KR101357173B1

KR101357173B1 - 단백질 ｇ 다합체를 이용하며 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서

Info

Publication number: KR101357173B1
Application number: KR1020110142763A
Authority: KR
Inventors: 이진형; 김현정; 장정호; 김종희
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2014-02-05
Also published as: KR20130074621A

Abstract

본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 면역 센서에 대한 것이다. 본 발명의 면역 센서는 검출 민감도가 높을 뿐 아니라 반복 사용이 가능한 장점이 있다.

Description

단백질 Ｇ 다합체를 이용하며 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서{REPEAT USABLE ELECTROCHEMICAL IMMUNOSENSOR USING MULTIMERIC PROTEIN G}

본 발명은 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서에 대한 것이다.

항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 진단키트 등의 응용 분야에서 대부분의 항체는 다양한 고체 물질 표면에 고정화된 형태로 사용된다.

항체의 고유한 결합 특성 및 활성을 손상시키지 않으면서 항체의 활성 부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 다양한 고체기판에 항체를 단분자막 형태 및 배향성을 조절하면서 고정화시키는 기술은 칩이나 센서의 검출 감도와 직접적으로 연결되므로 매우 중요하다. 특히 항체에서 항원에 대한 결합 부위는 Fab 영역에 존재하기 때문에 항체의 Fab 영역을 외부로 노출시키도록 항체를 고정화시키는 것은 항체의 성능과 감도를 높이는데 매우 중요하며 Fab 영역이 노출되지 않은 항체는 항체의 고정화에도 불구하고 그 기능을 상실하게 되어 고정화 양과 상관없이 센서 및 검출에는 효과가 없다. 결국 항체의 고정화시 고정화양만이 중요한 것이 아니라 배향성이 확보된 고정화가 중요한 요소가 되는 것이다.

또 다른 고려할 요소는, 항체의 단분자막으로부터 항원-항체 반응을 감도 높게 측정하기 위해서는 항원-항체간의 결합 반응이 입체제한(steric hindrance)을 최소로 하는 조건에서 높은 수준으로 이루어져야 한다는 것이다. 입체 제한은 주로 고체 표면에 고정화된 항체분자의 밀도에 의해 발생하며 밀도가 높은 경우 항원 결합 효율이 심각하게 떨어지게 된다.

일반적으로 입체제한을 줄이기 위하여 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합이 널리 이용되는데, 이는 배향성 고정화를 할 수 있으나, 트렙타비딘 및 비오틴이 고가의 시료라서 대량 생산 및 상업화이 곤란한 단점이 있다. 한편 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G를 이용하여 항체의 배향성을 확보하는 방법도 있는데(Boyle and Reis, Biotech. 5:697, 1987; Hoffman and O'Shannessay, J. Immunol. Methods, 112:113, 1988), 항체결합 단백질을 고체기판에 고정하는 과정에서 단백질의 배향성 조절이 어려워 항체의 고정 효율을 최적화하는데 문제가 되어 왔다.

상기와 같은 검출 효율 문제 외에도, 면역 센서는 1회 사용 후 폐기하는 것이 일반적인데, 현재 많이 사용되는 전기화학 바이오센서의 경우 필연적으로 전극이 사용되는데 많이 활용되고 있는 금 전극 기판의 경우 고가이고 한번의 실험으로 항체에 항원이 결합하고 나면 더 이상 항체를 사용할 수 없기 때문에 고가의 전극을 폐기해야 하는 점을 감안할 때 반복 사용이 가능한 면역 센서의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명의 목적은 배향성, 입체 제한 등이 개선될 뿐 아니라 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서칩을 제공한다.

또한 본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서칩을 이용한 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 면역 센서칩은 단백질 G 다합체를 이용함으로써 항체 결합부위의 3차원 구조를 형성하여 항체 결합에 있어 가장 접근성이 높은 구조를 제공하며, 이로써 항체 고정화가 증강되고 피검사체의 결합을 위한 적절한 항체 배향성을 확보하여, 검출 민감도가 향상된 특징이 있다. 또한 본 발명의 면역 센서칩은 시험 물질을 검출한 후, 시험 물질과 결합된 항체를 세척하여 새로운 항체를 고정화하여 전기화학 면역 센서칩을 반복 사용하는 것이 가능하다.

도 1은 단백질 G 다합체를 전극에 고정화시키는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 단백질 G 다합체, 제 1 항체(마우스 유래 항-E.coli 항체), 시험 물질 및 HRP 표지된 표지 항체(염소 유래 항-E.coli 항체)를 이용하여, 시험 물질을 검출하는 방법을 나타낸다.
도 3은 단백질 G 다합체를 이용한 면역 센서를 반복 사용하는 원리를 나타낸다.
도 4는 합성된 단백질 G 모노머, 다이머 및 트리머를 나타내며(a), 아울러 이들의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다(b): 단백질 G 모노머(1), 다이머(2), 트리머(3).
도 5는 단백질 G 다합체의 종류에 따른 항체 결합능을 나타낸다.
도 6은 단백질 G 다합체의 종류에 따른 검출 민감도를 나타낸다.
도 7은 단백질 G 다합체의 종류에 따른 면역 센서의 반복 사용 가능성을 나타낸다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서를 제공한다.

본 발명은 또한,

단백질 G 다합체에 제 1 항체를 결합시키는 단계;

상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;및

상기 시험 물질과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

단백질 G 다합체에 제 1 항체를 결합시키는 단계;

상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;

상기 시험 물질과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계;

상기 단백질 G 다합체-제 1항체-시험 물질의 복합체에 항체 제거제를 가하는 단계;및

상기 단백질 G 다합체에 제 2 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.

단백질 G 다합체

단백질 G 다합체는 복수 개의 단백질 G 모노머가 연결된 것이다. 바람직하게는 상기 단백질 G 모노머는 링커에 의하여 서로 연결된다. 상기 링커는 단백질 모노머를 연결하는데 사용되는 일반적인 링커면 제한없이 사용할 수 있으며, 예컨대, 상기 링커는 flexible한 (GGGGS)₃ 링커일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질 G 다합체는 2~10개의 모노머를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2~5 개의 모노머를 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 단백질 G 다합체는 다이머 또는 트리머이나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 시험 물질, 항체 등의 종류에 따라 적절한 개수의 모노머를 이용하여 단백질 G 다합체를 제조할 수 있을 것이다.

본 발명의 단백질 G 다합체는 단백질 G 다합체-커플링된 금 전극칩의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.

전극칩

본 발명의 전극칩은 면역 센서에 사용되는 일반적인 전극칩이면 된다. 예컨대, 본 발명의 전극칩은 금 전극칩, 탄소 전극칩 등이 될 수 있으며, 그래핀을 이용할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자는 목적 및 조건에 따라 적절한 전극칩을 이용할 수 있을 것이다.

본 발명의 전극칩은 세라믹 기판 위에 전극이 스크린 프린티드 되어 있는 형태로써, 효과적인 반응을 위해서 시험 물질과 결합하는 반응물(예컨대 단백질 G 다합체-항체 복합체)의 부피가 1~5 μl인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

금전극칩을 이용하는 경우, 본 발명의 금전극칩은 작업 전극과 상대전극은 금으로 구성되어 있고 기준전극은 은으로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 세라믹 기판은 가로 33 mm, 세로 10 mm 높이 0.5 mm 의 규격을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 G 다합체 - 커플링된 전극칩

본 발명의 단백질 G 다합체는 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 단백질 G 다합체와 전극칩의 커플링 방법은 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 단백질 G 다합체의 항체 결합능 및 전극칩의 기판 부착력을 유지한 채 이들이 충분한 결합력을 갖고 커플링되는 한, 커플링 방법이 특별히 제한되는 것은 아니다(도 1).

예컨대, 단백질 G 다합체의 말단의 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)을 환원시키고, 상기 환원된 설퍼히드릴기, 즉 설퍼기와 금의 반 공유결합을 이용하여, 상기 단백질 G 다합체를 금 전극칩 표면에 커플링시킬 수 있다.

상기 단백질 G 다합체의 말단의 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기의 환원은, 설퍼히드릴 기가 반응이 가능하도록 하는 것이다. 예컨대, 상기 설퍼히드릴기의 환원은 환원제를 처리하여 수행할 수 있으며, 이 때 환원제로 dl-dithiothreitol (DTT)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

참고로, 상기 금 전극칩이란, 작업 전극 및/또는 상대 전극이 금으로 된 것을 가리킨다. 예컨대, 상기 금 전극칩은 작업 전극 및 상대 전극은 금으로 되어 있고, 기준 전극은 은으로 되어 있는 전극칩 등이 될 수 있다.

상기 금 전극칩 표면에 환원된 설퍼기는 반 공유결합 반응을 통해서 별다른 전처리 과정이 필요없이 고정화 될 수 있다.

한편, 단백질 G 다합체를 전극칩에 고정하기 전, 먼저 전극칩 표면의 이물질을 제거하는 공정을 수행할 수도 있다. 상기 이물질 제거 공정은 전극칩에 산처리 등을 하여 수행될 수 있는데, 이때 사용하는 산 용액은 염산 혹은 황산이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 G 다합체 - 커플링된 금 전극칩의 제조예 1

산 처리된 금 전극칩 상에 환원제를 첨가하여 단백질G 다합체의 시스테인 잔기의 설퍼하이드릴 그룹을 환원시킨 단백질 G 다합체 용액을 금 전극칩 상에 떨어뜨리서 37℃에서 반응 시킨 후 버퍼 용액을 사용하여 금 전극칩에 붙지 않은 단백질 G 다합체를 세척한다.

전기화학 면역 센서

본 발명의 전기화학 면역 센서는 당업계에서 일반적으로 사용되는 전기화학 면역 센서를 가리킨다. 즉, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 시험 물질에 대한 인식능을 갖는 생물학적 수용체가 생물학적 상호작용 또는 인식 반응을 전기화학 신호로 변환함으로써 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 소자로, 바이오 칩을 포함한다.

예컨대 본 발명의 전기화학 면역 센서는 면역 센서일 수 있으며, 항체-항원 반응을 이용하여 인식되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 전기적 신호를 전기적 측정 방법을 통하여 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 전기화학 면역 센서는 단백질 G 다합체 커플링된 전극칩 및 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 전기화학 면역 센서의 사용 횟수에 따라 제 1 항체, 제 2 항체 등 제 n 항체가 될 수 있다. 본 발명의 전기화학 면역 센서는 단백질 G 다합체를 5~300 ng/㎖ 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5~200 ng/㎖ 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 5~100 ng/㎖ 포함할 수 있다. 그러나 이는 단백질 G 다합체의 사용량 대비 높은 검출 효율을 갖는 단백질 G 복합체의 농도이다. 그러므로 이보다 높은 농도를 갖는 경우 비록 사용량 대비 검출 효율 자체는 낮아지더라도 검출 효율의 절대치는 증가한다는 것은 자명하므로, 상기 범위를 벗어난다고 하여 본 발명의 범위를 벗어나는 것은 아니다.

반복 사용

본 발명의 전기화학 면역 센서는 반복 사용이 가능하다. 상기 "반복 사용"이란 본 발명의 면역 센서에 시험 물질을 가하여 시험 물질 내 특정 물질을 검출한 후, 상기 전기화학 면역 센서를 또다른 시험 물질의 검출에 재사용할 수 있는 것을 가리킨다. 상기 반복 사용은 본 발명의 전기화학 면역 센서를 2 회 이상 복수 회 사용하는 것이다.

예컨대, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 기판에 부착된 단백질 G 다합체-커플링된 금 전극칩에 제 1 항체를 결합하고, 여기에 시험 물질을 가하여 상기 제 1 항체와 시험 물질, 정확히는 시험 물질 내 특정 물질의 결합을 인식함으로써, 시험 물질 내 특정 물질을 검출할 수 있다(1회 사용). 그 후 항체 제거제를 처리하여, 제 1 항체-시험 물질 복합체를 단백질 G 다합체로부터 분리하면, 금 전극칩에 부착된 단백질 G 다합체만 남게 된다. 이때 단백질 G 다합체는 제 1 항체가 분리된 상태이다. 여기에 제 2 항체를 처리하여 단백질 G 다합체에 결합시키고, 또 다른 시험 물질을 처리하는 식(2회 사용)으로 본 발명의 전기화학 면역 센서를 반복 사용하게 된다.

본 발명에서 제 1 항체는 본 발명의 면역 센서를 첫 번째 사용할 때 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체를 가리키고, 제 2 항체는 본 발명의 면역 센서를 두 번째 사용할 때 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체를 가리킨다. 같은 식으로 본 발명의 면역 센서를 n번째 사용하는 경우, 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체는 제 n 항체라 부를 수 있을 것이다. 이때, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5,,, 와 같이, 1 이상의 임의의 정수이다.

항체

본 발명의 항체는 단백질 G 다합체에 결합할 수 있는 항체이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩은 단백질 G 다합체를 이용하여 항체에 결합하게 된다.

상기 항체는 제 1 항체 및 제 2 항체 등 제 n 항체에 모두 해당된다. 예컨대, 본 발명의 항체는 Rabbit IgG, Hamster IgG, Guinea Pig IgG, Bovine IgG, Sheep IgG, Goat IgG, Pig IgG, Chicken IgG, Mouse IgG 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

항체 제거제

본 발명의 항체 제거제는 전기화학 면역 센서의 반복 사용을 위하여 사용된다. 본 발명의 항체 제거제를 처리함으로써, 항체가 그것이 결합되어 있던 단백질 G 다합체, 즉, 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩으로부터 분리된다. 그러나 본 발명의 항체 제거제는 단백질 G 다합체와 전극칩간의 부착은 파괴하지 않는다.

이러한 특성, 즉 항체의 분리능을 가지면서도 단백질 G-다합체-커플링된 전극칩과의 부착을 파괴하지 않는 특성을 갖는 항체 제거제라면 제한 없이 본 발명의 항체 제거제로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체 제거제는 글라이신-산(acid)일 수 있으며, 바람직하게는 글라이신-HCl일 수 있고, pH 1.0~3.0일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 제 n 항체가 결합된 단백질 G 다합체 전극 복합체에 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2)를 100 ul를 처리한다. 그리고 반응 시간 10분 후 10 mM PBS (pH7.4)로 washing한 후 제 n+1 항체를 고정화 시킬 수 있다. 이때, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5,,, 와 같이, 1 이상의 임의의 정수이다.

시험 물질

본 발명의 시험 물질은 전기화학 면역 센서로 검출하려는 특정 물질을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되는 피검 물질을 가리킨다. 본 발명의 시험 물질은 항원을 포함할 수 있다.

<재료 및 방법>

재료

단일클론 항-E.coli IgG, 염소 항-E.coli IgG은 보레다 바이오테크(Boreda Biotech Co., Ltd (Gyeonggi, Rep. Korea))로부터 구입하였다. the Zeba desalt spin column, BCA^TM 단백질 검사 키트 및 alkaline phosphotase (ALP) 항체 표지 키트는 모두 Thermo Scientific Inc. (MA, USA)로부터 구입하였다. dl-dithiothreitol (DTT)는 GenDEPOT Inc. (TX, USA)로부터 구입하였다. Dimethylsulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS), sodium monobasic monohydrate, sodium phosphate dibasic, dodecyl sulfate sodium salt, Tween-20, glycine, bromophenol blue sodium salt 및 hydrochloric acid는 모두 Sigma-Aldrich(MO, USA)로부터 구입하였다. Sodium chloride는 Junsei Chemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다.

박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건

본 발명에서 사용한 박테리아 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다. 플라프미드 유지를 위하여 카나미신(kanamycin) 50 ㎍/㎖를 포함하는 Luria-Bertani 배지에서 Streptococcus dysgalactiae 및 E. coli BL21(DE3)를 37 ℃ 조건 하 배양하였다. UV/Vis spectrophotometer (Jasco Co., Japan)를 이용하여 600nm에서 optical density를 측정함으로써 세포 성장을 모니터링하였다.

시스테인- 태그된 폴리머 다합체 단백질 G의 발현 및 정제

G-spin Genomic DNA extraction kit (Intron Biotech Inc., Rep. Korea)를 이용하여 S. dysgalactiae로부터 genomic DNA를 제조하였다. 프라이머 쌍, PG-F:N(5'-accata tgactgacacttacaaatta-3'; NdeⅠ) 및 PG-R:BcysX(5'-acctcgagttagcatccggattcagttaccgta aaggt-3';BspEⅠ및 XhoⅠ)을 이용하여 PCR에 의하여 genomic DNA로부터 상기 단백질 G 코드 영역(spg 유전자)를 증폭하였다. 단백질 G 모노머 및 시스테인 태그 사이에 융합 단백질을 생기게 하기 위하여 상기 제한 부위를 포함시켰다. 상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터, pLUG에 클로닝한 후, 그 결과 생기는 플라스미드(pLUG-PG)를 NdeI/XhoI로 자르고(digest), spg 단편을 pET-28a에 붙여(ligate) pEPG-M을 만들었다(표 1).

다합체 단백질 G를 제조하기 위하여, 프라이머 PG-R:BcysX와 함께 PG-F:Alink(5'-ataccggtggaggcggttcaggcgg-aggtggctctggcggtggcggatcgactgacacttacaaatta-3';Age Ⅰ)를 이용하여 spa 유전자를 증폭하였다. 이들 DNA 단편들은 이후 글라이신/세린(GGGGS)3 링커를 통하여 pEPG-M 내 spg 유전자의 3' 말단에 융합되었다. 그 결과 생기는 플라스미드 pEPG-M, pEPG-D 및 pEPG-T는 모노머, 다이머 및 트리머 단백질 G를 각각 코드하며, 숙주인 E. coli BL21 내로 형질전환시켰다(transform).

다합체 단백질 G를 합성하기 위하여, 0.2 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 이들이 600nm에서 0.6의 최적 농도에 달한 후에 가하였다. 상기 세포들을 3시간 이상 성장시킨 후, 수확하고, French press를 이용하여 파쇄하였다. 단백질의 정제는 Qiagen (Hilden, Germany)의 설명서에 따라 Ni-nitrilotriacetic acid affinity chromatography에 의하여 수행하였다.

금 전극칩

금 전극 칩은 세라믹 기판 위에 스크린 프린팅 기법으로 금과 은을 찍어낸 것으로써 DropSens의 screen-printed gold electrode 1.6mm/ink AT를 사용하였다.

금 전극칩 상 다합체 단백질 G의 커플링

먼저 10.91 mM dl-dithiothreitol (DTT) (Gen- DEPOT Inc., USA)을 이용하여 시스테인-태그된 단백질 G 다합체(30 μM)를 30분간 실온에서 환원시켜, sulfhydryl 그룹을 완전히 환원시켜 sulfur 그룹으로 만든다. 상기 환원된 단백질 G 다합체를 1 μl를 작업 전극에 떨어뜨리고 37℃ 조건에서 30분간 보관하였다. 이후 10 mM PBS(pH 7.4)를 사용하여 금 전극에 붙지 않은 다합체 단백질 G를 3회 세척하였다.

단백질 G- 커플된 금 전극칩 상 제 1 항체의 고정화

마우스 유래 항-대장균(E.coli) IgG(제 1 항체)를 0.1% tween 20과 함께 10 mM PBS(pH 7.4) 내 200 ㎍/㎖로 용액을 준비하여 단백질 G-커플된 금 전극칩의 작업 전극에 가하였다. 상기 금 전극칩을 37℃ 조건에서 30분간 보관하였고 이후 10 mM PBS(pH 7.4)에 1% BSA (Bovine Serum Albumin)가 섞여있는 용액을 사용하여 단백질 G-커플된 금 전극칩에 붙지 않은 항체를 3회 세척하였다.

대장균(E. coli ) 검사의 수행

다양한 농도의 대장균 용액을 10mM PBS(pH 7.4)에 용해하여 준비하였다. 준비된 수용액 10 μl를 금 전극칩에 가하고, 밀봉한 후 37℃ 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 10 mM PBS로 3 회 세척한 후, 표지 항체로 Horseradish Peroxidase (HRP) 표지된 염소 항-E.coli IgG 100 ㎍/㎖을 처리하였는데, 이는 rotary shaker에서 실온 조건 하 30분간 10 mM PBS (pH 7.4) 200 ㎕ 내에서 HRP antibody labeling kit (Thermo Scientific Inc., USA) 를 이용하여 제조한 것이다. 금 전극칩 상에서 포착된(captured) 항원과 반응한 후, 결합하지 않은 임의의 HRP-표지된 항체는 씻어내고. Autolab (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands)를 이용하여 전류량을 측정하였다(도 2). 전류량 측정을 위해 4 mM 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB)를 0.06% H₂O₂와 0.1M KCl 이 용해되어 있는 0.05M citrate phosphate 용액에 준비하여 100 μl를 금 전극에 떨어뜨려서 측정하였다. 이때 -200mV에 대해서 600초 동안 측정한다. 측정은 Autolab Type II (Eco Chemie, The Netherlands)를 가지고 측정하며 cyclic voltammetric 측정은 50 mV s-1의 속도로 -0.3V에서 +0.8V까지 측정하였다.

금 전극칩 상의 고정화 된 제 1 항체의 탈착 및 제 2 항체의 재부착

상기 대장균 검사 수행 후 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 100 ul 를 처리하였다. 반응시간 10분 후 10 mM PBS (pH7.4)로 세척하여 제 1항체가 분리된 것을 확인하였다.

제 2항체인 또다른 마우스 유래 항-대장균 (E.coli) IgG를 최종농도를 200㎍/㎖가 되도록 0.1% 트윈20이 들어있는 10mM PBS (pH7.4) 버퍼를 이용하여 희석한 후 상기에서 단백질 G 커플링된 금 전극칩에 1㎕ 첨가한 후, 상기 방법과 동일하게 37℃ 조건에서 30분간 보관하였고 이후 10 mM PBS(pH 7.4)에 1% BSA (Bovine Serum Albumin)가 섞여있는 용액을 사용하여 단백질 G-커플된 금 전극칩에 붙지 않은 제 2 항체를 3회 세척하였다 (도 3).

기계 분석

단백질의 분자량은 SE-250(Amersham Biosciences, Sweden)를 이용하여 이들의 전기영동 이동성에 따라 측정되었다. 쌓이고 분리되는 젤의 젤 농도는 각각 4 % 및 12.5 %였다. 전류값 변화는 Autolab Type Ⅱ (Eco Chemie, The Netherlands)를 이용하여 측정되었다.

데이터 분석

모든 샘플들은 오차 분석을 위하여 3회 시험되었다.

<결과>

재조합 모노머 , 다이머 및 트리머 단백질 G

모노머, 다이머 및 트리머 형태의 세 가지 재조합 단백질 G이 E. coli BL21 내에서 합성되고, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의하여 모노머, 다이머 및 트리머 단백질 G의 크기가 각각 16 kDa, 32 kDa and 46 kDa인 것이 확인되었다(도 4(b)). 모노머 단백질 G를 유연한 (GGGG)3 링커와 함께 반복적으로 링크함으로써 다합체 단백질 G를 구성하였다(도 4(a)). 본 발명에서 사용한 poly-gly-ser 링커는 재조합 단백질 내 불연속적인 도메인들을 분리하였으며, 이로써 항원 결합 부위의 수가 증가하였다. 같은 식으로 금 전극칩에 부착할 때, 단백질 G를 배향시키기 위하여 사용되는 단백질 G의 N-말단에 단일의 시스테인 잔기를 도입하였다.

다합체 단백질 G를 이용한 전기화학 면역 센서의 제조

다합체 단백질 G가 커플링 된 금 전극칩에 항-E.coli IgG를 금 전극칩 상에 고정화하였다. 단백질 G는 두개의 항체 결합 부위가 있기 때문에 모노머 단백질 G의 경우 최대 2개의 항체와 결합할 수 있고, 다이머 단백질 G의 경우 최대 4개의 항체와 결합할 수 있으며, 트리머 단백질 G의 경우 최대 6개의 항체와 결합할 수 있다. 하지만 단백질 G의 분자량과 항체의 분자량을 고려했을 때 모노머의 단백질 G에 2개의 항체가 고정화 되는 것은 구조학적으로 불가능하다. 하지만 다합체 단백질 G로 갈수록 항체 고정화 자리가 증가하여 더 많은 항체가 고정화 될 수 있으며 또한 구조적으로 보다 3차원적인 구조를 갖게 되어 항체나 후에 검체가 접근할 수 있는 물질 전달 제한성 (Mass transfer limitation)이 낮아지기 때문에 도 5와 같이 더 많은 항체의 결합과 검체 검출이 가능하다

다합체 단백질 G 기반의 전기화학 면역 센서를 이용한 증강된 E. coli 검출

샌드위치 검사는 검출 분석에 있어 일반적으로 사용되는 방법이다. 항-E.coli IgG 고정화된 금 전극칩의 민감도를 조사하기 위하여, 샌드위치 검사를 수행하였다. 다양한 농도의 E.coli 용액을 금 전극칩과 반응시키고, 세척한 후 HRP 표지된 염소 항-E.coli IgG이 이 복합체에 결합하였다. 본 반응은 고정화 된 항체에 검체인 대장균 (E.coli)가 붙게 되고 여기에 HRP가 표지된 염소 유래 항-E.coli IgG가 붙어서 HRP가 기질을 분해하면서 전자를 제거하여 검체의 농도가 증가할수록 전류값이 상쇄되어, 전류값 변화량이 증가하는 원리를 이용한다.

단백질 G 다합체의 종류 및 E. coli 농도를 변화시켜 가면서, 샌드위치 검사를 수행한 결과, 트리머 단백질 G를 사용하여 제작한 전기화학 바이오센서의 경우 102개/ml의 농도에서도 데이터 값의 변화가 보였지만, 다이머 단백질 G와 모노머 단백질 G를 사용하여 제작된 전기화학 바이오센서의 경우 이 농도에서는 전류값의 변화가 보이지 않았다. 이는 동일 농도의 대장균을 이용하더라도 트리머 단백질 G를 사용하여 제작된 전기화학 바이오센서가 다이머 또는 모노머 단백질 G를 이용한 바이오센서보다 많은 양의 대장균 검체와 결합하고 후속적으로 HRP가 표지된 염소 항-E.coli와 결합하여 효소 반응 효율이 증가하였기 때문으로, 트리머 단백질 G를 이용 시, 전기화학 면역 센서의 민감도(면역 센서가 검출할 수 있는 검체의 최소 농도)가 우수하다는 것을 의미한다(도 6).

더군다나 전류값 변화의 기울기가 트리머 단백질 G를 사용하는 경우가 현저히 컸는바, 트리머 단백질 G가 더 효과적으로 검체를 잡는 것을 알 수 있었다.

반복 사용 확인

0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 처리를 통해 단백질 G와 항체간의 결합을탈착시킬 수 있다. 이때 단백질 G의 항체 부착 부위는 손상되지 않기 때문에 이후에 pH만 조절해주면 다시 항체를 결합할 수 있다. 기존 면역센서는 항체가 검체를 잡게 되면 항체와 검체를 분리할 수 없기 때문에 한번 사용한 면역센서는 다시 사용할 수 없게 되는데 특히 금 전극칩의 경우 고가인데 한번 사용하고 버려야하는 경제적인 문제가 있었다. 하지만 본 발명을 사용하면 검체와 결합한 항체를 탈착시키고 다른 종류의 항체도 결합시킬 수 있기 때문에 경제적이다.

처음 만들어진 전기화학 바이오센서를 가지고 105개/ml 농도의 대장균을 검출한 후 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 처리 후 다시 동일한 마우스 유래 항-E.coli IgG 항체를 결합시켜서 대장균을 검출하여 신호를 측정하는 것을 5번 반복적하였다.

그 결과, 여전히 트리머 단백질 G에서 가장 높은 전류값 변화가 나오고 있으며 반복횟수에 따라서 약간의 전류값 차이는 나지만 큰 변화가 나타나지 않고 안정되고 신뢰성있는 검출 신호가 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 7) 그러므로 본 발명의 면역센서는 반복 사용이 가능한 것으로 확인되었다.

Claims

전극칩에 커플링된 단백질 G 다합체;및
상기 단백질 G 다합체에 결합된 제 1 항체를 포함하는 반복 사용이 가능한 면역 센서.
제 1항에 있어서,
상기 단백질 G 다합체는 단백질 G 트리머인 것을 특징으로 하는 면역 센서.
제 1항에 있어서,
항체-항원 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역 센서.
단백질 G 다합체에 제 1 항체를 결합시키는 단계;
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;
상기 시험 물질 내 항원과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계;
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체-상기 항원의 복합체에 항체 제거제를 가하는 단계;및
상기 단백질 G 다합체에 제 2 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 반복 사용이 가능한, 시험 물질 내 항원의 검출 방법.
제 4항에 있어서,
상기 단백질 G 다합체는 전극칩에 부착되어 있으며,
상기 항체 제거제는 상기 제 1 항체를 상기 단백질 G 다합체로부터 분리하나,
상기 단백질 G 다합체와 전극칩 간의 부착을 파괴하지는 않는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 4항에 있어서,
상기 항체 제거제는 글라이신-산인 것을 특징으로 하는 검출 방법.