KR101903255B1 - 방적한 탄소나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 카본나노튜브 및 상기 카본나노튜브 상에 형성되는 보튤리늄 독소 리셉터를 포함하는 카본나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제공한다.

Description

방적한 탄소나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서{Sensor for detecting botulinum neurotoxin using spinning carbon-nanotube}
본 발명은 방적한 탄소나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방적한 탄소나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서 및 이를 이용한 보튤리늄 독소 검출방법에 관한 것이다.
보튤리늄 독소는 현재까지 알려진 독성 물질 중 가장 강력한 독성을 가진 물질이다. 이는 일반적으로 상한 음식이나, 부패한 동 식물에서 발견되는데, 사람에 대한 취사량은 매우 극소량이다.
또한, 보튤리늄 독소는 독성이 강력할 뿐 아니라 대량생산이 용이한 것으로 알려져 있어, 바이오테러에 사용 가능한 생화학 무기로 활용이 가능한 물질이다.
보튤리늄 독소는 기작하는 거동에 따라 A~G 까지 7가지 종류의 타입이 있다. 이 중 본 발명에 타겟으로 사용되는 독소는 E 타입 독소이다. 구조적으로 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어져있는데, 신경 전달 리셉터와 결합하는 heavy chain과 신경 전달 단백질을 가수분해를 통해 절단하는 light chain으로 구성된다.
그러나 현재까지 인정되고 있는 검출법은 동물실험을 통한 검출법으로 높은 선택성과 고 검출능을 가지는 장점이 있으나, 측정 시간이 수 일이 걸리며 실험에 사용하는 동물 관리를 위한 설비가 갖춰야 하기 때문에 많은 비용이 요구된다. 그리하여 실제 현장에서 활용할 센서로 개발하기 위해서는 짧은 검출 시간과 높은 검출능 그리고 저렴한 센싱 방법이 필요하다.
한편, 한국공개특허 제10-2016-0110643호(이하 선행문헌 1이라고 한다)에는 그래핀을 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서를 개시하고 있는데, 선행문헌 1은 고가의 그래핀을 사용하고, 분말상의 그래핀으로 된 센서를 제공하므로 대면적화가 어려우며, 가사 대면적의 그래핀을 이용하더라도 내구성, 복원성 등의 문제점을 가지고 있었다.
한국공개특허 제10-2016-0110643호(2016.09.22 공개)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로, 기계적 특성이 우수한 탄소나노튜브 시트를 이용한 대면적 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제공함에 있다.
또한 본 발명은 보튤리늄 독소 검출용 센서를 이용한 보튤리늄 독소의 검출방법을 제공함에 있다.
한편, 본 발명의 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 상세한 설명 및 그 효과로부터 용이하게 추론할 수 있는 범위 내에서 추가적으로 고려될 것이다.
이와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 카본나노튜브 및 상기 카본나노튜브 상에 형성되는 보튤리늄 독소 리셉터를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 보튤리늄 독소 검출용 센서는 카본나노튜브 시트를 이용한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 보튤리늄 독소 리셉터의 일단에 보튤리늄 독소가 접촉하는 경우, 전기저항이 증가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 보튤리늄 독소 리셉터는 항체, 효소, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 압타머, 지질, 코팩터 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 펩타이드는 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드는 보튤리늄 독소와 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 22번째 알지닌(R)과 23번째 이소루신(I)는 보튤리늄 독소와 결합하여 가수분해 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 항체는 면역글로불린 G일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 카본나노튜브와 상기 보튤리늄 독소 리셉터 사이에 형성되되, 상기 카본나노튜브와 비공유 결합하고, 상기 보튤리늄 독소 리셉터와 공유 결합하는 링커를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 링커는 하기 화학식 1로 표현될 수 있다:
[화학식 1]
X-L-Y
[상기 화학식 1에서, X는 피렌(pyrene)기 또는 흑연(graphite)이고, L은 (CH2)n 이며 여기서 n은 1 내지 4이고, Y는 하이드록실기(-OH)이다.]
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 링커는 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 카본나노튜브 시트는 표면처리 된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 보튤리늄 독소 검출용 센서를 이용한 보튤리늄 독소 검출방법을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출방법에 있어, 상술한 보튤리늄 독소 검출용 센서를 보튤리늄 독소를 포함하는 시료와 접촉시켜 전기 저항을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출방법에 있어, 상기 보튤리늄 독소를 포함하는 시료는 금속단백질 분해효소를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 바이오 테러에 사용될 수 있는 E 타입의 보튤리늄 독소를 신속하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 극미량인 수십 fM(femto-mole)의 보튤리늄 독소를 검출할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 카본나노튜브 시트를 이용함으로써, 유연성 있는 플렉서블 대면적 센서로 응용될 수 있다.
또한, 본 발명은 방직이 가능한 탄소나노튜브를 이용함으로써, 탄소나노튜브를 원하는 부분에 위치시키기 위한 공정이 요구되지 않으며, 이에 따라 탄소나노튜브 또는 탄소나노튜브 시트를 원하는 위치에 손쉽게 정렬시킬 수 있는 장점이 있다.
한편, 여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급됨을 첨언한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서를 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 이용되는 카본나노튜브 시트(101)를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 이용되는 카본나노튜브를 나타낸 TEM 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서의 제조과정을 도시한 단계별 개념 순서도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4 내지 6에 따라 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 상기 실시예 1에서 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 곡률반경에 따른 전류-전압 곡선을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 실시예 및 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 또한, 본 발명의 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명자들은 미량의 보튤리늄 독소를 검출하기 위한 센서를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 카본나노튜브에 표면처리, 표면개질 등을 수행하고 보튤리늄 독소 리셉터를 결합하여 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제조하는 경우, 최대 fM(femto-mole) 범주의 보튤리늄 독소를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 내구성 및 복원성 등의 기계적 물성이 우수하고 대면적 검출 센서로의 응용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 카본나노튜브 및 상기 카본나노튜브 상에 형성되는 보튤리늄 독소 리셉터를 포함하며, 상기 카본나노튜브로 된 카본나노튜브 시트를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "보튤리늄 독소 리셉터"는 보튤리늄 독소 표면과 결합할 수 있는 리셉터를 의미하며, 일 예로 항체, 효소, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 압타머, 지질, 코팩터 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "항체"는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장 면역글로불린의 특이성 결합력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 나타낸다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인 (항체 결합 부위)와 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 다중특이적 항체, 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화 항체, 키메라항체, 인트라바디 또는 항체 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "접촉(contacting)"은 상기 보튤리늄 독소 리셉터와 보튤리늄 독소와의 물리적 접촉이나 화학적 결합을 의미할 수 있다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대， 시험관(test tube) 또는 고분자로 된 컨테이너(container)에서 상술한 보튤리늄 독소 검출용 센서와 보튤리늄 독소 혼합액을 접촉시키는 것일 수 있다. 여기서 보튤리늄 독소 혼합액은 후술할 보튤리늄 독소를 포함하는 시료일 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "결합"은 둘 이상의 매체(물질)간의 직접적 결합 또는 간접적 결합을 의미할 수 있다. 일 예로, 직접적 결합은 상술한 보튤리늄 독소 리셉터와 보튤리늄 독소와의 화학 결합일 수 있으며, 간접적 결합은 보튤리늄 독소 리셉터와 카본나노튜브간의 결합이 다른 매개인자를 통하여 또는 매개인자와 함께 복합체(complex)를 이루는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어, 상기 매개인자는 링커일 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합(hydrogen bonding), 정전기적 결합(electrostatic interation), 반데르발스 결합(Van Der Waals interation), 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 결합(hydrophobic interaction), 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미할 수 있다. 일 예로, 상기 링커는 보튤리늄 독소 리셉터와 카본나노튜브를 연결할 수 있는 화합물일 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "비공유결합(non-covalent interaction)"은 원자 또는 분자가 공유결합 이외의 상호작용에 의해 집합체를 형성할 때 결합력이 약한 상호작용을 의미하는 것으로, 정전기적 결합(electrostatic interation), 소수성 결합(hydrophobic interaction), 수소 결합(hydrogen bonding), 반데르발스 결합(Van Der Waals interation)에 의한 상호작용을 포함할 수 있다.
또한, 상기 용어 "정전기적 결합(electrostatic interation)"은 반대 전하를 갖는 이온 사이의 전기적 인력에 의존하는 결합을 의미할 수 있고, 상기 용어 "소수성 결합(hydrophobic interaction)"은 극성 용매와의 상호작용을 피하고 열역학적으로 안정화하기 위한 소수성 분자들의 경향에 따른 결합을 의미할 수 있며, 상기 용어 "수소 결합(hydrogen bonding)"은 수소와 플루오린, 산소, 질소가 만나 생긴 극성 공유 결합 분자 사이에 생기는 쌍극자 쌍극자간 상호작용을 의미할 수 있다. 또한, 상기 용어 "반데르발스 결합(Van Der Waals interaction)"은 Van Der Waals 힘에 의해 분자에 극성이 생겨 상호간에 인력과 척력의 작용으로 이루어지는 결합을 의미할 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "스페이서(spacer)"란 펩타이드 서열 또는 상기 링커와 결합하는 아미노산의 짧은 서열을 나타낼 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "표면개질"은 개질 대상이 되는 물질의 기본적 물성에 변화를 주지 않으면서 다른 물질과의 결합을 용이하게 위해 표면을 변형 또는 변경시키는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 상술한 카본나노튜브 또는 카본나노튜브 시트의 표면개질은 상술한 보튤리늄 독소 리셉터와 결합시키기 위해 수행되는 것일 수 있다. 상기 카본나노튜브 또는 카본나노튜브 시트를 표면개질할 수 있는 물질로는 상술한 링커일 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "표면처리"는 전극과 카본나노튜브 또는 전극과 카본나노튜브 시트와의 에너지 장벽을 증가시키기 위한 처리를 수행하는 것을 의미할 수 있다. 상기 카본나노튜브 또는 카본나노튜브 시트를 표면처리하면, 상기 카본나노튜브 또는 카본나노튜브 시트의 표면에 결함부가 형성될 수 있다. 일 예로, 상기 표면처리의 방법은 UV-오존처리, 가스 플라즈마(여기서 가스는 수소, 메탄, 산소 중 적어도 어느 하나 이상인 것), Electrical Breakdown(절연파괴) 방식 등을 이용할 수 있으며, 상기 표면처리에 의해 상기 카본나노튜브 또는 카본나노튜브 시트는 p형 반도체 성질을 가질 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "분리된" 또는 "정제된" 펩타이드(예를 들면, 분리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분(예를 들면, 분리된 항원-결합 단편)은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예를 들면, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예를 들면, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않도록 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.
본 발명을 서술함에 있어, 용어 "기재"는 지지체의 역할을 수행하는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 상기 기재는 리지드 기재 또는 플렉서블 기재를 포함할 수 있다. 상기 리지드 기재의 구체적인 일 예로 소다라임 유리를 포함하는 유리 기재, 알루미나 등과 같은 세라믹 기재를 들 수 있고, 상기 플렉서블 기재의 구체적인 일 예로, 폴리이미드, PDMS(폴리디메틸실록산) 등과 같은 고분자 기재를 들 수 있다. 상기 고분자 기재는 유연성, 복원성, 내구성 등이 우수하므로, 상기 고분자 기재를 본 발명에 따른 기재로 사용하는 것은 본 발명의 목적달성에 좋다.
이하 본 발명을 첨부 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서를 도시한 모식도이다.
도 1을 참조하면, 상기 보튤리늄 독소 검출용 센서는 기재(10), 상기 기재(10) 상부에 형성되는 카본나노튜브 시트(100), 상기 카본나노튜브 시트(100)의 양단에 연결되는 전극(20), 및 상기 카본나노튜브 시트(100)의 상부에 형성되는 보튤리늄 독소 리셉터(200)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 보튤리늄 독소 리셉터(200)는 항체, 효소, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 압타머, 지질, 코팩터 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다.
상세하게, 도 1(a)는 상기 보튤리늄 독소 리셉터(200) 중에서 펩타이드(210)를 이용하는 경우 보튤리늄 독소 검출용 센서를 도시한 모식도이다. 도 1(a)에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 상기 펩타이드(210)가 카본나노튜브 시트(100) 상에 형성될 수 있다. 이 때, 상기 펩타이드(210)는 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드일 수 있다.
도 1(a)를 참조하면, 상기 펩타이드(210)의 일단에 보튤리늄 독소(BonT/E-Lc)가 접촉하는 경우, 상기 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 22번째 알지닌(R)과 23번째 이소루신(I)는 보튤리늄 독소와 결합하게 된다.
이 때, 상기 22번째 알지닌(R)과 상기 23번째 이소루신(I)는 보튤리늄 독소와 결합하여 가수분해 반응을 일으키게 된다. 또한, 이러한 가수분해 반응 이후, 상기 탄소나노튜브 시트(100) 상부에 분리된 펩타이드(211)이 형성될 수 있다. 여기서, 상기 보튤리늄 독소는 금속단백질 분해효소를 함유하는 시료에 혼합되어 사용될 수 있다. 금속단백질 분해효소를 함유하는 시료를 사용하는 경우, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 상기 보튤리늄 독소 검출시 감도가 향상된다. 일 예로, 상기 금속단백질 분해효소는 Mn2 +, Zn2 +, Ba2 +, Cu2 +, Co2 +, Ca2 +, Mg2 +, Ni2 +, Fe2+ 등의 이온을 함유할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어, 상기 금속단백질 분해효소는 펩타이드 1 몰 대비 0.1 내지 80 몰 일 수 있다. 이러한 몰 비율을 가지는 금속단백질 분해효소는 보튤리늄 독소 검출시 반응 시간을 단축시킬 수 있으며, 보튤리늄 독소의 감지능을 더욱 향상시킬 수 있다.
한편, 서열번호 2로 이루어진 아미노산을 갖는 스페이서(spacer)는 나선형 구조를 가질 수 있으며, 또한 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 N 말단에는 후술할 링커와 공유 결합할 수 있다.
도 1(b)는 상술한 보튤리늄 독소 리셉터(200) 중에서 항체(220)를 이용하는 경우 보튤리늄 독소 검출용 센서를 도시한 모식도이다. 도 1(b)에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 항원-항체 반응을 이용하기 위해 상기 항체(220)가 카본나노튜브 시트(100) 상에 형성될 수 있다.
도 1(b)를 참조하면, 상기 항체(220)의 일측에 보튤리늄 독소(BonT/E-Lc)가 접촉하는 경우, 상기 보튤리늄 독소는 상기 항체(220)에 안착되며 보튤리늄 독소와 항체(200)가 결합된 구조체(221)가 형성된다.
이 때, 상기 항체(220)는 면역글로불린 G일 수 있다. 상기 면역글로불린 G를 항체로 사용하는 경우, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 최대 fM(femto-mole) 단위의 보튤리늄 독소를 검출할 수 있다.
또한, 상기 항체(220)은 후술할 링커와 공유 결합할 수 있다.
한편, 도 1에 따로 도시하지는 않았지만, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 상기 카본나노튜브 시트(100)의 카본나노튜브와 상기 보튤리늄 독소 리셉터(200) 사이에 형성되는 링커를 포함할 수 있다.
상기 링커는 상기 카본나노튜브(100)와 비공유 결합하고, 상기 보튤리늄 독소 리셉터(200)와 공유 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 있어, 상기 링커는 하기 화학식 1로 표현될 수 있다:
[화학식 1]
X-L-Y
[상기 화학식 1에서, X는 피렌(pyrene)기 또는 흑연(graphite)이고, L은 (CH2)n 이며 여기서 n은 1 내지 4이고, Y는 하이드록실기(-OH)이다.]
상세하게, 상기 링커는 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester)일 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 있어, 상기 링커는 상술한 보튤리늄 독소 리셉터 1 몰 대비 100 내지 10000 몰일 수 있다.
상기 링커가 독소 리셉터 1몰 대비 100 미만이거나 10000초과 시, 리셉터에 결합되는 보튤리늄 독소가 적어지는 문제점이 있다. 즉, 상기 링커가 독소 리셉터 1몰 대비 100 미만인 경우에는, 링커에 결합하는 리셉터의 수가 적어져서 보튤리늄 독소에 대한 감지능이 저하되고, 상기 링커가 독소 리셉터 1몰 대비 10000 초과인 경우에는, 카본나노튜브 표면에 상기 링커들끼리 서로 응집되는 현상이 발생하게 되며, 이에 따라 상기 링커에 결합되는 리셉터의 수가 적어져서 보튤리늄 독소에 대한 감지능이 저하된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 이용되는 카본나노튜브 시트(101)를 나타낸 사진이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 카본나노튜브 시트(101)는 카본나노튜브 숲(forest)(90)으로부터 형성된 방적된 시트일 수 있다.
상세하게, 본 발명의 일 구체예에 따른 카본나노튜브 시트(101)는 상기 카본나노튜브 숲(90)의 일단을 일방향으로 인출함으로써 방적된 시트로 제조되는 것일 수 있다.
또한, 상기 카본나노튜브 시트(101)의 폭은 대략 0.1 내지 100 mm 일 수 있으나, 본 발명이 카본나노튜브 시트(101)의 폭에 한정되지 않는다. 이와 같은 폭을 가지는 카본나노튜브 시트(101)를 이용함으로써, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 대면적 센서로 응용이 가능하다.
한편, 본 발명의 일 구체예에 따른 카본나노튜브 시트는 표면처리 된 것일 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 카본나노튜브 시트의 전기전도도는 1 내지 3 μS 일 수 있다. 상기 카본나노튜브 시트의 전기저항이 1 μS 미만인 보튤리늄 독소 검출용 센서를 이용하는 경우, 수십 ㏁ 이상에서 신호를 보이는 보튤리늄 독소를 검출하기가 어렵다. 또한, 상기 카본나노튜브 시트의 전기저항이 3 μS 이상인 보튤리늄 독소 검출용 센서를 이용하는 경우, 극미량의 보튤리늄 독소에 대한 전기전도도의 변화가 극히 작아서 신뢰성이 저하된다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서에 이용되는 카본나노튜브를 나타낸 TEM 사진이다. 또한 상술한 바와 같이, 카본나노튜브 시트(100)(101)는 상기 카본나노튜브로 이루어진 것일 수 있다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 구체예에 따른 카본나노튜브는 다중벽 카본나노튜브일 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 보튤리늄 독소 검출용 센서를 이용한 보튤리늄 독소 검출방법을 포함한다.
본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출방법은 보튤리늄 독소 검출용 센서를 보튤리늄 독소를 포함하는 시료와 접촉시켜 전기 저항을 측정하는 단계를 포함한다.
이 때, 상기 보튤리늄 독소를 포함하는 시료는 상술한 금속단백질 분해효소를 함유하는 것일 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 설명을 위하여 하기의 제조예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하겠으나, 본 발명이 다음 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 카본나노튜브 시트의 제작
SiO2 막의 두께가 500 nm 인 실리콘 기판 상에 물리기상증착(PVD, Physical Vapor Deposition) 공정을 통해 촉매층인 알루미늄(Al) 층 및 철(Fe) 층을 증착하였다. 이 때, 알루미늄 층의 두께는 7 nm 이었고, 철 층의 두께는 2 nm 이었다. 이후, 화학기상증착(CVD, Chemcal Vapor Deposition) 공정을 이용하여 기판에 수직하게 성장된 카본나노튜브 숲을 제조하였다. 상기 화학기상증착 공정시, 증착 온도는 750 ℃, 압력은 700 Torr, 주입 가스로는 아르곤 270 sccm, 수소 450 sccm, 및 에틸렌 100 sccm, 증착 유지 시간은 1시간이었다.
이렇게 제조된 카본나노튜브의 직경은 약 5 ~ 100 nm이고, 길이는 약 750 ㎛이었다. 이후 상기 카본나노튜브 숲의 일단을 일정 각도로 일방향으로 잡아당겨 길이가 8 mm, 폭이 1 mm 인 방적된 카본나노튜브 시트를 제작하였다.
실시예 1
도 4에 도시된 바와 같이, 상기 제조예 1에서 제조된 카본나노튜브 시트를 PDMS 기판 위에 부착한 다음, 산소 플라즈마 처리를 수행하고 상기 카본나노튜브 시트의 양단에 약 50 V의 전압을 걸어주면서 절연파괴(electrical breakdown)를 수행하여 표면처리된 카본나노튜브 시트를 제조하였다. 이후, 상기 카본나노튜브 시트의 양단에 제조예 1에서 제조된 제1 카본나노튜브 시트와 제2 카본나노튜브 시트를 각각 부착하여 전극을 형성하고, 상기 표면처리된 카본나노튜브 시트와 이격된 상기 제1 카본나노튜브 시트와 제2 카본나노튜브 시트의 일단에 금(Au) 전극을 코팅하였다.
이후, 상기 표면처리된 카본나노튜브 시트의 표면에 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester) 6 mM 링커 용액을 주입하여 상기 링커를 결합시켰다. 이후 링커가 결합된 탄소나노튜브 시트에 다이메틸폼아마이드(DMF)와 완충용액(buffer solution)으로 세척하고, 서열번호 1로 이루어지는 0.8 μM의 펩타이드 용액을 주입함으로써, 탄소나노튜브 시트의 표면에 단분자층이 형성된 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제작하였다.
마지막으로, 완충용액(buffer solution)으로 탄소나노튜브 시트의 채널 부위를 세척하고, 3 nM의 보튤리늄 독소(Botulinum toxin type E light chain)가 함유된 시료를 상기 탄소나노튜브 시트를 가로지르는 유체 채널으로 흘려주면서 상기 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도를 측정하였다. 이때, 상기 시료는 20 μM의 ZnCl2를 함유하였다.
실시예 2
0.3 nM의 보튤리늄 독소를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 3
60 pM의 보튤리늄 독소를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
도 5는 상기 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도 변화를 나타낸 그래프이다. 도 5를 보면 도 5(a)는 상기 실시예 1에 따른 그래프, 도 5(b)는 상기 실시예 2에 따른 그래프, 도 5(c)는 상기 실시예 3에 따른 그래프를 각각 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 3에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 약 10 nM에서 10 pM의 보튤리늄 독소를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4
도 4에 도시된 바와 같이, 상기 제조예 1에서 제조된 카본나노튜브 시트를 PDMS 기판 위에 부착한 다음, 산소 플라즈마 처리를 수행하고 상기 카본나노튜브 시트의 양단에 약 50 V의 전압을 걸어주면서 절연파괴(electrical breakdown)를 수행하여 표면처리된 카본나노튜브 시트를 제조하였다. 이후, 상기 카본나노튜브 시트의 양단에 제조예 1에서 제조된 제1 카본나노튜브 시트와 제2 카본나노튜브 시트를 각각 부착하여 전극을 형성하고, 상기 표면처리된 카본나노튜브 시트와 이격된 상기 제1 카본나노튜브 시트와 제2 카본나노튜브 시트의 일단에 금(Au) 전극을 코팅하였다.
이후, 상기 표면처리된 카본나노튜브 시트의 표면에 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester) 6 mM 링커 용액을 주입하여 상기 링커를 결합시켰다. 이후 링커가 결합된 탄소나노튜브 시트에 다이메틸폼아마이드(DMF)와 완충용액(buffer solution)으로 세척하고, 서열번호 1로 이루어지는 0.8 μM의 펩타이드 용액을 주입함으로써, 탄소나노튜브 시트의 표면에 단분자층이 형성된 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제작하였다.
이후, 상기 표면처리된 카본나노튜브 시트의 표면에 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester) 6 mM 링커 용액을 주입하여 상기 링커를 결합시켰다. 이후 링커가 결합된 탄소나노튜브 시트에 다이메틸폼아마이드(DMF)와 완충용액(buffer solution)으로 세척하고, BoNT/E에 대한 항체인 10 μM의 IgG(카이스트 제조) 혼합하여 탄소나노튜브 시트의 표면에 단분자층을 형성하여 보튤리늄 독소 검출용 센서를 제작하였다.
마지막으로, 완충용액(buffer solution)으로 탄소나노튜브 시트의 채널 부위를 세척하고, 51 fM의 보튤리늄 독소(Botulinum toxin type E light chain)가 함유된 시료를 상기 탄소나노튜브 시트를 가로지르는 유체 채널으로 흘려주면서 상기 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도를 측정하였다.
실시예 5
100 fM의 보튤리늄 독소를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하였다.
실시예 6
500 fM의 보튤리늄 독소를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하였다.
도 6은 상기 실시예 4 내지 6에 따라 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 전기전도도 변화를 나타낸 그래프이다. 도 6을 보면 도 6(a)는 상기 실시예 4에 따른 그래프, 도 6(b)는 상기 실시예 5에 따른 그래프, 도 6(c)는 상기 실시예 6에 따른 그래프를 각각 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 4 내지 6에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 약 10 fM에서 1000 fM의 보튤리늄 독소를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 보튤리늄 독소 검출용 센서는 인간에 대한 상기 보튤리늄 독소의 반수 치사량(LD50)인 1 ~ 13 ng/kg (약 55 fM) 이하에서도 정확하게 측정할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 도 7은 상기 실시예 1에서 제조된 보튤리늄 독소 검출용 센서의 곡률반경에 따른 전류-전압 곡선을 나타낸 그래프이다. 도 7을 보면 도 7(a)는 보튤리늄 독소 검출용 센서를 구부린 곡률반경이 31.2 mm인 그래프, 도 7(b)는 보튤리늄 독소 검출용 센서를 구부린 곡률반경이 7.8 mm인 그래프, 도 7(c)는 보튤리늄 독소 검출용 센서가 평평한(flat) 경우의 그래프를 각각 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 보튤리늄 독소 검출용 센서를 구부린 곡률반경이 증가하더라도 전류-전압 곡선은 변화가 거의 없음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에 따른 독소 검출용 센서는 플렉서블 센서로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
10: 기재 20: 전극 90: 카본나노튜브 숲
100, 101: 카본나노튜브 시트
200: 보튤리늄 독소 리셉터 210: 펩타이드
220: 항체
<110> Korea Research Institute of Standards and Science <120> Sensor for detecting botulinum neurotoxin using spinning carbon-nanotube <130> 0353 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLAibAAGGDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADK <400> 1 Gly Leu Xaa Ala Ala Gly Gly Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln 1 5 10 15 Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Lys 20 25 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLAibAAGG <400> 2 Gly Leu Xaa Ala Ala Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMGNEIDTQNRQIDRIMEKADK <400> 3 Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile 1 5 10 15 Met Glu Lys Ala Asp Lys 20

Claims (12)

  1. 카본나노튜브 및 상기 카본나노튜브 상에 형성되는 보튤리늄 독소 리셉터를 포함하는 카본나노튜브 시트를 이용한 보튤리늄 독소 검출용 센서로서,
    상기 보튤리늄 독소 리셉터는,
    서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드이며,
    서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 22번째 알지닌(R)과 23번째 이소루신(I)은 보튤리늄 독소와 결합하여 가수분해 반응을 일으키고,
    상기 카본나노튜브 시트는,
    카본나노튜브 숲(forest)으로부터 형성된 방적된 시트이며,
    표면처리에 의해 p형 반도체 성질을 가지는,
    보튤리늄 독소 검출용 센서.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 보튤리늄 독소 리셉터의 일단에 보튤리늄 독소가 접촉하는 경우, 전기저항이 증가하는 보튤리늄 독소 검출용 센서.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 보튤리늄 독소 리셉터는,
    상기 펩타이드 대신에 면역글로불린 G를 갖는 항체인 보튤리늄 독소 검출용 센서.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 카본나노튜브와 상기 보튤리늄 독소 리셉터 사이에 형성되되,
    상기 카본나노튜브와 비공유 결합하고, 상기 보튤리늄 독소 리셉터와 공유 결합하는 링커를 포함하는 보튤리늄 독소 검출용 센서.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 링커는 하기 화학식 1로 표현되는 보튤리늄 독소 검출용 센서:
    [화학식 1]
    X-L-Y
    [상기 화학식 1에서, X는 피렌(pyrene)기 또는 흑연(graphite)이고, L은 (CH2)n 이며 여기서 n은 1 내지 4이고, Y는 하이드록실기(-OH)이다.]
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 링커는 1-피렌부타노익산 숙신이미딜 에스터(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester)인 보튤리늄 독소 검출용 센서.
  10. 삭제
  11. 제 1항, 제 2항, 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 보튤리늄 독소 검출용 센서를 보튤리늄 독소를 포함하는 시료와 접촉시켜 전기 저항을 측정하는 단계를 포함하는 보튤리늄 독소 검출방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 보튤리늄 독소를 포함하는 시료는 금속단백질 분해효소를 함유하는 보튤리늄 독소 검출방법.
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