KR20100042305A

KR20100042305A - 열안정성 단백질을 함유하는 융합단백질 및 이를 이용한 단백질의 정제방법

Info

Publication number: KR20100042305A
Application number: KR1020080101391A
Authority: KR
Inventors: 박일선
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-16
Filing date: 2008-10-16
Publication date: 2010-04-26

Abstract

본 발명은 응집하기 쉬운 목적단백질의 정제 방법에 관한 것으로서, 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질을 포함하는 융합단백질 및 그 플라스미드 벡터를 제공하며, 또한 상기 플라스미드 벡터가 주입된 대장균의 배양 및 정제를 통한 목적단백질의 제조방법을 제공한다. 상기 융합단백질의 일부를 구성하는 열안정성 단백질로서, 대장균으로부터 분리되어 동정된 TF(trigger factor)또는 DnaK를 사용하였다. 상기 열안정성 단백질은 대장균 내에서, 그리고 용액상에서 융합단백질을 안정화시킴으로써 목적단백질의 응집을 효과적으로 방지해주는 역할을 한다. 본 발명에 따르면, 대장균 내에서 봉입체를 형성하기 쉬운 목적단백질을 응집되지 아니한 가용성의 활성상태로 제조하기 위한 손쉬운 제조방법을 제공한다.

열안정성 단백질, 유비퀴틴, 융합단백질, 봉입체

Description

열안정성 단백질을 함유하는 융합단백질 및 이를 이용한 단백질의 정제방법{FUSION PROTEIN CONTAINING THERMO-STABLE PROTEIN AND ITS USE FOR PROTEIN PURIFICATION}

본 발명은 자발적인 응집체 형성에 따라 활성이 감소되기 쉬운 펩티드 또는 단백질을 활성을 보유한 가용성 형태로 제조하기 위한 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질을 포함하는 융합단백질을 대장균 E. coli 내에서 생산하고, 이를 디유비퀴틴 효소(deubiquitylating enzyme)를 사용하여 절단하는 것을 포함하는 방법으로 정제함으로써 응집되지 않은 가용성 형태의 목적단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

구조연구 및 생화학적 연구에 요구되는 펩타이드 또는 단백질(이하 목적단백질이라 한다)은 번역후 변형(post-translational modifications)이 필요한 경우를 제외하고는 대개 박테리아 발현 시스템들에 의해 생산된다. 그러나 이 경우, 유전형질 발현의 어려움, 낮은 수득률, 생산된 목적단백질의 불안정성, 및 정제상의 어려움이 문제점으로 대두된다. 특히, E. coli 내에서 생산되는 단백질은 자주 불용성 응집체로서 축적되어 봉입체를 형성하므로 활성이 감소된 형태로 산출되는 경 우가 많다. 더우기 생체 밖에서의 재접힘( in vitro refolding) 과정에 의하여 목적단백질의 활성을 회복하는 작업은 쉽지 않다.

대장균을 이용한 목적단백질의 발현 및 그 정제와 관련하여, 대장균 내에서 발현되는 재조합단백질의 용해성을 향상시키는 것이 중요한바, 이를 위해 가장 일반적으로 이용되는 기술 중 하나가 단백질 융합기술이다. 예를 들면, 융합단백질의 용해도를 향상시키기 위해 말토즈-결합 단백질(MBP), thioredoxin (TRX), transcription pausing factor L (NusA), thiol-disulfide oxidoreductase, glutathione S-transferase(GST) 등과 같은 다양한 단백질들을 융합파트너로서 목적단백질과 결합시킴으로써, 상기 목적단백질을 활성의 가용성 형태로 정제하는 기술들이 보고되고 있다.(Catanzariti 등, Protein Sci. 13, 1331-1339; De Marco 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, 766-771) 이 중에서, 상기 융합단백질의 용해성을 향상시키는 면에서는 GST 또는 TRX보다 MBP를 이용하는 것이 더 효과적으로 알려져 있다. 그러나 MBP는 융합된 단백질을 적절한 접힘으로 회복시키는 촉진제 역할을 할 수 없고 목적단백질의 형질발현을 촉진해주지 못하는 것으로 보고되는바, 이를 융합파트너로서 사용하는 것에는 한계가 있다. 이러한 점을 감안할 때, 응집경향이 있는 목적단백질을 제조함에 있어서 그 용해도 및 생리활성 등의 특성을 만족할만한 수준으로 유지시키기 위한 방법을 찾기 위한 후속 연구가 현재 필요한 상황이다.

본 발명의 목적은 응집하기 쉬운 펩타이드 또는 단백질을 활성을 갖는 가용성 형태로 제조하기 위한 제조방법을 개발하기 위한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서는 목적단백질을 함유하는 융합단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터를 이용한 제조방법에 초점을 맞추어, 상기 융합단백질의 일부를 구성하는 융합파트너로서 다양한 열안정성 단백질들을 시험함으로써 효과적인 융합단백질을 찾아내고, 이를 상기 목적단백질의 제조에 응용하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다. 상기 열안정성 단백질로서 TF(trigger factor) 또는 DnaK를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 DNA를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 대장균을 배양하고, 상기 배양된 대장균으로부터 수득된 상기 융합단백질을 디유비퀴틴 효소(deubiquitylating enzyme; Usp2-cc)로 처리하여 절단하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 대장균의 배양단계 및 상기 융합단백질의 절단단계 등을 포함하는 상기 제조방법에 의해 제조된 목적단백질을 제공한다.

본 발명은 응집되기 쉬운 목적단백질을 활성의 가용성 상태로 제조하기 위하여, 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질로 구성된 융합단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터를 사용하는 것을 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은 상기 융합단백질을 생산하는 대장균의 배양 및 상기 융합단백질의 선택특이적인 절단을 포함한 비교적 간편한 제조단계들로 구성되며, 활성을 갖는 가용성 상태의 목적단백질을 종래의 제조방법에 비해 약 1.5배 향상된 수득률로 제조할 수 있는 장점이 있다.

펩티드 또는 단백질의 정제에 관한 최근 보고에 따르면, 열안정성 단백질(thermostable protein)에 목적물질인 펩티드 또는 단백질(목적단백질)을 융합시킴으로써 상기 목적단백질의 안정성을 향상시켜 정제하는 기술들이 보고되고 있다.(드 마르코 등, J. Biotechnol. 107, 125-133)

이러한 선행기술들에 착안하여, 우리는 목적단백질의 용해도를 향상시켜줄 수 있는 융합파트너 역할을 할 수 있는 물질을 찾기로 하였고, 그 과정에서 다양한 E. coli 단백질들을 조사하였다. 그 결과, 우리는 목적단백질에 대한 융합파트너로 활용할 수 있는 적당한 단백질을 동정할 수 있었다. 상기 융합파트너를 함유한 융 합단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터를 사용함으로써, 대장균을 사용한 통상적인 발현시스템에서 상기 목적단백질이 봉입체를 형성하는 것을 방지하여 상기 목적단백질을 별도의 용해 및 회수과정이 없이도 성공적으로 정제시킬 수 있었다.

이하에 본 발명에 따른 대표적인 실시 예를 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장균으로부터 추출된 열안정성 단백질들의 동정

일반적으로, 대장균 내에 과발현되어 생성되는 단백질들 및 펩타이드들 중 상당수는 불용성 봉입체를 형성하며, 이에 따라 목적단백질의 용해 및 활성의 회복에 어려움이 따른다. 이러한 문제를 극복하기 위한 방법중 하나가 목적단백질을 일정한 단백질과 함께 융합시킴으로써 용해될 수 있는 형태로 만드는 것이다. 이에 따라, 우리는 대장균에 존재하는 열안정성 단백질들을 찾아, 이들을 응집하기 쉬운 목적단백질과 함께 융합시킬 경우 그 용해성이 향상되는지 여부를 조사하였다.

이를 위하여, 대장균 세포추출물을 10분 동안 끓이고, 원심분리한 후, 가용성 분획은 따로 보관하고, 상등액을 함유한 원래의 겔 부분을 변성시킨 후 2차원 polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 본 실험에 사용된 세포추출물은 37℃에서 하루 밤동안 배양된 E. coli DH5α 세포들을 용해완충액 A (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM phenylmethanesulphonylfluoride, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM 2-mercaptoethanol) 내 에서 18,000 lb/in²의 세포파쇄기(French pressure cell)를 사용하여 분쇄한 후 47,000×g의 조건으로 1시간동안 원심분리하여 제조되었다.

상기 세포추출물 중 가용성 분획을 10분 동안 끓이고, 30분 동안 16,500×g의 조건으로 원심분리한 뒤 그 가용성 분획을 다시 회수하였다. 상기 분획내의 단백질들을 10% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 사용하여 분석하였다. 이어서, 상기 겔 분획을 0.1% 2-mercaptoethanol 존재하에 10분 동안 끓여 상기 단백질을 변성시키고 sodium dodecylsulfate-PAGE를 사용하여 분석하였다. 이에 따른 단백질들(protein spots)을 선택하여 matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF; ProteomeTech. Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였고, 이어서 National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST 검색에 의해 동정하였다.

도 1(A)는 대장균으로부터 얻은 열안정성 단백질들의 2차원 PAGE 분석결과이다. 여기서, 좌측의 수치는 각 단백질위치의 상대적 분자량을 나타낸다.

도 1(A)의 표지된 단백질들은 MALDI-TOF에 의해 다음과 같이 동정되었다: 1, DnaK; 2, transcription pausing factor L (NusA); 3, 4, 5, trigger factor (TF); 6, 말토즈-결합 단백질 (MBP); 7, galactose glucose-binding protein; 8, FK-506-binding protein (FKBP); 9, D-ribose periplasmic protein (RbsB); 10, adenylate kinase (AKN); 11, outer membrane lipoprotein carrier protein; 12, 리보솜 단백질 S19 (RS19); 13, putative EscN protein (EscN); 14, GroES; 15, 리보솜 단백질 S19.

<실시예 2> 열안정성 단백질들의 복제

동정된 상기 열안정성 단백질들 중에서 10종의 단백질들을 임의적으로 선택하고, 각각에 해당하는 유전자들을 대장균 DH5α 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR증폭하고, pET21b 발현 시스템(Novagen, Madison, WI, USA)의 NdeI 및 BamHI 위치(또는 FKBP의 경우 NdeI/ HindIII 위치) 사이에 복제시킴으로써 선택된 각각의 열안정성 단백질의 플라스미드를 얻었다.

표 1은 열안정성 단백질들의 PCR 증폭에 사용된 프라이머들의 염기서열을 제시한다.

서열번호	프라이머	염기서열
1	DnaK의 포워드 프라이머	5′-GAATTCCATATGGGTAAAATAATTGGTATC-3′
2	DnaK의 리버스 프라이머	5′- GAAGAAGTCAAAGACAAAAAAGGATCCCG-3′
3	TF의 포워드 프라이머	5′- GGAATTCCATATGCAAGTTTCAGTTGAAAC-3′
4	TF의 리버스 프라이머	5′- GAGCTGATGAACCAGCAGGCGGGATCCCG-3′
5	MBP의 포워드 프라이머	5′- GGAATTCCATATGAAAATAAAAACAGGTG-3′
6	MBP의 리버스 프라이머	5′- CGCAGACTCGTATCACCAAGGTGGATCCCG-3′
7	RbsB의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGAACATGAAAAAACTGGC-3′
8	RbsB의 리버스 프라이머	5′-CTGAAACTGGTTGTTAAGCAGATGGATCCC-3′
9	EscN의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGACAACGTCAGACCGTCC-3′
10	EscN의 리버스 프라이머	5′-AAGTCCGCTCTATTCTTGATGCGGATCCCG-3′
11	FKBP의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGAAATCACTGTTTAAAG-3′
12	FKBP의 리버스 프라이머	5′-CCGCAGATTCTGCTAAAAAAAAGCTTGGG-3′
13	AKN의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGGTGGTATCGTTTATCG-3′
14	AKN의 리버스 프라이머	5′-GCTCTGGAAAAAATTCTCGGCGGATCCCG-3′
15	NusA의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGAACAAAGAAATTTTGGCTG-3′
16	NusA의 리버스 프라이머	5′-GCTGGTTCGGTGACGAAGCGTGGGATCCCG-3′
17	GroES의 포워드 프라이머	5′-GGAATTCCATATGAATATTCGTCCATTGCA-3′
18	GroES의 리버스 프라이머	5′-ATTCTGGCAATTGTTGAAGCGGGATCCGCG-3′

<실시예 3> 열안정성 단백질들의 복제유전자들에 대한 형질발현 및 열안정성 실험

실시예 2의 플라스미드와 합쳐져 형질변환된 E. coli BL21 (DE3) pLysS를 0.4 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)으로 처리하여 발현유도한 후, 세포들을 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 수확하여 용해완충액 A로 용해시킨 후 단시간의 소니케이션으로 분쇄시키고 16,500×g 하에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상기 단백질들의 형질발현 및 열안정성을 조사하기 위하여 원리분리후의 상등액을 10분 동안 끓인바, 그 전후에 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.

도 1(B)는 대장균 내에 과발현된 10종의 단백질들에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다. 여기서, TF로서는 도 1(A)의 단백질5를 과발현시킨 것을 사용하였다. 각각의 단백질마다 기록된 2개의 레인은 (-)끓이기 전, 및 (+)끓인 후의 단백질을 동일한 양으로 시험한 것이다. 이 중에서, MBP, FKBP, AKN, RS19, 및 EscN는 다른 단백질들에 비하여 10배의 양을 로딩한 것이다.

도 1(B)를 참조하면, DnaK, NusA, TF, FKBP, AKN, GroES, 및 EscN 단백질들은 잘 발현되고 열에 안정한 것으로 관찰되었다. 다만, MBP는 끓임에 따른 부분적인 응집현상이 관찰되지만, 발현은 용이하게 일어나는 것으로 나타났다. DbsB 또한 잘 발현되었으며, 다만 끓인 이후에 2개의 밴드들이 관찰되었다. 다른 한편으로, 리보솜 단백질(ribosomal protein) S19는 잘 발현되지 않았다. 상기 10개의 단백질들 중에서, 잘 발현되지 않거나 선행연구에서 시험된 것들을 제외한 결과, 우리는 다음 단계 실험의 대상으로서 DnaK, TF, EscN, 및 MBP을 선정하였다.

<실시예 4> 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질의 융합 플라스미드의 구성

표 2는 본원발명에서 목적단백질 등의 PCR 증폭에 사용된 프라이머들의 염기서열을 제시한다.

서열번호	프라이머	염기서열
19	Aβ₄₂의 포워드 프라이머	5'-CGGGATCCAGATGAAGTTGATGATCGGAAATTTC-3'
20	Aβ₄₂의 리버스 프라이머	5'-CCGCTCGAGTCACGCAATCACCACGCCGCCCAC-3'
21	Ub-Aβ₄₂의 포워드 프라이머	5'-CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGAC-3'
22	Ub-Aβ42의 리버스 프라이머	5'-CCGCTCGAGTCACGCTATGACAACACCGCC-3'
23	Ub-Aβ₄₂(BamHI)의 포워드 프라이머	5'-CTCCGCGGTGGAGATGCAGGATTC-3'
24	Ub-Aβ₄₂(BamHI)의 리버스 프라이머	5'-GGATCCTGCATCTCCACCGCGGAG-3'
25	Ub-Aβ₄₀의 포워드 프라이머	5'-GGGGGAGTATGAATCGCCCTC-3'
26	Ub-Aβ₄₀의 리버스 프라이머	5'-GAGGCCGATTCATACTCCCCC-3'
27	Aβ_(42-1)의 포워드 프라이머	5'-CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGAC-3'
28	Aβ_(42-1)의 리버스1 프라이머	5'-ATCACGCCACCAACGACAATCGCTCCACCGCGGAGGCGCAAGAC-3'
29	Aβ_(42-1)의 리버스2 프라이머	5'-TGAGTTTTTACCTGCGATAATTCCGAGCATCACGCCACCAACGAC-3'
30	Aβ_(42-1)의 리버스3 프라이머	5'-CAACACGAAAAATGCTTCATCCACAACTGAGTTTTTAACTGCGAT-3'
31	Aβ_(42-1)의 리버스4 프라이머	5'-TGATCCATATTCAACATGATGTTGTTTCAACACGAAAAATGCTTC-3'
32	Aβ_(42-1)의 리버스5 프라이머	5'-GAGTCAATCTGCTTCGAAGCGATGGTCTGATCCATATTCAACATG-3'
33	Aβ_(42-1)의 리버스6 프라이머	5'-CCGCTCGAGTCAATCTGCTTCGAA-3'
34	휴마닌의 포워드 프라이머	5'-CGCGGATCCCAGATCTTTGTGAAGAC-3'
35	휴마닌의 리버스1 프라이머	5'-AAAACCACGCGGCGCCATTCCACCGCGGAGGCGCAA-3'
36	휴마닌의 리버스2 프라이머	5'-ATCAATTTCACCGGTCAGCAGCAGCAGGCAGCTAAAACCACGCGGCGCCA-3′
37	휴마닌의 리버스3 프라이머	5'-CCGCTCCAGTCACGCACGACGTTTCACCGGCAGATCAATTTCACCGGTCA-3'
38	카스파제-2의 작은 서브유닛의 포워드 프라이머	5'-GGATTCCATATGGCCGGTAAGAAAAGTTG-3'
39	카스파제-2의 작은 서브유닛의 리버스 프라이머	5'-CGGATCCTGTGGGAGGGTGTCCTGG-3'
40	카스파제-2의 큰 서브유닛의 포워드 프라이머	5'-CGGATCCGGTCCTGTCTGCCTTCAAG-3'
41	카스파제-2의 큰 서브유닛의 리버스 프라이머	5'-GCGTTTTTTGCGGCCATCTTGTTGGTCAACCCC-3'
42	리버스-카스파제-2의 포워드 프라이머	5'-GAATTCCATATGCAAGTTTCAGTTGAAAC-3'
43	리버스-카스파제-2의 리버스 프라이머	5'-CGCGGATCCACCGCGGAGGCGCAACAACAG-3'

아밀로이드-베타(1-42) [Aβ_(1-42)]의 경우, 그 유전자를 주형으로 사용하여 Aβ_(1-42)를 표 2에서 제시된 적당한 프라이머들과 함께 PCR증폭시키고, pET28b (Novagen)의 BamHI 및 XhoI 위치 사이에 복제하였다. 또한, 상기 Aβ_(1-42) 유전자의 상부측에 NdeI/BamHI 를 이용하여 유비퀴틴을 복제하였다.

이어서, 위치-지향적인 돌연변이를 이용하여 BamHI를 제거한 후 [프라이머: 표 2의 Ub-Aβ₄₂(BamHI)], 상기 유비퀴틴-Aβ_(1-42) 융합체를 PCR증폭시키고 [프라이머: 표 2의 Ub-Aβ₄₂], 시험하고자 하는 열안정성 단백질을 함유한 플라스미드 내로 복제시켰다. 이는 BamHI 및 XhoI를 사용하여 상기 유비퀴틴-Aβ_(1-42) 융합체를 상기 열안정성 단백질의 하부에 위치시킴으로써 이루어졌다.

유비퀴틴-Aβ_(1-40)는 Aβ_(1-42)의 서열 말단으로부터 2개의 아미노산기 위치에 종결코돈을 삽입함으로써 제조되었다. [프라이머: 표 2의 Ub-Aβ₄₀]

유비퀴틴-Aβ_(42-1)[Aβ_(1-42)의 역방향 형] 융합체는 표 2의 Ub-Aβ₄₂ 포워드 프라이머 및 Aβ_(42-1)의 프라이머들을 사용한 다단계 과정을 통하여 합성하였다. 상기 융합체는 TF-플라스미드 융합 단백질 다음에 삽입 또는 서브크론(subclone)되었다.

휴마닌 펩티드(Shahnawaz 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 801-805)는 표 2의 프라이머들을 사용하여 합성하였고, 이는 전술한 방법에 따라 서브클론되었다.

한편, 리버스-카스파제-2의 경우 작은 서브유닛 및 큰 서브유닛으로 나누어 각각 표 2에 제시된 프라이머들을 사용하여 PCR증폭하였다. 전체 길이의 카스파제-2의 작은 서브유닛은 큰 서브유닛의 하부에 있는 pET21b 내에 복제하였다. 마지막으로, 이와같이 형성된 전체 구조체는 새로이 구성된 TF-유비퀴틴 플라스미드의 NdeI/BamHI 위치 내에 복제되었다. 상기 플라스미드는 표 2의 리버스-카스파제-2 프라이머들을 사용하여 PCR증폭되고, 이어서 TF와 유비퀴틴 사이에 위치한 BamHI 부위를 제거한 TF-유비퀴틴 pET21b 발현 시스템의 NdeI/BamHI 위치에 복제되었다.

<실시예 5> Aβ_(1-42) 및 기타 목적단백질들의 정제

Aβ_(1-42) 펩티드는 선행문헌에서 E. coli 내에서 봉입체를 형성하며, 이로부터 정제되는 것으로 보고된바,(Lee 등, Protein Expr. Purif. 40, 183-189) 우리는 Aβ_(1-42) 펩티드를 목적단백질로 하여 초기 시험을 수행하였다. 이를 위하여, Aβ_(1-42) 펩티드를 함유하는 플라스미드 벡터를 설계하고 조립하였다. 구체적으로, TF 및 유비퀴틴과 함께 융합된 Aβ_(1-42)를 융합체로서 과발현시키고, 실시예 1(열안정성 단백질의 동정)에서 기술된 방법을 사용하여 그 세포추출물을 제조하였다.

도 2(A)는 목적단백질의 발현에 사용되는 융합단백질 컨스트럭트의 개념도이다. 여기서, 유비퀴틴 하부의 문자열은 유비퀴틴의 아미노산 서열 일부를 표시한 것이다.

도 2(A)를 참조하면, 상기 플라스미드 벡터는 시험대상으로 선정된 열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 Aβ_(1-42)를 함유한다. 상기 유비퀴틴 시퀀스는 디유비퀴틴 효소 (Usp2-cc)를 이용하여 상기 융합단백질을 선택적으로 쪼갤 수 있도록 도입한 것이다. 상기 4종의 열안정성 단백질들을 각각 함유한 컨스트럭트(construct)들을 개별적으로 대장균 내에서 발현시키고, 과발현 및 용해 특성을 조사하였다. 상기 컨스트럭트가 과발현된 세포의 추출물을 원심분리한 후, 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)에 대한 SDS-PAGE 분석을 수행하여 상기 컨스트럭트가 Aβ_(1-42)에 대해 용해성을 부여해줄 수 있는지 조사하였다.

도 2(B)는 4종의 융합단백질들 각각에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다. 여기서, 좌측의 수치는 상대적 분자량을 나타낸 것이다. 각 단백질에 대한 한 쌍의 레인들은 상기 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)이 동일한 양으로 로딩된 것이며, 화살표는 발현된 융합단백질을 표시한다.

도 2(B)를 참조하면, DnaK 융합체 및 TF 융합체는 형질발현이 잘 이루어지며, 매우 높은 용해성을 보여준다. 그러나 EscN 융합체는 대부분(>70%) 봉입체로서 관찰되었다. MBP 융합체 또한 상당량이 불용성이었다. 따라서 본 연구의 목적에 따른 융합파트너로서 적합한 열안정성 단백질은 DnaK 및 TF임을 알 수 있었다. 다만, DnaK 융합체는 E. coli내에서 너무 높은 수준으로 발현되어, 발현수준의 평가가 다소 어려운 면이 있었다. 이를 고려하여, 상기 2종의 열안정성 단백질들 중 TF를 선택하여 다음 단계의 실험을 진행하였다.

이에 따라, TF를 응집파트너로서 함유한 융합단백질이 생성된 세포의 추출물의 가용성 분획을 Ni-NTA 컬럼 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 넣고 컬럼의 5배 부피의 완충액 A (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 및 1 mM 2-mercaptoethanol)를 사용하여 세정하고, 완충액 B (250 mM imidazole을 가한 완충액 A)를 사용하여 상기 단백질을 용출시켰다.

상기 융합단백질의 피크(peak) 분획들을 구분하여 모아 정량화하고, 2배로 희석하고, 1:100 효소-단백질 몰비로 탈유비퀴틴 효소(deubiquitylating enzyme)인 Usp2-cc (Baker 등, Methods Enzymol. 398, 540-554)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 상기 시료들을 preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC; C₁₈ column, 25 mm × 250 mm × 8 μm; Grace Vydac, Hesperia, CA, USA)로 분리하였다.

Aβ_(1-42)를 정제하기 위하여, 용매 시스템으로서 완충액 C (30 mM ammonium acetate, pH 10.0, 및 2% acetonitrile) 및 완충액 D (70% acetonitrile in water)를 사용하되, 20%-0% 완충액 D의 선형 농도구배의 조건으로 10 mL/분 유량으로 35분에 걸쳐 정제하였다. Aβ_(1-40) 및 Aβ_(42-1)의 정제에 있어서도 전술한 바와 동일한 방법을 사용하였다.

휴마닌(humanin)은 실리카-베이스(silica-based) 컬럼을 사용하고, 완충액 E [0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water] 및 완충액 F (buffer E plus 80% acetonitrile)의 용매시스템을 사용하되, 완충액 F의 5%-60% 선형 그래디언트의 조건으로 40분에 걸쳐 정제하였다. 상기 정제된 단백질들을 100% 1,1,1,3,3,3,-hexafluoro-2-propanol에 용해시키고 질소흐름 하에서 건조시킨 후 30분 동안 진공하에 두었다. 상기 시료들은 -20℃에서 보관되었다. Aβ_(1-42), Aβ_(1-40), 및 Aβ_(42-1) 펩타이드들은 사용 직전에 1 mg/mL 농도로 0.1% NH₄OH에 용해되었고, 10분 소니케이션을 거친 후 인산완충용액 (PBS; 10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 137 mM NaCl, 및 2 mM KCl)에 재분산하였다. 휴마닌은 10% 빙초산에 녹이고, 이어서 PBS 내에서 5회 희석하였다.

TF-유비퀴틴-리버스-카스파제-2를 0.4 mM IPTG를 사용하여 30℃에서 4시간 동안 과발현시켰다. 이어서, 세포들을 용해완충액 B (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM 2-mercaptoethanol)에 넣어 용해시키고 프렌치 압력 셀(French pressure cell)에서 분쇄하고, 47,000×g 의 조건으로 1시간 동안 원심분리하였다. 상기 세포추출물을 Ni-NTA 컬럼에 주입하고, 컬럼부피의 5배의 완충액 G (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 및 1 mM 2-mercaptoethanol)로 세정하고, 완충액 H (buffer G plus 250 mM imidazole)의 선형 농도구배 방법으로 용출하였다. 2회 희석된 융합단백질 분획들을 Usp2-cc을 사용하여 절단하고, 완충액 I (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol, 및 1 mM dithiothreitol) 및 완충액 J (buffer I plus 1 M NaCl)를 사용한 HiTrap Q 컬럼 크로마토그래피 (Amersham Biosciences)로 정제하였다.

구분된 분획들을 투석하여 NaCl을 제거하고, 완충액 K (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol, 및 1 mM dithiothreitol) 및 완충액 L (buffer K plus 1 M NaCl)을 사용하여 HiTrap CM column (Amersham Biosciences)으로 마지막으로 정제하였다. 상기 정제된 효소들은 10 mM NaCl을 가한 완충액 K를 사용하여 투석하고 -80℃에서 보관하였다.

TF-유비퀴틴-Aβ_(1-42) 융합단백질은 4℃에서 1개월 이상 안정한 것으로 나타났다. 상기 융합단백질을 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 통하여 초기정제한 후, 그 분획을 Usp2-cc 로 처리하여 다이제스트(digest)하고, 상기 다이제스트 된 분획을 C₁₈ 역상 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. Aβ_(1-42)의 정제 외에도, Aβ_(1-40), Aβ_(42-1), 및 휴마닌( 24개 아미노산들)을 상기 Aβ_(1-42)의 정제방법과 동일한 방법을 사용하여 정제하였다.

도 3(A)는 Aβ_(1-42) 및 그 융합단백질의 트리신(tricine)-PAGE 분석결과이다. 좌측의 수치는 예상 분자량을 표시한 것이다. 여기서, 레인-1은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피로 정제된 TF-유비퀴틴-Aβ_(1-42) 융합단백질, 레인-2는 Usp2-cc에 의해 다이제스트 된 융합단백질, 레인-3는 C₁₈ 역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된 Aβ_(1-42)에 대한 것이다.

도 3(B)는 Aβ_(1-42)의 정제를 위한 C₁₈ 역상 칼럼 크로마토그래피 용출 프로파일이다.

도 3(A)[레인-3] 및 도 3(B)를 참조하면, Aβ_(1-42)는 단일 피크로 용출되며, PAGE 분석에서 균일한 것으로 나타났다. 이는 MALDI-TOF 질량분광분석에서도 확인되었다. (측정질량 4514.6 Da; 예상질량 4513.8 Da; 데이터 미제시) 박테리아 배양액 1 ℓ 마다 약 6 mg의 펩타이드를 얻을 수 있었다. 이는 선행 문헌(Lee 등, Protein Expr. Purif. 40, 183-189)에서 보고된 것에 비해 수득률이 약 1.5배 높은 것이다.

도 3(C)는 C₁₈ 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제된 Aβ_(42-1), Aβ_(1-40), 및 휴마닌의 트리신 PAGE 분석 결과이다. 여기에 레인-1은 Aβ_(42-1), 레인-2는 Aβ_(1-40), 레인-3는 휴마닌을 나타낸다.

도 3(C)를 참조하면, Aβ_(1-42)의 정제방법과 동일한 방법을 사용하여 Aβ_(1-40), Aβ_(42-1), 및 휴마닌을 효과적으로 정제할 수 있음을 알 수 있다. Aβ_(1-40), Aβ_(42-1), 및 휴마닌의 정제는 1 ℓ의 박테리아 배양액마다 각각 ~8 mg, ~6 mg, 및 ~8 mg을 얻을 수 있었다.

<실시예 6> 본 발명에 따라 제조된 아밀로이드 펩티드들의 생물리적 및 생화학적 특성

아밀로이드 펩타이드는 그 생산방법에 따라 생물리적 특성 및 생화학적 특성이 다를 수 있다.(Dobeli 등, Biotechnology (NY) 13, 988-993) 이를 고려하여, 본 발명에 따른 정제기술을 사용하여 얻은 상기 Aβ_(1-42) 및 Aβ_(1-40) 펩티드들이 선행문헌에 보고된 바와 동일한 생물리적 특성 및 생화학적 특성을 가지는지 조사하였다.

본 발명에 따라 제조된 아밀로이드 펩티드들의 피브릴형성 측정을 위하여, Aβ_(1-42) (20 μM) 및 Aβ_(1-40) (40 μM)을 최종부피 300 μL로 인큐베이션 하였다. 상기 반응물의 20 μL 분취액을 80 μL의 새로 제조된 5 μM thioflavin T (ThT)에 혼합하였다. 형광측정은 여기파장 445 nm 및 방출파장 490 nm을 사용한 microplate spectrofluoremeter (SpectraMax GeminiXS; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하였다.

도 4(A)는 티오플라빈 T (ThT) 바인딩 분석으로 얻어진 Aβ_(1-42) (closed circle) 및 Aβ_(1-40) (open circle)의 시간별 피브릴형성 곡선들을 도시한 것이다. 도 4(A)를 참조하면, 본 발명에 따라 정제된 Aβ_(1-42) 및 Aβ_(1-40)는 모두 ThT 바인딩 분석에서 피브릴형성의 전형적인 곡선을 보여주고 있다.

원편광이색성(CD) 분광분석을 위하여, 20 μM Aβ_(1-42)의 PBS용액을 37℃에서 0시간 또는 24시간 동안 인큐베이션 하였다. CD 스펙트럼은 Jasco J-810 spectropolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan)를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 원자외선(far UV) CD 스펙트럼은 1 mm 광로의 큐벳을 사용하여 190~50 nm 사이에서 0.5 nm 간격으로 기록하였다. 각 시료마다 5회 누적하여 평균하였고, 0.1 nm 분해능, 0.5 s 반응시간, 50 nm/min 스캔속도로 측정하였다.

도 4(B)는 새로이 용해된 Aβ_(1-42) (점선) 및 24시간 동안 응집된 Aβ_(1-42) (실선)의 원편광이색성 스펙트럼들이다. 도 4(B)를 참조하면, 새로이 용해된 Aβ_(1-42)는 랜덤코일 형태, 24시간 동안 응집된 Aβ_(1-42)는 베타-시트 구조가 현저한바, 상기 정제된 펩티드는 생물리적 특성이 보존된 상태임을 알 수 있다.

세포배양 및 세포사멸 분석을 위하여, Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포들을 10% fetal bovine serum 및 1% 항생제를 보충한 Dulbecco's modified Eagle's medium 및 Ham's F12 (1:1) (Jeil Biotech Services, Daegu, Korea)내에서 5% CO₂, 37℃하에서 보관하였다. 상기 세포들은 96-well plates (Nunc, Roskilde, Denmark) 상에 2 × 10⁴ cells/well의 밀도로 분주되어 24시간 동안 배양되었다. 정제된 Aβ_(1-42) 또는 Aβ_(1-40)에 의한 세포사멸 분석은 MTT 환원테스트를 사용하였다. 구체적으로, 20 μL의 5 mg/mL MTT 용액을 96-well plate의 100 μL 배지에 첨가하고, CO₂ 인큐베이터내에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 100 μL의 20% SDS 용액 (용매: 50% (4,5-dimethylthiazol-2yl) 2,5-diphenyl-tetarzolium bromide (MTT) 및 N,N-dimethylformamide)를 첨가하였다. 16시간 동안 배양한 후, microplate reader (SpectraMax 190 Spectrophotometer; Molecular Devices)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 기록하였다.

도 4(C)는 SH-SY5Y 세포에 대한 Aβ_(1-42) (close bar) 및 Aβ_(1-40) (open bar)의 농도에 따른 독성을 나타내는 MTT 분석결과를 도시한 것이다. 에러 바는 독립적인 3회의 실험들로부터 얻어진 평균값의 표준편차를 의미한다.

본 발명에 따라 제조된 아밀로이드 펩티드의 DEVDase (caspase-3/7-유사)의 활성을 측정하기 위하여, 적절히 처리된 세포들을 ice-cold PBS로 2회 세정하였다. 이어서 40 μL 세포용해 완충액 C (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethanesulphonylfluoride, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL pepstatin A, 2 μg/mL aprotinin, 및 25 μg/mL ALLN)를 각 웰(well)에 첨가하고 얼음상에서 20분 동안 배양하였다. 효소 활성 분석은 100 μL 카스파제 분석 완충액 (10 mM HEPES-KOH, pH 7.0, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 및 10 mM dithiothreitol)내에서 10 μM의 N-아세틸 Asp-Glu-Val-Asp-아미노메틸 쿠마린 (Ac-DEVD-AMC)을 기질로 사용하여 30℃에서 수행되었다.

도 4(D)는 기질로서 10 μM DEVD-AMC를 사용하고, 20 μM Aβ_(1-42) (closed circle), 20 μM Aβ_(1-40) (open circle)에 의해 처리된 세포의 DEVDase (카스파제-3/7-유사) 활성을 상대적 형광세기 값으로 도표화한 것이다. 대조군으로서, 비처리된 세포(thin line)를 대비하였다.

도 4(C) 및 도 4(D)를 참조하면, 본 발명에 따라 정제된 Aβ_(1-42) 또는 Aβ_(1-40) 펩티드에 의해 처리된 SH-SY5Y 세포의 경우, 상기 펩티드의 농도증가에 따른 세포독성의 증가가 세포생존률의 현저한 감소로서 관찰되거나, 시간에 따른 카스파제-3 활성의 증가로서 현저히 관찰되는바, 상기 펩티드들 모두 생리활성을 보존하고 있음이 확인되었다.

<실시예 7> 기타 단백질의 정제를 위한 플라스미드 벡터의 응용

전술한 상기 플라스미드 벡터 시스템은 E. coli 내에서 발현될때 봉입체를 형성하는 다른 단백질의 정제에도 응용될 수 있다. 예컨대, 카스파제-2의 리버스 형태인 리버스-카스파제-2를 구조적으로 활성화된 형태로 생산하기 위해서는 상기 펩타이드는 작은 서브유닛에 이어 큰 서브유닛이 뒤따르는 형태로서 형성되어야 하는바, 종래기술에 따른 정제방법을 따를 경우 이러한 형태로 상기 펩타이드를 생산하는 데는 어려움이 있다.

도 5(A)는 리버스-카스파제-2가 과발현된 E. coli의 세포추출물의 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다. 좌측의 수치는 상대적 분자량을 표시한다. 도 5(A)를 참조하면, 통산적인 E. coli 발현시스템에서 리버스-카스파제-3 효소는 봉입체로서 누적됨을 알 수 있다.

상기 봉입체로부터 가용성의 활성 효소를 회수하기 위한 시도로서 이를 우레아에 녹이고 투석에 의한 재접힘을 시도했으나, 적은 양의 가용성 단백질을 얻었을 뿐이며, 이는 촉매역할에서 비활성이었다. 종래 제조방법에 따르는 상기 문제점을 극복하기 위하여, 우리는 TF-유비퀴틴-리버스카스파제-2를 조립하고, 이를 사용하여 생리활성을 갖는 리버스-카스파제-2을 제조하고자 하였다.

도 5(B)는 TF-유비퀴틴-리버스-카스파제-2를 과발현시킨 E. coli의 세포추출물의 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다. 도 5(B)를 참조하면, 상기 융합단백질은 가용성 형태를 가지며 성공적으로 발현되었음을 알 수 있다.

도 5(C)는 상기 TF-유비퀴틴-리버스카스파제-2의 가용성 분획에 대한 정제과정을 보여주는 SDS-PAGE 분석결과이다. 여기서, 레인-1은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피로 정제된 TF-유비퀴틴-리버스카스파제-2, 레인-2는 Usp2-cc로 다이제스트된 융합단백질, 레인-3는 카르복시메틸(CM) 컬럼 크로마토그래피로 정제된 리버스카스파제-2이다. A, B, 및 C의 화살표들은 각각 불용성 리버스-카스파제-2, 가용성 UF-유비퀴틴-리버스-카스파제-2, 및 정제된 리버스-카스파제-2를 표시한다.

도 5(C)의 분석결과에 따른 상기 정제과정을 거쳐 1 L의 박테리아 배양으로부터 0.3 mg의 활성 리버스-카스파제-2가 얻어졌다.

본 발명에 따라 제조된 리버스-카스파제-2의 효소 활성은 10 μM의 N-아세틸 Val-Asp-Val-Ala-Asp-아미노메틸 쿠마린 (Ac-VDVAD-AMC)을 사용하여 조사하였다. 형광측정을 위해 여기파장 360 nm 및 방출파장 480 nm의 조건으로 SpectraMax GeminiXS를 사용하였다.

도 5(D)는 정제된 리버스-카스파제-2 (100 ng, open circle) 및 노말(normal) 카스파제-2 (100 ng, closed circle)의 VDVADase 활성분석결과이다. 여기서, 10 μM VDVAD-AMC을 기질로서 사용하였다.

도 5(D)를 참조하면, 상기 정제된 효소의 활성은 통상의 정제시스템을 사용하여 가용성 분획으로 회수된 노말(normal) 카스파제-2의 활성에 필적하는바, 본 발명의 정제시스템에 의해 정제된 목적단백질은 변성에 따른 활성감소를 겪지 않았음을 보여주고 있다.

도 1(A)는 대장균으로부터 얻은 열안정성 단백질들의 2차원 PAGE 분석결과이다.

도 1(B)는 대장균 내에 과발현된 10종의 단백질들에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 2(A)는 목적단백질의 수용성 발현에 사용되는 융합단백질 구조체의 개념도이다.

도 2(B)는 4종의 융합단백질들 각각에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 3(A)는 Aβ_(1-42) 및 그 융합단백질의 트리신(tricine) PAGE 분석결과이다.

도 4(A)는 티오플라빈 T (ThT) 바인딩 분석으로 얻어진 Aβ_(1-42) (closed circle) 및 Aβ_(1-40) (open circle)의 시간별 피브릴형성 곡선들을 도시한 것이다.

도 4(B)는 새로이 용해된 Aβ_(1-42) (점선) 및 24시간 동안 응집된 Aβ_(1-42) (실선)의 원편광이색성 스펙트럼들이다.

도 4(C)는 SH-SY5Y 세포에 대한 Aβ_(1-42) (close bar) 및 Aβ_(1-40) (open bar)의 농도에 따른 독성을 나타내는 MTT 분석결과를 도시한 것이다.

도 4(D)는 기질로서 10 μM DEVD-AMC를 사용하고, 20 μM Aβ_(1-42) (closed circle), 20 μM Aβ_(1-40) (open circle)에 의해 처리된 세포의 DEVDase (카스파제-3/7-유사) 활성을 상대적 형광세기 값으로 도표화한 것이다.

도 5(A)는 리버스-카스파제-2가 과발현된 E. coli의 세포추출물의 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 5(B)는 TF-유비퀴틴-리버스카스파제-2를 과발현시킨 E. coli의 세포추출물의 가용성 분획(S) 및 불용성 분획(P)에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 5(C)는 상기 TF-유비퀴틴-리버스카스파제-2의 가용성 분획에 대한 정제과정을 보여주는 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 5(D)는 정제된 리버스-카스파제-2 (100 ng, open circle) 및 노말(normal) 카스파제-2 (100 ng, closed circle)의 VDVADase 활성분석결과이다.

<110> PARK, IL-SUN <120> FUSION PROTEIN CONTAINING THERMO-STABLE PROTEIN AND ITS USE FOR PROTEIN <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gaattccata tgggtaaaat aattggtatc 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gaagaagtca aagacaaaaa aggatcccg 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ggaattccat atgcaagttt cagttgaaac 30 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gagctgatga accagcaggc gggatcccg 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ggaattccat atgaaaataa aaacaggtg 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cgcagactcg tatcaccaag gtggatcccg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 ggaattccat atgaacatga aaaaactggc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> 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primer <400> 32 gagtcaatct gcttcgaagc gatggtctga tccatattca acatg 45 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 ccgctcgagt caatctgctt cgaa 24 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 cgcggatccc agatctttgt gaagac 26 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 aaaaccacgc ggcgccattc caccgcggag gcgcaa 36 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 atcaatttca ccggtcagca gcagcaggca gctaaaacca cgcggcgcca 50 <210> 37 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 37 ccgctccagt cacgcacgac gtttcaccgg cagatcaatt tcaccggtca 50 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 38 ggattccata tggccggtaa gaaaagttg 29 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 cggatcctgt gggagggtgt cctgg 25 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 cggatccggt cctgtctgcc ttcaag 26 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 41 gcgttttttg cggccatctt gttggtcaac ccc 33 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 42 gaattccata tgcaagtttc agttgaaac 29 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 cgcggatcca ccgcggaggc gcaacaacag 30

Claims

열안정성 단백질, 유비퀴틴, 및 목적단백질을 포함하는 융합단백질로서, 상기 열안정성 단백질은 TF(trigger factor) 또는 DnaK인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1 항의 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
제 2 항의 DNA를 포함하는 발현벡터.
제 3 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 4 항의 대장균을 배양하고,

상기 배양된 대장균으로부터 수득된 상기 융합단백질을 디유비퀴틴 효소(deubiquitylating enzyme; Usp2-cc)로 절단하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법.
제 5 항의 방법에 의해 제조된 목적단백질.