 서열번호 8로 표시되며, 상기 제1DNA는 서열번호 5로 표시되고, 상기 제2DNA는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다(표 2).
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 항-디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 항체인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 7).
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 항-인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 항체인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 7).
표적물질에 대한 결합제의 친화도 및 결합제에 대한 TEVP 또는 BLZ의 비율은 분석 성능에 영향을 미칠 수 있다. HER2 및 트롬빈에 대한 결합제에 대한 해리상수(Kd) 값은 보고된 바 있으며(trastuzumab to HER2: 173 pM; pertuzumab to HER2: 32 pM; Aptamer1 to thrombin: 102.6 nM; Aptamer2 to thrombin: 0.5 nM)(Deng, B. et al. Anal Chim Acta 837, 1-15, doi:10.1016/j.aca.2014.04.055 (2014); Komarova, T. V. et al. Sci Rep 9, 16168, doi:10.1038/s41598-019-52507-9 (2019)), 결합제에 공유적으로 연결된 ssDNA 분자의 수는 1개(트롬빈 압타머) 내지 4개(trastuzumab 및 pertuzumab)로 다양하다. 차이를 보완하기 위해, 4개의 구성성분(TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', 제1결합제-제1DNA, 제2결합제-제2DNA)의 농도를 최적화하여 HER2 및 트롬빈 각각의 검출 방법을 개발하였다. 각각의 선택된 조건 하에서 두 분석은 검출 범위와 LOD에서 유사한 성능을 보여주었다. 또한, 보고된 친화도 값이 없는 다른 결합제(항-cTnI 항체, 항-Dig 항체 및 다클론 항-hCG 항체)의 경우에도 구성성분의 농도를 조절하여 PPR 기반 동종 분석 방법을 수행할 수 있었다. 이러한 결과는 나노 몰 범위의 Kd 값을 가진 많은 이용 가능한 결합제가 PPR 기반 동종 분석에 활용 될 수 있음을 시사한다. 또한, 상기 PPR 기반 동종 분석은 모듈식이므로, 다른 유형의 표적물질에 대해 본 발명의 동종 분석을 적용하는 것은 당업자에게 용이하다.
표적물질에 대한 결합제는 직접적인 접합 대신 2개의 DNA 가닥 사이의 혼성화를 통해 TEVP 및 BLZ에 연결되었다. 이러한 접근법을 통해 ssDNA에 결합제들을 접합함으로써, 단백질(항체 포함) 및 압타머의 두 가지 유형의 결합제를 사용할 수 있다. 또한, 샘플과 혼합하기 전에 TEVP-제1결합제 및 BLZ-제2결합제를 제조할 필요가 없기 때문에, 원스텝 형식으로 분석을 수행할 수 있다. DNA 올리고머는 화학반응을 위한 특정 작용기를 포함하도록 합성될 수 있으므로, DNA와 접합체를 생성하는 다양한 경로가 보고되어 있다(Dovgan, I., et al., Bioconjug Chem 30, 2483-2501, doi:10.1021/acs.bioconjchem.9b00306 (2019)). NHS-아민 커플링 외에도, 다른 화학반응을 사용하여 보다 정의된 ssDNA-결합제 접합체를 생성할 수 있으며, 이는 분석의 견고성과 재현성에 기여한다.
단백질-단백질 상호작용과 같은 분자 상호작용을 검출하는 것은 다른 분자를 표적으로 하는 결합제를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 항체 및 압타머와 같은 결합제는 단백질의 번역 후 변형을 인식하는 것으로 보고되었으므로(Diaz-Fernandez A. et al. Chemical Science 11, 9402-9413, doi:10.1039/d0sc00209g (2020)), 표적 단백질에서 이러한 변형을 검출할 수 있다. 또한, 변형된 핵산에 대해 보고된 결합제(Bhattacharjee, R., et al., Analyst 143, 4802-4818, doi:10.1039/c8an01348a (2018))를 사용하여, 특정 위치에서 염색체의 후성적 변형을 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적물질이 소분자(small molecules)인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 상기 표적물질과 동일한 소분자이며, 항-소분자 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소분자가 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)인 경우, 상기 항-소분자 항체는 항-Dig 항체인 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 6).
본 발명에 있어서, 상기 제1DNA는 서열번호 1로 표시되고, 상기 제2DNA는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다(표 1).
본 발명에 있어서, 상기 프로테아제는 Tobacco Etch Virus (TEV) protease, Hepatitis C Virus (HCV) protease, Tobacco vein mottling virus (TVMV) protease 또는 Human rhinovirus (HRV) 3c protease인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 효소와 효소 활성 저해제인 단백질이 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 β-lactamase zymogen인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 발색성 기질일 수 있으며, 상기 발색성 기질은 CENTATM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 조성물에 표적물질을 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; (b) 상기 표적물질을 제1DNA-제1결합제 접합체의 제1결합제 및 제2DNA-제2결합제 접합체의 제2결합제에 결합시킨 다음, 상기 제1결합제에 연결된 제1DNA를 프로테아제(protease)에 연결된 제1DNA'와 혼성화(hybridization)시키고, 상기 제2결합제에 연결된 제2DNA를 효소원(zymogen)에 연결된 제2DNA'와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 제1결합제의 제1DNA와 혼성화된 제1DNA'-protease 접합체 및 제2결합제의 제2DNA와 혼성화된 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)에 의해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.
PPR 기반 분석 원리를 통해 단백질과 소분자에 대한 동종 분석 절차는 일정한 온도에서 혼합 및 읽기 형식으로 수행될 수 있다. 또한 b-lactamase에 의한 CENTATM의 촉매 변환은 흡광도 신호로 나노 몰 이하 농도에서도 표적물질을 검출할 수 있게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 효소와 효소 활성 저해제인 단백질이 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계의 근접 단백질가수분해 반응은 상기 프로테아제에 의해 펩타이드 링커가 절단됨으로써 상기 효소원이 효소와 효소 활성 저해제인 단백질로 분리되어 효소가 활성화되는 단계; 및 상기 활성화된 효소가 기질을 가수분해하여 신호를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로테아제는 Tobacco Etch Virus (TEV) protease, Hepatitis C Virus (HCV) protease, Tobacco vein mottling virus (TVMV) protease 또는 Human rhinovirus (HRV) 3c protease인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 β-lactamase zymogen인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 발색성 기질일 수 있으며, 상기 발색성 기질은 CENTATM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 β-lactamase zymogen이고, 상기 기질은 CENTATM이며, 상기 샘플이 표적물질을 함유하는 경우, 405nm에서 흡광도의 변화량이, 표적물질을 함유하지 않은 경우의 흡광도의 변화량보다, 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소원은 β-lactamase zymogen이고, 상기 기질은 Nitrocefin이며, 상기 샘플이 표적물질을 함유하는 경우 빨간색 신호를 나타내고, 표적물질을 함유하지 않은 경우 노란색 신호를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 항-소분자 항체를 추가로 포함하는 조성물에 소분자를 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; (b) 상기 제1결합제에 연결된 제1DNA를 프로테아제(protease)에 연결된 제1DNA'와 혼성화(hybridization)시키고, 상기 제2결합제에 연결된 제2DNA를 효소원(zymogen)에 연결된 제2DNA'와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화된 제1DNA'-protease 접합체와 상기 혼성화된 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)의 유발 유무를 기반으로 소분자의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 소분자(small molecules)의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 샘플이 소분자를 함유하는 경우, 상기 소분자가 항-소분자 항체에 결합함으로써, 상기 (c) 단계의 근접 단백질가수분해 반응은 일어나지 않고, 상기 반응에 의해 발생하는 신호가 없는 것을 특징으로 할 수 있다(실시예 6, 도 6).
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 샘플이 소분자를 함유하지 않은 경우, 상기 항-소분자 항체가 제1DNA-제1결합제 접합체의 제1결합제 및 제2DNA-제2결합제 접합체의 제2결합제에 결합함으로써, 상기 (c) 단계의 혼성화된 제1DNA'-protease 접합체와 상기 혼성화된 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응에 의해 신호가 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다(실시예6, 도 6).
본 발명에 따른 표적물질 또는 소분자의 검출방법을 수행함에 있어 사용되는 제1결합제, 제2결합제, 표적물질, 제1DNA 및 제2DNA 등과 관련된 구성에 대한 설명은 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: PPR기반 동종 분석(homogeneous assays)의 설계
프로테아제 및 자이모겐은 상보적인 ssDNA 분자 사이의 특이적이고 강력한 혼성화를 사용하여 분석을 위해 항체, 압타머, 항원과 같은 결합제에 물리적으로 연결되었다. 담배 식각 바이러스 프로테아제(tobacco etch virus protease; TEVP) 및 b-lactamase 자이모겐(b-lactamase zymogen; BLZ)을 단백질가수분해를 위한 쌍으로 사용했다. TEVP는 높은 특이성으로 인해 재조합 단백질 가공에 널리 사용되어 왔다. BLZ는 TEVP에 의해 활성화되도록 이전에 설계되었다(도 8). 두 단백질은 또한 인간 시스템과 직교하므로(orthogonal), 실제 샘플 적용분야에 중요하다. 4개의 접합체(TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', 제1결합제-제1DNA 및 제2결합제-제2DNA)와 β-lactamase에 대한 발색성 기질(CENTATM)을 샘플과 혼합하고 흡광도의 변화를 모니터링했다. 일반적인 분석은 원-스텝 형식으로 수행되고, 신호(가수분해된 CENTATM 의 경우 405 nm에서의 흡광도)는 1 시간 후에 측정되었다(도 1b).
표적물질을 검출하기 위한 동종 분석에서, 샘플을 반응 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 40 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5% (w/v) BSA, 및 pH 7.4)에서 4개의 접합체(TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', 제1결합제-제1DNA, 제2결합제-제2DNA) 및 400 mM CENTATM (EMD Millipore, USA)와 혼합하였다. β-lactamase에 의한 CENTATM의 가수분해는 37°C에서 1시간 동안 플레이트 리더(Synergy HT Multi-Detection Reader; BioTek Instruments, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도(A405)를 측정하여 모니터링 되었다. 흡광도 신호(ΔAbs = 60분에서 A405 - 1분에서 A405)는 표적물질의 농도에 대해 플롯되었다. 모든 실험은 적어도 세 번 수행되었으며, 검출 한계(limit of detection; LOD)는 블랭크에 대한 평균 ΔAbs 값과 표준 편차의 3배의 합으로 계산되었다. 소분자 검출을 위한 경쟁적 면역분석에서는, 반응용액에 표적에 대한 항체가 추가로 포함되었다. 다음 단백질이 표적물질로 사용되었다: HER2(세포 외 도메인; 10004-H08H; Sino Biological, China), cTnI 단백질(ab207624; Abcam, United Kingdom), 트롬빈(ab62452; Abcam), digoxigenin(D9026; Sigma, USA), digoxigenin 다클론 항체(PA1-85378; Thermo Fisher Scientific, USA) 및 hCG 단일클론 항체(MA5-14680; Thermo Fisher Scientific).
다양한 결합제에 적용할 수 있는 방법을 개발하고자 직접 접합 방법이 아닌 핵산 혼성화를 사용하여 TEVP와 BLZ를 결합제에 연결하였다. BLZ와 제2DNA '(표 1) 사이의 부위 특이적 접합은 이중기능성 링커(N-hydroxysuccinimide ester-(polyethyleneglycol)4-dibenzocyclooctyne; DBCO-PEG4-NHS ester)를 사용하였다(도 9). β-lactamase 자이모겐은 4-azido-L-phenylalanine (AzF)을 갖도록 조작되었으며 합성된 제2DNA'는 아민기를 사용하여 기능화되었다. SpyTag/Catcher 시스템은 제1DNA'을 TEVP에 접합하는 데 사용되었고, BLZ-제2DNA '결합방법이 프로테아제의 상당한 불활성화를 초래하는 것으로 이전에 관찰되었다. AzF가 포함된 SpyCatcher는 DBCO-PEG4-NHS 에스테르를 사용하여 제1DNA'(표 1)과 접합되었으며 SpyTag와 SpyCatcher 사이의 자발적인 이소펩티드 결합 형성은 TEVP-제1DNA' (도 10)를 생성했다.
결합제-ssDNA 분자의 생성은 결합제에 따라 다르며, 각 경우에 대한 방법은 하기 실시예에서 후술한다. ssDNA 분자의 서열은 분석 조건에서 가닥 사이의 강력하고 특정 상호작용을 가능하게 하도록 설계되었으며 Nucleic Acid Package를 사용하여 분석되었다.
아민-변형된 DNA
ssDNA 서열 (5'→3') 서열번호
제1DNA [Amine]CCTAACTTGACGATACAGCG 1
제2DNA [Amine]TGGAATGCTGGTGGCGTAGG 2
제1DNA' [Amine]CGCTGTATCGTCAAGTTA 3
제2DNA' [Amine]CCTACGCCACCAGCATTC 4
실시예 2: HER2의 엑토도메인(ectodomain)을 검출하기 위한 동종 분석
일부 암세포에서 과발현되는 것으로 보고된 인간 표피 성장인자 수용체-2(human epidermal growth factor receptor-2; HER2)(도 2a)의 엑토도메인(ectodomain)을 검출하기 위해 PPR을 기반으로 동종 분석을 수행했다. HER2에 대한 결합제로서, 각각 세포 외 도메인 IV 및 도메인 II에 결합하는 2개의 승인된 단일클론 항체인 trastuzumab 및 pertuzumab을 선택했다. HEK293F 세포를 사용하여 발현된 두 항체는 ssDNA(제1DNA 또는 제2DNA, 표 1)와 공유적으로 변형되어 trastuzumab-제1DNA 및 pertuzumab-제2DNA를 형성했다(도 11). 항체-ssDNA 접합체는 아민과 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테르 사이의 반응을 사용하여 제조하였고(도 11a); 아민-변형된 ssDNA를 먼저 과량의 Bis-NHS 에스테르 링커와 반응시킨 다음 NHS 에스테르기를 갖는 생성물을 항체와 접합시켰다. 항체 분자에는 하나 이상의 아민 그룹이 있으므로, 접근 방식은 필연적으로 이종 생성물을 생성했다(도 11b, c). 그러나, 상업적으로 이용 가능한 다양한 항체를 사용하기 위해 이 방법을 사용하여 항체-ssDNA 접합체를 생성하였다. 또한, 공급자로부터 2개의 항체를 사용하여 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I)을 검출하기 위한 분석을 실시하였다.
항체-ssDNA 접합체를 사용하여 먼저 분석 방법이 HER2의 ectodomain에 대한 특정 신호를 생성하는지 확인했다(도 2b). 다양한 항체 조합을 TEV-제1DNA '및 BLZ-제2DNA' 쌍으로 테스트했으며, 그 결과 각 ssDNA를 항-HER2 항체에 접합하는 것이 HER2 단백질을 검출하는 데 필요하고 충분하다는 것이 입증되었다. 흡광도 신호(*?*Abs)는 405nm에서 1분 및 60분에서 흡광도 값의 차이로 정의된다. 또한, CENTATM, 항체-ssDNA 접합체, TEV-제1DNA', BLA-제2DNA' 및 MgCl2를 포함한 반응 성분의 농도를 최적화했다(도 12). 최적화된 조건을 적용하여 샘플에서 HER2 엑토도메인 농도를 정량화했다(도 2c). CENTATM의 가수분해에 의해 생성된 405nm에서의 흡광도를 1시간 동안 모니터링 했으며 최대 20nM의 HER2에 대한 신호 차이가 관찰되었다(도 2c, d). 흡광도 차이와 HER2 농도 사이의 선형 관계는 0-1.25nM 범위에서 관찰되었으며, 검출 한계(limit of detection; LOD)는 5.03 pM이다(도 2e).
실시예 3: 세포막에서 HER2의 검출
HER2는 막 단백질이며, 이의 발현은 일반적으로 고정 및 반복 세척을 포함하여 여러 단계로 구성된 유세포분석(flow cytometry) 또는 면역조직화학 염색을 사용하여 분석된다. 본 발명에서는 HER2의 다양한 발현 수준을 가진 여러 유방암 세포주에 HER2를 검출하기 위한 원스텝 분석 절차를 수행하였다(도 3a). HER2의 가용성 엑토도메인을 분석할 때와 같이, 4개의 접합체(TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', trastuzumab-제1DNA, pertuzumab-제2DNA) 및 CENTATM를 부유세포(suspended cells)가 있는 용액에 첨가하고 흡광도 신호를 1시간 후에 측정하였다. 신호는 MCF-7, ZR-75-1, SK-OV-3, 및 BT-474의 순서로 증가했으며(도 3b), 이는 유세포분석(flow cytometry) 결과와 일치했다(도 3c). 또한, BT-474 셀을 사용하여 신호와 셀 수 사이의 선형 관계를 0- 2.5 Х 105 cells 범위에서 관찰하였고, LOD는 5.75 Х 103 cells 이다(도 3d). 샘플은 트립신으로 세포를 처리하여 제조하였고, 기재된 방법은 거의 손상되지 않은 세포에서 막 단백질을 분석하는 데 유용하다.
실시예 4: cTnI을 검출하기 위한 동종 분석
다양한 항원에 대해 이미 생성되거나 개발된 수많은 항체가 있으며, 그들을 결합제로 사용하는 PPR 기반의 동종 분석을 개발하였다. 혈액 내 심장 트로포닌 I(Cardiac troponin I; cTnI)는 심장 손상의 필수 바이오마커 역할을 하며 이를 검출하기 위한 단백질 검출방법이 연구되어 왔다. 본 발명에서는 cTnI의 아미노산 23-29(항-cTnI Ab1) 및 41-49(항-cTnI Ab2)에 해당하는 별개의 에피토프를 인식하는 2개의 상용화된 항-cTnI 항체를 사용하여 cTnI를 검출하기 위한 PPR 기반 동종 분석을 개발했다. 항-HER2 항체에 사용된 절차에 따라 항체를 ssDNA(제1DNA 및 제2DNA)에 접합하여 항-cTnI Ab1-제1DNA 및 항-cTnI Ab2-제2DNA를 형성했다(도 13). 항체-ssDNA 접합체를 사용한 분석은 농도 의존 곡선과 0-5.0nM cTnI 범위에서 선형 관계를 나타내었으며, LOD는 10.51pM이다(도 2e). 따라서, 다양한 항원에 대해 사용 가능한 다른 항체를 PPR 기반 동종 분석을 개발하는 데 쉽게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 트롬빈을 검출하기 위한 압타머를 이용한 동종 분석 및 동종 분석의 특이성
핵산으로 구성된 압타머는 다양한 분자에 대한 친화성을 갖도록 개발되었다. 압타머는 일반 항체와 비교하여, 작은 크기, 높은 안정성 및 화학적 합성을 통한 생산과 같은 장점이 있다. 본 발명에서는 분석에서 압타머를 결합제로 사용한 결과, 추가적인 접합 및 정제 단계 없이 ssDNA-결합제를 합성할 수 있었다. 인간 α-트롬빈의 개별 영역(15-mer 및 27-mer DNA)에 결합하는 것으로 보고된 2개의 압타머를 사용하였다. 15-mer 트롬빈 압타머(Aptamer1)는 섬유소원-인식 엑소사이트(fibrinogen-recognition exosite)와 상호작용하는 반면, 27-mer 압타머(Aptamer2)는 헤파린-결합 엑소사이트에 결합한다(도 14a). 합성된 Aptamer1-제1DNA 및 Aptamer2-제2DNA(표 2)를 사용하여 트롬빈 검출을 위한 PPR 기반 동종 분석을 수행하였다(도 5a). 항체를 결합제로 사용하는 분석과 비교하여 리포터 대 결합제 비율이 다르기 때문에 ssDNA-리포터 및 ssDNA-결합제의 농도에 대한 최적화가 필요하였다(도 14b). 트롬빈 농도에 대한 405nm에서의 흡광도 차이를 플로팅하여 쌍곡선 곡선을 얻었으며, 1.25 nM까지 선형관계를 관찰하였고, LOD는 6.82pM이였다(도 5b). 결과는 압타머가 PPR 기반 동종 분석을 위한 결합제로 사용될 수 있음을 보여준다.
또한, HER2, cTnI 및 트롬빈을 검출하기 위해 개발된 세 가지의 PPR 기반 동종 분석의 특이성을 평가했다. 결합제가 그들의 표적과 일치할 때만 신호가 배경과 크게 상이하였다(도 5c). 따라서, 표적물질에 적절한 결합제를 사용하여 특정한 동종 분석을 개발할 수 있음을 알 수 있다.
트롬빈 압타머 DNA
종류 서열 (5'→3') 서열번호
제1DNA TAACTTGACGATACAGCG 5
제2DNA GAATGCTGGTGGCGTAGG 6
제1압타머 GGTTGGTGTGGTTGG 7
제2압타머 AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGAC 8
제1압타머-제1DNA* GGTTGGTGTGGTTGGttttttTAACTTGACGATACAGCG 9
제2압타머-제2DNA* AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACttttttGAATGCTGGTGGCGTAGG 10
* 밑줄이 그어진 서열은 트롬빈 압타머를 나타내며, 소문자는 압타머와 제1DNA 또는 제2DNA 사이의 스페이서를 나타낸다.
실시예 6: 디곡시게닌(digoxigenin)을 검출하기 위한 경쟁적 동종 분석
단백질과 같은 생물학적 거대 분자와 달리, 몇 가지 예외를 제외하고는 소분자와 동시에 상호작용하는 결합제의 쌍을 발견하는 것은 일반적으로 한계가 있다(H Ueda, K. T., et al., Nat Biotechnol 14, 1714-1718, doi:10.1038/nbt1296-1714. (1996)). 따라서 경쟁적 ELISA와 같은 경쟁-기반 분석이 저분자량 표적물질을 검출하기 위해 개발되었다. 본 발명에서는 PPR 기반 분석 형식을 사용하여 소분자를 검출하기 위한 경쟁적 동종 분석을 개발하였다(도 6a). 화학물질인 디곡신(digoxin)은 다양한 심장 질병을 치료하는 데 사용되었으며 과다복용으로 인한 독성 가능성 때문에 이의 혈청 농도를 모니터링 해야한다. 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)은 디곡신(digoxin)의 일부이며(도 6b), 본 발명의 방법을 개발하는 데 사용되었다. 제1DNA과 제2DNA는 각각 TEVP-제1DNA' 및 BLZ-제2DNA'와의 연관성을 위해 digoxigenin NHS-ester(도 15a)에 접합되었다. TEVP-Dig와 BLZ-Dig 사이의 단백질 가수분해 반응은 항-Dig 항체에 결합함으로써 향상되지만, 샘플에서 digoxin에 의해 억제된다. TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', Dig-제1DNA, Dig-제2DNA 및 항-Dig 항체의 농도가 최적화되었다(도 15b). 405nm에서 흡광도 신호는 Dig 농도가 증가함에 따라 감소했으며(도 15c), 1/DAbs와 Dig 농도 사이의 선형관계는 0-10nM Dig 범위에서 관찰되었고, LOD는 273.9pM이다(도 6c).
실시예 7: 항체를 검출하기 위한 동종 분석
표적 항원에 대한 항체 농도는 치료제의 임상 반응을 이해하고 감염 및 자가면역 질환을 진단하는 데 필수적인 정보를 제공한다. 또한, 배지의 항체 역가는 치료용 항체의 생산 과정을 제어하는 중요한 매개변수이다. Digoxin에 대한 경쟁적 동종 분석을 위해 생성된 시약(Dig-제1DNA 및 Dig-제2DNA)은 샘플에서 항-Dig 항체를 검출하는 데 사용되었다(도 7a). TEVP-제1DNA', BLZ-제2DNA', Dig-제1DNA, 및 Dig-제2DNA의 농도가 최적화되었다(도 16). 항-Dig 항체 농도가 20nM로 증가함에 따라 405 nm에서 흡광도의 차이가 증가했고, 0-10nM의 범위에서 선형 곡선을 수득하였으며, LOD는 78.51pM이다(도 7b).
항원의 크기는 항체와 결합된 TVEP와 BLZ 간의 단백질 가수분해 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 본 발명에서는 단백질 항원에 대한 항체에 본 발명의 방법을 적용했다(인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin), hCG, 도 17a). hCG는 NHS-아민 커플링 반응을 사용하여 제1DNA 또는 제2DNA에 접합되었고(도 17b-d), 시약의 농도도 최적화되었다(도 17e). 항-hCG 항체에 대한 농도-반응 곡선은 0-10nM 범위에서 수득되었고, LOD는 9.83pM이다(도 7c). 이러한 결과로부터, 본 발명의 PPR 기반의 동종 분석 플랫폼은 소분자에서 큰 단백질에 이르기까지 자가항원을 포함하는 다양한 항원에 대한 항체를 검출하는 데 적용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 실험 방법
실시예 8-1: 단백질의 발현 및 정제
Tobacco etch virus protease-SpyTag(TEVP-SpyTag)
TEVP와 SpyTag로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드(pSPEL515)인 TEVP-SpyTag를 대장균 BL21 (DE3)에 형질감염시켰다. 37 ° C에서 2x YT 배지에서 성장한 배양물을 0.5의 광학 밀도(OD600)에서 0.4mM 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)로 유도한 다음 25 ° C에서 8 시간 동안 추가로 성장시켰다. 세포를 원심분리하여 수집하고, 단백질(His6 태그 포함)을 제조업체의 지침에 따라 Ni-NTA resin (Clontech, Japan)를 사용하여 정제했다. 정제된 TEVP-SpyTag 단백질은 -20 ° C에서 TEVP 저장 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 및 40% (v/v)의 glycerol; pH 8.0)에 저장되었다.
SpyCatcher-AzF 및 b-lactamase zymogen-azidophenylalanine (BLZ-AzF) SpyCatcher-AzF (pSPEL517) 또는 BLZ-AzF (pSPEL427)을 발현하는 플라스미드를 두 개의 다른 플라스미드와 함께 E. coli BL21 (DE3)에 형질감염 시켰다: 하나는 TAG codon에 반응하여 AzF를 통합하기 위해 Methanococcus jannaschii 로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소 및 tRNA의 직교 쌍을 인코딩하고, 다른 하나는 E. coli prolyl-tRNA 합성효소(ProRS)를 과발현하여 단백질의 AzF의 Pro 위치로의 잘못된 통합을 억제하기 위한 것이다. 세포를 37 ℃에서 2xYT에서 0.5의 OD600으로 성장시킨 다음, 0.2%의 L-arabinose 와 50nM 무수 테트라사이클린을 첨가하여 직교 쌍 및 ProRS의 발현을 유도하였다. OD600이 1.0에 도달하면 1mM AzF 및 0.4mM IPTG를 배양물에 첨가하여 SpyCatcher-AzF 또는 BLZ-AzF의 발현을 유도했다. SpyCatcher-AzF를 발현하는 세포는 30 ° C에서 8 시간 동안 추가로 배양되었고 BLZ-AzF를 발현하는 세포는 25 ° C에서 밤새 배양되었다. 단백질은 His6 태그를 가지고 있으며 제조업체의 지침에 따라 Ni-NTA 수지에서 정제되었다. BLZ-AzF는 주변 세포질 공간에서 발현되었고, 정제 절차는 주변 세포질 분획에 적용되었다. 정제된 단백질은 20%(v/v)의 글리세롤을 포함하는 PBS에 -20℃ 에서 보관되었다.
IgG (trastuzumab and pertuzumab) 및 human chorionic gonadotropin (hCG)
발현 벡터의 구축을 위해, Kozak 서열을 포함하는 trastuzumab, pertuzumab 및 hCG를 코딩하는 합성 유전자를 NotI 및 XhoI 사이트에서 pcDNA 3.1로 클로닝했다. 각 플라스미드를 포함하는 구축된 플라스미드 이름과 단백질 서열은 표 3에 기재되어 있다. 단백질은 FreeStyle 293 발현 배지(Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA)에서 유지되는 HEK293F 세포주에서 생산되었다. 단백질 발현을 위해, 단백질 서열을 암호화하는 250μg의 발현 벡터를 200mL의 배지에서 750μg의 폴리에틸렌이민(Polysciences, USA)을 통해 2 Х 106 cells로 형질 감염시켰다. 세포를 5 ~ 7 일 동안 배양한 후, 원심분리를 사용하여 상등액을 수집하고, 각 항체를 Captiva 단백질 A 친화성 수지(Repligen, USA)에서 정제하고, hCG를 제조업체에서 제공한 지침에 따라 NI-NTA 수지에서 정제했다. 정제된 각 단백질은 PBS에 -20℃에서 보관되었다.
단백질 서열
종류 서열 (5'→3') 서열
번호
TEVP-SpyTag(pSPEL515) MGSSHHHHHHGSWSHPQFEKKLGGGSGGGSAHIVMVDAYKPTKGGGSGGGSEFESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLVVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSGDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN 11
SpyCatcher-AzF*(pSPEL517) MGSSHHHHHHGSGGGS X KLGGGSGGGSAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI 12
BLZ-AzF*(pSPEL468) MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG X GGSGGSAGVMTGAKFTQIQFGMTRQQVLDIAGAENCETGGSFGDSIHCRGHAAGDYYAYATFGFTSAAADAKVDSKSQEKLLAPSAPTLTLAKFNQVTVGMTRAQVLATVGQGSCTTWSEYYPAYPSTAGVTLSLSCFDVDGYSSTGAYRGSAHLWFTDGVLQGKRQWDLVGSGGGSGGGSENLYFQGGGGSGGGSKLMDERNRQIAEIGASLIKHWGGGGGHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGEPSRIVVIYTTGSQALEHHHHHH 13
Trastuzumab, 중쇄(pSPEL874) MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 14
Trastuzumab, 경쇄(pSPEL875) MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 15
Pertuzumab, 중쇄(pSPEL624) MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16
Pertuzumab, 경쇄(pSPEL625) MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 17
hCG, α-서브유닛(pSPEL706) MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPLFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSHHHHHH 18
hCG, β-서브유닛(pSPEL707) MEMFQGLLLLLLLSMGGTWASKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGSHHHHHH 19
* X 는 AzF가 단백질에 통합되는 위치를 나타낸다.
단백질 농도의 결정
정제된 단백질의 농도는 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정되었으며, 흡광 계수(extinction coefficient)는 ProtParam 사이트(http://web.expasy.org/protparam/)를 통해 계산되었다.
실시예 8-2: 단일 가닥 DNA(ssDNA) 접합체의 제조
이중기능성 링커( N-hydroxysuccimide ester-(polyethylene glycol) 4 -dibenzocyclooctyne; DBCO-PEG 4 -NHS ester) 를 통한 ssDNA 및 단백질의 접합
5'아민기로 작용화된 단일 가닥 DNA(DNA1 '또는 DNA2')를 20배 몰 과량의 DBCO-PEG4-NHS 에스테르와 혼합했다. PBS의 반응 혼합물을 암실에서 25 ° C에서 2 시간 동안 배양했다. 변형된 ssDNA를 75 % 에탄올 침전으로 정제하여 미반응 링커를 제거하고 펠릿(pellet)을 -20 °C 에서 보관하기 위해 PBS에 재현탁했다. 5'-변형된 DNA2'(DNA2'-DBCO)와 BLZ-AzF는 DBCO와 아지드(azide) 간의 변형-촉진(strain-promoted) 아지드-알킨 반응을 위해 5 : 1의 몰비로 혼합되었다. PBS 중의 반응 혼합물을 4 ° C에서 밤새 배양하였다. 생성물을 먼저 HiTrap Q column (GE Healthcare Life Sciences, USA) 에서 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하여 접합되지 않은 단백질을 제거하고, 접합체를 0.2 ~ 1.0 M NaCl의 구배로 용리했다. 다음으로, 정제된 분획을 Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences, USA)에서 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 미반응 DNA2'-DBCO를 제거했다. 정제된 BLZ-DNA2 접합체를 20%(v/v)의 글리세롤을 함유하는 PBS에 -20 °C 에서 보관했다. SpyCatcher-AzF와 DNA1'-DBCO의 접합은 BLZ-DNA2 '에 사용한 방법과 동일한 방법으로 수행되었으며, 생성물은 0.2 ~ 1.0 M NaCl의 구배 용리를 갖는 HiTrap Q 컬럼을 사용하여 정제되었다. 정제된 용액에는 SpyCatcher와 SpyTag 간의 다음 반응을 방해하지 않는 미반응 DNA1'-DBCO가 포함되어 있다. 마지막으로, 부분적으로 정제된 SpyCatcher-DNA1'은 자발적인 이소펩티드 결합 형성을 위해 TEVP-SpyTag와 함께 배양되었다. 제조업체의 지침에 따라 Step-Tactin 수지 (IBA Lifesciences, Germany)를 사용하여 미반응 SpyCatcher-DNA1'을 제거했다. TEVP-SpyTag 단백질에는 Strep 태그가 있다. 정제된 BLZ-DNA2 접합체는 TEVP 저장 버퍼에 -20 °C 에서 저장되었다.
bis-N-hydroxysuccinimide (NHS) 링커를 통한 ssDNA 및 단백질의 접합
Bioneer Co. (Korea)에서 합성한 아민-기능화된 ssDNA(DNA1 또는 DNA2)를 200 배 몰 과량의 Bis-NHS 에스테르 링커와 혼합하고, PBS에서 반응 혼합물을 4 ° C에서 1 시간 동안 배양하였다. 변형된 ssDNA를 75 % 에탄올로 침전시켜 미반응 링커를 제거하고 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. NHS 에스테르기를 갖는 ssDNA를 trastuzumab, pertuzumab, 항-심장 트로포닌 I(cTnI) 항체 (ab92408, ab10231; Abcam, United Kingdom) 또는 hCG와 4 ° C에서 16 시간 동안 반응시켰다. 접합 반응에 대한 ssDNA 대 단백질의 비율은 trastuzumab의 경우 25 : 1, pertuzumab의 경우 45 : 1, anti-cTnI 항체의 경우 55 : 1, hCG의 경우 30 : 1 이었다. 접합체를 Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences, USA) 에서 겔 여과 크로마토그래피로 정제하여 미반응 ssDNA를 제거했다. 정제된 접합체는 PBS에서 -20 °C 에 보관되었다.
ssDNA 및 ε-(digoxigenin-3-0-acetamido)caproic acid N-hydroxysuccinimide ester (Dig-NHS ester)의 접합
아민-기능화된 ssDNA(DNA1 또는 DNA2)를 PBS에서 20 배 몰 과량의 Dig-NHS 에스테르(Sigma, USA)와 함께 25 ° C에서 2 시간 동안 배양했다. Dig-변형된 ssDNA를 75 % 에탄올로 침전시켜 미반응 Dig-NHS 에스테르를 제거했다. 펠릿을 PBS에 재현탁하고 용액을 -20 °C 에 보관했다. 접합체 농도는 MOLBIOTOOLS 사이트 (http://www.molbiotools.com/dnacalculator.html)에서 계산된 흡광 계수와 함께 260 nm에서 흡광도를 측정하여 계산되었다.
ssDNA-단백질 접합체 농도의 결정
각 접합체의 농도는 다음과 같이 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 계산했다(MOLBIOTOOLS 및 ProtParam 사이트에서 계산된 흡광 계수 사용).
A260,conjugate = A260,DNA + A260,Protein = ε260,DNA * b * c260,DNA + ε260,Protein * b * c260,Protein
A280,conjugate = A280,DNA + A280,Protein = ε280,DNA * b * c280,DNA + ε280,Protein * b * c280,Protein
여기서, ε: 흡광 계수(M-1cm-1), b: 경로 길이(cm), c: 농도 (M).
실시예 8-3: 원형질막에서 HER2의 검출
인간 유방암 세포주 BT-474, SK-OV-3, ZR-75-1 및 MCF-7은 10% 소태아혈청(FBS) 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신 용액이 보충된 RPMI 1640, (HyClone, USA)에서 5%의 CO2를 포함하는 가습 대기에서 37 ° C로 유지되었다. 분석법으로 HER2를 검출하기 위해, 트립신 처리 후 세포를 PBS로 세척하고 80μM Dynasore (dynamin inhibitor; ab120629; Abcam, United Kingdom)를 포함하는 반응 버퍼에 재현탁하여 0.5 Х 106 cells/mL 의 농도에 도달하였다. HER2 검출은 PPR 기반 동종 분석을 사용하여 수행되었다.
실시예 8-4: 유세포분석(Flow-cytometric analysis)
트립신 처리 후, 세포를 1mL의 차가운 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 완충액(PBS, 2%의 FBS)으로 2회 세척하고, 얼음에서 100nM trastuzumab과 함께 1 시간 동안 배양했다. 다음으로, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, Alexa Fluor 488 (A-11013; Invitrogen, Thermo Fisher, USA)과 접합된 10ng/mL 염소 항-인간 IgG (H + L) 교차-흡착된 2차 항체로 얼음에서 1 시간 동안 배양했다. 세척 단계 후, 세포를 500μL의 차가운 FACS 완충액에 재현탁하고, 세포 표면 형광 강도를 FACS (BD FACSCalibur, BD Biosciences, USA)로 분석했다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. i) 제1DNA와 제1결합제가 결합되어 있는 제1DNA-제1결합제 접합체;
    ii) 제1DNA에 상보적인 서열을 갖는 제1DNA'와 프로테아제(protease)가 결합되어 있는 제1DNA'-protease 접합체;
    iii) 제2DNA와 제2결합제가 결합되어 있는 제2DNA-제2결합제 접합체;
    iv) 제2DNA에 상보적인 서열을 갖는 제2DNA'와 효소원(zymogen)이 결합되어 있는 제2DNA'-zymogen 접합체; 및
    v) 상기 효소원에 특이적인 기질을 포함하는 표적물질 검출용 조성물로,
    상기 제1DNA-제1결합제 접합체 및 제2DNA-제2결합제 접합체는 각각 제1DNA'-protease 접합체 및 제2DNA'-zymogen 접합체와 혼성화되고,
    상기 제1결합제와 제2결합제가 각각의 표적 물질에 결합할 때, 제1DNA'-protease 접합체 및 제2DNA'-zymogen 접합체의 근접 단백질가수분해 반응(proximity proteolysis reaction)에 의해 검출 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 서로 동일 또는 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 각각 독립적으로 상기 표적물질에 결합할 수 있는 항체, 압타머, 항원, 소분자(small molecules) 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 또는 항-cTnI 항체이며; 상기 항원은 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 또는 인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적물질은 항원, 항체, 소분자(small molecules) 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원은 HER2, cTnI 또는 트롬빈(thrombin)이며; 상기 항체는 항-디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 항체 또는 항-인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 HER2인 경우, 상기 제1결합제는 트라스투주맙(trastuzumab)이고, 상기 제2결합제는 퍼투주맙(pertuzumab)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I; cTnI)인 경우, 상기 제1결합제는 제1 항-cTnI 항체이고, 상기 제2결합제는 제2 항-cTnI 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 트롬빈(thrombin)인 경우, 상기 제1결합제는 트롬빈과 결합할 수 있는 제1압타머이고, 상기 제2결합제는 트롬빈과 결합할 수 있는 제2압타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1압타머는 서열번호 7로 표시되고, 상기 제2압타머는 서열번호 8로 표시되며, 상기 제1DNA는 서열번호 5로 표시되고, 상기 제2DNA는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 항-디곡시게닌(Digoxigenin; Dig) 항체인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 항-인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 항체인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 인간 융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표적물질이 소분자(small molecules)인 경우, 상기 제1결합제 및 제2결합제는 상기 표적물질과 동일한 소분자이며, 항-소분자 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 소분자가 디곡시게닌(Digoxigenin; Dig)인 경우, 상기 항-소분자 항체는 항-Dig 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제1DNA는 서열번호 1로 표시되고, 상기 제2DNA는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 Tobacco Etch Virus (TEV) protease, Hepatitis C Virus (HCV) protease, Tobacco vein mottling virus (TVMV) protease 또는 Human rhinovirus (HRV) 3c protease인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 효소원은 효소와 효소 활성 저해제인 단백질이 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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