KR101789141B1

KR101789141B1 - 에틸렌 검출용 바이오센서 및 그 용도

Info

Publication number: KR101789141B1
Application number: KR1020140061153A
Authority: KR
Inventors: 김문일; 신용범; 이의진; 박경숙; 이소연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2017-10-23
Also published as: KR20150134157A

Abstract

본 발명은 에틸렌 검출용 바이오센서(Biosensor for Detecting Ethylene) 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중합체 형성 부위(Oligomerization domain)가 융합된 에틸렌 리셉터의 에틸렌 결합 부위(Ethylene Binding Domain: EtBD)를 시스테인 태그(cysteine-tag)로 FET(Field-Effect Transistor)에 탑재하여 제조된 에틸렌 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 에틸렌 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 에틸렌 검출용 바이오센서를 이용할 경우 에틸렌을 효율적으로 검출할 수 있어 과일ㆍ화훼ㆍ채소류를 포함하는 농산물(plant products)의 에틸렌을 모니터링하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

에틸렌 검출용 바이오센서 및 그 용도{Biosensor for Detecting Ethylene and Use Thereof}

본 발명은 에틸렌 검출용 바이오센서(Biosensor for Detecting Ethylene) 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중합체 형성 부위(Oligomerization domain)가 융합된 에틸렌 리셉터의 에틸렌 결합 부위(Ethylene Binding Domain: EtBD)를 시스테인 태그(cysteine-tag)로 FET(Field-Effect Transistor)에 탑재하여 제조된 에틸렌 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 에틸렌 검출방법에 관한 것이다.

에틸렌은 천연 식물 호르몬으로 "숙성 또는 노화" 호르몬으로도 잘 알려졌다. 기체성 호르몬인 에틸렌은 화훼, 과일, 채소와 같은 대부분의 식물 제품에서 생성되고 대기 중으로 방출된다. 또한, 에틸렌 생산은 제품 자체로부터 유래한 에틸렌에 의해서도 자극된다. 에틸렌(H₂C = CH₂)은 과일의 숙성(ripening)과 노화(aging)에 중요한 역할을 하는 유일한 가스 식물 호르몬으로 알려져 있다.

산업의 관점에서 보면, 에틸렌은 생산 제품에 유익하면서도 유해하다. 즉, 외부에서 첨가된 에틸렌 가스는 아보카도, 토마토, 바나나 등의 과일 숙성에 사용되지만, 노화 과정을 가속하고 제품의 품질 및 수명을 단축시킨다. 에틸렌에 의한 조기 노화(premature aging)는 식물 제품을 폐기하는 주된 요인이며 에틸렌 피해와 관련된 손실이 매년 약 수십억 달러에 이르는 것으로 추정된다. 따라서 에틸렌이 식물 제품 손상(spoilage)의 주요 기여자임을 고려할 때, 에틸렌의 특이적이면서도 정교한 모니터링을 통한 에틸렌 제어는 경제적으로 중요한 과일, 화훼 및 채소 제품의 품질을 유지하고 보관 기간을 늘려 상품 손실(product loss)을 줄이고 이익을 증가시키는 데 도움이 된다.

농업 산업에서 에틸렌의 모니터링이 중요한 사항임에도 불구하고 식물 제품에서 발생하는 에틸렌을 선택적이고 정교하게 감지하는 바이오센서의 개발은 걸음마 단계여서, 연구의 결실이 산업 현장으로 이어지지 못하고 있다. 본 발명을 산업 현장에 적용하면 식물 관련 제품의 손실을 줄이고 이익을 증가시킬 수 있다.

이와 같은 이유로 본 발명에서는 에틸렌 검출용 전계효과트랜지스터(Field-Effect Transistor: FET) 바이오센서를 처음으로 개발하게 되었으며, 생물학적 리셉터를 포획제(capture agent)로 사용하여 에틸렌을 검출할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 간단한 방법으로 생물학적 인식을 기반으로 하는 기체 리간드(에틸렌)-리셉터 간의 결합 검출방식으로 전기장을 활용한 에틸렌을 검출하는 바이오센서를 제조하고자 예의 노력한 결과, 에틸렌 검출용 바이오센서를 사용할 경우, 선택적이면서도 정교하게 에틸렌 검출이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 에틸렌 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 에틸렌의 검출방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널(Channel); 상기 채널의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(Source)과 드레인 전극(Drain); 및 상기 채널의 상부 표면에 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터가 고정되어 있는 게이트 전극을 구비하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 에틸렌 검출용 바이오센서를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 에틸렌 검출용 바이오센서의 게이트 전극에 에틸렌이 함유된 시료를 주입시킨 다음, 반응시키는 단계, 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계 및 상기 측정된 전류 값을 이용하여 에틸렌의 유무를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에틸렌의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 에틸렌 검출용 바이오센서를 이용할 경우 에틸렌을 효율적으로 검출할 수 있어 과일ㆍ화훼ㆍ채소류를 포함하는 농산물(plant products)의 에틸렌을 모니터링하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 FET 게이트 표면에 시스테인 태그된 올리고메릭 EtBD(Cys-tagged oligomeric EtBD)의 고정된 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 FET의 n-형 인버젼 레이어(inversion layer) 및 FET 바이오센서를 나타낸 것이다.
도 3은 시스테인 태그된 올리고메릭 EtBD(Cys-tagged oligomeric EtBD)을 나타내는 것으로 N-말단으로부터 6xHis, oligomerization domain, EtBD 및 Cys 순서로 구성되어 있다.
도 4는 ETR1 유전자를 나타낸 것으로 A는 pET21b 벡터에 삽입된 ETR1의 플라스미드 지도를 나타낸 것이고 B는 ETR1(1-165 아미노산)의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 MOSFET(Metal Oxide Semiconductor Field-Effect Transistor)의 외관 사진(A) 및 핀 지도(pin map)(B)를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널(Channel); 상기 채널의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(Source)과 드레인 전극(Drain); 및 상기 채널의 상부 표면에 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터가 고정되어 있는 게이트 전극을 구비하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 에틸렌 검출용 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 에틸렌 검출용 바이오센서는 n형 전계효과트랜지스터(Field-Effect Transistor: FET)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 기판은 단일층상의 규소와 이산화규소를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 게이트 전극은 금 박막 전극인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 게이트 전극은 APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 처리하여 활성화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리셉터는 에틸렌 결합 부위(Ethylene Binding Domain: EtBD)과 중합체 형성 부위(oligomerization domain)를 함유하는 융합 단백질인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 에틸렌 결합 부위는 ETR1(Ethylene receptor 1) 유래의 서열번호 2(서열목록 참조)로 표시되는 1-165 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 중합체 형성 부위는 GCN4-류신 지퍼(leucine zipper) 도메인 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중합체 형성 부위는 DI(Dimerization domain), TRI(Trimerization domain) 및 TETRA(Tetramerization domain)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 티올(thiol) 작용기 또는 태그를 추가로 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 태그는 친화 크로마토그래피 컬럼에서의 융합 단백질의 용이한 정제를 위해서 바이오틴, 글루타티온-S 트랜스 퍼라제(GST), 6xHis 및 비드(예컨대, 카르복실화 폴리스티렌 비드 또는 상자성 비드)로 구성되는 군에서 선택하여 사용할 수 있으며 바람직하게는 6xHis를 사용할 수 있다.

애기장대(Arabidoposis)의 에틸렌 리셉터 패밀리는 5개 그룹으로 분류할 수 있으며 이 중 하나가 ETR1(EThylene Receptor 1)이다. ETR1은 세 가지 도메인인 에틸렌 결합, 히스티딘 키니아제(histidine kinase) 및 리시버(receiver)로 구성되어 있다. EtBD(Ethylene binding domain)은 리셉터의 센서 도메인이라고 알려져 있으며, 선행 유전학 연구에 의하면 에틸렌 결합 부위에 특정 돌연변이를 유발하면 도미넌트 에틸렌 무감각(dominant ethylene insensitivity)을 나타내는 것으로 확인되었다(Bleecker, Ethylene perception and signaling; an evolutionary perspective, Trens. Plant Sci., 4:269-273, 1999; Hall et al., The relationship between ethylene binding and dominant insensitivity conferred by mutant forms of the ETR1 ethylene receptor, Plant Physiol., 12:291-300, 1999).

본 발명에서는 애기장대(Arabidopsis) ETR1(EThylene Receptor 1)의 에틸렌 결합 부위(Ethylene binding domain(EtBD); 아미노산 1-165)을 에틸렌 포획제(ethylene capture agent)로 선택하였다. 최근 연구에 의하면 생체 외(in vitro)에서 에틸렌 리셉터 간의 물리적 상호 작용이 일어날 수 있어 리셉터들의 중합체 형성(oligomerization) 상태가 에틸렌의 결합 친화력을 조절하는 데 중요하다고 보고된 바 있다(Hua J. et al., Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis, Cell, 94:261-271, 1998; Mueller-Dieckmann H-J. et al., The structure of the signal receiver domain of the Arabidopsis ethylene receptor ETR1, Structure, 7:1547-1556), 1999).

또한, 애기장대에서 ETR1과 다른 에틸렌 리셉터 간의 상호작용이 가능하다는 것이 보고된 바 있어 에틸렌 리셉터가 다중결합 형태(multimeric form)로 식물에 존재할 수 있음을 시사하였다(Grefen et al., Subcellular Localization and In Vivo Interactions of the Arabidopsis thaliana Ethylene Receptor Family Members, Mol. Plant, 1:308-320, 2008; Gao et al ., Heteromeric Interactions among Ethylene Receptors Mediate Signaling in Arabidopsis, J. Biol. Chem., 283:23801-23810, 2008). 이와 관련해서 본 발명은 에틸렌 결합 도메인의 올리고메릭 상태에 따라 동족 리셉터(cognate receptor)의 에틸렌 결합 친화력이 조절될 수 있을 것으로 보았다.

본 발명에서 에틸렌 검출용 바이오센서는 과일, 화훼, 채소 등의 세포 내 소포체(Endoplasmic Reticulum: ER)에 존재하는 생체 리셉터(ETR1 융합 단백질 또는 Cys:EtBD 융합 단백질)를 포획제로 사용하여 에틸렌을 측정하도록 설계되었다. 즉, 식물세포의 소포체 막에서 발생하는 에틸렌 감지 이벤트를 모방하여 설계된 독특한 시스템이다. 에틸렌 생물학을 바탕으로 한 본 발명에서는 에틸렌이 식물 제품의 숙성, 노화 및 손상을 유발할 수 있다는 전제하에서 출발했으며 에틸렌이 특이적으로 에틸렌 리셉터 ETR1의 EtBD에 결합하는 내용을 골자로 하고 있다.

본 발명에서는 에틸렌 결합 부위인 EtBD의 올리고메릭 상태(oligomeric state)가 에틸렌의 결합 기능에 영향을 미칠 수 있으며, ETR1 이량체(dimer)의 에틸렌 결합 도메인들 사이에서 에틸렌 결합이 되므로 EtBD의 중합체 형성(oligomerization) 도메인 DNA 염기서열을 가지는 컨스트럭트(construct)를 유전자 조작하여 ETR1 융합 단백질(ETR1 fusion protein)로 발현하고 정제하였다. 상기 에틸렌 결합 부위는 티올(thiol) 작용기를 통해서 상기 금 박막 게이트 전극에 고정시키는 것을 특징으로 한다. 상기 ETR1 융합 단백질의 시스테인으로 태그된 올리고메릭 EtBD(cysteine-tagged oligomeric EtBD)는 부착된 시스테인(cysteines) 태그의 티올 작용기(thiol: -SH)와 FET의 금(Gold) 간의 특이적 상호작용으로 FET 게이트 센싱 레이어(FET gate sensing layer) 표면에 EtBD를 방향을 제어하는 가운데 고정(orientation-controlled immobilization)시켜서 EtBD-개조된 FET 에틸렌 검출용 바이오센서(EtBD-modified FET ethylene biosensor)를 제조하였다(도 1).

시스테인 태그된 올리고메릭 EtBD(Cys tagged EtBD: EtBD:Cys) 단백질의 어셈블리는 중합체 형성 부위(oligomerization domain)를 통해 중재 되며, 결합을 증진시키고, 구조적으로 안정(conformational stability)시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질 중합체 형성 기능을 활용하기 위해서 유전자 조작으로 표적 단백질에 중합체 형성 도메인을 융합시킬 수 있다(Park, K. et al., Combination of cysteine- and oligomerization domain-mediated protein immobilization on a surface plasmon resonance(SPR) gold chip surface. Analyst, 136:2506-2511, 2011). 특성이 가장 잘 알려진 중합체 도메인 중 하나는 GCN4의 류신 지퍼(leucine zipper)로 효모의 전사 활성제(transcriptional activator)로 작용하며, 33개의 아미노산으로 구성되어 있고 병렬적으로 이량체성 코일-코일(dimeric coiled-coils) 구조를 형성한다(E. K. O'Shea et al., Science, 254:539-544, 1991; E. K. O'Shea et al., R. Rutkowski and P. S. Kim, Science, 243:538-542, 1989). 이량체 GCN4 류신 지퍼의 변종들은 a 및 d의 위치에 돌연변이를 일으켜서 다양한 다중결합된 형태를 가질 수 있다.

본 발명에서는 EtBD의 중합체 형성을 촉진하기 위해서 GCN4 류신 지퍼 도메인에서 유래한 이량체, 삼량체 또는 사양체 컨스트럭트(construct)를 EtBD와 융합시켜 멀티메릭 EtBD의 어셈블리(assembly)를 가능케 하였다. 또한, 음성 대조군으로 에틸렌에 결합 못 하는 돌연변이인 EtBD 컨스트럭트(Cys-65-Tyr)도 제조하였다.

본 발명에 있어서, 에틸렌 결합 부위는 온도 또는 삼투압 조절 하에서 용해된 상태로 합성시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 막에 결합되어 있는 단백질 또는 소수성 모이티(hydrophobic moiety)는 불용성 단백질인 인쿨루션 바디(inclusion body)를 형성하기 때문에 정제하기 어렵다. 선행연구에 의하면 온도를 낮추거나 삼투압을 조절해서 스트레스를 가하면 mRNA로부터 단백질로 번역(translation)되는 과정을 지연(slow down)시켜 표적 단백질 및 단백질-폴딩 효소로 하여금 제대로 된 리폴딩(refolding)이 진행되도록 더 많은 기회를 제공할 수 있다(Ghosh et al, Method for enhancing solubility of the expressed recombinant proteins in Escherichia coli, BioTechniques, 37:418-423, 2004; Jeong et al, Stress-Governed Expression and Purification of Human Type II Hexokinase in Escherichia coli, J. Microbiol. Biotechnol., 17:638-643, 2007).

본 발명에서 사용된 "인-프레임 융합(in-frame fusion)"은 둘 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 연합시켜 본래의 ORF의 정확한 판독 프레임을 유지하는 방식으로 연속적인 보다 긴 ORF를 형성함을 지칭한다. 따라서, 생성된 재조합 융합 단백질은 본래의 ORF에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상응하는 둘 이상의 분절을 함유하는 단일 단백질이다. 또한, "재조합", "접합된", "연결된" 및 "융합된" 또는 "융합"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 2개 이상의 화학 요소 또는 성분을 화학적 접합 또는 재조합 수단을 비롯한 어떠한 수단에 의해 함께 연합시킴을 지칭한다.

본 발명에서는 에틸렌 분자를 포획하는 EtBD를 FET 게이트 표면에 방향을 제어하는 가운데 고정화하기 위해서 시스테인과 접합된 EtBD를 활용하였다. 기존의 많은 연구가 단백질의 고정화(protein immobilization) 분야에서 행해지고 있는 이유는 정교한 바이오센서를 개발하기 위해서다. 특히, 단백질의 방향을 제어하여 고정시키는 방법과 관련된 연구가 그렇다(F. Rusmini et al., Biomacromolecules, 8:1775-1789, 2007; Y. Jung et al ., Analyst, 133:697-701, 2008; Park, K. et al ., Combination of cysteine- and oligomerization domain-mediated protein immobilization on a surface plasmon resonance (SPR) gold chip surface. Analyst 136:2506-2511, 2011). 본 발명에서는 자가-방향 고정(self-oriented immobilization)과 관련된 기술 중에서 금 칩(gold chip)의 금과 단백질에 포함된 시스테인의 티올 작용기(-SH)간의 Au-S 결합을 기반으로 하는 고정화하는 과정(J. M. Lee et al., Anal Chem, 79:2680-2687, 2007; H. A. Weng et al., J Mater Sci Mater Med., 21:1511-1519, 2010)을 사용하여 시스테인이 접합된 EtBD를 FET에 고정하였다.

최근 몇 년 동안, FET 형 바이오센서는 소형화(miniaturizability), 빠른 반응 시간(response time), 높은 신호 대 잡음 비율 등의 많은 장점으로 인해 지대한 관심을 받고 있고 응용장치에 관한 광범위한 연구가 진행되고 있다(Schoning, M.J. and Poghossian, A. Recent advances in biologically sensitive field-effect transistors (BioFETs), Analyst, 127:1137-1151, 2002; Yuqing, M. et al., Ion sensitive field effect transducer-based biosensors, Biotechnol. Adv., 21:527-534, 2003; Lee, C-S. et al ., Ion-sensitive field-effect transistor for biological sensing, Sensors, 9:7111-7131, 2009). 선행 연구에서 본 발명자들은 리간드(ligand)로 유도된 단백질의 구조적 변화를 모니터링 할 수 있는 FET 바이오센서의 새로운 응용방법을 보여주었다. 이 연구에 의하면 FET 바이오센서 상에서 맥아당이 MBP(Maltose binding protein)에 결합했을 때 구조(conformation)가 변하는 것을 확인할 수 있었다(Park, H.-J. et al., An ISFET biosensor for the monitoring of maltose-induced conformational changes in MBP., FEBS Letters, 583:157-162, 2009). 생체 인식 요소(bio recognition element)로서 리셉터 단백질은 리간드에 대한 결합 특이성으로 인해 우수한 포획제여서 표적 분석물(analytes)을 분석하는데 용이하다.

생물학적 메커니즘에 기반을 둔 리간드 결합에 따른 리셉터의 구조(conformation) 변화는 특정 리간드를 탐지하기 위한 훌륭한 예를 제공할 수 있다. 리셉터 내에서의 리간드의 구조 상태는 표면 전하를 결정하므로 전계효과트랜지스터(FET) 기반 바이오센서를 이용하여 모니터링할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 에틸렌 검출용 바이오센서의 게이트 전극에 에틸렌이 함유된 시료를 주입시킨 다음, 반응시키는 단계, (b) 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계 및 (c) 상기 측정된 전류 값을 이용하여 에틸렌의 유무를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에틸렌의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 게이트 전극에 인가되는 전압은 0.01V 내지 0.6V인 것을 특징으로 할 수 있다.

전계효과트랜지스터(Field-Effect Transistor, FET) 바이오센서는 소스(source), 게이트(gate) 및 드레인(drain)으로 구성되어 있으며, 전기장 효과에 의해 소스 및 드레인 사이의 채널을 흐르는 전류가 변하는 반도체 특성을 이용한 바이오센서이다. 일반적으로 바이오센서로 쓰이는 전계효과트랜지스터는 n형 또는 p형 반도체 기판 양측부에 소스 전극 및 드레인 전극이 있으며, 소스 및 드레인 전극과 접촉하는 게이트가 형성되어 있다. 게이트는 절연층, 전극층 및 프로브(probe) 생체분자를 붙이기 위한 금속 물질층으로 구성된다. 게이트 전극 표면에서 프로브가 동종 표적물과 반응하면 게이트 주변 전기장에 변화가 일어나며, 게이트 주변 전기장의 변화에 영향을 받아 소스 전극과 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값이 함께 변하고, 이러한 전류의 변화를 측정하여 시료 내의 표적물을 검출할 수 있다.

FET를 운영(operate)하려면 n-형(또는 p-형) 인버젼 레이어는 소스와 드레인 사이의 채널에서 충분한 양(또는 음) 전압을 게이트에 가하여 유도되어야 한다. FET 바이오센서의 경우 전류의 규모는 게이트 유전체(gate dielectric)에서 상호작용하는 고분자로 결정된다. FET의 매력은 별도의 표지(label)없이 생체 분자가 상호작용하는 것을 전도도(conductance) 또는 관련된 전기적 성질을 통해서 검출할 수 있다는 점이다(도 2).

전계효과트랜지스터에는 정공을 운반체(케리어)로 이용하며 게이트 전압이 0V일 때, 채널에 전류가 흐르는 p형 전계효과트랜지스터와 전자를 운반체로 이용하며 게이트 전압이 0.01V 내지 6V일 때, 채널에 전류가 흐르는 n형 전계효과트랜지스터가 있고, 전계효과트랜지스터로 p형과 n형이 모두 이용될 수 있다.

본 발명에서는 에틸렌 유도하에 리셉터 단백질의 구조적 재배열을 모니터링할 수 있는 FET 형 에틸렌 검출용 바이오센서를 개발하였다. 에틸렌 검출용 바이오센서에 에틸렌이 결합하면 EtBD의 2개의 서브유닛(subunit)이 가까워져 두 도메인의 구조적 커플링(conformational coupling)을 가져온다. 이론에 의하면, n형 FET 바이오센서에서 드레인 전류(drain current)는 게이트의 음전하로 인해 감소하며, 대응되는 전하는 FET 장치의 게이트 전압을 결정한다. 일반적으로, FET형 바이오센서의 드레인 전류는 다음과 같이 정의할 수 있다.

(포화 부위) (1)

(1-1)

(1-2)

상기 μ_n는 전자 이동성(electron mobility), C는 단위 면적당 총 게이트 커패시턴스(capacitance), C_ox는 단위 면적당 게이트 산화물 커패시턴스, C_chem는 단위 면적당 게이트 화학 분자 커패시턴스 및 C_bio는 단위 면적당 게이트 생체 분자 커패시턴스이다. 커패시턴스는 직렬로 연결되어 있다. W는 게이트 폭, L은 게이트 길이, V_TH는 임계값 전압(threshold voltage), ε는 유전체(dielectric) 상수 및 A는 단위 면적이다. FET 바이오센서의 d_bio 및 V_GS와 같은 전도(conductance) 구성 요소들은 센서 표면상에서 검출되는 시료 내 생체분자 (DNA, 단백질 등)의 표면 전하의 농도 및 표면으로부터의 거리 등에 의해 좌우된다. 드레인 전류 변화는 "충전 기여"의 관점에서 설명될 수 있다(상기 수식: (1), (1-1) 및 (1-2)).

FET 형 바이오센서에서의 전기장은 모바일 전하 운반체(mobilie charge carrier)가 외부 전기장을 스크린 아웃(screen out)했을 때의 길이인 "Debye 길이"를 경과하면 소멸된다. 상기 Debye 길이는 생체 분자간의 상호작용을 측정하는 FET 형 바이오센서의 주요 단점 중 하나로 보고된 바 있다(Stern, E. et al., Importance of the Debye screening length on nanowire field effect transistor sensors, Nano Lett., 7:3405-3409, 2007; Lee, C-S. et al ., Ion-sensitive field-effect transistor for biological sensing, Sensors, 9:7111-7131, 2009). 따라서, 생체 분자간의 반응이 Debye 길이 이내에서 발생하도록 하는게 FET 응용에서 본질적으로 필요하다.

이와 같은 관점에서 FET 형 에틸렌 검출용 바이오센서는 에틸렌 등 간단한 기체 호르몬으로 유도된 리셉터의 구조적 변화를 모니터링하는데 적합하다. 왜냐하면 구조적으로 변형된 리셉터 단백질은 표면과 매우 근접하게 분석할 수 있어 FET를 사용하여 전류변화를 정교하게 검출할 수 있기 때문이다.

본 발명의 일 양태에서 ETR1(Ethylene receptor 1)로부터 유래한 에틸렌 결합 부위(EtBD domamin)에 중합체 형성 부위(dimerization domain), 시스테인-태그(cysteine-tag) 및 히스티딘-태그(6xHis)를 유전자 조작으로 재조합하여 정제하였으며 FET(Field-Effect Transistor)의 게이트 감지 레이어(sensing layer) 표면에 고정하여 에틸렌 검출용 FET 바이오센서를 제조하였다.

본 발명의 다른 양태에서, 에틸렌 검출용 FET 바이오센서는 에틴렌에 대한 리셉터의 매우 높은 특이성으로 인해서 FET 게이트 표면의 EtBD 단백질이 에틸렌에 결합되었을 때 EtBD 단백질의 구조적 변화가 표면 전하의 현저한 차이로 인한 드레인 전류(drain current)의 변화를 유도하여 게이트 전압의 변화가 수반되어 나타나는 것으로 확인되어 복잡한 혼합물(공기) 중 특정 리간드(에틸렌)를 검출할 수 있었으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에서, EtBD 단백질의 불용성을 극복하기 위해서 낮은 온도 또는 삼투압을 조절해서 스트레스-유도식 발현 전략을 적용하여 인쿨루션 바디(inclusion body)를 생체 외(in vitro) 변성(denaturation) 및 원형 재현(renaturation) 프로세스를 통해 가용성 EtBD 단백질을 합성할 수 있었다.

본 발명의 전계효과트랜지스터 형의 바이오센서를 이용하면 생체분자에 별도의 표지물질을 달지 않고도 전기적으로 특이적인 에틸렌-리셉터 상호작용을 전계효과트랜지스터 바이오센서로 모니터링 할 수 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예1: 시스테인 태그된 올리고메릭 EtBD(Cys tagged EtBD: EtBD:Cys)의 제조

하기 실시예 1∼3에서 사용된 PCR 증폭용 DNA 중합효소는 Bioprogen(대한민국), 제한효소는 NEB(미국), pET21a 벡터 및 BL21 대장균은 Novagen(독일), 핵산 정제키트는 Bioneer(대한민국)에서 구매하였으며 그 외 시약은 Sigma Aldrich(미국)에서 구매하였다.

시스테인을 가지는 단량체(monomer), 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 및 사양체(tetramer)의 EtBDs를 제조하기 위하여 c-말단에 시스테인을 가지는 애기장대(Arabidoposis)의 EtBD(Ethylene binding domain; 아미노산 1-165) cDNA를 5' 프라이머 (GGA ATT CAT GGA AGT CTG CAA TTG T) 및 3' 프라이머 (CCC AAG CTT AGT CTT TAA AAT AGT ATG)를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)으로 증폭시켰다. 5'과 3' 말단은 각각 EcoRI 및 HindIII 제한효소의 분할서열(cleavage site)을 포함하도록 설계되었다. PCR 산물인 Cys:EtBD는 DNA 정제키트를 사용하여 정제하였고 EcoRI 및 HindIII로 처리한 후 수득하였다.

표 1은 중합체 형성 부위(oligomerization domain)인 DI(Dimerization domain), TRI(Trimerization domain) 또는 TETRA(Tetramerization domain)을 가지는 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 중합체 형성부위는 화학적 방법으로 제조하였으며 BamHI 및 EcoRI 분할서열을 5'과 3' 말단에 포함시켰다. 상기 중합체 형성 부위를 BamHI 및 EcoRI 제한효소로 처리한 후 수득하였다.

EtBD:Cys를 DI, TRI 또는 TETRA와 라이게이션(ligation)시킨 결과 DI:EtBD:Cys, TRI:EtBD:Cys 및 TETRA:EtBD:Cys를 수득할 수 있었고 이를 pET21a 벡터의 BamHI 및 HindIII 부위에 삽입하여 인-프레임 융합(in-frame fusion)으로 pDI:EtBD:Cys, pTRI:EtBD:Cys 및 pTETRA:EtBD:Cys를 수득할 수 있었다. 단량체 EtBD:Cys(pEtBD:Cys)로 구성된 컨스트럭트(construct)를 얻기 위해서는 pET21a 벡터의 EcoRI 및 HindIII 부위에 EtBD:Cys를 삽입하였다(도 4).

대조군으로 사용되는 DI:mEtBD:Cys 컨스트럭트(Cys-65-Tyr)를 제조하기 위해서 사이트-디렉티드 돌연변이화(site-directed mutagenesis)한 다음 pET21a 벡터의 EcoRI 및 HindIII 부위에 DI:mEtBD:Cys를 삽입하였다.

상기 모든 컨스트럭트의 융합 유전자 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

GCN4 유래 중합체 형성 부위(oligomerization domain)의 DNA/아미노산 서열

도메인(Domain)	DNA 염기서열 및 아미노산 서열(가로)
이량체화 (Dimerization)	AGA(R) ATG(M) AAA(K) CAA(Q) CTT(L) GAA(E) GAC(D) AAG(K) GTT(V) GAA(E) GAA(E) TTG(L) CTT(L) TCG(S) AAA(K) AAT(N) TAT(Y) CAC(H) TTG(L) GAA(E) AAT(N) GAG(E) GTT(V) GCC(A) AGA(R) TTA(L) AAG(K) AAA(K) TTA(L) GTT(V) GGC(G) GAA(E) CGC(R)
삼량체화 (Trimerization)	AGA(R) ATG(M) AAA(K) CAA(Q) ATT(I) GAA(E) GAC(D) AAG(K) ATT(I) GAA(E) GAA(E) ATC(I) CTT(L) TCG(S) AAA(K) ATT(I) TAT(Y) CAC(H) ATC(I) GAA(E) AAT(N) GAG(E) ATT(I) GCC(A) AGA(R) ATT(I) AAG(K) AAA(K) TTA(L) ATT(I) GGC(G) GAA(E) CGC(R)
사양체화 (Tetramerization)	AGA(R) ATG(M) AAA(K) CAA(Q) ATT(I) GAA(E) GAC(D) AAG(K) CTA(L) GAA(E) GAA(E) ATC(I) CTT(L) TCG(S) AAA(K) TTA(I) TAT(Y) CAC(H) ATC(I) GAA(E) AAT(N) GAG(E) CTT(L) GCC(A) AGA(R) ATT(I) AAG(K) AAA(K) TTA(L) CTT(L) GGC(G) GAA(E) CGC(R)

실시예2: 인쿨루션 바디(inclusion body)를 형성하는 EtBD의 용해도를 개선시키는 제조방법

pEtBD:Cys, pDI:EtBD:Cys, pTRI:EtBD:Cys, pTETRA:EtBD:Cys 또는 pDI:mEtBD:Cys 플라스미드(plasmid)를 BL21(Escherichia coli., BL21(DE3))에 형질전환시킨 후 37℃에서 OD₆₀₀이 0.6이 될 때까지 쉐이킹(shaking) 배양한 상태에서 1mM IPTG(Isopropyl-2-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 4시간 추가 배양하였다. 상기 배양된 BL21은 10 분간 4 ℃에서 6,000 g로 원심분리한 후 수득하였다.

낮은 온도(18℃) 또는 삼투성 스트레스(1M 소비톨(sorbitol))하에서 발현된 pEtBD:Cys, pDI:EtBD:Cys, pTRI:EtBD:Cys, pTETRA:EtBD:Cys 또는 pDI:mEtBD:Cys 플라스미드를 함유하는 BL21 유래의 융합 단백질의 용해도를 비교하기 위해서 상기 배양된 BL21을 OD₆₀₀이 0.6이 되도록 맞춘 다음 50 mM Tris HCl 완충용액(pH 8.0)에 현탁시켜 초음파 처리로 분쇄하였다. 분쇄된 BL21의 추출액(crude lysate)은 가용성 또는 불용성 층(fraction)으로 나눈 다음 10% SDS-PAGE 상에서 상기 각 층(fraction)에 대해서 단백질 전기영동을 수행하였다. 용해도의 계산방식은 "가용성 단백질/총 발현된 단백질)x 100%"으로 하였다.

헥사히스티딘(hexahistidine: 6xHis)으로 태그된 EtBD:Cys, DI:EtBD:Cys, TRI:EtBD:Cys, TETRA:EtBD:Cys 및 DI:mEtBD:Cys 단백질을 정제하기 위해서 1L의 추출액을 IDA-miniexcellose affinity 칼럼에 첨가하고 10mL 이쿨루블레이션 완충용액(quilibration buffer: 50 mM phosphate, 0.5 N NaCl, pH 8.0)으로 3회 세척하였다. 재조합 단백질은 0.5 M 이미다졸(imidazole)이 첨가된 이쿨루블레이션 완충용액으로 용출(elution)하였다. 수득한 올리고메릭 Cys:EtBD는 항 EtBD 단클론항체를 이용하여 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다(도 3).

EtBD 단백질의 불용성을 극복하기 위해서 낮은 온도 또는 삼투압을 조절해서 스트레스-유도식 발현 전략을 적용하여 인쿨루션 바디를 생체 외(in vitro) 변성(denaturation) 및 원형 재현(renaturation) 프로세스를 통해 가용성 EtBD 단백질의 합성을 가능케 하였다. 특히, EtBD:Cys의 다양한 종류의 중합체를 측정할 때에는 나이브 겔(naive gel)을 사용하는 등 비변성 단백질 처리 조건(non-denaturing condition)에서 분석하여 중합체 상태가 유지되도록 하였다.

실시예3: EtBD-FET 센서를 이용한 에틸렌 모니터링 방법

3-1: MOSFET(Metal Oxide Semiconductor Field-Effect Transistor) 제작

MOSFET 바이오센서는 CMOS (Complementary metal oxide semiconductor, 보완 금속 산화물 반도체) 기술을 이용하여 제작하였고, Au 필름은 티올(-SH) 조작을 위한 게이트 전극으로 사용되었다. 상기 반도체 장치는 n형(100) 실리콘-온-절연체 (Silicon-on-insulator: SOI) 웨이퍼(wafer: 15~20ohm-cm)를 초기 재료, 150nm 두께의 실리콘 상층 및 400nm 두께의 산화물(박스) 층으로 구성되어있었다. SOI 웨이퍼는 캐리어 층(carrier layer)을 포함하여 절연 중간층을 함유하고 있고 절연 중간층은 활성 반도체 층을 함유하였다.

활성부위는 표준 사진석판술(photolithography)을 통해서 형성되었으며 플라즈마 에칭(plasma etching)에 의해 희생층(sacrificial layer)을 패턴화(pattern)하였다. n+ 소스/드레인 레이어(source/drain layer)는 인 이온(phosphorous ion) 주입을 통해 형성되었고 게이트 산화물(gate oxide)은 고온 건조 산화를 통해 두께 45nm에 이르도록 성장된 필드 산화물(field oxide)로 수득할 수 있었다. 마지막 과정에서는 금의 금속층(450 Å) 및 니켈 크롬 합금(50 Å)은 습식 에칭(wet etching) 프로세스를 사용하여 패턴화되었다(표 2).

3-2: MOSFET 측정

올리고메릭 EtBD:Cys를 고정화되기 전에 MOSFET의 I_D-V_D 특성을 검사하였다. 우선, MOSFET의 게이트 전극을 세척하기 위해서 아세톤, 메탄올 및 증류수에서 5분간 초음파 처리를 하였다. 세척 후에는 게이트 전극의 표면을 120초간 120W에서 O₂ 플라즈마 처리를 하였다. 0.1xPBS에 현탁된 100nM의 EtBD:Cys, DI:EtBD:Cys, TRI:EtBD:Cys, TETRA:EtBD:Cys 및 DI:mEtBD:Cys 시리즈 샘플을 게이트 전극에 2시간 동안 고정하였다. 상기 올리고메릭 Cys:EtBD 시리즈를 고정한 후 리셉터-FET에 에틸렌 가스를 1에서 0.01 ppb까지 처리하였다. 드레인 전류(drain current) 측정은 80% 습도에서 쉴드 상자(shield box)안에서 실시하였다.

ISFET 바이오센서의 제조 프로세스

단계	프로세스
Starting wafer	5 inch n-type(100) Si wafer, 15 ohm-cm
Photolithography	Active masking, positive PR process
Oxide growth	Wet oxidation, 250 Å (1,100℃, 50 min)
Ion implantation	Phosphorous dopping for n+ S/D
Gate oxide growth	Dry oxidation, 450 Å (950℃, 1 hr)
Photolithography	Gate masking, positive PR process
Photolithograhy	Contact masking, positive PR process
Metal deposition	Aluminum metallization (100 nm)
Passivation	PECVD deposition (Silicon nitride)

실험결과, 에틸렌 검출용 바이오센서인 EtBD-FET는 에틴렌에 대한 리셉터의 매우 높은 특이성으로 인해서 복잡한 혼합물(공기)중 특정 리간드(에틸렌)를 검출할 수 있었다. 이러한 결과는 FET 게이트 표면의 EtBD에 에틸렌이 결합 되었을 때 표면 전하의 현저한 차이로 인한 드레인 전류(drain current)의 변화가 유도되어 게이트 전압의 변화가 수반되어 나타나는 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY KIM, MOONIL <120> Biosensor for Detecting Ethylene and Use Thereof <130> P14-B107 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 495 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana (thale cress)_ETR1 partial cDNA(for 1-165 amino acids) <400> 1 atggaagtct gcaattgtat tgaaccgcaa tggccagcgg atgaattgtt aatgaaatac 60 caatacatct ccgatttctt cattgcgatt gcgtattttt cgattcctct tgagttgatt 120 tactttgtga agaaatcagc cgtgtttccg tatagatggg tacttgttca gtttggtgct 180 tttatcgttc tttgtggagc aactcatctt attaacttat ggactttcac tacgcattcg 240 agaaccgtgg cgcttgtgat gactaccgcg aaggtgttaa ccgctgttgt ctcgtgtgct 300 actgcgttga tgcttgttca tattattcct gatcttttga gtgttaagac tcgggagctt 360 ttcttgaaaa ataaagctgc tgagctcgat agagaaatgg gattgattcg aactcaggaa 420 gaaaccggaa ggcatgtgag aatgttgact catgagatta gaagcacttt agatagacat 480 actattttaa agact 495 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana (thale cress)_ETR1(1-165 amino acids) <400> 2 Met Glu Val Cys Asn Cys Ile Glu Pro Gln Trp Pro Ala Asp Glu Leu 1 5 10 15 Leu Met Lys Tyr Gln Tyr Ile Ser Asp Phe Phe Ile Ala Ile Ala Tyr 20 25 30 Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu Ile Tyr Phe Val Lys Lys Ser Ala Val 35 40 45 Phe Pro Tyr Arg Trp Val Leu Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile Val Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Phe Thr Thr His Ser 65 70 75 80 Arg Thr Val Ala Leu Val Met Thr Thr Ala Lys Val Leu Thr Ala Val 85 90 95 Val Ser Cys Ala Thr Ala Leu Met Leu Val His Ile Ile Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ser Val Lys Thr Arg Glu Leu Phe Leu Lys Asn Lys Ala Ala Glu 115 120 125 Leu Asp Arg Glu Met Gly Leu Ile Arg Thr Gln Glu Glu Thr Gly Arg 130 135 140 His Val Arg Met Leu Thr His Glu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Arg His 145 150 155 160 Thr Ile Leu Lys Thr 165

Claims

기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널(Channel); 상기 채널의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(Source)과 드레인 전극(Drain); 및 상기 채널의 상부 표면에 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터가 고정되어 있는 게이트 전극을 구비하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법으로서,
상기 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터는 ETR1(Ethylene receptor 1) 유래의 서열번호 2로 표시되는 1-165 아미노산 서열을 가지는 에틸렌 결합 부위(Ethylene Binding Domain: EtBD)를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 n형 전계효과트랜지스터(Field-Effect Transistor: FET)인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 기판은 단일층상의 규소와 이산화규소를 포함하는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 게이트 전극은 금 박막 전극인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 게이트 전극은 APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 처리하여 활성화되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터는 에틸렌 결합 부위와 중합체 형성 부위(oligomerization domain)를 함유하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 중합체 형성 부위는 GCN4-류신 지퍼(leucine zipper) 도메인 유래인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 중합체 형성 부위는 DI(Dimerization domain), TRI(Trimerization domain) 및 TETRA(Tetramerization domain)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 융합 단백질은 티올(thiol) 작용기 또는 태그를 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 태그는 바이오틴, GST, 6xHis 및 비드로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 융합 단백질은 온도 또는 삼투압 조절 하에서 용해된 상태로 합성시키는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 에틸렌 결합 부위는 티올(thiol) 작용기를 통해서 상기 게이트 전극에 고정시키는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서의 제조방법.
기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널(Channel); 상기 채널의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(Source)과 드레인 전극(Drain); 및 상기 채널의 상부 표면에 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터가 고정되어 있는 게이트 전극을 구비하는 에틸렌 검출용 바이오센서로서,
상기 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터는 ETR1(Ethylene receptor 1) 유래의 서열번호 2로 표시되는 1-165 아미노산 서열을 가지는 에틸렌 결합 부위(Ethylene Binding Domain: EtBD)를 포함하는 것인, 에틸렌 검출용 바이오센서.
제14항에 있어서, 상기 바이오센서는 n형 전계효과트랜지스터(Field-Effect Transistor: FET)인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제14항에 있어서, 상기 기판은 단일층상의 규소와 이산화규소를 포함하는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제14항에 있어서, 상기 게이트 전극은 금 박막 전극인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제14항 또는 제17항에 있어서, 상기 게이트 전극은 APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 처리하여 활성화되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제14항에 있어서, 상기 에틸렌과 특이적으로 결합하는 리셉터는 에틸렌 결합 부위와 중합체 형성 부위(oligomerization domain)를 함유하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
삭제
제19항에 있어서, 상기 중합체 형성 부위는 GCN4-류신 지퍼(leucine zipper) 도메인 유래인 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제19항에 있어서, 상기 중합체 형성 부위는 DI(Dimerization domain), TRI(Trimerization domain) 및 TETRA(Tetramerization domain)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제19항에 있어서, 상기 융합 단백질은 티올(thiol) 작용기 또는 태그를 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
제23항에 있어서, 상기 태그는 바이오틴, GST, 6xHis 및 비드로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 에틸렌 검출용 바이오센서.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에틸렌의 검출방법:
(a) 제14항의 에틸렌 검출용 바이오센서의 게이트 전극에 에틸렌이 함유된 시료를 주입시킨 다음, 반응시키는 단계;
(b) 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 전류 값을 이용하여 에틸렌의 유무를 확인하는 단계.
제25항에 있어서, 상기 게이트 전극에 인가되는 전압은 0.01V 내지 0.6V인 것을 특징으로 하는 에틸렌의 검출방법.