ITMI20011138A1 - Vettore e metodi di impiego per l'espressione selettiva di geni in siti di angiogenesi in vivo - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un nuovo vettore di trasferimento, una particella che trasduce lo stesso vettore, metodi di trattamento di patologie correlate all 'angiogenesi utilizzanti lo stesso vettore, l'impiego dello stesso vettore per fabbricare medicamenti per uso i tali metodi di trattamento e metodi di somministrazione e di espressione di un gene in cellule responsabili di angiogenesi mediante trasduzione dello stesso vettore ex vivo.

Vengono descritti in particolare metodi differenti per introdurre il vettore in cellule impegnate nell'angiogenesi e/o loro precursori, sia in vivo sia ex vivo, per ottenere un'espressione selettiva in vivo.

La somministrazione di un gene in vivo è un potente approccio per studiare processi biologici e sviluppare terapie innovative. Si possono ottenere concentrazioni protratte, efficaci, di proteine o RNA mediante sintesi in situ in contrapposizione alle difficolta' tecniche di produzione in vitro e di somministrazione sistemica.

La somministrazione e l'espressione mirata di geni biologicamente attivi nell'instaurazione dell'angiogenesi patologica e tumorale potrebbero essere usate per inibire o favorire il processo, e/o per interferire con altri aspetti della patologia sottostante. L'espressione mirata di geni in cellule coinvolte nella neoformazione di vasi dovrebbe dare concentrazioni efficaci di un fattore biologico terapeutico soltanto in corrispondenza dei siti della patologia, alleviando le preoccupazioni di tossicità da una somministrazione diretta di dosi elevate e da un'espressione diffusa in tessuti sani.

L'angiogenesi tumorale è un processo centrale che controlla la crescita di un tumore effettuata da tessuti geneticamente stabili e secondo modelli comuni fra tumori eterogenei. Inoltre, essa presenta caratteristiche selettive utili per il bersagliamento specifico.

Un tumore si origina dall'interazione di una popolazione eterogenea di cellule trasformate in tessuti ospiti permettendo la crescita progressiva della massa tumorale e il suo supporto da parte dello stroma e di vasi sviluppati di recente. Queste interazioni hanno le seguenti caratteristiche importanti:

1. Il reclutamento di vasi diventa un fattore obbligato e di limitazione della velocità di crescita non appena il tumore raggiunge una massa critica e/o diventa invasiva (1).

2. La popolazione di cellule tumorali è eterogenea e geneticamente instabile (2, 3). I vasi e lo stroma del tumore sono costituiti da tessuti omogenei e geneticamente stabili.

3. I tumori differiscono grandemente per quello che riguarda il tipo cellulare di origine e per quello che riguarda la combinazione di lesioni genetiche derivanti dalla loro crescita. L 'angiogenesi tumorale deve seguire alcuni modelli ricorrenti.

4. L'angiogenesi si verifica in alcune condizioni fisiologiche negli individui adulti. Inoltre, 1'angiogenesi di un tumore può avere caratteristiche distinte da quelle osservate in altre condizioni, come la cicatrizzazione di ferite (4-6).

Quindi, i vasi in corso di angiogenesi rappresentano un bersaglio omogeneo, stabile e selettivo condiviso fra tumori eterogenei, e le terapie per il cancro dirette contro il reclutamento di vasi sarebbero altamente efficaci, ampiamente applicabili, relativamente non tossiche e scarsamente induttive di resistenza.

Tuttavia, la fonte tissutale (fonti tissutali) di cellule che contribuiscono alla formazione di vasi tumorali e le loro modalità' di crescita entro il tumore sono ancora oscuri. Il sequestro di vasi preesistenti, la crescita di nuove ramificazioni e la vasculogenesi in situ da precursori derivati dal midollo osseo sono stati proposti come meccanismi che contribuiscono in misure differenti (7). Sono stati riportati pochi dati conclusivi, in parte a causa della mancanza di tecniche sperimentali che permettono l'identificazione e la marcatura selettiva di queste cellule in vivo.

Il processo di angiogenesi potrebbe essere il bersaglio del veicolo di somministrazione e dell'attività dei geni terapeutici.

Gli agenti di trasferimento di geni disponibili fino a recentemente hanno avuto limitazioni significative per applicazioni in vivo.

Compito precipuo della presente invenzione è quello di fornire un nuovo vettore che porti all'integrazione di geni in modo efficiente nella maggior parte dei tipi di tessuti ma che ne consenta l'espressione selettiva solo in cellule impegnate nell<'>angiogenesi.

La presente invenzione ha come scopo fornire ed esprimere selettivamente geni in siti di angiogenesi.

Un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire metodi per la somministrazione di geni con attività anti-tumorali, inclusi, ma non limitati a, geni suicidi, di citochine immunomodulatorie e proinfiammatorie, di inibitori dell'invasione di tessuti e dell<1>angiogenesi.

Un ulteriore compito della presente invenzione è quello di fornire un vettore di trasferimento per bersagliare una malattia metastatica disseminata, la condizione più impegnativa e letale del cancro.

Inoltre, uno scopo della presente invenzione è quello di realizzare un vettore e metodi per permettere interventi biologici in tutti i casi in cui si verifica angiogenesi. Esempi includono, ma non sono limitati alla, inibizione di condizioni di neovascolarizzazione della retina e di infiammazione cronica caratterizzate da angiogenesi, promozione dell'angiogenesi in tessuti ischemie! come arti o il miocardio.

Un altro scopo della presente invenzione è quello di realizzare un vettore di trasferimento per impiego insieme con la somministrazione di uno o di una combinazione di fattori angiogenetici.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di permettere di identificare e sottoporre a screening geni bersaglio candidati con attività biologica nei vari casi di angiogenesi menzionati sopra.

Questi ed altri scopi che risulterano evidenti dalla lettura della seguente descrizione sono raggiunti da un costrutto di vettore lentivirale di trasferimento di sequenze nucleotidiche in vivo e ex vivo caratterizzato dal fatto che comprende sequenze di regolazione della trascrizione non-codificanti di uno o più geni endoteliali di mammiferi.

Le sequenze di regolazione della trascrizione sono preferibilmente sequenze dalle regioni introniche e promotrici di uno o più geni endoteliali di mamiferi.

I geni endoteliali sono preferibilmente umani o murini, ad esempio geni endoteliali scelti dal gruppo costituito da Tie2, Tlk-1, Tiel e ICDM-2 umani o murini.

In una forma di realizzazione, il vettore lentivirale è derivato da HIV-l

In una forma di realizzazione preferita, le sequenze regolatrici della trascrizione sono sequenze dalle regioni introniche e promotrici almeno di Tie2 murino.

In una altra forma di realizzazione preferita, le sequenze regolatrici della trascrizione sono sequenze dalle regioni introniche e promotrici almeno di Tie2 umano.

Un esempio di costrutto secondo la presente invenzione è un costrutto che comprende le sequenze pRRLsin.mTie2Enh.cPPT.mTie2Pr:eGFP.Wpre disposte in questo ordine o in un ordine diverso per la sequenza intronica di mTie2.

La presente invenzione riguarda inoltre una particella di vettore lentivirale che trasduce il vettore di trasferimento secondo la presente invenzione.

La particella secondo la presente invenzione può includere vari rivestimenti, come ad esempio il rivestimento della glicoproteina del VSV e il rivestimento della glicoproteina del virus anfotropo della leucemia murina.

La presente invenzione riguarda inoltre un metodo di somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi mediante iniezione nel tessuto, affetto da una patologia, di vettori descritti sopra. La patologia include ma non è limitata a ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina o una malattia infiammatoria cronica.

La presente invenzione riguarda inoltre un metodo di somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi di un tumore mediante iniezione nella massa tumorale di vettori descritti sopra.

La somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi può essere realizzata mediante iniezione di vettori descritti sopra nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica per la somministrazione sistemica o nella vascolatura afferente del tessuto affetto da una patologia.

La patologia da trattare con il metodo della presente invenzione include ma non è limitata a ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina, una malattia infiammatoria cronica.

La somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi di un tumore e in metastasi può essere realizzata mediante iniezione di vettori descritti sopra nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica o nella vascolatura afferente del tumore o della regione (regioni) affette da metastasi.

La presente invenzione riguarda inoltre un metodo di somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi in una condizione patologica mediante trasduzione dei vettori descritti sopra in cellule progenitrici derivate da midollo osseo ex vivo seguita da trapianto in riceventi condizionati o non condizionati. La condizione patologica include ma non è limitata a ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina, una malattia infiammatoria cronica.

La presente invenzione riguarda anche un metodo di somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angiogenesi di un tumore e in metastasi mediante trasduzione dei vettori descritti sopra in cellule progenitrici derivate dal midollo spinale ex vivo seguita da trapianto in recipienti condizionati e non condizionati.

L'invenzione riguarda inoltre l'impiego di un costrutto di vettore lentivirale secondo la presente invenzione per la fabbricazione di un preparato per uso nel trattamento di una patologia correlata all'angiogenesi mediante somministrazione ed espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angeogenesi, come ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina, e malattie infiammatorie croniche.

Il preparato può essere per somministrazione mediante iniezione nel tessuto affetto da detta patologia oppure per somministrazione mediante iniezione nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica per la somministrazione sistemica oppure in vascolature afferenti del tessuto affetto da detta patologia.

L'invenzione riguarda inoltre l'impiego di un costrutto di vettore lentivirale secondo l'invenzione per fabbricare un preparato per uso nel trattamento di un tumore mediante somministrazione ed espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angeogenesi di un tumore.

Il preparato può essere per somministrazione mediante iniezione nella massa tumorale oppure per somministrazione nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica o nella vascolatura afferente del tumore o delle regioni affette da metastasi.

La seguente discussione è focalizzata sull<1>angiogenesi che si verifica nell’instaurazione di un tumore e di sue metastasi. Considerazioni simili e strategie simili di bersagliamento di geni si applicano anche all’angiogenesi che si verifica in altre patologie che includono l'ischemia di un tessuto, condizioni croniche di infiammazione o neo-vascolarizzazione della retina.

La richiedente ha studiato, come modello operativo dell'angiogenesi, 1'angiogenesi tumorale in un modello di trapianto di tumore in topi nudi.

Un metodo usato ha comportato la somministrazione diretta di vettori nella massa tumorale. Un altro metodo usato ha comportato la somministrazione di un vettore nel circolo sanguigno, tramite una vena periferica per la somministrazione sistemica o nella vascolatura afferente il tumore.

Il bersagliaraento selettivo di cellule impegnate nell'angiogenesi è stato ottenuto sfruttando l'infezione efficiente di un vettore pseudotipizzato dal rivestimento di del virus della stomatite vescicolare (VSV), o altri rivestimenti con ampio tropismo e limitando l'espressione del transgene a cellule endoteliali e loro precursori impegnati nell'angiogenesi mediante incorporazione, nel vettore, di specifici elementi di controllo della trascrizione.

E' stato sperimentato un ampio gruppo di regioni regolatorie e promotrici da geni specificamente espressi in cellule endoteliali e/o indotte per angiogenesi, in combinazioni differenti per ottenere specificità di espressione di transgeni. Parecchie caratteristiche uniche del vettore lentivirale hanno permesso questo lavoro.

Un altro metodo usato ha comportato la trasduzione ex vivo di cellule progenitrici di midollo osseo con vettori mirati all'endotelio e il trapianto in riceventi ablati del midollo o non condizionati.

I risultati della richiedente hanno mostrato che il midollo osseo contribuiva in modo sostanziale alla vascolatura del tumore. La trasduzione efficiente di cellule staminali ematopoietiche mediante vettori lentivirali ha permesso l'identificazione della progenie marcata dal gene nello stroma e nella vascolatura tumorale.

Nella strategia ex vivo, i progenitori endoteliali originati in vivo dalle cellule progenitrici del midollo osseo trasdotte ex vivo con vettori specifici per l'endotelio si localizzavano nei siti dell'angiogenesi, come il tumore e le sue metastasi, agendo come veicoli del gene in esame o terapeutico.

Si possono anche impiegare vettori regolati in combinazione con l'espressione mirata così che l'espressione di un gene terapeutico venga regolata temporaneamente proteggendo nei confronti di effetti indesiderati della terapia.

Il vettore della presente invenzione può essere usato per esprimere un regolatore della trascrizione, come, ad esempio, un attivatore o repressore dipendente da tetracicline, selettivamente in cellule impegnate nell'angiogenesi e verrebbe combinato con un altro vettore che contiene la cassetta di espressione regolata per i geni in esame o terapeutici.

In alternativa, sia la cassetta di espressione mirata per il regolatore che la cassetta responsiva per i geni in esame o terapeutici possono essere incorporate in un singolo costrutto di vettore. I vettori bersagliati regolati sono cruciali nella strategia della trasduzione del midollo osseo ex vivo, dato il suo potenziale per la produzione prolungata di cellule trasdotte in vivo.

La richiedente ha usato un nuovo sistema di trasferimento di geni basato su lentivirus (vettori lentivirali ibridi, LV) che superano parecchie limitazioni dei sistemi noti (8-11): gli LV infettano un'ampia gamma di tessuti, si integrano efficientemente nella cromatina indipendentemente dalla divisione cellulare, non trasferiscono alcun gene virale, possono essere somministrati direttamente in vivo, permettono l'espressione protratta del transgene e non devono superare una preesistente immunità virale.

Lavori precedenti hanno anche migliorato la sicurezza biologica di LV, alleviando le preoccupazioni derivanti dall'impiego di vettori derivati da virus patogeni (12-15).

La richiedente ha sviluppato parecchie strategie per bersagliare LV nell'angiogenesi di un tumore, come riportato in dettaglio negli esempi.

Alcune strategie per bersagliare virus nell'angiogenesi di tumori hanno comportato la somministrazione diretta di LV nel tumore o nel circolo sanguigno. Il bersagliamento di cellule endoteliali può essere tentato a livello di infezione scegliendo rivestimenti virali specifici per l'endotelio o ingegnerizzati. Questi approcci hanno dato finora vettori con una infettività troppo bassa per essere impiegati in vivo (16).

Vettori sviluppati per il bersagliamento di cellule endoteliali a livello della infezione con rivestimenti virali specifici per l'endotelio o ingegnerizzati, possono tuttavia essere combinati con alcune delle strategie descritte nella presente domanda.

Qui, la richiedente ha sfruttato l'efficiente infezione di un vettore pseudotipizzato dal rivestimento di VSV e l'espressione limitata del transgene in cellule impegnate nell'angiogenesi mediante incorporazione nel vettore di specifici elementi di controllo della trascrizione.

La richiedente ha raccolto un ampio gruppo di regioni regolatorie/promotrici putative e consolidate da geni specificamente espressi in cellule endoteliali e/o indotte per angiogenesi. La richiedente le ha introdotte in combinazione differente in LV e le ha sperimentate per la specificità dell'espressione ex vivo e in vivo di transgeni. Parecchie caratteristiche uniche di LV permettono questo approccio:

1. Vettori auto-inattivanti precedentemente sviluppati dalla richiedente sottopongono a delezione tutte le regioni virali di controllo della trascrizione e guidano l'espressione di transgeni soltanto dalle sequenze esogene (14)

2. Il contenuto minimo di sequenze virali sembra proteggere LV dal meccanismo di sorveglianza del genoma che porta spesso all'inattivazione di vettori retrovirali

3. LV possono fornire efficientemente frammenti genici relativamente grandi inclusi elementi di regolazione complessi (17).

Altre strategie comportavano la trasduzione ex vivo di cellule progenitrici ematopoietiche (CSE) di midollo osseo con vettori bersagliati all'endotelio seguita dalla ripopolazione di ospiti parzialmente mieloablati. Dati recenti, inclusi gli esperimenti della richiedente, supportano il punto di vista che il midollo osseo contribuisca alla vascolatura del tumore (18). I LV trasducevano CPE con un'elevata efficienza e senza richiedere una manipolazione prolungata ex vivo o trattamento con citochine (19-21, 11). Queste condizioni favorevoli hanno permesso alla richiedente di dimostrare un contributo sostanziale di cellule marcate con un gene dal midollo osseo alla vascolatura del tumore e suoi precursori nello stroma del tumore.

Gli esperimenti descritti sopra hanno fornito la prova di principio della somministrazione di geni bersagliati al tumore. Essi possono essere applicati alla somministrazione di geni terapeutici in quanto:

1. La somministrazione a base di geni facilita la somministrazione di fattori proteici e RNA bersagliando i segnali molecolari che controllano 1'angiogenesi e la metastasi della crescita tumorale.

2. Si possono ottenere e mantenere concentrazioni efficaci di fattori mediante sintesi in situ in contrapposizione alle sfide tecniche della produzione in vitro e della somministrazione sistemica.

3. La somministrazione può essere ottimizzata prima che il gene terapeutico venga scelto in quanto le farmacocinetiche dipendono dal veicolo.

4. L'espressione era limitata a cellule specificamente impegnate nell'angiogenesi. La somministrazione diretta di vettori in vivo e l'espressione ubiquitaria possono precludere l'impiego di parecchi geni anti-cancro a causa della tossicità sistemica, del danno a tessuti sani, della presentazione del prodotto al sistema immunitario mediante cellule trasdotte che presentano 1'antigene e immunizzazione contro di esso, dell'aumento incontrollato del dosaggio a causa della crescita di cellule tumorali trasdotte. Il bersagliamento di vasi tumorali dovrebbe dare concentrazioni efficaci di un fattore biologico terapeutico proprio dove avvengono le crescite invasive metastatiche. Tali fattori terapeutici espressi in vivo comprendono fattori citotossici condizionati angiostatina, endostatine, interleuchine, fattori anti-angiogenetici, fattori immunomodulatori.

Nella strategia ex vivo, i progenitori endoteliali originati in vivo da CPE trasdotte ex vivo con cassette di espressione specifiche per l'endotelio si localizzano nel tumore e nei suoi siti metastatici agendo come veicoli del gene in esame o terapeutico.

ESEMPI

Generazione di un vettore lentivirale con espressione selettiva in cellule coinvolte nell'angiogenesi

In figura 1 è mostrata una rappresentazione schematica del vettore provirale integrato che mostra le caratteristiche principali dei costrutti lentivirali.

Poiché la trascrizione a partire dall'LTR è abolita a causa di una delezione di 400 nucleotidi nella regione U3 (14), la trascrizione del gene reporter eGFP viene diretta da un promotore interno e, in alcuni casi, da sequenze regolatrici addizionali situate all'estremità 5' del vettore, a valle dell'elemento di risposta per Rev e a monte dei siti accettori di splicing.

Sequenze che agiscono in cis ed elementi di regolazione posttrascrizionale che incrementano l'espressione del transgene sono state incorporate nel vettore.

E ' stato mostrato che 1'inserzione di una copia del tratto polipurinico centrale (cPPT) a monte del promotore interno ha aumentato significativamente l'efficienza della traslocazione nucleare del genoma del vettore nella cellula ospite (11).

Inoltre, l'elemento situato all'estremità 3' del genoma del virus dell'epatite della marmotta americana (Wpre), che è stato dimostrato aumentare l'esportazione verso il citoplasma e/o la poliadenilazione dei trascritti virali, è stato inserito all'estremità 3' del vettore, facendo aumentare fortemente il livello dei trascritti nel citoplasma delle cellule trasdotte.

Un ampio repertorio di elementi presuntivi di regolazione trascrizionale endotelio-specifici è stato inserito a monte del gene reporter eGFP nel costrutto di trasferimento lentivirale. I seguenti cloni di DNA sono stati ottenuti da collaborazioni con il Dr. U. Deutsch e il Dr. G. Breier (Max-Planck-Institut, Bad Nauheim, FRG), e il Prof. Bussolino (Università di Torino):

frammento di 1,8 kb del promotore di Flk-1 murino (22)

frammento di 2,085 kb che contiene il promotore di Tie2 murino (23) frammento di 510 bp dal promotore di Tiel murino

frammento di 466 bp dal promotore di ICAM-2 umano

frammento di 2,5 kb dal promotore VE-Cadherin murino (24).

Sono anche state ottenute le sequenze enhancer introniche: frammento di 1653 bp dal miglioratore di Tie2 (23)

enhancer intronico da 2,0 kb dal gene Flk-1 murino (25)

enhancer minimo da 430 bp dal gene Flk-1 murino.

Per generare pdmT2-short, un frammento HindlII-HindlII di 2084 bp contenente il promotore di Tie2 murino (mTie2) (ottenuto dal plasmide pBSIIKS(+) derivato da pHHSDKXK, gentilmente fornito dal Dr. U. Deutsch) è stato clonato nel costrutto lentivirale pRRLsin-hCMV.eGFP.Wpre in sostituzione di un frammento Clal-XbaI corrispondente al promotore di CMV umano (hCMV).

Per generare un vettore contenente la sequenza cPPT, il frammento Clal-Kpnl di 1880 bp, ottenuto dal costrutto pRRLsin.cPPT.hCMV.eGFP.Wpre (11), è stato sostituito con il frammento BglII-Kpnl di 3356 bp ottenuto dal vettore contenente il promotore di mTie2.

Nel costrutto pdmT2-short (pRRLsin.cPPT.mTie2Pr.eGFP.Wpre), il gene reporter eGFP risulta essere sotto il controllo trascrizionale del promotore di Tie2 murino.

Per generare pdmT2, un frammento Xhol-Kpnl di 1658 bp, contenente l'enhancer intronico del gene mTie2 ottenuto da pHHSDKXK, è stato inserito, con orientamento senso o antisenso, nel sito unico Miei presente nel vettore pmdHT2.

Oltre al promotore di mTie2 pdmT2 (pRRLsin.mTie2Enh.cPPT.mTie2Pr.eGFP.Wpre) risulta contenere elementi di regolazione presenti al di fuori della regione del promotore al 5' del gene mTie2 e necessari per l'espressione endotelio-specifica (23; dati base GenBank numero di accesso U85629).

La sequenza nucleotidica e la mappa del vettore pdmT2 sono rappresentate nelle Figure 9 e 10.

Convalida di costrutti in vitro

L'efficienza di trasferimento della cassetta di espressione per ciascun vettore è stata valutata mediante trasduzione della linea cellulare HeLa.

Il terreno condizionato di cellule 293T, utilizzato per la produzione dei vettori, è stato concentrato 250 volte. Eguali volumi di ciascuna preparazione di vettore sono stati utilizzati per trasdurre cellule HeLa.

Mediante Southern blot di cellule trasdotte, è stata verificata la qualità delle preparazioni di vettore sulla base del confrontabile livello di integrazione e della stabilità dell'espressione del transgene.

Inoltre è stato impiegato il Southern blot per il calcolo del numero medio di copie di vettore integrate per genoma delle cellule trasdotte lfigura 2).

Il DNA genomico purificato da cellule HeLa trasdotte (1. promotore di hICAM2; 2. promotore di mTiel; 3. promotore/enhancer di hCMV; 4. promotore di hPGK; 5. promotore di mFlkl; 6. promotore di mTie2; 7. promotore di mVE-Cad; 8. promotore/enhancer intronico di mTie2, orientamento senso; 9. promotore /enhancer intronico di mTie2, orientamento antisenso; 10. promotore/enhancer intronico di mFlkl) ed una curva standard di DNA plasmidico (20, 10, 5, 3, 1 e 0,5 equivalenti di copie di vettore per genoma) sono stati digeriti con 1<1>endonucleasi di restrizione AflII, che rilascia un frammento di vettore che si estende dal 5'-LTR al 3'-LTR.

E' stata utilizzata una sonda corrispondente alla sequenza eGFP per rivelare il vettore integrato. E' stato calcolato il numero di copie integrate di vettore per unità di volume di preparazione per normalizzare l'attività di trasduzione delle differenti preparazioni di vettore nelle seguenti prove sperimentali.

Come primo approccio sperimentale, un ampio gruppo di linee cellulari immortalizzate e colture primarie è stato trasdotto in vitro con l'intero repertorio di vettori. Fra le altre, sono state utilizzate cellule endoteliali primarie umane e porcine, fibroblasti primari umani, linfociti primari umani, progenitori ematopoietici murini e umani e la loro progenie, cellule di adenocarcinoma della mammella murino (TS/A) e le linee cellulari HeLa e 293T.

Ciascun tipo di cellula è stato trasdotto con una quantità di vettore tale da ottenere un'integrazione stabile e un confrontabile numero di copie integrate per ciascun vettore.

L'analisi citofluorometrica dell'espressione di eGFP è stata effettuata quando il livello di espressione del transgene è stabile, una condizione che viene raggiunta 5-7 giorni dopo la trasduzione, ma che dipende principalmente dal tipo di cellula, dall'attività trascrizionale del promotore e dalla emi-vita del prodotto del transgene.

Sono state analizzate due variabili per selezionare il vettore più efficace: i) il livello di espressione del transgene nella cellula bersaglio (tipo endoteliale) doveva essere significativo e doveva essere osservato nella maggioranza delle cellule, e ii) il livello dell'espressione del transgene nella cellula non bersaglio (cellule di tipo non endoteliale) doveva essere basso o non rilevabile nella maggioranza delle cellule. Presi assieme, i due parametri esprimono la selettività o specificità dell'espressione di un dato vettore.

Mentre i vettori contenenti i promotori ubiquitari di h-CMV e h-PGK guidavano l'espressione di eGFP ad un livello molto elevato in tutti i tipi di cellule testati, la maggior parte dei vettori promotori endoteliali esprimevano il transgene a livelli variabili, ma spesso in modo non tessuto-specifico (dati non presentati).

Comunque, l'analisi citofluorometrica di cellule trasdotte chiaramente indicava che i vettori contenenti sequenze regolatrici dal gene mTie2 meglio soddisfacevano le condizioni richieste quando confrontati con gli altri, presentando così la selettività di espressione più elevata per cellule endoteliali.

I dati selezionati da queste analisi sono rappresentati nelle figure 2 e 3.

Figura 3 mostra la trasduzione di cellule endoteliali vascolari ombelicali umane primarie (HUVEC). Gli istogrammi mostrano l'espressione di eGFP di cellule non trasdotte (A e B, parte colorata), di cellule trasdotte con il vettore di hPGK ubiquitario (A, linea nera), con pdmT2- short (B, linea nera) e con pdmT2 (senso) (B, linea verde).

Come mostrato nella figura, entrambi i vettori che contengono sequenze regolatrici dal gene mTie2 trasducevano ed esprimevano il gene reporter eGFP in virtualmente tutte le cellule nella popolazione sperimentata, soddisfacendo così il primo requisito per l'espressione selettiva in cellule endoteliali.

Inoltre, il vettore pdmT2 permetteva una espressione del transgene più elevata rispetto a pdmT2- short, indicando che gli elementi di regolazione che agiscono in cis presenti all'esterno della regione del promotore in 5' del gene mTie2 facevano migliorare la prestazione del vettore di almeno due volte (media dell'intensità della fluorescenza: vettore di hPGK, 1476; pdmT2- short, 121; pdmT2 (senso), 252).

Figura 4 mostra la trasduzione di cellule di adenocarcinoma della mammella murino (TS/A). Gli istogrammi mostrano l'espressione di eGFP in cellule non trasdotte (A e B, parte colorata), le cellule trasdotte con il vettore di hPGK ubiquitario (A, linea nera), con pdmT2- short (B, linea nera) e con pdmT2 (senso) (B, linea verde).

L'espressione guidata dai vettori pdmT2- short e pdmT2 (senso) è quasi non rivelabile e comunque soltanto in meno del 2% della popolazione totale di cellule (media di intensità della fluorescenza: 25-30) mentre il vettore di hPGK esprimeva il transgene nel 72% della popolazione totale (media dell'intensità della fluorescenza: 524).

Questi risultati indicano chiaramente che l'espressione del transgene è fortemente limitata nella linea cellulare non endoteliale sperimentata, soddisfacendo cosi il secondo requisito per l'espressione selettiva in cellule endoteliali.

Risultati confrontabili sono stati ottenuti quando sono stati testati altri tipi di cellule non endoteliali (dati non presentati).

Inoltre, il vettore pdmT2 determinava una espressione inferiore del transgene rispetto a pdmT2- short, indicando che 1 ' enhancer intronico del gene mTie2 presente nell'ultimo vettore faceva migliorare la specificità di espressione reprimendo l'espressione del transgene nelle cellule non endoteliali. Sono stati ottenuti risultati confrontabili sperimentando altri tipi di cellule non endoteliali (dati non presentati).

Per confermare i dati di espressione del transgene, si è stata effettuata l'analisi Northern blot con l'RNA totale purificato da cellule 293T trasdotte con l'intero repertorio di vettori. I trascritti che contengono la sequenza di eGFP erano quasi non rivelabili in campioni ottenuti da cellule 293T trasdotte con pdmT2- short e pdmT2, mentre sono stati osservati livelli da bassi ad elevati di espressione di RNA in campioni di RNA totale da cellule trasdotte con gli altri vettori specifici per cellule endoteliali o ubiquitari (dati non presentati).

In conclusione, pdmT2 si è osservato essere il vettore più efficace per il targeting endoteliale, per via del basso livello basale di espressione del transgene in cellule non endoteliali e per l'elevato livello ottenuto in cellule endoteliali in vitro.

I richiedenti hanno poi valutato la significatività dei livelli basali di espressione del transgene che si rilevano mediante la sensibile analisi citofluorometrica, mediante somministrazione di un gene condizionalmente tossico a cellule permissive (endoteliali, HUVEC) e non permissive (non endoteliali, 293T), utilizzando i vettori pdmT2 e il vettore contenente il promotore di hCMV.

La sequenza di eGFP è stata sostituita con una cassetta di espressione bicistronica per il gene della nitroreduttasi batterica seguita da una sequenza IRES-eGFP.

E' stato valutato il rapporto fra la resistenza e la morte di cellule trasdotte a seguito di trattamento con il profarmaco metronidazolo. Il trattamento con metronidazolo non ha comportato morte cellulare in cellule 293T trasdotte con il vettore pdmT2, sebbene queste cellule esprimessero livelli bassi, ma rivelabili, del gene eGFP.

Al contrario, si osservò chiaramente tossicità in cellule 293T trasdotte con il vettore di controllo di hCMV e in cellule HUVEC trasdotte con i vettori pdmT2 e con il vettore contenente il promotore di hCMV (dati non presentati).

Questi risultati indicavano che i livelli basali di espressione del transgene diretti dal vettore pdmT2 in cellule non endoteliali avevano un significato biologico limitato.

Somministrazione sistemica di pdmT2

Gli esperimenti sopra menzionati hanno definito pdmT2 come il vettore candidato migliore per il bersagliamento delle cellule endoteliali.

Per convalidare ulteriormente la specificità endoteliale di pdmT2, è stato sviluppato un modello in vivo di angiogenesi tumorale. Specifreamente, è stata utilizzata la linea cellulare tumorigenica TS/A, derivata da un adenocarcinoma della mammella murino, per indurre tumori sottocutanei in topi immunocompromessi.

Il tumore TS/A nell'animale ospite recluta cellule endoteliali in modo efficiente tramite angiogenesi/vasculogenesi. Queste cellule vengono ben identificate mediante immunocolorazione con il marcatore di vasi PECAM-1 (CD31).

Sono state sfruttate strategie differenti di somministrazione dei vettori per valutare l'efficienza di trasduzione e la tessutospecificità di pdmT2, in confronto ai vettori contenenti i promotori di hPGK e hCMV, che esprimono in modo ubiquitario.

Il primo approccio di somministrazione sperimentato era la somministrazione endovenosa del vettore. 5<*>10<A>5 cellule TS/A sono state iniettate sottocute in topi nudi. Una settimana dopo, quando i tumori avevano raggiunto un diametro di 4-5 mm, nella vena della coda dei topi è stata iniettata una dose di vettore che corrispondeva a 1-5<*>10<A>8 particelle infettive. Una settimana dopo la somministrazione di pdmT2, l'analisi immunoistochimica su sezioni di tumore rivelava una co-localizzazione ben definita di eGFP e dei marcatori di cellule endoteliali PECAM-1 (figura 5ì e VE-caderina, mentre quasi nessuna cellula positiva per eGFP poteva essere rilevata in altri organi ben vascolarizzati, inclusi il fegato (figura 6), i polmoni e il cuore.

Al contrario, il vettore di controllo che porta il promotore di PGK, aveva determinato un diffuso e alto livello di espressione di eGFP nella massa tumorale (figura 53⁄4 e in altri organi, come il fegato (figura 61.

I dati riportati indicavano che l'attività trascrizionale di pdmT2 era limitata ad una frazione delle cellule endoteliali che costituiscono i vasi del tumore, in quanto nessun altro tipo di cellula presente nel tessuto era positivo per l'espressione di eGFP.

Inoltre, l'espressione di eGFP non era rivelabile nella cellule endoteliali che costituiscono i vasi degli altri organi analizzati. Presi assieme, questi risultati indicavano che, quando si effettuava una somministrazione endovenosa, l'espressione del transgene dal nuovo vettore veniva specificamente osservata nelle cellule endoteliali impegnate nel processo di angiogenesi tumorale.

Somministrazione intratumorale del vettore pdmT2

Un secondo approccio sperimentale per la convalida in vivo di pdmT2 era la somministrazione intratumorale del vettore. Sono state iniettate dosi crescenti (1-10<*>10<*>7 particelle infettive) di vettore dentro la massa tumorale, sia in stadi precoci, quando il tumore era semplicemente visibile, e successivamente quando aveva raggiunto una dimensione maggire.

I tumori sono stati dissezionati e analizzati in tempi sempre più lunghi dopo l'iniezione per monitorare la comparsa e il destino di cellule trasdotte in vivo.

In tali esperimenti, il vettore di controllo che portava il promotore di hCMV trasduceva la massa tumorale ad un livello molto elevato (figura 71. Diversamente, l'espressione di eGFP guidata da pdmT2 era osservabile solo in una popolazione cellulare più dispersa (figura 7 ) , localizzata principalmente alla periferia del tumore, che esprimeva marcatori vascolari ed ematopoietici, come PECAM-1 (CD31), l'actina della muscolatura liscia (SMA), CD45 e Seal (dati non presentati).

Tali cellule stromali, che esprimono il gene reporter eGFP sotto controllo delle sequenze regolatrici del gene mTie2, si è pensato possano essere coinvolte nel processo di angiogenesi che porta alla vascolarizzazione di un tumore.

Questa ipotesi venne suggerita dai seguenti dati: i) si trovò che la maggior parte delle cellule positive per eGFP erano incorporate o presenti in stretta associazione con i piccoli vasi sanguigni del tumore; ii) le cellule positive per eGFP non esprimevano alcun marcatore di differenziamento mieloide o linfoide, permettendo di escludere l'espressione in monociti/macrofagi infiltrati nel tumore, che rappresentano una proporzione significativa della popolazione stromale; iii) è stato precedentemente dimostrato che il gene del recettore cellulare di Tie2 è sovraespresso in cellule endoteliali impegnate nell'angiogenesi.

Nonostante il diverso pattern di trasduzione ottenuto mediante la somministrazione intratumorale, rispetto alla somministrazione endovenosa, i risultati sopra menzionati indicavano una trasduzione efficiente e selettiva delle cellule endoteliali e delle cellule non endoteliali verosimilmente coivolte nell*angiogenesi

Trasduzione ex vivo di cellule di midollo osseo da parte del vettore pdmT2 e trapianto in vivo.

Per esaminare l'origine delle cellule trasdotte dal vettore pdmT2, cellule ematopoietiche staminali purificate dal midollo osseo murino vennero trasdotte con pdmT2 e con il vettore contenente il promotore hPGK e vennero trapiantate in topi nudi irradiati. Due mesi dopo il trapianto, si iniettarono cellule tumorali per via sottocutanea e si esaminò il tumore due settimane dopo (figura 83⁄4.

L'analisi immunoistochimica di sezioni del tumore rivelava che le cellule derivate dal midollo osseo contribuivano predominantemente alla formazione dello stroma del tumore. La maggior parte delle cellule che esprimono il transgene eGFP sotto il promotore di hPGK risultarono essere della linea ematopoietica (positiva per CD45), co-localizzando principalmente con marcatori di differenziazione dì monociti-macrofagi (positivi per CD14, F480) (figura 83⁄4.

Al contrario, quando si impiegava il vettore pdmT2, l'espressione del transgene era limitata ad una sotto-popolazione di cellule stromali che esprimevano marcatori vascolari/ematopoietici, come PECAM-1 (CD31), actina della muscolatura liscia (SMA) e CD45 (figura 8).

Come si otteneva con la somministrazione intratumorale di pdmT2, ma qui con un grado di specificità più elevato, la maggior parte di queste cellule erano cellule di tipo endoteliale o fisicamente associate con i vasi sanguigni.

Questi risultati indicano che il vettore pdmT2 bersaglia progenitori endoteliali che esistono fra, o si originano da cellule in grado di ripopolare l'ospite derivate dal midollo osseo e che vengono reclutate efficientemente nei vasi del tumore.

L'espressione selettiva del transgene in queste cellule in vivo può permettere terapie di bersagliamento nel tumore primario e nei suoi siti metastatici.

I risultati ottenuti hanno fornito la prova del principio di un trasferimento genico efficace e dell'espressione selettiva in cellule impegnate nell<'>angiogenesi nel tumore.

Il chiarimento di questi processi e l'identificazione degli elementi molecolari coinvolti sono compiti cruciali per l'avanzamento della comprensione del cancro e per convalidare bersagli potenziali di nuove terapie. Medinte trasferimento di geni bersagliati su cellule impegnate nell'angiogenesi di un tumore, abbiamo identificato la loro fonte tissutale e le loro modalità di crescita nel tumore, ottenendo la prova di un trasferimento genico efficace e dell'espressione selettiva in cellule impegnate nell'angiogenesi nel tumore.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Costrutto di vettore lentivirale di trasferimento di sequenze nucleotidiche in vivo e ex vivo caratterizzato dal fatto che comprende sequenze di regolazione della trascrizione non-codificanti di uno o più geni endoteliali di mammiferi.
2. 2. Costrutto secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che dette sequenze di regolazione della trascrizione sono sequenze dalle regioni introniche e promotrici di uno o più geni endoteliali di mamiferi.
3. 3. Costrutto secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che detti geni endoteliali sono umani o murini.
4. 4. Costrutto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detto vettore lentivirale è derivato da HIV-1
5. 5. Costrutto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detti geni endoteliali sono scelti dal gruppo costituito da Tie2, Tlk-1, Tiel e ICDM-2 umani o murini.
6. 6.Costrutto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che comprende sequenze regolatrici della trascrizione dalle regioni introniche e promotrici almeno di Tie2 murino.
7. 7. Costrutto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 caratterizzato dal fatto che comprende sequenze regolatrici della trascrizione dalle regioni introniche e promotrici almeno di Tie2 umano.
8. 8. Costrutto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 caratterizzato dal fatto che comprende le sequenze pRRLsin.mTie2Enh.cPPT.mTie2Pr:eGFP.Wpre disposte in questo ordine o in un ordine diverso per la sequenza intronica di mTie2.
9. 9. Particella di vettore lentivirale che trasduce il vettore di trasferimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
10. 10. Particella di vettore lentivirale secondo la rivendicazione 9 caratterizzata dal fatto che include il rivestimento della glicoproteina del VSV.
11. 11. Particella di vettore lentivirale secondo la rivendicazione 9 caratterizzata dal fatto che include il rivestimento della glicoproteina del virus anfotropo della leucemia murina.
12. 12. Impiego di un costrutto di vettore lentivirale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 per la fabbricazione di un preparato per uso nel trattamento di una patologia correlata all'angiogenesi mediante somministrazione ed espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angeogenesi.
13. 13. Impiego secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detta patologia è scelta tra ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina, e malattie infiammatorie croniche.
14. 14. Impiego secondo una delle rivendicazioni 12 o 13 caratterizzato dal fatto che detto preparato è per somministrazione mediante iniezione nel tessuto affetto da detta patologia.
15. 15. Impiego secondo una delle rivendicazioni 12 o 13 caratterizzato dal fatto che detto preparato è per somministrazione mediante iniezione nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica per la somministrazione sistemica oppure in vascolature afferenti del tessuto affetto da detta patologia.
16. 16. Impiego di un costrutto di vettore lentivirale secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 per fabbricare un preparato per uso nel trattamento di un tumore mediante somministrazione ed espressione selettiva di un gene in cellule impegnate nell'angeogenesi di un tumore.
17. 17. Impiego secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto che detto preparato è per somministrazione mediante iniezione nella massa tumorale.
18. 18. Impiego secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto che detto preparato è per somministrazione nel circolo sanguigno attraverso una vena periferica o nella vascolatura afferente del tumore o delle regioni affette da metastasi.
19. 19. Metodo di somministrazione e di espressione selettiva di un gene in cellule responsabili di angiogenesi in una condizione patologica, mediante trasduzione di un vettore di trasferimento secondo le rivendicazioni da 1 a 8 in cellule progenitrici derivate da midollo osseo ex vivo.
20. 20. Metodo secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che detta patologia è scelta tra ischemia di un tessuto, neovascolarizzazione della retina e malattie infiammatorie croniche.
21. 21. Metodo di somministrazione ed espressione selettiva di un gene in cellule responsabili dell'angiogenesi in un tumore e di metastasi, mediante trasduzione di vettore di trasferimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 in cellule progenitrici derivate dal midollo osseo ex vivo.
22. 22. Costrutto di vettore secondo le rivendicazioni da 1 a 8 caratterizzato dal fatto che detto vettore è con espressione bersagliata regolata