WO2021192641A1 - ターゲットの分析キットおよびそれを用いた分析方法 - Google Patents

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WO2021192641A1
WO2021192641A1 PCT/JP2021/003906 JP2021003906W WO2021192641A1 WO 2021192641 A1 WO2021192641 A1 WO 2021192641A1 JP 2021003906 W JP2021003906 W JP 2021003906W WO 2021192641 A1 WO2021192641 A1 WO 2021192641A1
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mss
film
binding substance
target
membrane
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PCT/JP2021/003906
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賢司 宮崎
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日本電気株式会社
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
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    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
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    • G01L—MEASURING FORCE, STRESS, TORQUE, WORK, MECHANICAL POWER, MECHANICAL EFFICIENCY, OR FLUID PRESSURE
    • G01L1/00—Measuring force or stress, in general
    • G01L1/18—Measuring force or stress, in general using properties of piezo-resistive materials, i.e. materials of which the ohmic resistance varies according to changes in magnitude or direction of force applied to the material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N19/00—Investigating materials by mechanical methods

Definitions

  • the present invention relates to a target analysis kit and an analysis method using the same.
  • Target detection is important in a wide variety of fields such as food and medical care, and various methods have been proposed.
  • a film-type surface stress sensor has attracted attention (see Patent Document 1).
  • the film-type surface stress sensor can analyze the presence or absence and amount of a target by deforming the film by binding the target to a film such as a silicon film and measuring the fluctuation of electrical resistance due to the deformation. ..
  • the method of binding the target to the membrane is required to be further improved from the viewpoint of, for example, improvement of analysis accuracy and expansion of the applicable target.
  • the present inventor implants a film-type surface stress sensor (hereinafter referred to as “MSS”), which takes a new form for binding the target, specifically, an aptamer capable of binding to the target on the surface thereof.
  • MSS film-type surface stress sensor
  • the target when a target is present in the contacted sample liquid, the target binds to the aptamer to form a complex, so that the stress on the membrane of the MSS is relative to that of the MSS not bound to the target.
  • the strain of the film becomes large. Therefore, in the MSS, by applying a voltage to the MSS and measuring the resistance value, the coupling of the target can be measured as a change in the resistance value, that is, an electric signal. Therefore, according to the MSS, the target in the sample liquid can be analyzed.
  • an object of the present invention is to provide an analysis kit containing an MSS capable of obtaining a stronger electrical signal as compared with an MSS in which a binding substance that can bind to a target is immobilized.
  • the target analysis kit of the present invention includes a first binding substance that binds to the target and a film-type surface stress sensor.
  • the film-type surface stress sensor includes a second binding substance, a film, and a sensor substrate.
  • the second binding substance binds to the target and is immobilized on the membrane.
  • the membrane is a membrane that is deformed by the binding of the target to the second binding substance.
  • the sensor substrate has a support area and has a support area.
  • the support region supports the film and has a piezoresistive element.
  • the piezoresistive element is an element that detects deformation of the film.
  • a sample solution is brought into contact with the analysis kit of the present invention, and the target in the sample solution, the first binding substance, and the first A complex forming step of forming a complex with the binding substance of 2 and An application step of applying a voltage to the film-type surface stress sensor in the liquid phase, and It includes an analysis step of analyzing a target in the sample liquid by measuring a stress change of the piezoresistive element in the film type surface stress sensor.
  • a stronger electrical signal can be obtained as compared with MSS in which a binding substance that can bind to a target is immobilized.
  • FIG. 1 is a diagram showing a mechanism by which the signal of MSS is enhanced in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a general configuration of the MSS.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the structure of the MSS in Reference Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the voltage of MSS in Reference Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the voltage of MSS in Example 1.
  • the "Membrane-type Surface-stress Sensor” is also referred to as an MSS.
  • MSS a film having a binding property to a target is supported by a support having a piezoresistive element. Then, when the target is bound to the film, the film is stressed by the binding, and the film is deformed (strain is generated) due to the occurrence of strain or the like, and the amount of deformation of the film. A stress is generated in the piezoresistive element of the support that supports the film, and the resistance value of the piezoresistive element changes in proportion to the stress.
  • the MSS sensor By applying a voltage to the MSS and measuring the electric signal accompanying the change in the resistance value, it is possible to indirectly qualitatively analyze the presence or absence of the target bound to the film. Further, according to the MSS sensor. , The amount of the target bound to the membrane can be quantitatively analyzed by applying a voltage to the MSS and measuring the electric signal accompanying the change in the resistance value.
  • the present invention can quantitatively analyze the target in such an MSS.
  • a second binding material that binds to specifically, by immobilizing the second binding material on the membrane, the target is bound to the MSS via the second binding material. Therefore, in the MSS of the present invention, other configurations are not particularly limited except for immobilizing the second binding substance on the membrane, and existing configurations can be used, and in the future, the same functions can be obtained. It can also be used for the configuration of.
  • the target is not particularly limited and can be set arbitrarily.
  • the target may be, for example, a substance that can come into contact with the first binding substance and the second binding substance in a liquid, that is, in a liquid phase.
  • the target has, for example, a region to which the binding substance binds, i.e., one or more epitopes of the binding substance.
  • the target has, for example, one or more epitopes of the first binding substance, and the epitope of the second binding substance. It has one or more epitopes.
  • the target is an epitope of the first binding substance and the second binding substance.
  • the partial overlap means, for example, a state in which a part of the recognition site of the first binding substance and a part of the recognition site of the second binding substance overlap in the target.
  • the epitope of the first binding substance and the epitope of the second binding substance do not conflict with each other in the binding of the first binding substance and the second binding substance to the target. It is desirable to set.
  • the competition is that, for example, the binding of the first binding substance to the target partially or completely inhibits the binding of the second binding substance to the target, and / or the second binding. It means that the binding of the substance to the target partially or completely inhibits the binding of the first binding substance to the target.
  • the competition is, for example, in the presence of the first binding substance and the second binding substance on a plate in which the first binding substance and the second binding substance are labeled and the target is immobilized.
  • examples of the target include microorganisms including bacteria such as anthrax, Escherichia coli, salmonella, and Escherichia coli; viruses such as influenza virus; allergens; and the like.
  • examples of the allergen include grains such as wheat; eggs; meat; fish; shellfish; vegetables; fruits; milk; beans such as peanuts; pollen such as sugi and cypress.
  • the type of the target is not particularly limited, and examples thereof include high molecular weight compounds such as proteins, sugar chains, nucleic acids, and polymers; low molecular weight compounds; and the like.
  • the target When the target is a microorganism, a virus, or an allergen, the target generally has a plurality of the same structures such as the same protein, lipid, nucleic acid, etc., so that the target is, for example, the first binding substance. And / or it can be said that it has a plurality of epitopes of the second binding substance.
  • the target when the target is a monomer of a protein, a sugar chain, or a nucleic acid, the target has, for example, the first binding substance and / or the second binding substance because it has one identical structure. It can be said that it has one epitope of.
  • the "binding substance” may be a substance that can bind to the target, that is, a binding substance.
  • the binding substance include antibodies, aptamers and the like.
  • the target is a receptor or a ligand thereof
  • the binding agent may be a ligand or a receptor, respectively.
  • the receptor may be a fusion protein with the Fc region of immunoglobulin, that is, a receptor-Fc fusion protein, preferably with the Fc region of an IgG protein. Fusion protein, that is, receptor-IgG Fc.
  • the Fc fusion protein can be prepared, for example, by linking the C-terminal amino acid of the receptor directly or via a linker to the N-terminal amino acid of the CL region or CH1 region of an immunoglobulin.
  • the "antibody” can also be said to be a soluble immunoglobulin having a binding property to a target.
  • the type of antibody include IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM.
  • IgA include IgA1 and IgA2.
  • IgG includes, for example, IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.
  • the antibody may be an antigen-binding fragment thereof, that is, a partial peptide of the antibody having binding property to the target.
  • the antigen-binding fragment is, for example, a polypeptide containing a part of the antibody, more specifically, a binding region or a variable region of the antibody.
  • the antigen-binding fragment includes, for example, Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv fragment, rIgG (semi-IgG) fragment, single-chain antibody (scFv), and bivariable domain antibody (DVD-Ig TM).
  • Diabody triabody, tetrabody, tandab, flexibody, which is a combination of scFv and diabody, tandem scFv (eg, BiTE (eg, BiTE) R), Micromet Co.), DART (TM) (MacroGenics Co.), Fcab (TM) or mAb 2 (TM) (F-star Inc.), Fc engineering antibodies (Xencor, Inc.) or DuoBody (R) (Genmab Company) etc.
  • the antibody a known antibody having binding property to the target or an antigen-binding fragment thereof may be used, or a new antibody or an antigen-binding fragment thereof obtained by immunizing an animal or the like with the target may be used. good.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody may be a blood-derived fraction such as serum or plasma containing an antibody capable of binding to a target.
  • the "aptamer” is a nucleic acid molecule having binding property to a target.
  • the aptamer can also be, for example, a nucleic acid molecule that specifically binds to a target.
  • the building blocks of the aptamer are, for example, nucleotide residues and non-nucleotide residues. Examples of the nucleotide residue include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue, and the nucleotide residue may be modified or unmodified, for example.
  • the aptamer examples include a DNA aptamer composed of a deoxyribonucleotide residue, an RNA aptamer composed of a ribonucleotide residue, an aptamer containing both, an aptamer containing a modified nucleotide residue, and the like.
  • the length of the aptamer is not particularly limited, and is, for example, 10 to 200 bases.
  • an existing aptamer may be used, or, depending on the target, for example, a newly acquired aptamer using the SELEX method or the like may be used.
  • binding or “bondable” may mean that the binding substance of interest actually binds to the binding object (target) bound to the binding substance. It may mean binding in a simulation using a molecular docking method or the like, but the former is preferable.
  • the binding between the binding substance and the binding target can be detected by using, for example, an analysis method of protein-protein interaction, and for example, an antibody antigen reaction such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, ELISA method, or flow cytometry can be performed. It can be detected using the method used.
  • the binding between the binding substance and the binding target is detected, for example, by contacting the cell expressing the binding target with the labeled binding substance and then detecting the label in the cell. can.
  • the first binding substance is preferably an aptamer or an antibody.
  • the second binding substance is preferably an aptamer or an antibody.
  • the epitope of the first binding substance and the second binding substance can be appropriately set based on the type of the target and its structure.
  • the epitopes of the first binding substance and the second binding substance may be the same or different.
  • the epitopes of the first binding substance and the second binding substance can be set to the same epitope, for example.
  • the epitopes of the first binding substance and the second binding substance can be set to different epitopes, for example.
  • the first binding substance may be contained separately from the MSS, or may be arranged on the membrane of the MSS, for example.
  • the first binding substance may be labeled.
  • the label is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes, and enzymes.
  • the fluorescent substance include fluorescent groups such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, and TYE.
  • Alexa dyes such as Alexa 488 and Alexa 647.
  • the enzyme include luciferase, alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, glucuronidase and the like.
  • the weight of the first binding substance is increased by being labeled, the combination of the second binding substance and the target is compared with the case where the unlabeled first binding substance is used.
  • the weight of the complex during body formation can be increased.
  • the stress of the MSS on the film increases relatively, and the strain increases.
  • the signal detected when a voltage is applied to the MSS can be further enhanced.
  • the first binding substance is preferably immobilized on a carrier.
  • the carrier include beads, particles and the like.
  • the material of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include metal and plastic.
  • the carrier may be, for example, polystyrene beads or particles, silica beads or particles, agarose beads or particles, glass beads or particles, acrylic resin beads or particles, polyvinyl alcohol resin beads or particles, polycarbonate. Examples include beads or particles.
  • the carrier may be magnetic beads.
  • the size of the label and the carrier may be, for example, a size that allows the labeled first binding substance and the first binding substance immobilized on the carrier to diffuse in the liquid phase.
  • the size of the label and the carrier is, for example, 1 nm to 100 ⁇ m and 10 nm to 100 ⁇ m.
  • the weight of the label and the carrier is preferably heavier than, for example, the target.
  • the present invention can further enhance the signal detected when a voltage is applied to the MSS.
  • the label and carrier are bound to, for example, at least one of the 5'end and the 3'end of the nucleic acid.
  • the first binding substance is a protein
  • the label and carrier are bound, for example, to the N-terminus, C-terminus, or side chain of the protein.
  • the label and carrier are, for example, directly or indirectly bound to the first binding substance.
  • the label and carrier are bound via a linker.
  • the analysis kit of the present invention may further include a buffer solution, an instruction manual, and the like.
  • the first binding substance and the MSS may be contained separately or collectively.
  • the first binding material may be located, for example, on the MSS membrane of the MSS.
  • the "sample liquid” may be a liquid.
  • the sample to be collected is a liquid, it may be used as it is as a liquid sample, or it may be a liquid sample prepared by diluting, suspending, dispersing or the like with a liquid solvent.
  • a liquid sample prepared by dissolving, suspending, dispersing, etc. with a liquid solvent may be used.
  • the collected sample is a gas, for example, it may be a liquid sample in which the aerosol in the gas is concentrated, or a liquid sample prepared by dissolving, suspending, dispersing, etc. with a liquid solvent.
  • the type of the liquid solvent is not particularly limited, and is, for example, a solvent that does not easily affect the binding between the first binding substance and the second binding substance and the target, and specific examples thereof include water and a buffer solution. And so on.
  • Examples of the collected sample include food, blood, urine, saliva, body fluid, soil, wastewater, tap water, pond, river, air and the like.
  • the sample liquid may be, for example, a liquid containing a target, a liquid not containing a target, or a liquid in which it is unknown whether or not the sample liquid contains a target.
  • analysis of the present invention only uses MSS in which a binding substance (second binding substance) that can be bound to the target is immobilized.
  • An estimation mechanism for obtaining a stronger electrical signal as compared with the analysis used (hereinafter referred to as “analysis of reference examples”) will be described with reference to FIG.
  • the present invention is not limited to the following estimation mechanism.
  • an aptamer is used as the second binding substance
  • another binding substance such as an antibody is also targeted as the second binding substance by the same mechanism. It is presumed that a stronger electrical signal can be obtained as compared with the analysis using only MSS in which the binding substance that can bind to is immobilized.
  • the MSS 100 having the MSS film 13 (hereinafter referred to as “MSS film”) on which the aptamer 15 (second binding substance) is immobilized is used.
  • MSS film the MSS 100 having the MSS film 13 (hereinafter referred to as “MSS film”) on which the aptamer 15 (second binding substance) is immobilized is used.
  • FIG. 1 (B) a sample solution containing the target 16 is dropped onto the MSS film 13.
  • the aptamer 15 can bind to the target 16, it forms the first complex as shown in FIG. 1 (C).
  • the weight of the target 16 is loaded onto the MSS membrane 13 via the aptamer 15.
  • stress is applied to the MSS film 13 and strain is generated.
  • the signal caused by the distortion generated during the transition from FIG. 1 (B) to FIG. 1 (C) is detected.
  • aptamer 17 (first binding substance) is further added dropwise to the MSS film 13 of FIG. 1 (C). Then, since the aptamer 17 can bind to the first complex of the aptamer 15 and the target 16, as shown in FIG. 1 (E), the aptamer 17 forms a complex of the aptamer 15 and the target 16 and the aptamer 17. .. Further, as the complex is formed, the weight of the aptamer 17 is loaded on the MSS membrane 13 via the first complex of the aptamer 15 and the target 16. As a result, as shown in FIG. 1 (E), further stress is applied to the MSS film 13, and further strain is generated. Then, in the analysis of the present invention, a signal caused by the distortion generated at the transition from FIG. 1 (B) to FIG. 1 (E) is detected.
  • the analysis of the present invention detects a larger strain of the MSS film 13 as compared with the analysis of the reference example. Therefore, it is presumed that the analysis of the present invention can further enhance the signal detected when a voltage is applied to the MSS100 as compared with the analysis of the reference example.
  • FIG. 1 from FIG. 1 (B), an example in which a voltage is applied to the MSS 100 to detect a signal has been described, but the present invention is not limited to this, and for example, FIG. 1 (D). Therefore, a voltage may be applied to the MSS 100 to detect a signal.
  • the aptamer 17 is preferably immobilized on a carrier heavier than the target 16.
  • the formation of the complex is carried out in two steps, in which the first complex of the aptamer 15 and the target 16 is formed, and then the first complex and the aptamer 17 form the complex again.
  • the complex may be formed in a one-step forming step.
  • the MSS of the present embodiment includes an aptamer, a membrane, and a sensor substrate.
  • the aptamer is a nucleic acid molecule that binds to a target and is immobilized on the membrane, and the membrane is the aptamer.
  • a film that is deformed by the coupling of the target to, the sensor substrate has a support region, the support region supports the film, has a piezo resistance element, and the piezo resistance element is the film. It is characterized in that it is an element that detects deformation of.
  • the film is also referred to as an MSS film.
  • the MSS film is not particularly limited as long as it is deformed by the coupling of the target and stress is applied to the piezoresistive element by the deformation.
  • the film is, for example, a thin film, and the thickness thereof and the area of each surface are not particularly limited, and are the same as, for example, the MSS film used in a commercially available MSS.
  • the planar shape of the film is, for example, a circle, and specifically, for example, a perfect circle.
  • the material of the film is not particularly limited, and is, for example, a silicon film, and specific examples thereof include n-type Si (100).
  • the aptamer is immobilized on the MSS film.
  • the aptamer may be immobilized on one surface of the MSS film, or may be immobilized on both surfaces, for example.
  • the aptamer on one surface and the aptamer on the other surface are, for example, the same aptamer that binds to the same target.
  • the surface of the MSS film may be, for example, one surface or both sides.
  • the method for immobilizing the aptamer on the MSS film is not particularly limited, and the aptamer may be directly immobilized on the MSS film or indirectly immobilized on the MSS film. In the former case, for example, by chemically treating the MSS membrane and the aptamer, it can be immobilized by a covalent bond or the like.
  • the direct fixing method for example, a method using photolithography can be mentioned, and as a specific example, US Pat. No. 5,424,186 and the like can be referred to.
  • a method of synthesizing the sensor on the MSS film can be mentioned. Examples of this method include the so-called spot method, and as a specific example, US Pat. No.
  • the aptamer can be immobilized on the MSS membrane via a linker.
  • the type of the linker is not limited in any way, and examples thereof include a combination of biotin or a biotin derivative (hereinafter referred to as biotins) and avidin or an avidin derivative (hereinafter referred to as avidins).
  • biotins include, for example, biocithin
  • avidin derivative includes, for example, streptavidin.
  • the length of the linker is, for example, the length of the shortest molecular chain (main chain length) from the functional group on the MSS film (for example, the oxygen atom of the silanol group on the silicon film) to the affinity tag such as avidin or the aptamer. ) Can be expressed.
  • the main chain length of the linker is 1 to 20, and the sensitivity of MSS can be improved. Therefore, preferably 1 to 15, 1 to 13, 3 to 13, 5 to 13, 1 to 11, 3 to 11, 1 ⁇ 10, 3 ⁇ 10, 1 ⁇ 8, 3 ⁇ 8, 1 ⁇ 5, 1 ⁇ 3, 1 or 2.
  • the immobilization method will be illustrated below, but the present invention is not limited thereto.
  • the biotins are bound to either the MSS membrane or the aptamer, and the avidins are bound to the other. Then, by binding the biotins and the avidins, the aptamer can be indirectly immobilized on the MSS membrane.
  • the aptamer was indirectly fixed to the MSS membrane by utilizing the specific binding between avidins and biotins, that is, the affinity of biotins to avidins.
  • affinity tags other than avidins-biotins may be used.
  • the affinity tag include His tag (His ⁇ 6 tag) -nickel ion, glutathione-S-transferase-glutathione, maltose-binding protein-maltose, epitope tag (myc tag, FLAG tag, HA (hemaglutinin) tag)-.
  • Antibodies or antigen binding fragments are available. The point that other affinity tags may be used is the same in the second to fourth examples described later.
  • the aptamer may be immobilized on the MSS membrane, for example, via an intervening membrane.
  • the intervening membrane is formed on the MSS membrane, and the biotins are bound to either the intervening membrane or the aptamer, and the avidins are bound to the other, as in the first example.
  • the intervening film is, for example, a film of a metal such as gold, and can be formed by depositing the metal on the MSS film.
  • the thickness of the intervening membrane is not particularly limited, and is, for example, 10 to 100 nm.
  • the intervening membrane may be, for example, one layer or two or more layers.
  • the intervening film is formed into, for example, two layers, and a metal film (adhesive film) for adhesion is provided with respect to the MSS film from the viewpoint of improving the adhesiveness of the gold film. It is preferable to form the gold film through the film.
  • the metal of the adhesive film include titanium and chromium.
  • the thickness of the adhesive film is, for example, 0.1 to 10 nm, and the thickness of the gold film is, for example, 0.1 to 100 nm.
  • a self-assembled monolayers (SAM) of thiolalkane is formed on the surface of the intervening membrane by using a thiolalkane to which the biotins are bound.
  • SAM self-assembled monolayers
  • the aptamer that is formed and bound to the biotins may be brought into contact with the aptamer, and the aptamer may be immobilized by binding the biotins to the avidins.
  • a method of binding the streptavidins by binding an amino group to the MSS membrane and further binding glutaraldehyde That is, a silane coupling agent having an amino group is reacted with the MSS film, and an amino group is bonded onto the MSS film.
  • the reaction can be carried out, for example, by applying a solution containing a silane coupling agent having an amino group to the MSS membrane.
  • a cross-linking agent capable of binding an amino group to the main chain or side chain of an amino acid to the MSS film, or a linker between the amino group and the main chain or side chain of the amino acid to the MSS film.
  • a cross-linking agent such as glutaraldehyde, which can form the above, and one end of the cross-linking agent such as glutaraldehyde is bonded to the amino group on the MSS film.
  • a cross-linking agent such as glutaraldehyde
  • glutaraldehyde which can form the above
  • one end of the cross-linking agent such as glutaraldehyde is bonded to the amino group on the MSS film.
  • the surface of the MSS film after silane coupling is washed, a solution containing a cross-linking agent is applied to the MSS film, and the amino group and the cross-linking agent are bonded.
  • the conditions of the cross-linking reaction can be appropriately determined, for example, depending on the type of the cross-linking agent.
  • the avidins are bound to the other end of the cross-linking agent such as glutaraldehyde.
  • the surface of the crosslinked MSS membrane is washed, a solution containing avidins is applied, and the other end of the crosslinking agent is bound to the main chain or side chain of the amino acids of the avidins. Then, the biotin-bound aptamer is brought into contact with the MSS membrane thus treated, and the aptamer can be immobilized by binding the biotins and the avidins.
  • the silane coupling agent is represented by, for example, Y—Si (CH 3 ) 3-n (OR) n .
  • n, R, and Y include, for example, the following examples.
  • the "n" is 2 or 3.
  • R include an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group; an acyl group such as an acetyl group and a propyl group; and the like.
  • Y is a reactive functional group having an amino group at the end.
  • silane coupling agent having an amino group examples include N- (2-aminoethyl) -3-aminopropylmethyldimethoxysilane (for example, KBM-602 (manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd.)) and N- (2-aminoethyl).
  • the cross-linking agent can be appropriately determined depending on the functional group of the main chain or side chain of the amino acid to be bound to the linker.
  • the functional group include an amino group (-NH 2 ), a thiol group (-SH), a carboxyl group (-COOH) and the like.
  • the amino group is contained, for example, in the N-terminal of a protein or peptide or in the side chain of lysine.
  • the thiol group is contained in, for example, the side chain of cysteine.
  • the carboxyl group is contained, for example, in the C-terminal of a protein or peptide or in the side chain of aspartic acid or glutamic acid.
  • the cross-linking agent includes, for example, a cross-linking agent having an aldehyde group such as glutaaldehyde at both ends; bis (sulfosuccinimidyl) sverate (BS3), Discusin imidazole glutarate (DSG), dysuccinimidyl sverate (DSS), dithiobis (succinimidyl propionate), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (succinimidyl propionate) (DTSP) , Dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), dissuccinimidyl tartrate (DST), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (ESG), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) ) (Sulfosuccinimidyl) ) (Sulfos
  • examples of the cross-linking agent include N- (6-maleimide caproyloxy) succinimide (EMCS) and N- (6-maleimide caproyloxy) sulfosuccinimide (Sulfo).
  • N-EMCS N- (8-maleimidoacet-oxysuccinimide ester (AMAS), N- ⁇ -maleimidopropyl-oxysuccinimideester (BMPS), N- ⁇ -maleimidobutyryl-oxysuccinimideester (GMBS), N- ⁇ -maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimideester (Sulfo-GMBS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester (MBS), mmal -N-hydroxysulfosuccinimideester (Sulfo-MBS), succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), succinimidyl 4- (p-maleimidopheny
  • N-hydroxysuccinimide such as succinimidyl iodoacetate (SIA), succinimidyl 3- (bromoacetamido) propionate (SBAP), succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (Sulfo-SIAB)
  • a cross-linking agent having an active ester and a haloacetyl reactive group at both ends; succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl 6- (3 (2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate (LC-SPDP), succinimidyl 6- (3 (2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP), 4-succinimidyloxycarbonyl
  • examples of the cross-linking agent include Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), and N-hydroxysuccinimide (NHS). ), N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), acetic anhydride and the like. Since DCC, EDC, NHS, Sulfo-NHS, and anhydrous acetic acid directly bond an amino group and a carboxyl group, for example, they do not remain between the carboxyl group and the amino group, and the linker region derived from the cross-linking agent is used. (Group) does not occur.
  • DCC Dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Sulfo-NHS N-hydroxysulfosuccinimi
  • the cross-linking agent is preferably a cross-linking agent in which self-condensation does not substantially occur because the length of the linker can be made substantially constant or constant.
  • Constant linker length means that, for example, in a plurality of aptamer linkers, the linker length of each aptamer is substantially the same or the same.
  • the length of the linker can be achieved, for example, by making the structure of the linker the same.
  • the sensitivity of MSS can be improved by using such a cross-linking agent. The improvement in sensitivity is presumed to be due to the following reasons.
  • the present invention is not limited to the following estimation.
  • a target When a target binds to an aptamer, a steric obstacle due to the target occurs around the aptamer bound to the target. If the aptamer is immobilized at different distances to the MSS membrane, the target is likely to come into contact with the aptamer located distal to the MSS membrane. Therefore, it is presumed that the target preferentially binds to the aptamer distal to the MSS membrane. In this case, even if a steric disorder caused by the target occurs around the aptamer to which the target is bound, other aptamers are present on the MSS film side as compared with the aptamer to which the target is bound. Since there are many, it is difficult to receive a three-dimensional obstacle caused by the target.
  • the target binds to the aptamer, it is unlikely that the surrounding aptamer will move due to the influence of the steric obstacle. Therefore, when the aptamer is immobilized at different distances with respect to the MSS film, the possibility that the MSS film is distorted due to the movement of the position of the surrounding aptamer on the MSS film is also relative. Low. On the other hand, when the aptamer is immobilized at substantially the same distance to the MSS membrane, when the target binds to the aptamer, the surrounding aptamer is affected by the steric damage caused by the target.
  • the position of the surrounding aptamer will move, and there is a relatively high possibility that the MSS film will be distorted due to the movement of the position of the surrounding aptamer. That is, when the aptamer is immobilized at substantially the same distance with respect to the MSS membrane, the position of the surrounding aptamer also moves on the MSS membrane due to the binding of one aptamer and the target. The strain of the MSS film will be amplified. Therefore, when the aptamer is immobilized at substantially the same distance with respect to the MSS film, that is, when the length of the linker is substantially constant, it is presumed that the sensitivity of the MSS film is improved. NS.
  • a cross-linking agent having an active ester at both ends of the molecule a cross-linking agent having an N-hydroxysuccinimide active ester and a haloacetyl reactive group at both ends, a cross-linking agent having an N-hydroxysuccinimide active ester and a pyridyldithiol-reactive group at both ends, Examples include DCC, EDC, NHS, Sulfo-NHS, and anhydrous acetate.
  • the linker is represented by, for example, the following formula (1).
  • M 1 represents an atom bonded to the silane coupling agent on the MSS film
  • L 1 represents a region (group) derived from the silane coupling agent
  • L 2 is a crosslink.
  • M 1 represents an atom bonded to the silane coupling agent on the MSS film
  • L 1 represents a region (group) derived from the silane coupling agent
  • L 2 is a crosslink.
  • L 2 may or may not be present
  • M 2 represents an atom attached to the cross-linking agent or NH in the affinity tag.
  • NH represents an amine derived from an amino group of a silane coupling agent having an amino group.
  • L 1 is, for example, (M 1 ) -Si (CH 3 ) 2-m (OR 4 ) m- R 1- (NH) or (M 1 ) -Si (CH 3 ) 2-m (OR 4 ) m. It is represented by -R 2- NH-R 3- (NH).
  • R 1 is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 are, for example, independently linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, and may be the same or different. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group and the like.
  • R 4 is, for example, a hydrogen atom or a bond.
  • m is 1 or 2.
  • L 1 is represented by, for example, (M 1 ) -Si (OR 4 ) 2- (CH 2 ) 3- (NH). .. R 4 is, for example, a hydrogen atom or a bond.
  • the length of the linker is, for example, the length of the functional group on the MSS film (for example, the oxygen atom of the silanol group on the silicon film) and the shortest molecular chain to the affinity tag such as avidin (main chain length). Can be represented.
  • the main chain length of the linker is 1 to 20, and the sensitivity of MSS can be improved. Therefore, preferably 1 to 15, 1 to 13, 3 to 13, 5 to 13, 1 to 11, 3 to 11, 1 ⁇ 10, 3 ⁇ 10, 1 ⁇ 8, 3 ⁇ 8, 1 ⁇ 5, 1 ⁇ 3, 1 or 2.
  • the bond between avidins and biotins is used, but the third example is not limited to this, and the linker is directly bonded to the hydroxyl group or phosphoric acid group of the aptamer. May be good.
  • the aptamer can be immobilized on the MSS membrane by amididing the phosphate group at the 3'end and reacting with the linker.
  • a method of binding the streptavidins via the above can be mentioned. That is, a silane coupling agent having a methacrylic group is reacted with the MSS membrane to bond an amino group on the MSS membrane. The reaction can be carried out, for example, by applying a solution containing a silane coupling agent having a methacrylic group to the MSS membrane.
  • a linker is formed between the main chain or side chain of the amino acid derivative and the main chain or side chain of the amino acid of avidins. It reacts with a possible cross-linking agent to bind one end of the cross-linking agent to the amino acid derivative on the MSS membrane. Specifically, the surface of the MSS membrane after the amino acid derivative treatment is washed, a solution containing a cross-linking agent is applied to the MSS membrane, and the amino acid derivative and the cross-linking agent are bound to each other.
  • the conditions of the cross-linking reaction can be appropriately determined, for example, depending on the type of the cross-linking agent.
  • the avidins are bound to the other end of the cross-linking agent. Specifically, the surface of the crosslinked MSS membrane is washed, a solution containing avidins is applied, and the other end of the crosslinking agent is bound to the main chain or side chain of the amino acids of the avidins. Then, the biotin-bound aptamer is brought into contact with the MSS membrane thus treated, and the aptamer can be immobilized by binding the biotins and the avidins.
  • the silane coupling agent is represented by, for example, Y—Si (CH 3 ) 3-n (OR) n .
  • n, R, and Y include, for example, the following examples.
  • the "n" is 2 or 3.
  • R include an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group; an acyl group such as an acetyl group and a propyl group; and the like.
  • Y is a reactive functional group having a methacrylic group at the end.
  • the silane coupling agent having a methacryl group includes, for example, 3- (methacryloyloxy) propylmethyldimethoxysilane (for example, KBM-502 (manufactured by Shinetsu Silicone Co., Ltd.)) and 3- (methacryloyloxy) propyltrimethoxysilane (for example, KBM-503 (manufactured by Shinetsu Silicone), GENIOSIL (registered trademark) GF31 (manufactured by Asahi Kasei Wacker Silicone)), 3- (methacryloyloxy) propylmethyldimethoxysilane (for example, KBE-502 (manufactured by Shinetsu Silicone)), ( 3-methacryloyloxypropyl) triethoxysilane (for example, KBE-503 (manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd.)) and the like can be mentioned.
  • the amino acid or amino acid derivative has, for example, a functional group capable of reacting with a methacrylic group and a carboxyl group.
  • the functional group capable of reacting with the methacrylic group include a thiol group (-SH) and the like.
  • the amino acid or amino acid derivative having a thiol group include cysteine; cysteine modified with an amino group such as N-acetylcysteine; and the like.
  • the cross-linking agent can be appropriately determined depending on, for example, the functional group of the amino acid derivative used for cross-linking and the functional group of the amino acid of the avidins used for cross-linking.
  • the two functional groups are amino groups
  • the description of the cross-linking agent in the case of utilizing the amino group of the main chain or side chain of the amino acid in the third example can be incorporated.
  • the cross-linking agent will be described as a cross-linking agent when the thiol group of the side chain of the amino acid in the third example is used. Can be used.
  • the cross-linking agent uses the carboxyl group of the main chain or side chain of the amino acid in the third example. The description of the agent can be used.
  • the cross-linking agent is preferably a cross-linking agent in which self-condensation does not substantially occur because the length of the linker can be made constant.
  • the sensitivity of MSS can be improved by a mechanism similar to the mechanism described in the third example described above.
  • Specific examples of the cross-linking agent in which self-condensation does not substantially occur include a cross-linking agent having N-hydroxysuccinimide active ester at both ends, a cross-linking agent having an imide ester reactive group at both ends, and a maleimide group and N-hydroxysuccinimide activity.
  • the linker is represented by, for example, the following formula (2).
  • M 1 represents an atom bonded to the silane coupling agent on the MSS film
  • L 1 represents a region (group) derived from the silane coupling agent
  • A is an amino acid derivative
  • L 2 represents a region (group) derived from the cross-linking agent, L 2 may or may not be present
  • M 2 represents an atom bonded to the cross-linking agent or NH in the affinity tag.
  • R 4 is, for example, a hydrogen atom or a bond.
  • R 5 is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group and the like.
  • m is 1 or 2.
  • l is 0 or 1.
  • R 4 is, for example, a hydrogen atom or a bond.
  • acetic anhydride is used as the cross-linking agent, L 2 does not exist, for example.
  • the length of the linker may be represented by, for example, the length of the functional group on the MSS membrane (for example, the silanol group on the silicon membrane) and the shortest molecular chain length (main chain length) to the affinity tag such as avidin. can.
  • the main chain length of the linker is 1 to 20, and the sensitivity of MSS can be improved. Therefore, preferably 1 to 15, 1 to 13, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 5, 1 ⁇ 3, 1 or 2.
  • the bond between avidins and biotins is used, but the fourth example is not limited to this, and the linker is directly bonded to the hydroxyl group or phosphoric acid group of the aptamer. May be good.
  • the aptamer can be immobilized on the MSS membrane by amididing the phosphate group at the 3'end and reacting with the linker.
  • the site of immobilization of the aptamer on the MSS membrane is not particularly limited, and examples thereof include a 3'end and a 5'end.
  • the sensor substrate has a support region that supports the MSS film, and the support region has a piezoresistive element.
  • the sensor substrate supports the MSS film by the support region.
  • the aptamer is immobilized on one or both surfaces facing each other as described above, and the aptamer is supported on the side surface by the sensor substrate.
  • the sensor substrate preferably partially supports, for example, the MSS film, and specifically, it preferably partially supports the side surface of the MSS film.
  • the number of portions (supporting portions) supported by the supporting region of the sensor substrate is not particularly limited, and is, for example, four points. It should be noted that this is an example and is not limited in any way.
  • the support region is, for example, a silicon film, and the p-typed region (p-type Si) is formed by p-typening an arbitrary region of the silicon film by doping with impurities. It can function as the piezoresistive element.
  • the support region has, for example, the piezoresistive element at or near a portion supporting the MSS film.
  • the sensor substrate may be entirely made of silicon, or only the support region may be a silicon film, and the material other than the support region including the piezoresistive element is not particularly limited.
  • the sensor substrate has a circuit for applying a voltage.
  • the circuit includes a plurality of piezoresistive elements in the support region. Wheatstone bridge circuit including.
  • the electrical signal accompanying the change in the resistance value in the piezoresistive element can be measured.
  • the sensor substrate may have a plurality of the support regions, and the plurality of support regions may each support the MSS film.
  • the number of the support regions and the number of the MSS films supported are not particularly limited, and may be one or two or more, respectively.
  • the plurality of MSS membranes may be, for example, an MSS membrane in which an aptamer for the same target is immobilized, or an MSS membrane in which an aptamer for a different target is immobilized.
  • the "aptamer for the same target” may be, for example, an aptamer having the same sequence for the same target, or an aptamer having a different sequence for the same target.
  • the MSS of the present embodiment has a plurality of MSS films in which aptamers for the same target are immobilized, for example, a plurality of analyzes for the same target can be performed simultaneously with one MSS. Further, when the MSS of the present embodiment has a plurality of MSS films in which aptamers for different targets are immobilized, for example, analysis for different targets can be performed simultaneously with one MSS.
  • the analytical kit of the present invention has a first binding agent corresponding to each target.
  • the MSS of the present embodiment may be, for example, a form in which the MSS film is arranged on the sensor substrate at the time of use, and the sensor substrate and the MSS film may be separately independent before use.
  • the MSS of the present invention may be, for example, a kit containing the sensor substrate and the MSS film separately and independently.
  • the change in the resistance value accompanying the stress change of the piezoresistive element in the MSS can be measured as an electronic signal by using an existing measurement module. ..
  • the sample solution is brought into contact with the analysis kit of the present invention, and the target in the sample solution, the first binding substance, and the second binding substance are combined.
  • the application step of applying a voltage to the film type surface stress sensor in the liquid phase, and the measurement of the stress change of the piezo resistance element in the film type surface stress sensor. Includes an analysis step to analyze the target of.
  • the analysis method of the present embodiment is characterized by using the analysis kit of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the complex formation step can be carried out, for example, by bringing the MSS in the analysis kit into contact (coexistence) with the sample solution and the first binding substance.
  • the contact for example, the contact between the MSS, the sample solution, and the first binding substance may be performed separately or simultaneously.
  • the forming step, the film-type surface stress sensor after the formation of the first complex, and the first binding substance are brought into contact with each other to form a complex of the first complex and the first binding substance.
  • the contact can be carried out by immersing the MSS in the sample solution.
  • the contact in the first complex forming step is performed by immersing the support region including the piezoresistive element in the sensor substrate and the MSS film supported by the support region in the sample liquid. Can be implemented.
  • the conditions for immersing the MSS in the sample liquid are not particularly limited, and examples thereof include 0.1 to 120 minutes at a temperature of 20 to 35 ° C. and 0.1 to 120 minutes at a temperature of 50 to 60 ° C.
  • the MSS has a plurality of MSS films, for example, the plurality of MSS films in the MSS may be immersed in the same sample solution at the same time.
  • the MSS is brought into contact with the first binding substance.
  • the contact with the first binding substance is, for example, immersing the support region including the piezoresistive element in the sensor substrate and the MSS film supported by the support region in the liquid containing the first binding substance. This may be carried out by adding the first binding substance to the sample liquid in which the MSS is immersed.
  • the reaction conditions with the first binding substance are not particularly limited, and the description of the immersion conditions of the MSS can be incorporated.
  • the sample solution, the MSS, and the first binding substance are brought into contact with each other, and the target in the sample solution, the second binding substance, and the first binding substance are brought into contact with each other.
  • the contact can be carried out by immersing the MSS in the sample liquid and adding the first binding substance to the sample liquid in parallel.
  • the support region including the piezoresistive element in the sensor substrate and the MSS film supported by the support region are immersed in the sample liquid, and the first bond is made to the sample liquid. It can be carried out by adding a substance.
  • the conditions for immersing the MSS in the sample liquid are not particularly limited, and examples thereof include 0.1 to 120 minutes at a temperature of 20 to 35 ° C. and 0.1 to 120 minutes at a temperature of 50 to 60 ° C.
  • the MSS has a plurality of MSS films, for example, the plurality of MSS films in the MSS may be immersed in the same sample solution at the same time.
  • a voltage is applied to the film-type surface stress sensor in the liquid phase.
  • the conditions for applying the voltage are not particularly limited, and for example, the same conditions as those of commercially available MSS can be exemplified.
  • the liquid phase may be, for example, the sample liquid in the dipping step or another solvent. In the latter case, the MSS after the dipping step may be taken out from the sample solution, immersed in a new solvent, and a voltage may be applied. After the step of immersing the sample liquid, the MSS is immersed in a new solvent in this way, such as when the MSS is washed in order to remove a substance that has not bound to the aptamer in the sample, and the voltage is increased. Is preferably applied.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include buffer solutions such as PBS and Tris-HCl, water and the like.
  • the timing of the application is the start of the complex forming step, during the complex forming step, or after the complex forming step.
  • the target in the sample liquid is analyzed by measuring the stress change of the piezoresistive element in the MSS.
  • the stress change can be measured, for example, by measuring an electric signal, and a commercially available measurement module (for example, MSS-8RM, NANOSENSOR) or the like can be used.
  • a control binding substance that does not bind to the target may be fixed to the MSS membrane and used as a reference MSS.
  • the signal measured using the reference MSS and the first binding substance and the signal measured using the analysis kit of the present invention may be used for analysis. ..
  • the sensor substrate 10 has an electrode 11, an aluminum wire 12, an MSS film 13 and a piezo resistance element 14, and the MSS film 13 has an aluminum wire 12 via the piezo resistance element 14.
  • the aluminum wire 12 has a structure in which each of the aluminum wires 12 is connected to the electrode 11.
  • Acrylic resin (trade name: Mr. COLOR 62, manufactured by GSI Creos) and epoxy resin (trade name: PM165-R Hi, manufactured by Cemedine) are applied to the aluminum wire on the sensor substrate for waterproof treatment.
  • the processed sensor substrate was connected to a substrate with a connector (trade name IFB-FFC- (0.5) 4P-B, manufactured by AITENDO) so that the electrode could be inserted.
  • the entire connector of the substrate with the connector was waterproofed by applying and filling the same resin as described above in the exposed metal portion, the gap connected to the metal portion, and the like.
  • the streptavidin solution was dropped onto the back surface of the MSS film of the sensor substrate (the surface opposite to the surface on which the aluminum wire was formed), and the streptavidin solution was dropped under a water vapor atmosphere (100% (relative)). Humidity)), left at room temperature for 1 hour.
  • the streptavidin solution was prepared by suspending it in 1 ⁇ PBS (pH 7.4) so that the streptavidin content was 2%.
  • 3 ⁇ l of the streptavidin solution was added dropwise to the surface of the MSS membrane, allowed to stand under the same conditions, and further washed with the PBS. Then, the sensor substrate was dried at room temperature for 10 minutes.
  • the two sensor substrates are processed, one sensor substrate is further coupled with an aptamer to form the MSS of Reference Example 1A, and the other sensor substrate is further coupled with poly T for negative control. (NC) MSS of 1A.
  • the aptamer solution was prepared by suspending thrombin aptamer (SEQ ID NO: 1: GGTTGGTGTGGTTGGTTTTT-biotin-3') having a biotin tag added to the 3'end in the PBS to a final concentration of 1 ⁇ mol / l.
  • the thrombin aptamer Since the thrombin aptamer has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the thrombin aptamer is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was used as the MSS of Reference Example 1A.
  • the poly T solution is prepared by suspending poly T DNA (SEQ ID NO: 2: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3') with a biotin tag added to the 3'end in the PBS so as to have a final concentration of 1 ⁇ mol / l. bottom. Since the poly T has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the poly T is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was designated as the MSS of NC1A.
  • the entire sensor substrate was immersed in a 100 ⁇ mol / l BiotinSAM ethanol solution (Dojin Chemical Laboratory), allowed to stand at room temperature for 1 hour, and further washed with ethanol. Then, in the same manner as in (1) above, the substrate was connected to the substrate with the connector, and the entire connector was further waterproofed.
  • the two sensor substrates are processed, one sensor substrate is further coupled with an aptamer to form the MSS of Reference Example 1B, and the other sensor substrate is further coupled with poly T to form NC1B. It was designated as MSS.
  • aptamer solution 3 ⁇ l of the aptamer solution was dropped onto the surface of the one sensor substrate and allowed to stand at room temperature for 1 hour under a water vapor atmosphere (100% (relative humidity)).
  • the aptamer solution was prepared by suspending the thrombin aptamer in PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 50 minutes, and washed with the PBS.
  • the thrombin aptamer Since the thrombin aptamer has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the thrombin aptamer is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was used as the MSS of Reference Example 1B.
  • the poly T solution was prepared by suspending the DNA of the poly T in the PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 50 minutes, and washed with the PBS. Since the poly T has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the poly T is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was designated as NC1B MSS.
  • silane coupling method-1 After washing the sensor substrate of the commercially available MSS with ethanol, the end portion on which the MSS film was arranged was immersed in a silane coupling solution and allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
  • the silane coupling agent had a composition of 8 ml of ethanol, 200 ⁇ l of acetic acid, 10 ⁇ l of APTMS (3-aminopropyltriethoxysilane), and 1.8 ml of pure water. Then, the soaked end portion of the sensor substrate was washed with pure water and treated at 110 ° C. for 1.5 hours.
  • the sensor substrate is waterproofed to the aluminum wire on the sensor substrate, the sensor substrate is connected to the substrate with a connector, and the entire connector is waterproofed. provided.
  • the surface at the end where the MSS film is arranged is washed with 0.1 mol / l Tris-HCl (pH 8), and then further 0.1 mol / l Tris-HCl (pH 8).
  • the end portion was immersed in pH 8) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The ends were then washed with the PBS.
  • the two sensor substrates are processed, one sensor substrate is further coupled with an aptamer to form the MSS of Reference Example 1C, and the other sensor substrate is further coupled with poly T to NC1C. MSS.
  • aptamer solution 3 ⁇ l of the aptamer solution was dropped onto the surface of the one sensor substrate and allowed to stand at room temperature for 1 hour under a water vapor atmosphere (100% (relative humidity)).
  • the aptamer solution was prepared by suspending the thrombin aptamer in PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and washed with the PBS.
  • the thrombin aptamer Since the thrombin aptamer has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the thrombin aptamer is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was used as the MSS of Reference Example 1C.
  • the poly T solution was prepared by suspending the DNA of the poly T in the PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and washed with the PBS. Since the poly T has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the poly T is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was designated as NC1C MSS.
  • N-acetylcysteine solution is dropped onto one surface of the MSS film of the sensor substrate (the surface on which the aluminum wire is formed), and UV (Nitride, NS365L-6SMG) is irradiated for several minutes. bottom. Irradiation was performed in a water vapor atmosphere (100% (relative humidity)) at room temperature until dry. Then, the sensor substrate was washed with pure water and dried at room temperature.
  • the sensor portion of the sensor substrate was immersed in an acetic anhydride solution (10% acetic anhydride, 90% acetonitrile) and reacted at 60 ° C. for 0.5 hours. After the reaction, the sensor substrate was washed with acetonitrile.
  • the sensor substrate was dried at room temperature for 10 minutes. Further, 1 ⁇ l of a 0.5% streptavidin solution was added dropwise to the same surface of the MSS film of the sensor substrate, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1.5 hours under a water vapor atmosphere (100% (relative humidity)). After the standing, the sensor substrate was washed with the PBS.
  • the sensor board is waterproofed to the aluminum wire on the sensor board, and then the sensor board is connected to the board with a connector to cover the entire connector. Waterproofed.
  • the two sensor substrates are processed, one sensor substrate is further coupled with an aptamer to form the MSS of Reference Example 1D, and the other sensor substrate is further coupled with poly T to NC1D. MSS.
  • the aptamer solution was prepared by suspending the thrombin aptamer in PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and washed with the PBS. Since the thrombin aptamer has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the binding of the biotin to the streptavidin causes the surface of the MSS membrane as shown in FIG.
  • the thrombin aptamer will be fixed to. This was used as the MSS of Reference Example 1D.
  • the MSS of Reference Example 1D corresponds to an MSS in which the aptamer is immobilized at substantially the same distance with respect to the MSS film.
  • the poly T solution was prepared by suspending the DNA of the poly T in the PBS so as to have a final concentration of 5 ⁇ mol / l. After standing, the mixture was further immersed in PBS containing 1% BSA, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and washed with the PBS. Since the poly T has a biotin tag, if streptavidin is bound to the surface of the MSS membrane, the poly T is fixed to the surface of the MSS membrane by the binding of biotin and the streptavidin. Will be. This was designated as NC1D MSS.
  • the MSSs of Reference Examples 1A to 1D and the MSSs of NC1A to NC1D were set as a set, and at the same time, they were immersed in a sample solution, a voltage was applied, and the voltage change accompanying the stress change was measured. Specifically, first, the end portion of the MSS containing the MSS film was immersed in the PBS, a voltage was applied to the MSS, and the voltage signal was left until it became stable. Then, when the measurement time at which the voltage signal was sufficiently stable was 1400 seconds or 2100 seconds, the immersion of the MSS was switched to the thrombin solution, and the voltage signal was continuously measured.
  • the thrombin solution was prepared by mixing a thrombin reagent ( ⁇ Thrombin, Human, manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) with the PBS so as to have a final concentration of 240 nmol / l.
  • FIG. 4 is a graph showing the voltage.
  • (A) shows the results of Reference Examples 1A and NC1A
  • (B) shows the results of Reference Examples 1B and NC1B
  • (C) shows the results of Reference Examples 1C and NC1C
  • D) shows the results of Reference Example 1D and NC1D.
  • the horizontal axis represents the elapsed time after switching to the thrombin solution
  • the vertical axis represents the voltage ( ⁇ V).
  • the MSS of the reference example showed a lower voltage on average as compared with the MSS of the control.
  • the average value of the voltage difference is the reference example 1D (about 15 ⁇ V)>.
  • Reference Example 1A (about 13 ⁇ V)>
  • Reference Example 1C (about 10 ⁇ V) ⁇
  • Reference Example 1B (about 7 ⁇ V).
  • the target can be detected by arranging the second binding substance on the MSS membrane.
  • MSS of Example 1 The MSS used in the analysis kit of Example (MSS of Example 1) was prepared in the same manner as in Reference Example 1A. Further, the control MSS (MSS of Comparative Example 1) was produced in the same manner as the NC1A.
  • the thrombin aptamer of SEQ ID NO: 3 binds to and does not compete with the thrombin aptamer of SEQ ID NO: 1 at different positions of thrombin. Then, 100 ⁇ l of avidin-labeled magnetic beads (Dynabeads M-280 Streptavidin) and 2 ⁇ l of aptamer solution (100 ⁇ mol / l) were mixed and allowed to stand at room temperature for 0.5 hours. As a result, an aptamer immobilized on the carrier was produced.
  • the MSS of Example 1 and the MSS of Comparative Example 1 were set as a set, and at the same time, they were immersed in a sample solution, a voltage was applied, and the voltage change accompanying the stress change was measured. Specifically, first, the end portion of the MSS containing the MSS film was immersed in the PBS, a voltage was applied to the MSS, and the voltage signal was left until it became stable. Then, when the voltage signal was sufficiently stable at the measurement time of 1400 seconds, the immersion of the MSS was switched to the thrombin solution, and the voltage signal was continuously measured.
  • the thrombin solution was prepared by mixing a thrombin reagent ( ⁇ Thrombin, Human, Funakoshi) with the PBS so as to have a final concentration of 240 nmol / l.
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement of voltage over time.
  • the horizontal axis represents the elapsed time after switching to the thrombin solution
  • the vertical axis represents the voltage ( ⁇ V).
  • the voltage fluctuation in the MSS of Comparative Example 1 in the figure at around 350 seconds is caused by the measurer mistakenly touching the MSS of Comparative Example 1.
  • the analysis using MSS (Aptamer) of Example 1 there is a difference of about 70 to 80 in voltage value as compared with the analysis using MSS (polyT) of Comparative Example 1.
  • the analysis kit and analysis method of the present invention enable analysis of the target.
  • the MSS of Reference Examples 1A to 1D has a difference of about 5 to 10 times as a voltage value as compared with NC1A to 1D. Therefore, according to the analysis kit and analysis method of the present invention, it was found that a stronger electrical signal of about 5 times or more can be obtained as compared with the MSS in which the binding substance that can bind to the target is immobilized.
  • the analysis method using the analysis kit of the present invention enhances the signal as compared with the analysis using MSS in which the binding substance that can bind to the target is immobilized.
  • Appendix 1 Includes a first binding material that binds to the target and a film-type surface stress sensor.
  • the film-type surface stress sensor includes a second binding substance, a film, and a sensor substrate.
  • the second binding substance binds to the target and is immobilized on the membrane.
  • the membrane is a membrane that is deformed by the binding of the target to the second binding substance.
  • the sensor substrate has a support area and has a support area.
  • the support region supports the film and has a piezoresistive element.
  • the piezoresistive element is an element that detects deformation of the film.
  • (Appendix 2) The analysis kit according to Appendix 1, wherein the first binding substance is an aptamer or an antibody.
  • (Appendix 3) The analysis kit according to Appendix 1 or 2, wherein the first binding substance is immobilized on a carrier.
  • (Appendix 4) The analysis kit according to Appendix 3, wherein the carrier is beads.
  • (Appendix 5) The analysis kit according to any one of Supplementary note 1 to 4, wherein the second binding substance is an aptamer or an antibody.
  • (Appendix 6) The analysis kit according to any one of Appendix 1 to 5, wherein the film is a silicon film.
  • (Appendix 7) The analysis kit according to any one of Appendix 1 to 6, wherein the support region partially supports the membrane.
  • (Appendix 12) The analysis kit according to any one of Supplementary note 1 to 10, wherein the second binding substance is immobilized on the surface of the membrane via a linker.
  • (Appendix 13) The analysis kit according to Appendix 12, wherein the length of the linker is substantially constant.
  • (Appendix 14) The analysis kit according to Appendix 12 or 13, wherein the linker contains a silane coupling agent.
  • (Appendix 15) The sensor substrate has a plurality of support areas and has a plurality of support areas.
  • the analysis kit according to any one of Appendix 1 to 14, wherein the plurality of support regions each support the membrane.
  • the plurality of film-type surface stress sensors include a sensor in which a second binding substance is immobilized for different targets.
  • the sensor board has a circuit and The support region includes a plurality of piezoresistive elements.
  • the analysis kit according to any one of Appendix 1 to 16, wherein the circuit is a Wheatstone bridge circuit including the plurality of piezoresistive elements.
  • Appendix 18 A complex in which the sample solution is brought into contact with the analysis kit according to any one of Appendix 1 to 17 to form a complex of the target in the sample solution, the first binding substance, and the second binding substance.
  • the complex forming step is A first complex forming step of bringing the sample liquid into contact with the film-type surface stress sensor to form a first complex of the target in the sample liquid and the second binding substance.
  • a second in which the film-type surface stress sensor after the formation of the first complex and the second binding substance are brought into contact with each other to form a complex of the first complex and the second binding substance.
  • the liquid phase is the sample liquid, The analysis method according to Appendix 18 or 19, wherein the application step is performed in parallel with the complex formation step.
  • the present invention a stronger electrical signal can be obtained as compared with MSS in which a binding substance that can bind to a target is immobilized. Therefore, the present invention is useful, for example, in the field of analysis of samples and the like, the field of medical treatment, and the like.

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Abstract

ターゲットに結合可能な結合物質が固定化された膜型表面応力センサと比較して、強い電気シグナルを得られる膜型表面応力センサを含む分析キットを提供する。　本発明のターゲットの分析キットは、ターゲットに結合する第１の結合物質と、膜型表面応力センサとを含み、 前記膜型表面応力センサは、第２の結合物質と、膜と、センサ基板とを含み、 前記第２の結合物質は、前記ターゲットに結合し、前記膜に固定化され、 前記膜は、前記第２の結合物質への前記ターゲットの結合により変形する膜であり、 前記センサ基板は、支持領域を有し、 前記支持領域は、前記膜を支持し、ピエゾ抵抗素子を有し、 前記ピエゾ抵抗素子は、前記膜の変形を検出する素子である。

Description

ターゲットの分析キットおよびそれを用いた分析方法
　本発明は、ターゲットの分析キットおよびそれを用いた分析方法に関する。
　食品、医療等の多種多様な分野において、ターゲットの検出は重要であり、様々な方法が提案されている。そして、近年において、膜型表面応力センサが注目されている（特許文献１参照）。前記膜型表面応力センサは、例えば、シリコン膜等の膜にターゲットを結合させることで、前記膜を変形させ、前記変形による電気抵抗の変動を測定することによって、ターゲットの有無や量を分析できる。しかしながら、ターゲットを前記膜に結合させる方式については、例えば、分析精度の向上や、適応できるターゲットの拡張等の観点から、さらなる改良が求められている。
国際公開第ＷＯ２０１１／１４８７７４号
　そこで、本発明者は、ターゲットを結合させるための新たな形態をとる膜型表面応力センサ（以下、「ＭＳＳ」という）、具体的には、その表面に、ターゲットに結合可能なアプタマーを固定化がされているＭＳＳを発明した。前記ＭＳＳでは、接触させたサンプル液中にターゲットが存在すると、前記ターゲットが前記アプタマーに結合して複合体化するため、前記ターゲット未結合のＭＳＳと比較して、ＭＳＳの膜への応力が相対的に大きくなり、前記膜の歪みが大きくなる。このため、前記ＭＳＳでは、前記ＭＳＳに電圧を印加して、抵抗値を測定することで、前記ターゲットの結合を抵抗値の変化、すなわち、電気シグナルとして測定できる。このため、前記ＭＳＳによれば、前記サンプル液中のターゲットを分析できる。
　しかしながら、前記ＭＳＳを用いて、様々なターゲットを分析する場合、前記電気シグナルの増強が必要と考えられた。そこで、本発明は、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳと比較して、強い電気シグナルを得られるＭＳＳを含む分析キットの提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のターゲットの分析キット（以下、「分析キット」という）は、ターゲットに結合する第１の結合物質と、膜型表面応力センサとを含み、
前記膜型表面応力センサは、第２の結合物質と、膜と、センサ基板とを含み、
前記第２の結合物質は、前記ターゲットに結合し、前記膜に固定化され、
前記膜は、前記第２の結合物質への前記ターゲットの結合により変形する膜であり、
前記センサ基板は、支持領域を有し、
前記支持領域は、前記膜を支持し、ピエゾ抵抗素子を有し、
前記ピエゾ抵抗素子は、前記膜の変形を検出する素子である。
　本発明のターゲットの分析方法（以下、「分析方法」という）は、サンプル液と、前記本発明の分析キットと接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第１の結合物質と、前記第２の結合物質との複合体を形成する複合体形成工程と、
液相中で前記膜型表面応力センサに電圧を印加する印加工程と、
前記膜型表面応力センサにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化の測定により、前記サンプル液中のターゲットを分析する分析工程とを含む。
　本発明によれば、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳと比較して、強い電気シグナルを得られる。
図１は、本発明において、ＭＳＳのシグナルが増強するメカニズムを示す図である。 図２は、ＭＳＳの一般的な構成を示す模式図である。 図３は、参考例１におけるＭＳＳの構造を示す模式図である。 図４は、参考例１におけるＭＳＳの電圧を示すグラフである。 図５は、実施例１におけるＭＳＳの電圧を示すグラフである。
　本発明において、以下、「膜型表面応力センサ（Membrane-type Surface-stress Sensor」は、ＭＳＳともいう。いわゆるＭＳＳは、ターゲットへの結合性を有する膜が、ピエゾ抵抗素子を有する支持体に支持されている。そして、前記ターゲットが前記膜に結合すると、前記結合により前記膜は応力を受けて、歪みの発生等により前記膜は変形（歪みの発生）する。そして、前記膜の変形の量に応じて、前記膜を支持する前記支持体のピエゾ抵抗素子に応力が発生し、前記応力に比例して、前記ピエゾ抵抗素子の抵抗値が変化する。このため、前記ＭＳＳセンサによれば、ＭＳＳに電圧を印加して、抵抗値の変化に伴う電気シグナルを測定することで、間接的に、前記膜に結合した前記ターゲットの有無を定性的に分析できる。また、前記ＭＳＳセンサによれば、ＭＳＳに電圧を印加して、抵抗値の変化に伴う電気シグナルを測定することで、前記膜に結合した前記ターゲットの量を定量的に分析できる。本発明は、このようなＭＳＳにおいて、ターゲットに結合する第２の結合物質を使用すること、具体的には、前記膜に前記第２の結合物質を固定化することで、前記ターゲットを前記第２の結合物質を介してＭＳＳに結合させる。このため、本発明のＭＳＳにおいて、前記膜に前記第２の結合物質を固定化する以外、その他の構成は、特に制限されず、既存の構成を利用でき、また、同様の機能を奏する将来の構成にも利用できる。
　本発明において、「ターゲット」は、特に制限されず、任意に設定できる。前記ターゲットは、例えば、液体中、すなわち、液相で前記第１の結合物質および前記第２の結合物質に接触できる物質であればよい。前記ターゲットは、例えば、前記結合物質が結合する領域、すなわち、前記結合物質のエピトープを１または複数有する。前記第１の結合物質のエピトープが前記第２の結合物質のエピトープと異なる場合、前記ターゲットは、例えば、前記第１の結合物質のエピトープを１または複数有し、かつ前記第２の結合物質のエピトープを１または複数有する。他方、前記第１の結合物質のエピトープが、前記第２の結合物質のエピトープと同じまたは部分的に重複する場合、前記ターゲットは、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のエピトープを複数有する。前記部分的な重複は、例えば、前記ターゲットにおいて、前記第１の結合物質の認識部位の一部と、前記第２の結合物質の認識部位の一部とが重なっている状態を意味する。
　前記ターゲットにおいて、前記第１の結合物質のエピトープと前記第２の結合物質のエピトープとは、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のターゲットへの結合において、競合が生じないように設定されることが望ましい。前記競合は、例えば、前記第１の結合物質のターゲットへの結合により、前記第２の結合物質の前記ターゲットへの結合が部分的もしくは完全に阻害されること、および／または前記第２の結合物質のターゲットへの結合により、前記第１の結合物質の前記ターゲットへの結合が部分的もしくは完全に阻害されることを意味する。前記競合は、例えば、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質を標識し、前記ターゲットを固相化したプレート上で、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質の共存下で反応させた際に、前記第１の結合物質または前記第２の結合物質の単独の存在下と比較して、標識の検出が有意に低下するかによって判断できる。前記標識の検出が有意に低下する場合、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質は競合していると判断できる。他方、前記標識の検出が有意に低下しない、すなわち、有意差がない場合、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質は競合していないと判断できる。
　本発明において、前記ターゲットは、例えば、炭疽菌、大腸菌、サルモネラ、大腸菌等の細菌をはじめとする微生物；インフルエンザウイルス等のウイルス；アレルゲン；等があげられる。前記アレルゲンは、例えば、小麦等の穀物；卵；肉；魚；貝；野菜；果物；牛乳；ピーナッツ等の豆；スギ、ヒノキ等の花粉等があげられる。前記ターゲットの種類は、特に制限されず、例えば、タンパク質、糖鎖、核酸、ポリマー等の高分子化合物；低分子化合物；等があげられる。前記ターゲットが微生物、ウイルス、またはアレルゲンである場合、前記ターゲットは、一般的に、同一のタンパク質、脂質、核酸等の同一の構造を複数有するため、前記ターゲットは、例えば、前記第１の結合物質および／または前記第２の結合物質のエピトープを複数有しているといえる。他方、前記ターゲットがタンパク質、糖鎖、または核酸の単量体である場合、同一の構造を１つ有するため、前記ターゲットは、例えば、前記第１の結合物質および／または前記第２の結合物質のエピトープを１つ有しているといえる。
　本発明において、「結合物質」は、ターゲットに結合可能な物質、すなわち、結合物質であればよい。前記結合物質は、例えば、抗体、アプタマー等があげられる。前記ターゲットが、受容体またはそのリガンド場合、前記結合物質は、それぞれ、リガンドまたは受容体でもよい。前記結合物質としてリガンドに対する受容体を用いる場合、前記受容体は、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質、すなわち、受容体－Ｆｃ融合タンパク質であってもよく、好ましくは、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域との融合タンパク質、すなわち、受容体－ＩｇＧ　Ｆｃである。前記Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、前記受容体のＣ末端のアミノ酸を直接またはリンカーを介して、免疫グロブリンのＣＬ領域またはＣＨ１領域のＮ末端のアミノ酸と連結することにより調製できる。
　本発明において、「抗体」は、ターゲットに対して結合性を有する可溶型の免疫グロブリンということもできる。前記抗体の種類は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭがあげられる。ＩｇＡは、例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２があげられる。ＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４があげられる。前記抗体は、その抗原結合断片、すなわち、前記ターゲットへの結合性を有する抗体の部分ペプチドであってもよい。前記抗原結合断片は、例えば、前記抗体の一部、より具体的には、前記抗体の結合領域または可変領域を含むポリペプチドである。前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｒＩｇＧ（半ＩｇＧ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、タンダブ（tandab）、ｓｃＦｖとダイアボディとの組合せであるフレキシボディ（flexibody）、タンデム（tandem）ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ（登録商標）、Micromet社）、ＤＡＲＴ（登録商標）（MacroGenics社）、Ｆｃａｂ（商標）またはｍＡｂ２（商標）（F-star社）、Fc engineering抗体（Xencor社）またはDuoBody（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ社）等があげられる。前記抗体としては、ターゲットに結合性を有する公知の抗体またはその抗原結合断片を用いてもよいし、ターゲットを動物等に免疫することにより得られる、新たな抗体またはその抗原結合断片を用いてもよい。また、前記抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。前記抗体は、ターゲットに結合可能な抗体を含む血清、血漿等の血液由来の画分でもよい。
　本発明において、「アプタマー」は、ターゲットに対して結合性を有する核酸分子である。前記アプタマーは、例えば、ターゲットに特異的に結合する核酸分子ということもできる。前記アプタマーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられ、前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されても、未修飾でもよい。前記アプタマーは、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡアプタマー、リボヌクレオチド残基からなるＲＮＡアプタマー、両方を含むアプタマー、修飾ヌクレオチド残基を含むアプタマー等があげられる。前記アプタマーの長さは、特に制限されず、例えば、１０～２００塩基である。前記ターゲットに対するアプタマーは、例えば、既存のアプタマーを使用してもよいし、前記ターゲットに応じて、例えば、ＳＥＬＥＸ法等を利用して新たに取得したものを使用することもできる。
　本発明において、「結合する」または「結合可能」は、対象の結合物質が、前記結合物質に結合される結合対象物（ターゲット）に対して実際に結合することを意味してもよいし、分子ドッキング法等を用いたシミュレーションにおいて結合することを意味してもよいが、好ましくは、前者である。前記結合物質と前記結合対象物との結合は、例えば、タンパク質間相互作用の解析方法を利用して検出でき、例えば、共免疫沈降、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー等の抗体抗原反応を利用した方法を利用して検出できる。具体例として、前記結合物質と前記結合対象物との結合は、例えば、前記結合対象物を発現する細胞と、標識化した結合物質とを接触後、前記細胞において、標識を検出することにより検出できる。
　前記第１の結合物質は、好ましくは、アプタマーまたは抗体である。また、前記第２の結合物質は、好ましくは、アプタマーまたは抗体である。
　前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のエピトープは、前記ターゲットの種類およびその構造に基づき、適宜設定できる。前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のエピトープは、同じでもよいし、異なってもよい。前記ターゲットがターゲット内に共通する構造を複数有している場合、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のエピトープは、例えば、同じエピトープに設定できる。他方、前記ターゲットがターゲット内に共通する構造を複数有していない場合、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質のエピトープは、例えば、異なるエピトープに設定できる。
　本発明の分析キットにおいて、前記第１の結合物質は、例えば、前記ＭＳＳと別個に収容されていてもよいし、前記ＭＳＳの膜上に配置されてもよい。
　前記第１の結合物質は、標識されてもよい。前記標識は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ等があげられる。前記第１の結合物質は、標識されることにより、その重量が増加するため、未標識の第１の結合物質を用いた場合と比較して、前記第２の結合物質および前記ターゲットとの複合体形成時の複合体の重量を増加させることができる。そして、前記重量が増加することにより、ＭＳＳの膜に対する応力が、相対的に増加し、歪みが大きくなる。この結果、前記標識化第１の結合物質を用いた場合、前記ＭＳＳに電圧を印加した際に検出されるシグナルを、より増強できる。
　前記第１の結合物質は、担体に固定化されていることが好ましい。前記担体は、ビーズ、粒子等があげられる。前記担体の材質は、特に制限されず、例えば、金属、プラスチック等があげられる。具体例として、前記担体は、例えば、ポリスチレン製ビーズまたは粒子、シリカ製ビーズまたは粒子、アガロース製ビーズまたは粒子、ガラス製ビーズまたは粒子、アクリル樹脂製ビーズまたは粒子、ポリビニルアルコール樹脂製ビーズまたは粒子、ポリカーボネート製ビーズまたは粒子等があげられる。前記担体は、磁気ビーズでもよい。
　前記標識および担体の大きさは、例えば、前記標識化された第１の結合物質および前記担体に固定化された第１の結合物質が、液相中で拡散可能な大きさであればよい。具体例として、前記標識および担体の大きさは、例えば、１ｎｍ～１００μｍ、１０ｎｍ～１００μｍである。
　前記標識および担体の重量は、例えば、前記ターゲットより重いことが好ましい。これにより、本発明は、前記ＭＳＳに電圧を印加した際に検出されるシグナルを、さらに増強できる。
　前記第１の結合物質が核酸の場合、前記標識および担体は、例えば、前記核酸の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合している。他方、前記第１の結合物質がタンパク質の場合、前記標識および担体は、例えば、前記タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または側鎖に結合している。
　前記標識および担体は、例えば、直接または間接的に、前記第１の結合物質に結合している。前記間接的な結合の場合、前記標識および担体は、リンカーを介して結合している。
　本発明の分析キットは、さらに、緩衝液、使用説明書等を含んでもよい。
　本発明の分析キットにおいて、前記第１の結合物質と、前記ＭＳＳとは分離して収容されてもよいし、まとめて収容されてもよい。後者の場合、前記第１の結合物質は、例えば、前記ＭＳＳのＭＳＳ膜上に配置されてもよい。
　本発明において、「サンプル液」は、液体であればよい。採取検体が液体の場合、それをそのまま液体サンプルとしてもよいし、さらに、液体溶媒によって、希釈、懸濁、分散等を行って調製した液体サンプルでもよい。採取検体が固体の場合、例えば、液体溶媒によって、溶解、懸濁、分散等を行って調製した液体サンプルでもよい。また、採取検体が気体の場合、例えば、前記気体中のエアロゾルを濃縮した液体サンプルでもよいし、さらに、液体溶媒によって、溶解、懸濁、分散等を行って調製した液体サンプルでもよい。前記液体溶媒の種類は、特に制限されず、例えば、前記第１の結合物質および前記第２の結合物質とターゲットとの結合等に影響を与えにくい溶媒であり、具体例として、水、緩衝液等があげられる。前記採取検体は、例えば、食品、血液、尿、唾液、体液、土壌、排水、水道水、池、河川、空気等が例示できる。前記サンプル液は、例えば、ターゲットを含む液体でもよいし、ターゲットを含まない液体でもよいし、ターゲットを含むか否かが不明な液体でもよい。
　つぎに、本発明の分析キットを用いた分析および分析方法（以下、「本発明の分析」という）が、ターゲットに結合可能な結合物質（第２の結合物質）が固定化されたＭＳＳのみを用いた分析（以下、「参考例の分析」という）と比較して、強い電気シグナルを得られる推定メカニズムについて、図１を参照して説明する。ただし、本発明は、以下の推定メカニズムに何ら制限されない。また、前記第２の結合物質としてアプタマーを用いる場合を例にあげて説明するが、本発明の分析は、第２の結合物質として、抗体等の他の結合物質についても同様のメカニズムにより、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳのみを用いた分析と比較して、強い電気シグナルを得られると推定される。
　まず、本発明および参考例の分析において、共通する部分について説明する。本発明および参考例の分析では、図１（Ａ）に示すように、アプタマー１５（第２の結合物質）が固定化されたＭＳＳの膜１３（以下、「ＭＳＳ膜」という）を有するＭＳＳ１００を用いる。つぎに、図１（Ｂ）に示すように、前記ＭＳＳ膜１３上に、ターゲット１６を含むサンプル液を滴下する。すると、アプタマー１５は、ターゲット１６と結合可能であるため、図１（Ｃ）に示すように、第１の複合体を形成する。また、前記第１の複合体が形成されるに従って、ターゲット１６の重量は、アプタマー１５を介して、ＭＳＳ膜１３に負荷される。これにより、図１（Ｃ）に示すように、ＭＳＳ膜１３には応力が加わり、歪みが生じる。参考例の分析では、図１（Ｂ）から図１（Ｃ）に移行する際に生じる歪みに起因するシグナルを検出する。
　本発明の分析は、図１（Ｄ）に示すように、図１（Ｃ）のＭＳＳ膜１３に対して、さらに、アプタマー１７（第１の結合物質）を滴下する。すると、アプタマー１７は、アプタマー１５とターゲット１６との第１の複合体に結合可能であるため、図１（Ｅ）に示すように、アプタマー１５とターゲット１６とアプタマー１７との複合体を形成する。また、前記複合体が形成されるに従って、アプタマー１７の重量は、アプタマー１５とターゲット１６との第１の複合体を介して、ＭＳＳ膜１３に負荷される。これにより、図１（Ｅ）に示すように、ＭＳＳ膜１３にはさらなる応力が加わり、さらなる歪みが生じる。そして、本発明の分析では、図１（Ｂ）から図１（Ｅ）に移行する際に生じる歪みに起因するシグナルを検出する。
　図１に示すように、本発明の分析は、参考例の分析と比較して、ＭＳＳ膜１３のより大きな歪みを検出することになる。このため、本発明の分析は、参考例の分析と比較して、ＭＳＳ１００に電圧を印加した際に検出されるシグナルを、さらに増強できると推定される。
　なお、図１においては、図１（Ｂ）から、ＭＳＳ１００に電圧を印加し、シグナルを検出する例をあげて説明したが、本発明は、これに限定されず、例えば、図１（Ｄ）から、ＭＳＳ１００に電圧を印加し、シグナルを検出してもよい。この場合、アプタマー１７は、ターゲット１６より重い担体に固定化されていることが好ましい。また、図１の説明において、複合体の形成は、アプタマー１５とターゲット１６との第１の複合体を形成後、前記第１の複合体とアプタマー１７とで再度複合体を形成するという２段階の形成工程で行なったが、後述するように、複合体の形成は、１段階の形成工程で行なってもよい。
　以下に、本発明の分析キットにおけるＭＳＳの態様について、さらに、例をあげて説明する。本発明は、以下の実施形態には限定されない。また、各実施形態の説明は、特に言及がない限り、互いの説明を援用できる。さらに、各実施形態の構成は、特に言及がない限り、組合せ可能である。
［実施形態１］
　本実施形態のＭＳＳは、前述のように、アプタマーと、膜と、センサ基板とを含み、前記アプタマーは、ターゲットに結合する核酸分子であり、前記膜に固定化され、前記膜は、前記アプタマーへの前記ターゲットの結合により変形する膜であり、前記センサ基板は、支持領域を有し、前記支持領域は、前記膜を支持し、ピエゾ抵抗素子を有し、前記ピエゾ抵抗素子は、前記膜の変形を検出する素子であることを特徴とする。
　本実施形態のＭＳＳにおいて、前記膜は、ＭＳＳ膜ともいう。前記ＭＳＳ膜は、前述のように、ターゲットの結合によって変形し、その変形によって、前記ピエゾ抵抗素子に応力を与えるものであればよく、特に制限されない。前記膜は、例えば、薄膜であり、その厚みおよび各表面の面積は、特に制限されず、例えば、市販のＭＳＳに使用されているＭＳＳ膜と同様である。前記膜の平面形状は、例えば、円形であり、具体的には、例えば、正円である。前記膜の素材は、特に制限されず、例えば、シリコン膜であり、具体例として、ｎ型　Ｓｉ（１００）があげられる。
　本実施形態のＭＳＳにおいて、前記ＭＳＳ膜には、前記アプタマーが固定化されている。前記アプタマーは、例えば、前記ＭＳＳ膜の一方の表面に固定化されてもよいし、両方の表面に固定化されてもよい。前記ＭＳＳ膜の両面に前記アプタマーが固定化される場合、一方の表面のアプタマーと他方の表面のアプタマーは、例えば、同じターゲットに結合する同じアプタマーであることが好ましい。以下の説明において、前記ＭＳＳ膜の表面とは、例えば、一方の表面でもよいし、両面でもよい。
　前記ＭＳＳ膜に対する前記アプタマーの固定化方法は、特に制限されず、前記ＭＳＳ膜に対して、前記アプタマーを直接的に固定化しても、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記ＭＳＳ膜と前記アプタマーとを化学的処理することによって、共有結合等により固定化することができる。前記直接的な固定方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、他の直接的な固定方法は、例えば、前記ＭＳＳ膜上で前記センサを合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書等を参照できる。後者の場合、例えば、前記ＭＳＳ膜に対して、リンカーを介して前記アプタマーを固定化することができる。前記リンカーの種類は、何ら制限されず、例えば、ビオチンまたはビオチン誘導体（以下、ビオチン類という）と、アビジンまたはアビジン誘導体（以下、アビジン類という）との組み合わせ等があげられる。前記ビオチン誘導体は、例えば、ビオシチン等があり、前記アビジン誘導体は、例えば、ストレプトアビジン等がある。前記リンカーの長さは、例えば、ＭＳＳ膜上の官能基（例えば、シリコン膜上のシラノール基の酸素原子）と、アビジン等のアフィニティータグまたはアプタマーまでの最短の分子鎖の長さ（主鎖長）で表すことができる。前記リンカーの主鎖長は、１～２０であり、ＭＳＳの感度を向上できることから、好ましくは、１～１５、１～１３、３～１３、５～１３、１～１１、３～１１、１～１０、３～１０、１～８、３～８、１～５、１～３、１または２である。以下に、固定化方法を例示するが、本発明は、これらには制限されない。
　第１の例として、前記ＭＳＳ膜および前記アプタマーのいずれか一方に、前記ビオチン類を結合させ、他方に、前記アビジン類を結合させる。そして、前記ビオチン類と前記アビジン類とを結合させることによって、間接的に、前記ＭＳＳ膜に前記アプタマーを固定化できる。
　なお、第１の例では、アビジン類－ビオチン類間の特異的な結合、すなわち、アビジン類へのビオチン類のアフィニティーを利用して、アプタマーを間接的にＭＳＳ膜に固定したが、本発明はこれに限定されず、アビジン類－ビオチン類以外のアフィニティータグを利用してもよい。前記アフィニティータグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ×６タグ）－ニッケルイオン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ－グルタチオン、マルトース結合タンパク質－マルトース、エピトープタグ（ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ）－抗体または抗原結合断片が利用できる。他のアフィニティータグを用いてもよい点は、後述の第２～４の例においても同様である。
　第２の例として、前記ＭＳＳ膜に対して、例えば、介在膜を介して、前記アプタマーを固定化してもよい。前記ＭＳＳ膜上に前記介在膜を形成し、前記第１の例と同様に、前記介在膜および前記アプタマーのいずれか一方に、前記ビオチン類を結合させ、他方に、前記アビジン類を結合させ、前記ビオチン類と前記アビジン類との結合により、前記介在膜を介して前記アプタマーを前記ＭＳＳに固定化できる。前記介在膜は、例えば、金等の金属の膜であり、前記ＭＳＳ膜に対して前記金属を蒸着することにより形成できる。前記介在膜の厚みは、特に制限されず、例えば、１０～１００ｎｍである。前記介在膜は、例えば、一層でも二層以上でもよい。前記介在膜の表面を金にする場合、前記介在膜は、例えば、二層とし、金膜の接着性を向上できる点から、前記ＭＳＳ膜に対して、接着用の金属膜（接着膜）を介して前記金膜を形成することが好ましい。前記接着膜の金属は、例えば、チタン、クロム等があげられる。前記接着膜の厚みは、例えば、０．１～１０ｎｍであり、前記金膜の厚みは、例えば、０．１～１００ｎｍである。前記介在膜に前記ビオチン類を結合する場合、例えば、前記介在膜の表面に、さらに、前記ビオチン類が結合したチオールアルカンを用いて、チオールアルカンの自己形成膜（ＳＡＭ：self-assembled monolayers）を形成し、前記ビオチン類が結合したアプタマーを接触させ、前記ビオチン類と前記アビジン類との結合により、前記アプタマーを固定化してもよい。
　第３の例として、前記ＭＳＳ膜に対して、アミノ基を結合させ、さらにグルタルアルデヒドを結合させることによって、前記ストレプトアビジン類を結合させる方法があげられる。すなわち、前記ＭＳＳ膜に対して、アミノ基を有するシランカップリング剤を反応させ、前記ＭＳＳ膜上にアミノ基を結合させる。前記反応は、例えば、アミノ基を有するシランカップリング剤を含む溶液を前記ＭＳＳ膜に塗布することにより実施できる。さらに、前記ＭＳＳ膜に対して、アミノ基とアミノ酸の主鎖もしくは側鎖とを結合可能な架橋剤、または前記ＭＳＳ膜に対して、アミノ基とアミノ酸の主鎖もしくは側鎖との間にリンカーを形成可能な、グルタルアルデヒド等の架橋剤とを反応させ、前記ＭＳＳ膜上の前記アミノ基にグルタルアルデヒド等の架橋剤の一端を結合させる。具体的には、シランカップリング後のＭＳＳ膜について、膜表面を洗浄し、架橋剤を含む溶液を前記ＭＳＳ膜に塗布し、前記アミノ基と、前記架橋剤とを結合させる。前記架橋反応の条件は、例えば、架橋剤の種類に応じて適宜決定できる。つぎに、前記グルタルアルデヒド等の架橋剤の他端に前記アビジン類を結合させる。具体的には、架橋後のＭＳＳ膜について、膜表面を洗浄し、アビジン類を含む溶液を塗布し、架橋剤の他端と、アビジン類のアミノ酸の主鎖または側鎖とを結合させる。そして、このように処理した前記ＭＳＳ膜に、前記ビオチンを結合させたアプタマーを接触させ、前記ビオチン類と前記アビジン類との結合により、前記アプタマーを固定化できる。
　シランカップリング剤は、例えば、Ｙ－Ｓｉ（ＣＨ３）３－ｎ（ＯＲ）ｎで表される。前記シランカップリング剤がアミノ基を有するシランカップリング剤の場合、ｎ、Ｒ、およびＹは、例えば、以下の例があげられる。前記「ｎ」は、２または３である。Ｒは、例えば、メチル基、エチル基等のアルキル基；アセチル基、プロピル基等のアシル基；等があげられる。Ｙは、アミノ基を末端に有する反応性官能基である。
　前記アミノ基を有するシランカップリング剤は、例えば、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピルメチルジメトキシシラン（例えば、KBM-602（信越シリコーン社製））、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン（例えば、KBM-603（信越シリコーン社製））、３－アミノプロピルトリメトキシシラン（例えば、KBM-903（信越シリコーン社製））、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（例えば、KBE-903（信越シリコーン社製））、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン（例えば、GENIOSIL（登録商標）GF 91（旭化成ワッカーシリコーン社製））、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルメチルジメトキシシラン（例えば、GENIOSIL（登録商標）GF 95（旭化成ワッカーシリコーン社製））等があげられる。
　前記架橋剤は、リンカーと結合するアミノ酸の主鎖または側鎖の官能基に応じて、適宜決定できる。前記官能基は、例えば、アミノ基（－ＮＨ２）、チオール基（－ＳＨ）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）等があげられる。前記アミノ基は、例えば、タンパク質もしくはペプチドのＮ末端またはリジンの側鎖が有する。前記チオール基は、例えば、システインの側鎖が有する。前記カルボキシル基は、例えば、タンパク質もしくはペプチドのＣ末端またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖が有する。
　前記アミノ酸の主鎖または側鎖のアミノ基を利用する場合、前記架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド等のアルデヒド基を両端に有する架橋剤；ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（BS3）、グルタル酸ジスクシンイミジル（DSG）、スベリン酸ジスクシンイミジル（DSS）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（DSP）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（DTSP）、ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（DTSSP）、酒石酸ジスクシンイミジル（DST）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ESG）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（Sulfo-ESG）、ＰＥＧ化ビス（スルホスクシンイミジル）（BS(PEG)5、BS(PEG)9等）等のＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステル（N-ヒドロキシスクシンイミド反応基）を両端に有する架橋剤；アジポイミド酸ジメチル（DMA）、ピメルイミド酸ジメチル（DMP）、ピメルイミド酸ジメチル（DMS）等のイミドエステル反応基を両端に有する架橋剤；等があげられる。
　前記アミノ酸の側鎖のチオール基を利用する場合、前記架橋剤としては、例えば、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド（Sulfo-EMCS）、Ｎ－（８－マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（HMCS）、Ｎ－（８－マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミド（Suflo-HMCS）、N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester（AMAS）、N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester（BMPS）、N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester（GMBS）、N-γ-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester（Sulfo-GMBS）、m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（MBS）、m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester（Sulfo-MBS）、succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate（SMCC）、sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate（Sulfo-SMCC）、succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl) butyrate（SMPB）、sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidophenyl) butyrate（Sulfo-SMPB）、Succinimidyl 6-((beta-maleimidopropionamido) hexanoate)（SMPH）、succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)（LC-SMCC）、N-κ-maleimidoundecanoyl-oxysulfosuccinimide ester（Sulfo-KMUS）等のマレイミド基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとを分子の両端に有する架橋剤；succinimidyl iodoacetate（SIA）、succinimidyl 3-(bromoacetamido) propionate（SBAP）、succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate（SIAB）、sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate（Sulfo-SIAB）等のＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ハロアセチル反応基とを両端に有する架橋剤；succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate（SPDP）、succinimidyl 6-(3(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate（LC-SPDP）、succinimidyl 6-(3(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate（Sulfo-LC-SPDP）、4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-α(2-pyridyldithio) toluene（SMPT）、2-Pyridyldithiol-tetraoxatetradecane-N-hydoxysuccinimide（PEG4-SPDP）、2-Pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydoxysuccinimide（PEG12-SPDP）等のＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ピリジルジチオール反応基とを両端に有する架橋剤；等があげられる。
　前記アミノ酸の主鎖または側鎖のカルボキシル基を利用する場合、前記架橋剤としては、例えば、Dicyclohexylcarbodiimide（DCC）、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide（EDC）、N-hydroxysuccinimide（NHS）、N-hydroxysulfosuccinimide（Sulfo-NHS）、無水酢酸等があげられる。なお、DCC、EDC、NHS、Sulfo-NHS、無水酢酸は、例えば、アミノ基とカルボキシル基とを直接結合させるため、カルボキシル基とアミノ基との間に残存せず、架橋剤に由来するリンカー領域（基）は生じない。
　前記架橋剤は、リンカーの長さを略一定化または一定化できることから、自己縮合が実質的に生じない架橋剤が好ましい。前記「リンカーの長さが一定」は、例えば、複数のアプタマーのリンカーにおいて、各アプタマーのリンカーの長さが略同じまたは同じであることを意味する。前記リンカーの長さは、例えば、リンカーの構造を同一とすることにより達成できる。第３の例では、このような架橋剤を用いることにより、ＭＳＳの感度を向上できる。前記感度の向上は、以下の理由によると推定される。なお、本発明は、以下の推定に何ら制限されない。アプタマーにターゲットが結合すると、ターゲットと結合したアプタマーの周囲には、前記ターゲットに起因する立体的障害が生じる。前記アプタマーが前記ＭＳＳ膜に対して異なる距離で固定化されている場合、前記ターゲットは、前記ＭＳＳ膜から遠位端側に存在するアプタマーと接触する可能性が高い。このため、前記ターゲットは、前記ＭＳＳ膜から遠位端側のアプタマーと優先的に結合すると推定される。この場合、前記ターゲットが結合したアプタマーの周囲に前記ターゲットに起因する立体的障害が生じても、他のアプタマーは、前記ターゲットが結合したアプタマーと比較して、前記ＭＳＳ膜側に存在するものが多いため、前記ターゲットに起因する立体的障害を受けづらい。このため、前記ターゲットがアプタマーに結合しても、周囲に存在するアプタマーが、立体的障害による影響を受けて、位置が動く可能性が低い。したがって、前記アプタマーが前記ＭＳＳ膜に対して異なる距離で固定化されている場合、前記ＭＳＳ膜上では、前記周囲のアプタマーの位置の移動に起因して、ＭＳＳ膜の歪みが生じる可能性も相対的に低い。他方、前記アプタマーが前記ＭＳＳ膜に対して略同一の距離で固定化されている場合、アプタマーにターゲットが結合すると、周囲のアプタマーは、前記ターゲットに起因する立体的障害の影響を受ける。このため、周囲のアプタマーの位置が動く可能性が高く、周囲のアプタマーの位置の移動に起因して、ＭＳＳ膜の歪みが生じる可能性も相対的に高い。すなわち、前記アプタマーが前記ＭＳＳ膜に対して略同一の距離で固定化されている場合、前記ＭＳＳ膜上では、１つのアプタマーとターゲットとの結合により、周囲のアプタマーの位置の移動も生じるため、前記ＭＳＳ膜の歪みが増幅されることになる。したがって、前記アプタマーが前記ＭＳＳ膜に対して略同一の距離で固定化されている場合、すなわち、前記リンカーの長さが略一定化されている場合、前記ＭＳＳ膜は、感度が向上すると推定される。
　前記自己縮合が実質的に生じない架橋剤の具体例としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを両端に有する架橋剤、イミドエステル反応基を両端に有する架橋剤、マレイミド基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを分子の両端に有する架橋剤、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ハロアセチル反応基とを両端に有する架橋剤、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ピリジルジチオール反応基とを両端に有する架橋剤、DCC、EDC、NHS、Sulfo-NHS、無水酢酸等があげられる。
　前記リンカーは、例えば、下記式（１）で表される。下記式（１）において、Ｍ１は、ＭＳＳ膜上のシランカップリング剤と結合している原子を表し、Ｌ１は、シランカップリング剤由来の領域（基）を表し、Ｌ２は、架橋剤由来の領域（基）を表し、Ｌ２は、あってもなくてもよく、Ｍ２は、アフィニティータグにおける架橋剤またはＮＨと結合している原子を表す。また、ＮＨは、アミノ基を有するシランカップリング剤のアミノ基由来のアミンを表す。
　Ｍ１－Ｌ１－ＮＨ－Ｌ２－Ｍ２・・・（１）
　Ｌ１は、例えば、（Ｍ１）－Ｓｉ（ＣＨ３）２－ｍ（ＯＲ４）ｍ－Ｒ１－（ＮＨ）または（Ｍ１）－Ｓｉ（ＣＨ３）２－ｍ（ＯＲ４）ｍ－Ｒ２－ＮＨ－Ｒ３－（ＮＨ）で表される。Ｒ１は、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分枝状のアルキル基である。Ｒ２およびＲ３は、例えば、それぞれ独立して、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、同じでもよいし、異なってもよい。前記アルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等があげられる。Ｒ４は、例えば、水素原子または結合手である。ｍは、１または２である。
　前記シランカップリング剤として、３－アミノプロピルトリエトキシシランを用いた場合、Ｌ１は、例えば、（Ｍ１）－Ｓｉ（ＯＲ４）２－（ＣＨ２）３－（ＮＨ）で表される。Ｒ４は、例えば、水素原子または結合手である。また、前記架橋剤として、グルタルアルデヒドを用いた場合、Ｌ２は、例えば、（ＮＨ）＝ＣＨ－Ｃ３Ｈ６－ＣＨ＝（ＣＨ（ＣＨＯ）－Ｃ２Ｈ４－ＣＨ）ｎ＝ＣＨ（ＣＨＯ）－Ｃ２Ｈ４－Ｃ＝（Ｍ２）で表される。
　前記リンカーの長さは、例えば、ＭＳＳ膜上の官能基（例えば、シリコン膜上のシラノール基の酸素原子）と、アビジン等のアフィニティータグまでの最短の分子鎖の長さ（主鎖長）で表すことができる。前記リンカーの主鎖長は、１～２０であり、ＭＳＳの感度を向上できることから、好ましくは、１～１５、１～１３、３～１３、５～１３、１～１１、３～１１、１～１０、３～１０、１～８、３～８、１～５、１～３、１または２である。
　なお、第３の例では、アビジン類－ビオチン類の結合を利用しているが、第３の例は、これに限定されず、前記アプタマーの水酸基またはリン酸基に、リンカーを直接結合させてもよい。この場合、アプタマーは、３’末端のリン酸基をアミダイド化し、前記リンカーと反応させることにより、前記ＭＳＳ膜に固定化できる。
　第４の例として、前記ＭＳＳ膜に対して、メタクリル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）を結合させ、さらにアミノ酸またはその誘導体（以下、「アミノ酸誘導体」という）を介して、前記ストレプトアビジン類を結合させる方法があげられる。すなわち、前記ＭＳＳ膜に対して、メタクリル基を有するシランカップリング剤を反応させ、前記ＭＳＳ膜上にアミノ基を結合させる。前記反応は、例えば、メタクリル基を有するシランカップリング剤を含む溶液を前記ＭＳＳ膜に塗布することにより実施できる。さらに、前記ＭＳＳ膜に対して、Ｎ－アセチルシステイン等のアミノ酸誘導体を反応させた後、前記アミノ酸誘導体の主鎖または側鎖と、アビジン類のアミノ酸の主鎖または側鎖の間にリンカーを形成可能な架橋剤とを反応させ、前記ＭＳＳ膜上の前記アミノ酸誘導体に架橋剤の一端を結合させる。具体的には、アミノ酸誘導体処理後のＭＳＳ膜について、膜表面を洗浄し、架橋剤を含む溶液を前記ＭＳＳ膜に塗布し、前記アミノ酸誘導体と、前記架橋剤とを結合させる。前記架橋反応の条件は、例えば、架橋剤の種類に応じて適宜決定できる。つぎに、前記架橋剤の他端に前記アビジン類を結合させる。具体的には、架橋後のＭＳＳ膜について、膜表面を洗浄し、アビジン類を含む溶液を塗布し、架橋剤の他端と、アビジン類のアミノ酸の主鎖または側鎖とを結合させる。そして、このように処理した前記ＭＳＳ膜に、前記ビオチンを結合させたアプタマーを接触させ、前記ビオチン類と前記アビジン類との結合により、前記アプタマーを固定化できる。
　前述のように、前記シランカップリング剤は、例えば、Ｙ－Ｓｉ（ＣＨ３）３－ｎ（ＯＲ）ｎで表される。前記シランカップリング剤がメタクリル基を有するシランカップリング剤の場合、ｎ、Ｒ、およびＹは、例えば、以下の例があげられる。前記「ｎ」は、２または３である。Ｒは、例えば、メチル基、エチル基等のアルキル基；アセチル基、プロピル基等のアシル基；等があげられる。Ｙは、メタクリル基を末端に有する反応性官能基である。
　前記メタクリル基を有するシランカップリング剤は、例えば、３－（メタクリロイルオキシ）プロピルメチルジメトキシシラン（例えば、KBM-502（信越シリコーン社製））、３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシラン（例えば、KBM-503（信越シリコーン社製）、GENIOSIL（登録商標）GF31（旭化成ワッカーシリコーン社製））、３－（メタクリロイルオキシ）プロピルメチルジメトキシシラン（例えば、KBE-502（信越シリコーン社製））、（３－メタクリロイルオキシプロピル）トリエトキシシラン（例えば、KBE-503（信越シリコーン社製））等があげられる。
　前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体は、例えば、メタクリル基と反応可能な官能基と、カルボキシル基とを有する。前記メタクリル基と反応可能な官能基は、例えば、チオール基（－ＳＨ）等があげられる。前記チオール基を有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、例えば、システイン；Ｎ－アセチルシステイン等のアミノ基が修飾されたシステイン；等があげられる。
　前記架橋剤は、例えば、架橋に供するアミノ酸誘導体の官能基と、架橋に供するアビジン類のアミノ酸の官能基とに応じて、適宜決定できる。具体例として、２つの官能基がアミノ基の場合、前記架橋剤は、前記第３の例における前記アミノ酸の主鎖または側鎖のアミノ基を利用する場合の架橋剤の説明を援用できる。また、２つの官能基の一方がアミノ基であり、他方がチオール基である場合、前記架橋剤は、前記第３の例における前記アミノ酸の側鎖のチオール基を利用する場合の架橋剤の説明を援用できる。さらに、２つの官能基の一方がアミノ基であり、他方がカルボキシル基である場合、前記架橋剤は、前記第３の例における前記アミノ酸の主鎖または側鎖のカルボキシル基を利用する場合の架橋剤の説明を援用できる。
　前記架橋剤は、リンカーの長さを一定化できることから、自己縮合が実質的に生じない架橋剤が好ましい。第４の例では、このような架橋剤を用いることにより、前述の第３の例で説明するメカニズムと同様のメカニズムにより、ＭＳＳの感度を向上できる。自己縮合が実質的に生じない架橋剤の具体例としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを両端に有する架橋剤、イミドエステル反応基を両端に有する架橋剤、マレイミド基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを分子の両端に有する架橋剤、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ハロアセチル反応基とを両端に有する架橋剤、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと、ピリジルジチオール反応基とを両端に有する架橋剤、DCC、EDC、NHS、Sulfo-NHS、無水酢酸等があげられる。
　前記リンカーは、例えば、下記式（２）で表される。下記式（２）において、Ｍ１は、ＭＳＳ膜上のシランカップリング剤と結合している原子を表し、Ｌ１は、シランカップリング剤由来の領域（基）を表し、Ａは、アミノ酸誘導体を表し、Ｌ２は、架橋剤由来の領域（基）を表し、Ｌ２は、あってもなくてもよく、Ｍ２は、アフィニティータグにおける架橋剤またはＮＨと結合している原子を表す。
　Ｍ１－Ｌ１－Ａ－Ｌ２－Ｍ２・・・（２）
　Ｌ１は、例えば、（Ｍ１）－Ｓｉ（ＣＨ３）２－ｍ（ＯＲ４）ｍ－Ｒ５－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨｌ（ＣＨ３）２－ｌ－（Ａ）で表される。Ｒ４は、例えば、水素原子または結合手である。Ｒ５は、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分枝状のアルキル基である。前記アルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等があげられる。ｍは、１または２である。ｌは、０または１である。
　前記シランカップリング剤として、３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシランを用いた場合、Ｌ１は、例えば、（Ｍ１）－Ｓｉ（ＯＲ４）２－（ＣＨ２）３－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（ＣＨ３）２－（Ａ）で表される。Ｒ４は、例えば、水素原子または結合手である。また、前記アミノ酸誘導体として、Ｎ－アセチルシステインを用いた場合、Ａは、例えば、（Ｌ１）－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（－ＮＨＣＯＣＨ３）－Ｃ（＝Ｏ）－（Ｍ２）で表される。前記架橋剤として、無水酢酸を用いた場合、Ｌ２は、例えば、存在しない。
　前記リンカーの長さは、例えば、ＭＳＳ膜上の官能基（例えば、シリコン膜上のシラノール基）と、アビジン等のアフィニティータグまでの最短の分子鎖の長さ（主鎖長）で表すことができる。前記リンカーの主鎖長は、１～２０であり、ＭＳＳの感度を向上できることから、好ましくは、１～１５、１～１３、１～１１、１～１０、１～８、１～５、１～３、１または２である。
　なお、第４の例では、アビジン類－ビオチン類の結合を利用しているが、第４の例は、これに限定されず、前記アプタマーの水酸基またはリン酸基に、リンカーを直接結合させてもよい。この場合、アプタマーは、３’末端のリン酸基をアミダイド化し、前記リンカーと反応させることにより、前記ＭＳＳ膜に固定化できる。
　前記ＭＳＳ膜に対する前記アプタマーの固定化部位は、特に制限されず、例えば、３’末端または５’末端があげられる。
　本実施形態のＭＳＳにおいて、前記センサ基板は、前記ＭＳＳ膜を支持する支持領域を有し、前記支持領域は、ピエゾ抵抗素子を有する。前記センサ基板は、前記支持領域によって、前記ＭＳＳ膜を支持する。前記ＭＳＳ膜は、例えば、対向する一方の表面または両方の表面に、前述のように前記アプタマーが固定化され、側面において、前記センサ基板により支持される。前記センサ基板は、例えば、前記ＭＳＳ膜を部分的に支持することが好ましく、具体的に、前記ＭＳＳ膜の側面を部分的に支持することが好ましい。前記ＭＳＳ膜において、前記センサ基板の支持領域によって支持されている箇所（支持部）の数は、特に制限されず、例えば、４点である。なお、これは例示であって、何ら制限されない。
　前記センサ基板において、前記支持領域は、例えば、シリコン膜であり、前記シリコン膜の任意の領域を、不純物のドーピングによりｐ型化することによって、前記ｐ型化した領域（ｐ型Ｓｉ）を、前記ピエゾ抵抗素子として機能させることができる。前記支持領域は、例えば、前記ＭＳＳ膜を支持している箇所またはその付近に、前記ピエゾ抵抗素子を有する。前記センサ基板は、例えば、全体がシリコン製でもよいし、前記支持領域のみがシリコン膜でもよく、前記ピエゾ抵抗素子を含む支持領域以外の材料は、特に制限されない。
　本実施形態のＭＳＳにおいて、例えば、前記センサ基板は、電圧を印加するための回路を有する。前記支持領域が、複数の点で前記ＭＳＳ膜を支持し、その支持している箇所およびその付近に、それぞれピエゾ抵抗素子を有する場合、例えば、前記回路は、前記支持領域における複数のピエゾ抵抗素子を含むホイートストンブリッジ回路があげられる。本実施形態のＭＳＳは、例えば、前記ホイートストンブリッジ回路に電圧を印加することで、前述のように、前記ピエゾ抵抗素子における抵抗値の変化に伴う電気シグナルを測定できる。
　本実施形態のＭＳＳは、例えば、前記センサ基板が、複数の前記支持領域を有し、前記複数の支持領域が、それぞれ、前記ＭＳＳ膜を支持してもよい。本実施形態のＭＳＳにおいて、前記支持領域の数および支持される前記ＭＳＳ膜の数は、特に制限されず、それぞれ、１つでもよいし、２つ以上の複数でもよい。本実施形態のＭＳＳが複数の前記ＭＳＳ膜を有する場合、前記複数のＭＳＳ膜は、例えば、同じターゲットに対するアプタマーが固定化されたＭＳＳ膜でもよいし、異なるターゲットに対するアプタマーが固定化されたＭＳＳ膜でもよく、両方であってもよい。ここで、「同じターゲットに対するアプタマー」とは、例えば、同じターゲットに対する同じ配列のアプタマーでもよいし、同じターゲットに対する異なる配列のアプタマーでもよい。
　本実施形態のＭＳＳが同じターゲットに対するアプタマーが固定化されたＭＳＳ膜を複数有する場合、例えば、同じターゲットに対する分析を一つのＭＳＳで、同時に複数行うことができる。また、本実施形態のＭＳＳが異なるターゲットに対するアプタマーが固定化されたＭＳＳ膜を複数有する場合、例えば、異なるターゲットに対する分析を一つのＭＳＳで、同時に行うことができる。この場合、本発明の分析キットは、各ターゲットに対応する第１の結合物質を有する。
　本実施形態のＭＳＳは、例えば、使用時において、前記センサ基板に前記ＭＳＳ膜が配置された形態であればよく、使用前は、前記センサ基板と前記ＭＳＳ膜とが別個独立した形態でもよい。後者の場合、例えば、本発明のＭＳＳは、例えば、前記センサ基板と前記ＭＳＳ膜とを別個独立に含むキットであってもよい。
　本実施形態のＭＳＳは、例えば、後述する分析方法において、既存の計測モジュールを使用して、前記ＭＳＳにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化に伴う抵抗値の変化を、電子シグナルとして測定することができる。
［実施形態２］
　本実施形態のターゲットの分析方法は、サンプル液と、前記本発明の分析キットと接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第１の結合物質と、前記第２の結合物質との複合体を形成する複合体形成工程と、液相中で前記膜型表面応力センサに電圧を印加する印加工程と、前記膜型表面応力センサにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化の測定により、前記サンプル液中のターゲットを分析する分析工程とを含む。本実施形態の分析方法は、本発明の分析キットを使用することが特徴であり、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
　前記複合体形成工程は、例えば、前記分析キットにおけるＭＳＳを、前記サンプル液と、前記第１の結合物質と接触（共存）させることで実施できる。前記接触において、例えば、前記ＭＳＳと、前記サンプル液と、前記第１の結合物質との接触は、別個に実施してもよいし、同時に実施してもよい。
　前記接触を別個に実施する場合、前記サンプル液と、前記ＭＳＳとを接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第２の結合物質との第１の複合体を形成させる第１の複合体形成工程と、前記第１複合体形成後の膜型表面応力センサと、前記第１の結合物質とを接触させ、前記第１の複合体と、前記第１の結合物質との複合体を形成させる第２の複合体形成工程とを含む。前記接触は、前記ＭＳＳを、前記サンプル液に浸漬することにより実施できる。具体的には、前記第１の複合体形成工程における接触は、前記センサ基板における前記ピエゾ抵抗素子を含む支持領域と、それに支持された前記ＭＳＳ膜とを、前記サンプル液に浸漬させることにより、実施できる。前記サンプル液への前記ＭＳＳの浸漬条件は、特に制限されず、例えば、温度２０～３５℃で０．１～１２０分、温度５０～６０℃で０．１～１２０分等が例示できる。前記ＭＳＳが複数のＭＳＳ膜を有する場合は、例えば、前記ＭＳＳにおける複数のＭＳＳ膜を同時に同じサンプル液に浸漬させればよい。
　つぎに、前記第２の複合体形成工程では、前記ＭＳＳを、前記第１の結合物質と接触させる。前記第１の結合物質との接触は、例えば、前記第１の結合物質を含む液に、前記センサ基板における前記ピエゾ抵抗素子を含む支持領域と、それに支持された前記ＭＳＳ膜とを浸漬させることにより、実施してもよいし、前記ＭＳＳが浸漬しているサンプル液に、前記第１の結合物質を添加することにより実施してもよい。前記第１の結合物質との反応条件は、特に制限されず、前記ＭＳＳの浸漬条件の説明を援用できる。
　他方、前記接触を同時に実施する場合、前記サンプル液と、前記ＭＳＳと、前記第１の結合物質とを接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第２の結合物質と、前記第１の結合物質との複合体を形成させる。前記接触は、前記ＭＳＳの前記サンプル液への浸漬と、前記サンプル液への前記第１の結合物質の添加とを並行して行なうことにより実施できる。具体的には、前記接触は、前記センサ基板における前記ピエゾ抵抗素子を含む支持領域と、それに支持された前記ＭＳＳ膜とを、前記サンプル液に浸漬させると共に、前記サンプル液に前記第１の結合物質を添加することにより、実施できる。前記サンプル液への前記ＭＳＳの浸漬条件は、特に制限されず、例えば、温度２０～３５℃で０．１～１２０分、温度５０～６０℃で０．１～１２０分等が例示できる。前記ＭＳＳが複数のＭＳＳ膜を有する場合は、例えば、前記ＭＳＳにおける複数のＭＳＳ膜を同時に同じサンプル液に浸漬させればよい。
　前記印加工程は、前述のように、液相中で前記膜型表面応力センサに電圧を印加する。前記電圧の印加条件は、特に制限されず、例えば、市販のＭＳＳと同様の条件が例示できる。前記液相は、例えば、前記浸漬工程におけるサンプル液でもよいし、他の溶媒でもよい。後者の場合、前記浸漬工程後の前記ＭＳＳを、前記サンプル液から取出し、新たな溶媒に浸漬させて、電圧を印加すればよい。前記サンプル液への浸漬工程後、前記サンプル中の前記アプタマーに結合しなかった物質を除去するために、前記ＭＳＳを洗浄した場合等、このように新たな溶媒に前記ＭＳＳを浸漬させて、電圧を印加することが好ましい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝液、水等があげられる。
　前記印加のタイミングは、前記複合体形成工程の開始、前記複合体形成工程中、または前記複合体形成工程後である。
　前記分析工程は、前述のように、前記ＭＳＳにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化の測定により、前記サンプル液中のターゲットを分析する。前記応力変化の測定は、例えば、電気シグナルの測定により行うことができ、市販の計測モジュール（例えば、ＭＳＳ-８ＲＭ、ＮＡＮＯＳＥＮＳＯＲ社）等が使用できる。本発明の分析方法では、例えば、前記ターゲットに結合しないコントロールの結合物質をＭＳＳ膜に固定し、リファレンスのＭＳＳとしてもよい。この場合、前記分析工程では、例えば、リファレンスのＭＳＳと前記第１の結合物質とを用いて測定したシグナルと、本発明の分析キットを用いた測定したシグナルとを用いて、分析してもよい。
［参考例１］
　市販のＭＳＳにおけるＭＳＳ膜に、アプタマーを固定化し、ターゲットの分析が可能であることを確認した。
（１）非特異的吸着法によるアプタマーの固定
　市販のＭＳＳ（商品名：SD-MSS-1K2G、NANOSENSOR社）を使用した。前記ＭＳＳの構成を、図２の上面図に示す。前記ＭＳＳは、図２に示すように、センサ基板１０が、電極１１、アルミ線１２、ＭＳＳ膜１３およびピエゾ抵抗素子１４を有し、ＭＳＳ膜１３は、ピエゾ抵抗素子１４を介してアルミ線１２と連結し、アルミ線１２は、それぞれ電極１１と連結した構造である。
　前記センサ基板上の前記アルミ線に、アクリル樹脂（商品名：Mr.COLOR 62、GSI クレオス社製)、およびエポキシ樹脂（商品名PM 165-R Hi、セメダイン社製）を塗布して、防水処理を施した。そして、処理後の前記センサ基板を、その電極が挿入されるように、コネクタ付き基板（商品名IFB-FFC-(0.5)4P-B、AITENDO社製）に連結させた。さらに、前記コネクタ付き基板のコネクタの全体について、金属の露出部、および金属部へつながる隙間等に、前述と同じ樹脂を塗布・充填することによって、防水処理を施した。
　つぎに、前記センサ基板のＭＳＳ膜に対して、その裏面（前記アルミ線が形成されている表面とは反対側の面）に、ストレプトアビジン溶液１μｌを滴下し、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記ストレプトアビジン溶液は、ストレプトアビジンが２％となるように１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して調製した。つぎに、前記ＰＢＳで前記裏面を洗浄した後、前記ＭＳＳ膜の表面に、前記ストレプトアビジン溶液３μｌを滴下し、同条件で静置し、さらに、前記ＰＢＳで洗浄した。そして、前記センサ基板を、１０分間、室温で乾燥させた。
　このようにして、２つの前記センサ基板を処理し、一方のセンサ基板には、アプタマーをさらに結合させ、参考例１ＡのＭＳＳとし、他方のセンサ基板には、ポリＴをさらに結合させ、ネガティブコントロール（ＮＣ）１ＡのＭＳＳとした。
　すなわち、前記一方のセンサ基板には、アプタマー溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記アプタマー溶液は、３’末端にビオチンタグが付加されたトロンビンアプタマー（配列番号１：GGTTGGTGTGGTTGGTTTTT-biotin-3’）を終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。前記トロンビンアプタマーは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記トロンビンアプタマーが固定されることになる。これを参考例１ＡのＭＳＳとした。
　前記他方のセンサ基板には、ポリＴ溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記ポリＴ溶液は、３’末端にビオチンタグが付加されたポリＴのＤＮＡ（配列番号２：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3’）を終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。前記ポリＴは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記ポリＴが固定されることになる。これをＮＣ１ＡのＭＳＳとした。
（２）金蒸着法によるアプタマーの固定
　特に示さない限りは、前記（１）と同様の処理を行った。すなわち、前記市販のＭＳＳのセンサ基板について、前記センサ基板上のアルミ線への防水処理を施した後、前記センサ基板の電極をマスクし、前記ＭＳＳ膜を含めた前記センサ基板の全面にチタン蒸着を行い、その後、さらに金蒸着を行った。前記チタン蒸着により、厚さ約５ｎｍのチタン薄膜を形成し、前記金蒸着により、厚さ約１００ｎｍの金薄膜を形成した。そして、前記センサ基板をエタノールで洗浄した。
　つぎに、前記センサ基板の全体を、１００μｍｏｌ／ｌ　ＢｉｏｔｉｎＳＡＭエタノール溶液（同仁化学研究所）に浸漬し、室温で１時間静置し、さらに、エタノールで洗浄した。そして、前記（１）と同様に、前記コネクタ付き基板に連結し、さらに前記コネクタ全体に防水処理を施した。
　つぎに、前記センサ基板のＭＳＳ膜に対して、その一方の表面（前記アルミ線が形成されている表面）に、０．５％のストレプトアビジン溶液１μｌを滴下し、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、０．５時間静置した。つぎに、前記ＰＢＳで洗浄した後、前記センサ基板を、１０分間、室温で乾燥させた。
　このようにして、２つの前記センサ基板を処理し、一方のセンサ基板には、アプタマーをさらに結合させ、参考例１ＢのＭＳＳとし、他方のセンサ基板には、ポリＴをさらに結合させ、ＮＣ１ＢのＭＳＳとした。
　すなわち、前記一方のセンサ基板には、アプタマー溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記アプタマー溶液は、前記トロンビンアプタマーを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で５０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記トロンビンアプタマーは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記トロンビンアプタマーが固定されることになる。これを参考例１ＢのＭＳＳとした。
　前記他方のセンサ基板には、ポリＴ溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記ポリＴ溶液は、前記ポリＴのＤＮＡを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で５０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記ポリＴは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記ポリＴが固定されることになる。これをＮＣ１ＢのＭＳＳとした。
（３）シランカップリング法によるアプタマーの固定－１
　前記市販のＭＳＳの前記センサ基板をエタノールで洗浄した後、前記ＭＳＳ膜が配置されている端部をシランカップリング溶液に浸漬して、室温で２０分間静置した。前記シランカップリング剤は、エタノール８ｍｌ、酢酸２００μｌ、ＡＰＴＭＳ（３－アミノプロピルトリエトキシシラン）１０μｌ、純水１．８ｍｌの組成とした。そして、前記センサ基板の浸漬させた前記端部を純水で洗浄し、１１０℃で１．５時間処理を行った。
　前記センサ基板について、前記（１）と同様に、前記センサ基板上のアルミ線への防水処理を施した後、前記センサ基板を、前記コネクタ付き基板に連結し、前記コネクタの全体に防水処理を施した。
　つぎに、前記センサ基板の前記ＭＳＳ膜の一方の表面（前記アルミ線が形成されている表面）に、１４％グルタルアルデヒド溶液１μｌを滴下し、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、０．７５時間静置した。つぎに、前記ＰＢＳで洗浄した後、前記センサ基板を、１０分間、室温で乾燥させた。さらに、前記センサ基板のＭＳＳ膜の同じ表面に、０．５％ストレプトアビジン溶液１μｌを滴下し、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、０．５時間静置した。つぎに、前記センサ基板について、前記ＭＳＳ膜が配置されている端部の前記表面を、０．１ｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄した後、さらに、０．１ｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）に前記端部を浸漬し、室温で１５分間静置した。その後、前記端部を前記ＰＢＳで洗浄した。
　このようにして、２つの前記センサ基板を処理し、一方のセンサ基板には、アプタマーをさらに結合させ、参考例１ＣのＭＳＳとし、他方のセンサ基板には、ポリＴをさらに結合させて、ＮＣ１ＣのＭＳＳとした。
　すなわち、前記一方のセンサ基板には、アプタマー溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記アプタマー溶液は、前記トロンビンアプタマーを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で３０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記トロンビンアプタマーは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記トロンビンアプタマーが固定されることになる。これを参考例１ＣのＭＳＳとした。
　前記他方のセンサ基板には、ポリＴ溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記ポリＴ溶液は、前記ポリＴのＤＮＡを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で３０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記ポリＴは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記ポリＴが固定されることになる。これをＮＣ１ＣのＭＳＳとした。
（４）シランカップリング法によるアプタマーの固定－２
　前記実施例１（１）の市販のＭＳＳの前記センサ基板をエタノールで洗浄した後、前記ＭＳＳ膜が配置されている端部をシランカップリング溶液を１００μｌほどでリンスし、室温で１．５時間放置した。前記シランカップリング剤は、エタノール８ｍｌ、酢酸２００μｌ、ＡＰＴＭＳ（トリメトキシリル３－プロピルメタクリル酸（３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシラン）１００μｌ、純水１．８ｍｌの組成とした。そして、前記センサ基板をエタノールで洗浄し、室温で５分乾燥した。
　つぎに、前記センサ基板のＭＳＳ膜の一方の表面（前記アルミ線が形成されている表面）に、Ｎ－アセチルシステイン溶液１μｌを滴下し、ＵＶ（ナイトライド社、ＮＳ３６５Ｌ－６ＳＭＧ）を数分照射した。水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、乾燥するまで照射した。その後、前記センサ基板を、純水で洗浄し、室温で乾燥した。
　つぎに、前記センサ基板のセンサ部分を無水酢酸溶液（１０％無水酢酸、９０％アセトニトリル）に浸し、６０℃、０．５時間反応させた。前記反応後、前記センサ基板をアセトニトリルで洗浄した。
　つぎに、前記センサ基板を、１０分間、室温で乾燥させた。さらに、前記センサ基板のＭＳＳ膜の同じ表面に、０．５％ストレプトアビジン溶液１μｌを滴下し、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１．５時間静置した。前記静置後、前記センサ基板を、前記ＰＢＳで洗浄した。
　前記センサ基板について、前記実施例１（１）と同様に、前記センサ基板上のアルミ線への防水処理を施した後、前記センサ基板を、前記コネクタ付き基板に連結し、前記コネクタの全体に防水処理を施した。
　このようにして、２つの前記センサ基板を処理し、一方のセンサ基板には、アプタマーをさらに結合させ、参考例１ＤのＭＳＳとし、他方のセンサ基板には、ポリＴをさらに結合させて、ＮＣ１ＤのＭＳＳとした。
　すなわち、前記一方のセンサ基板には、アプタマー溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記アプタマー溶液は、前記トロンビンアプタマーを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で３０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記トロンビンアプタマーは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、図３に示すように、前記ＭＳＳ膜の表面に前記トロンビンアプタマーが固定されることになる。これを参考例１ＤのＭＳＳとした。なお、参考例１ＤのＭＳＳは、アプタマーが、ＭＳＳ膜に対して略同一の距離で固定化されたＭＳＳに対応する。
　前記他方のセンサ基板には、ポリＴ溶液３μｌを、前記表面に滴下して、水蒸気雰囲気下（１００％（相対湿度））、室温で、１時間静置した。前記ポリＴ溶液は、前記ポリＴのＤＮＡを終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。静置後、さらに、１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳに浸漬し、室温で３０分静置し、前記ＰＢＳで洗浄した。前記ポリＴは、ビオチンタグを有することから、前記ＭＳＳ膜の表面にストレプトアビジンが結合していれば、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンとの結合により、前記ＭＳＳ膜の表面に前記ポリＴが固定されることになる。これをＮＣ１ＤのＭＳＳとした。
（５）電気シグナルの検出
　参考例１Ａ～参考例１ＤのＭＳＳ、ＮＣ１Ａ～ＮＣ１ＤのＭＳＳを、それぞれセットとし、同時にサンプル液に浸漬し、電圧を印加し、応力変化に伴う電圧変化を測定した。具体的には、まず、前記ＰＢＳに、前記ＭＳＳにおけるＭＳＳ膜を含む端部を浸漬し、前記ＭＳＳに電圧を印加して、電圧のシグナルが安定するまで放置した。そして、電圧のシグナルが十分に安定した計測時間１４００秒または２１００秒の時点で、前記ＭＳＳの浸漬をトロンビン溶液に切り替え、電圧のシグナルを引き続き測定した。前記トロンビン溶液は、終濃度２４０ｎｍｏｌ／ｌとなるようにトロンビン試薬（αＴｈｒｏｍｂｉｎ，Ｈｕｍａｎ、フナコシ社製）を前記ＰＢＳに混合して調製した。これらの結果を図４に示す。
　図４は、電圧を示すグラフである。図４において、（Ａ）は、参考例１ＡおよびＮＣ１Ａの結果を示し、（Ｂ）は、参考例１ＢおよびＮＣ１Ｂの結果を示し、（Ｃ）は、参考例１ＣおよびＮＣ１Ｃの結果を示し、（Ｄ）は、参考例１ＤおよびＮＣ１Ｄの結果を示す。図４において、横軸は、トロンビン溶液に切替えた後の経過時間を示し、縦軸は、電圧（μＶ）を示す。図４（Ａ）～（Ｄ）に示すように、いずれのＭＳＳにおいても、参考例のＭＳＳは、コントロールのＭＳＳと比較して、平均して低い電圧を示した。また、電圧降下後の安定化しつつある状況において、参考例のＭＳＳの電圧と、コントロールのＭＳＳの電圧との差を比較した場合、電圧の差の平均値は、参考例１Ｄ（約１５μＶ）＞参考例１Ａ（約１３μＶ）＞参考例１Ｃ（約１０μＶ）≧参考例１Ｂ（約７μＶ）であった。
　以上のことから、ＭＳＳ膜上に、第２の結合物質を配置することにより、ターゲットを検出できることがわかった。
［実施例１］
　本発明の分析キットを用いた分析方法により、シグナルが増強することを確認した。
（１）ＭＳＳの作製
　実施例の分析キットに用いるＭＳＳ（実施例１のＭＳＳ）は、前記参考例１Ａと同様にして作製した。また、コントロールのＭＳＳ（比較例１のＭＳＳ）は、前記ＮＣ１Ａと同様にして作製した。
（２）固定化アプタマーの作製
　担体として、アビジン標識磁気ビーズ（粒径：２．８μｍ、Dynabeads M-280 Streptavidin、ベリタス社製）を用いた。つぎに、５’末端がビオチン標識されたトロンビンアプタマー（配列番号３：5’-biotin-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’）を終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるように、前記ＰＢＳに懸濁して調製した。前記トロンビンアプタマーは、ビオチンタグを有することから、前記磁気ビーズのストレプトアビジンが結合することにより、担体に固定化したアプタマーを調製できる。なお、配列番号３のトロンビンアプタマーは、配列番号１のトロンビンアプタマーと、トロンビンの異なる位置に結合し、かつ競合しないことを確認している。そして、１００μｌのアビジン標識磁気ビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）と、２μｌのアプタマー溶液（１００μｍｏｌ／ｌ）とを混合し、室温で、０．５時間静置した。これにより、前記担体に固定化されたアプタマーを作製した。
（３）電気シグナルの検出
　実施例１のＭＳＳおよび比較例１のＭＳＳを、それぞれセットとし、同時にサンプル液に浸漬し、電圧を印加し、応力変化に伴う電圧変化を測定した。具体的には、まず、前記ＰＢＳに、前記ＭＳＳにおけるＭＳＳ膜を含む端部を浸漬し、前記ＭＳＳに電圧を印加して、電圧のシグナルが安定するまで放置した。そして、電圧のシグナルが十分に安定した計測時間１４００秒の時点で、前記ＭＳＳの浸漬をトロンビン溶液に切り替え、電圧のシグナルを引き続き測定した。前記トロンビン溶液は、終濃度２４０ｎｍｏｌ／ｌとなるようにトロンビン試薬（αＴｈｒｏｍｂｉｎ，Ｈｕｍａｎ、フナコシ社）を前記ＰＢＳに混合して調製した。
　前記サンプル液において、電圧のシグナルが十分に安定した後、前記担体に固定化されたアプタマーを含む溶液に切り替え、電圧のシグナルを引き続き測定した。この結果を図５に示す。
　図５は、経時的な電圧の測定を示すグラフである。図５において、横軸は、トロンビン溶液に切替えた後の経過時間を示し、縦軸は、電圧（μＶ）を示す。なお、図中の比較例１のＭＳＳにおける３５０秒前後における電圧のブレは、測定者が、比較例１のＭＳＳに誤って触れてしまったためにより生じている。図５に示すように、実施例１のＭＳＳ（Aptamer）を用いた分析では、比較例１のＭＳＳ（poly T）を用いた分析と比較して、電圧値として、約７０～８０の差が生じ、本発明の分析キットおよび分析方法により、ターゲットの分析が可能であることがわかった。また、前記参考例１において、参考例１Ａ～１ＤのＭＳＳは、ＮＣ１Ａ～１Ｄと比較して、電圧値として、約５～１０倍の差が生じている。このため、本発明の分析キットおよび分析方法によれば、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳと比較して、約５倍以上の強い電気シグナルを得られることがわかった。
　以上のことから、本発明の分析キットを用いた分析方法により、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳを用いた分析と比較して、シグナルが増強することが確認できた。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２０年３月２６日に出願された日本出願特願２０２０－０５６８９６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
ターゲットに結合する第１の結合物質と、膜型表面応力センサとを含み、
前記膜型表面応力センサは、第２の結合物質と、膜と、センサ基板とを含み、
前記第２の結合物質は、前記ターゲットに結合し、前記膜に固定化され、
前記膜は、前記第２の結合物質への前記ターゲットの結合により変形する膜であり、
前記センサ基板は、支持領域を有し、
前記支持領域は、前記膜を支持し、ピエゾ抵抗素子を有し、
前記ピエゾ抵抗素子は、前記膜の変形を検出する素子である、
ターゲットの分析キット。
（付記２）
前記第１の結合物質は、アプタマーまたは抗体である、付記１記載の分析キット。
（付記３）
前記第１の結合物質は、担体に固定化されている、付記１または２記載の分析キット。
（付記４）
前記担体は、ビーズである、付記３記載の分析キット。
（付記５）
前記第２の結合物質は、アプタマーまたは抗体である、付記１から４のいずれかに記載の分析キット。
（付記６）
前記膜が、シリコン膜である、付記１から５のいずれかに記載の分析キット。
（付記７）
前記支持領域は、前記膜を部分的に支持する、付記１から６のいずれかに記載の分析キット。
（付記８）
前記膜の一方の表面に前記第２の結合物質が固定化されている、付記１から７のいずれかに記載の分析キット。
（付記９）
前記膜の両面に前記第２の結合物質が固定化されている、付記１から７のいずれかに記載の分析キット。
（付記１０）
前記第２の結合物質が、アビジンまたはアビジン誘導体と、ビオチンまたはビオチン誘導体との結合体を介して、前記膜に固定化されている、付記１から９のいずれかに記載の分析キット。
（付記１１）
前記膜の表面に、金属膜を有し、前記金属膜を介して、前記第２の結合物質が、前記膜の表面に固定化されている、付記１から９のいずれかに記載の分析キット。
（付記１２）
前記第２の結合物質は、リンカーを介して、前記膜表面に固定化されている、付記１から１０のいずれかに記載の分析キット。
（付記１３）
前記リンカーの長さは、略一定である、付記１２記載の分析キット。
（付記１４）
前記リンカーは、シランカップリング剤を含む、付記１２または１３記載の分析キット。
（付記１５）
前記センサ基板が、複数の支持領域を有し、
前記複数の支持領域は、それぞれ、前記膜を支持する、付記１から１４のいずれかに記載の分析キット。
（付記１６）
前記複数の膜型表面応力センサが、異なるターゲットに対する第２の結合物質が固定化されたセンサを含み、
前記第１の結合物質として、異なるターゲットに対する第１の結合物質を含む、付記１５記載の分析キット。
（付記１７）
前記センサ基板は、回路を有し、
前記支持領域は、複数のピエゾ抵抗素子を含み、
前記回路は、前記複数のピエゾ抵抗素子を含むホイートストンブリッジ回路である、付記１から１６のいずれかに記載の分析キット。
（付記１８）
サンプル液と、付記１から１７のいずれかに記載の分析キットと接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第１の結合物質と、前記第２の結合物質との複合体を形成する複合体形成工程と、
液相中で前記膜型表面応力センサに電圧を印加する印加工程と、
前記膜型表面応力センサにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化の測定により、前記サンプル液中のターゲットを分析する分析工程とを含む、ターゲットの分析方法。
（付記１９）
前記複合体形成工程は、
　前記サンプル液と、前記膜型表面応力センサとを接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第２の結合物質との第１の複合体を形成させる第１の複合体形成工程と、
　前記第１複合体形成後の膜型表面応力センサと、前記第２の結合物質とを接触させ、前記第１の複合体と、前記第２の結合物質との複合体を形成させる第２の複合体形成工程とを含む、付記１８記載の分析方法。
（付記２０）
前記印加工程において、前記液相が、前記サンプル液であり、
前記複合体形成工程と並行して前記印加工程を行う、付記１８または１９記載の分析方法。
　本発明によれば、ターゲットに結合可能な結合物質が固定化されたＭＳＳと比較して、強い電気シグナルを得られる。このため、本発明は、例えば、試料等の分析分野、医療分野等において有用である。
１０　　センサ基板
１１　　電極
１２　　アルミ線
１３　　ＭＳＳ膜
１４　　ピエゾ抵抗素子
１００　ＭＳＳ

 

Claims (20)

  1. ターゲットに結合する第１の結合物質と、膜型表面応力センサとを含み、
    前記膜型表面応力センサは、第２の結合物質と、膜と、センサ基板とを含み、
    前記第２の結合物質は、前記ターゲットに結合し、前記膜に固定化され、
    前記膜は、前記第２の結合物質への前記ターゲットの結合により変形する膜であり、
    前記センサ基板は、支持領域を有し、
    前記支持領域は、前記膜を支持し、ピエゾ抵抗素子を有し、
    前記ピエゾ抵抗素子は、前記膜の変形を検出する素子である、
    ターゲットの分析キット。
  2. 前記第１の結合物質は、アプタマーまたは抗体である、請求項１記載の分析キット。
  3. 前記第１の結合物質は、担体に固定化されている、請求項１または２記載の分析キット。
  4. 前記担体は、ビーズである、請求項３記載の分析キット。
  5. 前記第２の結合物質は、アプタマーまたは抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析キット。
  6. 前記膜が、シリコン膜である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析キット。
  7. 前記支持領域は、前記膜を部分的に支持する、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析キット。
  8. 前記膜の一方の表面に前記第２の結合物質が固定化されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析キット。
  9. 前記膜の両面に前記第２の結合物質が固定化されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析キット。
  10. 前記第２の結合物質が、アビジンまたはアビジン誘導体と、ビオチンまたはビオチン誘導体との結合体を介して、前記膜に固定化されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析キット。
  11. 前記膜の表面に、金属膜を有し、前記金属膜を介して、前記第２の結合物質が、前記膜の表面に固定化されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析キット。
  12. 前記第２の結合物質は、リンカーを介して、前記膜表面に固定化されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分析キット。
  13. 前記リンカーの長さは、略一定である、請求項１２記載の分析キット。
  14. 前記リンカーは、シランカップリング剤を含む、請求項１２または１３記載の分析キット。
  15. 前記センサ基板が、複数の支持領域を有し、
    前記複数の支持領域は、それぞれ、前記膜を支持する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析キット。
  16. 前記複数の膜型表面応力センサが、異なるターゲットに対する第２の結合物質が固定化されたセンサを含み、
    前記第１の結合物質として、異なるターゲットに対する第１の結合物質を含む、請求項１５記載の分析キット。
  17. 前記センサ基板は、回路を有し、
    前記支持領域は、複数のピエゾ抵抗素子を含み、
    前記回路は、前記複数のピエゾ抵抗素子を含むホイートストンブリッジ回路である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析キット。
  18. サンプル液と、請求項１から１７のいずれか一項に記載の分析キットと接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第１の結合物質と、前記第２の結合物質との複合体を形成する複合体形成工程と、
    液相中で前記膜型表面応力センサに電圧を印加する印加工程と、
    前記膜型表面応力センサにおける前記ピエゾ抵抗素子の応力変化の測定により、前記サンプル液中のターゲットを分析する分析工程とを含む、ターゲットの分析方法。
  19. 前記複合体形成工程は、
    　前記サンプル液と、前記膜型表面応力センサとを接触させ、前記サンプル液中のターゲットと、前記第２の結合物質との第１の複合体を形成させる第１の複合体形成工程と、
    　前記第１複合体形成後の膜型表面応力センサと、前記第１の結合物質とを接触させ、前記第１の複合体と、前記第１の結合物質との複合体を形成させる第２の複合体形成工程とを含む、請求項１８記載の分析方法。
  20. 前記印加工程において、前記液相が、前記サンプル液であり、
    前記複合体形成工程と並行して前記印加工程を行う、請求項１８または１９記載の分析方法。

     
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