CN115725660B - 一种重组流感亚单位疫苗的制备方法 - Google Patents
一种重组流感亚单位疫苗的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。属于生物技术领域。本发明将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上,经过多级高密度发酵和纯化,对半成品进行初步筛选鉴定,将符合要求的半成品制备成鼻喷剂,对合格的产品灌装处理。本发明获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白。与现有技术相比,本发明取得的有益效果为:缩短了重组流感亚单位疫苗的生产周期,提高了外源基因的表达量,且产品无弹状病毒和杆状病毒的污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体的说是涉及一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。
背景技术
流感即流行性感冒,是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病,流感给人类健康带来巨大危害和潜在威胁。接种疫苗是预防和控制流感病毒感染最有效方法之一。目前,市面上的四价流感亚单位疫苗和流感裂解疫苗等的主要抗原仍以血凝素(HA)蛋白研究为主,流感病毒的血凝素是引起宿主产生保护性抗体应答的主要抗原,且在与宿主细胞表面受体结合、膜融合、病毒颗粒包装结合和病毒粒子致病性等多方面发挥着重要作用,HA仍然是疫苗研制的重要靶抗原。
国内外流感疫苗大多是鸡胚疫苗,这种疫苗传统生产工艺固然成熟,但仍存在很多缺陷,如生产成本高、产量不稳定、劳动强度大,生产周期较长,病毒容易变异,易引起过敏反应,一旦发生流感大流行,难以在短时间内制备出足够数量的疫苗。
与鸡胚基质生产流感疫苗相比,细胞流感疫苗具有较多的优势,如生产周期短、工艺采用相对密闭的生物反应器系统,可有效降低微生物污染风险、疫苗不含卵清蛋白,可降低接种后过敏反应风险。细胞基质来源的流感疫苗虽然优势多于鸡胚法生产的流感疫苗,但也存在着一些问题,如细胞复苏的过程不能保证批次间稳定、传统的生物反应器对细胞的剪切力较大、需要去除生物制品中核酸残留和污染、如何保证产品中无弹状病毒和杆状病毒的污染。建立高效的流感疫苗扩增系统是细胞培养的流感疫苗生产的关键步骤。
综上,鉴于此,如何提供一种高效生产重组流感亚单位疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上,经过多级高密度发酵和纯化,获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白;
甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
ATGAAGGCCATCCTGGTTGTGATGCTGTACACATTCACAACTGCCAACGCTGACACCCTCTGCATCGGCTACCACGCTAACAACAGCACTGACACCGTCGACACAGTCCTGGAAAAGAACGTGACTGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAACGGAAAGCTGTGTAAGCTGCGCGGCGTGGCTCCACTGCACCTCGGCAAGTGTAACATCGCTGGATGGATCTTGGGTAACCCAGAATGCGAATCCCTGAGCACAGCCCGCTCCTGGTCATACATCGTGGAGACCTCCAACAGCGACAACGGAACATGCTACCCAGGTGACTTCATCAACTACGAAGAACTCCGCGAGCAGCTCAGCTCCGTGAGCAGCTTCGAGCGTTTCGAGATCTTCCCTAAGACTAGCAGCTGGCCAAACCACGACTCTGACAACGGAGTGACTGCTGCTTGCCCTCACGCCGGTGCTAAGTCCTTCTACAAGAATCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAAGAGCTACCCCAAGATCAACCAAACATACATCAACGACAAGGGAAAGGAGGTTCTCGTGCTGTGGGGCATCCACCACCCTCCAACAATCGCCGACCAGCAGAGCCTCTACCAGAACGCTGATGCTTACGTTTTCGTGGGCACCTCTCGCTACAGCAAGAAGTTCAAGCCAGAAATCGCCACCAGGCCAAAGGTGCGTGACCAAGAAGGACGTATGAACTACTACTGGACCCTCGTTGAACCAGGAGACAAGATCACATTCGAAGCTACCGGCAACCTGGTGGCCCCTCGTTACGCCTTCACAATGGAACGTGATGCTGGTTCAGGTATCATCATCTCTGACACCCCTGTCCACGACTGCAACACAACTTGTCAAACTCCTGAGGGTGCTATCAACACCTCTCTGCCCTTCCAAAACGTCCACCCTATCACTATCGGCAAGTGTCCAAAGTACGTTAAGTCCACCAAGCTCAGGCTCGCTACTGGCCTCCGTAACGTGCCATCAATCCAAAGCCGTGGACTGTTCGGAGCCATCGCTGGTTTCATCGAAGGTGGATGGACCGGTATGGTGGATGGCTGGTACGGTTACCACCACCAAAACGAACAGGGCTCCGGATACGCCGCCGACCTGAAGAGCACACAGAACGCTATCGACAAGATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAAAAGATGAACACCCAGTTCACCGCTGTGGGAAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGCGCATCGAGAACCTGAACAAGAAGGTCGATGACGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAACTCCTGGTCCTGCTGGAGAACGAGCGTACCCTGGACTACCACGACTCCAACGTGAAGAACCTCTACGAGAAGGTGCGCAACCAACTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCATAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCCGTGAAGAACGGAACTTACGACTACCCTAAGTACTCTGAAGAGGCTAAGCTGAACCGCGAAAAGATCGACGGAGTCAAGCTGGACTCCACTCGTATCTACCAGATCTTGGCCATCTACTCTACCGTGGCCAGCTCCCTCGTGCTGGTTGTCTCACTCGGCGCCATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAACGGTTCACTGCAGTGTCGTATCTGCATCTAA;SEQ ID NO.1;
甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
ATGAAAACAATCATCGCCCTGAGCAACATCCTGTGCCTGGTGTTCGCTCAGAAGATCCCAGGTAACGACAACTCCACCGCCACTCTGTGCCTGGGACACCACGCTGTGCCAAACGGCACTATCGTTAAGACAATCACCAACGACCGCATCGAAGTGACTAACGCTACTGAGCTCGTTCAAAACTCCTCAATCGGCGAGATCTGTGGTTCTCCACACCAAATCCTCGACGGTGGAAACTGTACCCTGATCGACGCCCTGCTCGGAGACCCCCAATGTGACGGTTTCCAGAACAAGGAGTGGGACCTGTTCGTGGAGCGTTCTCGCGCCAACTCAAACTGCTACCCATACGACGTGCCTGACTACGCTTCTCTCCGTAGCCTGGTTGCTAGCTCCGGCACTCTCGAATTTAAGAACGAGTCTTTCAACTGGACCGGAGTGAAGCAGAACGGTACATCATCTGCCTGCATCCGCGGTTCAAGCTCCTCATTCTTCTCACGCCTGAACTGGCTGACTTCCCTGAACAACATCTACCCTGCCCAGAACGTGACAATGCCTAACAAGGAGCAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGTGTCCACCACCCTGACACCGATAAGAACCAGATCTCCCTGTTCGCCCAATCCAGCGGTCGTATCACCGTCAGCACCAAGCGTTCACAGCAGGCCGTGATCCCTAACATCGGTTCAAGACCCCGCATCAGAGACATCCCCTCTCGTATCTCAATCTACTGGACCATCGTGAAGCCAGGCGACATCCTCCTGATCAACAGCACCGGTAACCTGATCGCTCCTAGGGGTTACTTCAAGATCCGCTCTGGTAAAAGCTCAATCATGCGCTCCGACGCCCCTATCGGAAAGTGCAAGAGCGAGTGTATCACCCCCAACGGTTCCATCCCTAACGACAAGCCATTCCAGAACGTCAACAGGATCACATACGGAGCCTGTCCTCGCTACGTCAAGCAGTCAACTCTGAAGCTGGCCACCGGTATGCGTAACGTGCCTGAAAAGCAAACCCGCGGCATCTTCGGCGCCATCGCTGGTTTCATCGAGAACGGCTGGGAAGGTATGGTTGACGGCTGGTACGGATTCCGTCACCAAAACTCTGAAGGTCGTGGTCAGGCTGCTGACTTGAAGTCCACTCAGGCCGCTATCGACCAGATCAACGGCAAGCTCAACCGCCTGATCGGCAAGACCAACGAAAAGTTCCACCAGATCGAAAAGGAGTTCTCTGAAGTGGAAGGACGCGTGCAGGACCTGGAAAAGTACGTTGAGGACACTAAGATCGACCTGTGGTCATACAACGCTGAGCTCCTGGTCGCCCTGGAAAACCAGCACACCATCGACCTGACAGATTCTGAGATGAACAAGCTCTTCGAAAAGACTAAGAAGCAGCTCCGTGAAAACGCTGAGGACATGGGAAACGGTTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGTGACAACGCCTGCATCGGTTCAATCCGTAACGAAACTTACGACCACAACGTTTACCGTGACGAAGCTCTGAACAACCGTTTCCAAATCAAGGGTGTTGAACTGAAGTCCGGTTACAAGGACTGGATTCTCTGGATCAGCTTCGCCATGAGCTGCTTCCTGCTGTGTATCGCCCTGCTGGGCTTCATCATGTGGGCTTGCCAGAAGGGTAACATCCGTTGTAACATCTGTATCTAA;SEQ ID NO.2;
乙型Yamagata系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
ATGAAGGCCATCATCGTTCTCCTGATGGTTGTGACATCCAACGCCGACCGCATCTGTACTGGTATCACAAGCTCAAACAGCCCTCACGTCGTTAAGACCGCTACACAGGGTGAGGTCAACGTGACCGGCGTGATCCCTCTGACCACAACCCCTACTAAGAGCTACTTCGCTAACCTGAAGGGTACACGCACTCGCGGCAAGCTGTGTCCAGACTGCCTGAACTGCACCGACTTGGATGTGGCCCTGGGTCGTCCAATGTGCGTCGGCACCACCCCCTCAGCCAAGGCTAGCATCCTGCACGAAGTGAGGCCCGTGACTAGCGGCTGCTTCCCAATCATGCACGACCGTACTAAGATCCGCCAGCTGCCTAACCTCCTCCGCGGCTACGAAAAGATCCGTCTGAGCACCCAGAACGTGATCGACGCCGAGAAGGCTCCTGGTGGCCCTTACCGTCTGGGCACTAGCGGCTCCTGCCCAAACGCCACCAGCAAGATCGGATTCTTCGCTACCATGGCCTGGGCCGTCCCTAAGGACAACTACAAGAACGCTACCAACCCTCTCACCGTGGAGGTCCCATACATCTGCACTGAGGGTGAGGACCAGATCACTGTCTGGGGATTCCACTCCGACAACAAGACCCAAATGAAGTCCCTGTACGGCGACTCCAACCCTCAGAAGTTCACCTCATCTGCTAACGGTGTCACTACACACTACGTGAGCCAGATCGGCGACTTCCCCGACCAGACCGAGGACGGTGGCCTGCCCCAGTCCGGCCGCATCGTGGTTGACTACATGATGCAGAAGCCTGGCAAGACAGGCACTATCGTGTACCAACGCGGCGTCCTGCTCCCACAGAAGGTGTGGTGTGCTAGCGGCCGTTCCAAGGTTATCAAGGGCAGCCTGCCCCTGATCGGTGAGGCTGACTGCCTGCACGAGGAGTACGGTGGTCTGAACAAGTCCAAGCCATACTACACTGGCAAGCACGCCAAGGCCATCGGCAACTGTCCAATCTGGGTCAAGACTCCACTGAAGCTGGCTAACGGAACCAAGTACCGCCCCCCCGCTAAGTTGCTGAAGGAACGTGGCTTCTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCCTCGAGGGAGGCTGGGAAGGCATGATCGCTGGTTGGCACGGCTACACCAGCCACGGTGCCCACGGCGTGGCTGTGGCCGCTGACTTGAAGTCCACCCAGGAAGCTATCAACAAGATCACCAAGAACCTCAACTCCCTGAGCGAGCTCGAGGTGAAGAACCTGCAGCGCCTGTCCGGTGCTATGGACGAACTGCACAACGAGATCCTGGAACTGGACGAGAAGGTTGACGACCTCCGTGCCGACACCATCTCCTCCCAGATCGAGCTGGCCGTGCTGCTGAGCAACGAAGGTATCATCAACTCCGAAGATGAGCACCTGCTCGCCCTGGAGCGTAAGCTCAAGAAGATGCTGGGCCCCTCCGCTGTTGACATCGGCAACGGTTGTTTCGAGACTAAGCACAAGTGTAACCAAACCTGCCTCGACCGTATCGCCGCCGGTACTTTCAACGCTGGTGAGTTCAGCCTGCCTACCTTCGACTCCCTGAACATCACCGCCGCCAGCCTGAACGACGACGGCCTGGACAACCACACAATCCTGCTGTACTACTCCACAGCTGCTAGCTCACTGGCTGTGACTCTGATGCTGGCCATCTTCATCGTGTACATGGTGAGCCGTGACAACGTGAGCTGTAGCATCTGCCTGTAA;SEQ ID NO.3;
乙型Victoria系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
ATGAAGGCCATCATCGTCCTGCTGATGGTGGTGACCTCCAACGCTGACCGCATCTGTACCGGTATCACTTCCAGCAACTCCCCTCACGTTGTTAAGACCGCCACCCAGGGCGAAGTGAACGTGACCGGTGTGATCCCCCTGACCACCACTCCTACCAAGTCCCACTTCGCTAACCTGAAGGGCACAGAAACACGCGGTAAACTCTGCCCTAAGTGCCTGAACTGTACAGACCTCGACGTCGCTCTGGGTCGCCCCAAGTGTACTGGAAAGATCCCCAGCGCCCGTGTGAGCATCCTGCACGAGGTTCGCCCTGTGACAAGCGGCTGTTTCCCAATCATGCACGACCGTACCAAGATCCGCCAGCTCCCTAACCTGCTGCGTGGCTACGAACACGTGAGGCTGAGCACCCACAACGTGATCAACACCGAGGACGCCCCTGGCGGTCCATACGAAATCGGCACAAGCGGAAGCTGTCTCAACATCACCAACGGAAAGGGCTTCTTCGCCACCATGGCCTGGGCTGTTCCTAAGAACAAGACAGCCACTAACCCCCTGACAATCGAAGTTCCCTACATCTGTACCGAAGAAGAAGATCAGATCACCGTGTGGGGTTTCCACAGCGACGACGAGACTCAGATGGCCCGCCTCTACGGCGACTCCAAGCCTCAGAAGTTCACCAGCTCCGCTAACGGCGTGACCACCCACTACGTGAGCCAGATCGGCGGCTTCCCAAACCAGACTGAAGATGGTGGCCTGCCACAGTCCGGTCGTATCGTTGTGGACTACATGGTGCAGAAGTCAGGCAAGACTGGCACAATCACATACCAGCGCGGCATCCTGCTCCCCCAAAAGGTGTGGTGCGCTAGCGGAAAGAGCAAGGTCATCAAGGGCAGCCTGCCACTGATCGGTGAAGCTGACTGCCTGCACGAAAAGTACGGAGGCCTGAACAAGTCCAAGCCTTACTACACCGGTGAGCACGCTAAGGCTATCGGCAACTGCCCTATCTGGGTCAAGACTCCACTGAAGCTGGCCAACGGTACAAAGTACCGCCCCCCCGCTAAGCTGCTGAAGGAACGTGGTTTCTTCGGTGCCATCGCTGGCTTCCTGGAAGGCGGCTGGGAGGGTATGATCGCTGGCTGGCACGGCTACACTAGCCACGGTGCTCACGGCGTCGCCGTGGCTGCCGACCTGAAGTCCACCCAGGAGGCCATCAACAAGATCACCAAGAACCTGAACAGCCTCTCTGAACTGGAGGTGAAGAACCTGCAGCGTCTGAGCGGCGCTATGGACGAACTGCACAACGAGATCCTCGAACTCGACGAGAAGGTTGACGACCTCCGTGCTGACACCATCAGCTCACAGATCGAGCTGGCCGTGCTGCTGAGCAACGAGGGAATCATCAACTCCGAGGACGAACACCTGCTGGCCCTGGAACGTAAGCTGAAGAAGATGCTGGGTCCTAGCGCCGTTGAGATCGGCAACGGTTGTTTCGAGACCAAGCACAAGTGTAACCAGACATGCCTGGACAGGATCGCCGCCGGCACTTTCGACGCCGGCGAGTTCAGCCTGCCCACCTTCGACAGCCTGAACATCACCGCTGCCTCCCTGAACGACGACGGCCTGGACAACCACACCATCCTGCTGTACTACTCCACCGCCGCCTCCAGCCTCGCTGTCACTCTGATGATCGCCATCTTCGTGGTGTACATGGTGAGCCGCGACAACGTGAGCTGTAGCATCTGCCTGTAA;SEQ ID NO.4。
进一步的,甲型H1N1毒株的HA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示;
MKAILVVMLYTFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTARSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSDNGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGKSYPKINQTYINDKGKEVLVLWGIHHPPTIADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVAPRYAFTMERDAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNVHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDGVKLDSTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI;SEQ ID NO.5。
其中下划线部分为信号肽序列。
甲型H3N2毒株的HA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;
MKTIIALSNILCLVFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICGSPHQILDGGNCTLIDALLGDPQCDGFQNKEWDLFVERSRANSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFKNESFNWTGVKQNGTSSACIRGSSSSFFSRLNWLTSLNNIYPAQNVTMPNKEQFDKLYIWGVHHPDTDKNQISLFAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAMSCFLLCIALLGFIMWACQKGNIRCNICI;SEQ ID NO.6。
其中下划线部分为信号肽序列。
乙型Yamagata系毒株的HA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示;
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEKIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKIGFFATMAWAVPKDNYKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNKTQMKSLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGDFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEEYGGLNKSKPYYTGKHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICL;SEQ ID NO.7。
其中下划线部分为信号肽序列。
乙型Victoria系毒株的HA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示;
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHVRLSTHNVINTEDAPGGPYEIGTSGSCLNITNGKGFFATMAWAVPKNKTATNPLTIEVPYICTEEEDQITVWGFHSDDETQMARLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGKSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVVYMVSRDNVSCSICL;SEQ ID NO.8。
其中下划线部分为信号肽序列。
进一步的,包括如下步骤:
(1)构建重组质粒:
(11)构建重组质粒:
将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,形成pOET5.1-HA1-HA2-A;
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,形成pOET5.1-HA3-HA4-B;
将构建的载体pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B送至天津擎科生物技术有限公司进行基因合成。
(12)质粒的转化:
取出大肠杆菌化学感受态细胞DH5α立即放在冰上,将2~10μL质粒DNA(基因合成干粉溶解后稀释10~100倍使用)冰浴15~45min,热激60s,添加已复温的LB培养基,置于37℃摇床180~220r/min温育培养,培养0.5~2h后取出5~10μL菌液涂平板,LB培养基平板置于37℃培养16~18h。培养结束后使用无菌接种环挑取正常的菌斑5~10个单菌落然后加入到含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养16~20h,收取2~5mL菌液进行质粒的小量提取,溶解于20~60μL无菌水,并对pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B质粒目的基因进行鉴定,鉴定无误后进行菌种保藏。
进一步的,所述步骤(12)中所用引物序列如表1所示。
表1引物的序列
(13)菌体发酵培养:
一级菌种培养:接5~10μL保藏的菌接种至含有15~30mL LB液体培养基的100mL三角瓶中,37℃,160~220r/min培养6~12h。
二级菌种扩大培养:接3~15mL已活化的一级菌种接种至含有250~500mL LB液体培养基的3L挡板三角瓶,37℃,160~220r/min培养12~18h。
菌体收获:取50~500mL无菌的离心瓶,将培养好的菌液分装入离心瓶,4~25℃,500~10000g离心5~30min,弃上清。用生理盐水重悬菌体,然后置于4~25℃,500~10000g离心10~20min,弃上清,并收获菌体。
(14)质粒DNA提取:
采用PureLinkHiPure质粒DNA大量提取试剂盒从菌体中纯化高纯度的质粒DNA,使质粒DNA浓度控制为0.9~1.5mg/mL。
(2)构建重组杆状病毒:
将所述转染络合物滴入昆虫细胞Expisf9-ZY,于27~28℃下,100~135rpm孵育培养24~120h,此时即为P0代重组杆状病毒;
所述昆虫Expisf9-ZY细胞已于2022年08月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.45248,分类命名为草地贪夜蛾细胞,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
(3)重组杆状病毒的培养:
将P0代重组杆状病毒依次经过种子液培养和发酵培养进行增殖培养,得重组流感抗原蛋白收获液;
(4)重组杆状病毒的纯化:
将所述重组流感抗原蛋白收获液依次经核酸酶处理、样品浓缩与缓冲液置换处理、柱纯化层析、病毒灭活和过滤除菌,得重组流感HA抗原蛋白溶液;
(5)半成品检测:
将步骤(4)的重组流感HA抗原蛋白液进行杆状病毒和弹状病毒(N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因)检测,如未检出即为合成半成品;
(6)鼻喷剂的制备:
所述鼻喷剂包括如下组分,按重量分数计,HA抗原蛋白50~200份、壳聚糖0.01~0.3份、甘油0.01~0.5份、0.9%NaCl 0.1~0.5份和注射用水5~20份;
制备方法为:将上述组分于5000~10000r/min,乳化3~10min,对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验;
(7)分装处理:
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中,每瓶含5ml,使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在20~80mg范围,即得重组流感亚单位疫苗。
进一步的,所述步骤(11)的具体操作为:将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至poET5.1的载体的多克隆位点上,其中甲型H1N1病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,甲型H3N2病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA1-HA2-A的结构。
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至poET5.1的载体的多克隆位点上,其中乙型Victoria系病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,乙型Yamagata系病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA3-HA4-B的结构。
进一步的,所述步骤(11)中,在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA,均将编码的氨基酸的N端的原有信号肽替换为外源信号肽;
所述外源信号肽为Melittin信号肽、GP64信号肽、HIV-ENV信号肽中的任一一种;外源信号肽序列见表2。
表2外源信号肽序列
序号 | 名称 | 序列 |
1 | Melittin | MKFLVNVALVFMVVYISYIYA;SEQ ID NO.11; |
2 | GP64 | MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA;SEQ ID NO.12; |
3 | HIV-ENV | MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPINMTGS;SEQ ID NO.13; |
进一步的,所述步骤(2)中,重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比0.1~1:0.1~1混合,且重组质粒DNA的总浓度达到0.1~70μg。
进一步的,所述步骤(2)的具体操作为:
(21)昆虫细胞的准备:
a.细胞复苏培养:
从-80℃超低温冰箱中取出冻存的30ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:23~30℃,5~10min。
b.待冻存袋解冻后,将昆虫细胞Expisf9-ZY转移到无菌的15~50ml离心管内,加入10~20ml昆虫细胞培养基,100~600g离心5~20min,弃去上清。
所述昆虫细胞培养基为ESF AFTM培养基。
c.用10~30ml昆虫细胞培养基重悬离心管内细胞沉淀,然后将昆虫细胞培养基补足至20~100ml,后转移至125~500ml的细胞摇瓶培养,该过程细胞复苏需要15~60min,27℃,摇床110~130℃培养。
(22)转染质粒的准备:
将重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比0.1~1:0.1~1混合,且重组质粒DNA的总浓度达到0.1~70μg。
(23)转染络合物准备:
e.置于18~30℃下孵育5~30min,得转染络合物。
(24)转染与收毒:
缓慢的将所述转染络合物滴入复苏好的昆虫细胞Expisf9-ZY,于27~28℃下,100~135rpm孵育培养24~120h,待昆虫细胞出现时结束培养,此时即为P0代重组杆状病毒。将P0代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比100~200:0.1~0.5:0.1~1混合,然后转移至30~100ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1~2×107cell/ml。
进一步的,所述步骤(3)的具体操作为:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养;
(32)P1代重组病毒种子液制备:
将P0代重组杆状病毒按照MOI 0.01~7接种至500~1000ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞活率控制在0.3×105~20×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12~15μm,于27~28℃,培养48~120h,细胞活率在60~85%时收毒,即为P1代重组病毒种子液。将P0代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比100~200:0.1~0.5:0.1~1混合,然后转移至30~100ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1~2×107cell/ml;
(33)生物反应器发酵:
将细胞密度0.1×106~8×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按1~10%的接种量接种至50L WAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的30~60%,在27~28℃条件下将细胞培养至8~24h时排出8~10L的昆虫细胞,然后以100~200ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共10~15L的发酵培养基和0.5~5ml ExpiSfTM Enhancer蛋白增强剂。将P1代重组病毒种子液按MOI 0.01~7接种至生物反应器,待培养24~192h,细胞活率在40~85%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液。
进一步的,步骤(3)的具体操作为:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养:
从超低温冰箱中取出冻存的30~100ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为23~30℃,5~10min。
移至无菌的离心杯中,50~1000g离心5~20min,弃掉上清,保留沉淀,然后用20~100ml细胞复苏培养基重悬昆虫细胞Expisf9-ZY,使重悬后细胞密度大于0.5×106cells/ml,将重悬的昆虫细胞Expisf9-ZY放入无菌的250~500ml的细胞培养瓶内于27~28℃悬浮培养,摇床转速100~135r/min。当昆虫细胞Expisf9-ZY密度生长达到6~10×106cells/ml时进行传代,传代时昆虫细胞Expisf9-ZY接种密度为0.3~1×106cells/ml。
细胞复苏培养基配方:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比70~90:30~10的比例混合后使用。
(32)P1代重组病毒种子液制备:
使用种子液培养基对昆虫细胞Expisf9-ZY进行扩大培养,培养至细胞密度控制在0.6×106~30×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12~15μm时对细胞进行传代处理。
所述种子液培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比60-90:40-10的比例混合后使用。
将P0代重组杆状病毒按照MOI 0.01~7接种至500~1000ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞密度控制在0.3×105~20×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12~15μm,于27~28℃,培养48~120h,细胞活率在60~85%时收毒,即为P1代重组病毒种子液。
(33)生物反应器发酵:
将细胞密度0.1×106~8×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按1~10%的接种量接种至50L WAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的30~60%,在27~28℃条件下将细胞培养至8~24h时排出8~10L的昆虫细胞,然后以100~200ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共10~15L的发酵培养基和0.5~5ml ExpiSfTM Enhancer蛋白增强剂。将P1代重组病毒种子液按MOI 0.01~7接种至生物反应器,待培养24~192h,细胞活率在40~85%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液。
50L WAVE生物反应器参数为:摇速10~30r/min,摇动角度4~9°,通气流速为0.1~0.4L/min,溶氧度35~50%,初始pH值6.0~7.4。
所述发酵培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比50-90:50-10的比例混合后使用。
进一步的,外源营养物质(棉籽水解物)制备方法:
将5~20g棉籽粉与50~100mL蒸馏水置于250~500mL玻璃三角瓶中,添加0.5~5%(E/S,以底物重量计)的复合酶,混匀后,将溶液pH调到6.5~7.5。复合酶(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶),复合酶配比分别为0.5~5:0.5~5:0.5~5。在45~55℃恒温振荡器中酶解60~320min,水解完成后,于90~100℃灭酶5~30min,冷却至20~30℃,抽滤,将制备的水解液经过10~30KD的超滤膜超滤冻干保存,即得到棉籽水解物,其检测指标如表3所示。
表3棉籽水解物检测指标
序号 | 项目 | 测定结果 | 内控标准 |
1 | 微生物含量 | 0CFU/g | 0CFU/g |
2 | 内毒素 | ≤20EU/g | ≤200EU/g |
3 | pH值 | 6.8 | 6.2-7.5 |
4 | 水分含量 | ≤5.4 | ≤6 |
进一步的,所述步骤(4)的具体操作为:
(41)样品预处理:
细胞发酵结束后,将发酵液分装至250~500ml的无菌离心杯中,于4~25℃下,500~10000r/min离心5~30min后弃掉沉淀,将离心后的上清分装留存备用。
(42)核酸酶处理:
将(41)的上清样品、核酸酶和MgCl2按照体积比:10~30:0.05~0.5:0.01~0.03混合,于23~37℃条件下,反应10~120min,反应结束后用pH 7.0的PBST缓冲液洗滤3~5次。
(43)样品浓缩与缓冲液置换处理:
将含有目标蛋白的发酵液置于磷酸盐缓冲液中,目的蛋白发酵液与缓冲液的体积比为0.5~2:3~7,混合均匀后,采用截留分子量10~100kD的超滤膜包进行浓缩处理,流速控制在100~300ml/min,将发酵液浓缩到10~50倍时进行3~7浓缩换液处理,待样品浓缩完后,加入0.05~2mM PMSF溶液,收集浓缩液。
(44)柱纯化层析:
所述重组流感亚单位疫苗病毒液先经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化(平衡缓冲液:20mM PB溶液,1.0mM EDTA二钠,0.01%Triton X-100,5%甘油,pH5.9;洗脱缓冲液:20mM PB溶液,100mMNaCl,0.05%TritonX-100,5%甘油,pH 7.03),最后经过Finedex 200pg(平衡缓冲液:20mM PB溶液,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH7.03)进行再次纯化;
(45)病毒灭活:
将纯化后目的蛋白液与β-丙内酯按体积比500~5000:0.1~1混合,β-丙内酯的质量浓度0.1~5mg/L,于4~15℃灭活12~96h,37℃水浴0.5~2h,以达到分解β-丙内酯的目的。
(46)过滤除菌:
将样品过0.22~0.45微米的滤膜,得到重组流感HA抗原蛋白溶液。
进一步的,所述步骤(5)为将制备好的重组流感HA抗原蛋白溶液进行杆状病毒和弹状病毒(N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因)检测,重组流感HA抗原蛋白溶液均检测不出表4的目的基因条带,表明样品中无杆状病毒和无弹状病毒污染,即为合格的半样品。
检测引物信息如表4所示。
表4检测引物检测表
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明取得的有益效果为:1、采用昆虫细胞杆状病毒表达系统实现了四价流感疫苗的高效制备,不需要频繁的蓝白斑筛选,易于重组载体的构建;2、与传统水浴复苏细胞相比,本发明采用的细胞复苏方式,可以自动识别复苏终点以最大限度的提高复苏后细胞的活性,同时减少过程中人工处理误差和批间差异,同时避免样品在解冻复苏过程中损失、污染,可记录复苏全过程的数据。3、在目的蛋白大量生产环节采用缓慢流加的外源营养物质,可延长昆虫细胞的表达时间,提高目的蛋白的产量4、采用高密度多级发酵方式制备生产重组目标蛋白,提高了疫苗的生产效率,达到高效制备重组流感疫苗的目的,该扩增方式可显著减少生物制药企业种子罐的购买投入、运行成本和维护成本;5、与传统的细胞罐发酵生产流感疫苗相比,本发明采用WAVE摇摆生物反应器生产重组流感疫苗,避免了细胞罐搅拌桨叶对昆虫细胞或病毒的剪切影响,该方法间接的提高了目的蛋白的表达量,同时采用WAVE摇摆生物反应器的使用避免了对细胞罐发酵设备的灭菌或清洗环节,操作简便,大大节省了生产空间,降低了劳动成本,提高了疫苗的生产效率。6、本发明重组流感疫苗制备工艺,在昆虫细胞发酵过程中,发酵罐使用酶解的棉籽作为培养基成分之一,这是因为酶解的棉籽富含大量的可溶性蛋白和小分子多肽类等物质,有利于昆虫细胞和杆状病毒的快速利用,从而缩短了重组流感疫苗制备周期。7、本发明提供的重组杆状病毒的构建方法具有高效、快速、稳定等特点,可一次完成4个蛋白的同时高效表达,解决了传统生产中转染效率低和病毒滴度偏低的问题,大大缩短了生产周期。8、剔除原有基因的信号肽,添加新信号肽,实现了目的基因的高效分泌表达。9、本发明可直接用于对鼻腔内部进行注射喷雾重组流感亚单位疫苗,易操作,使用方便,降低了医用耗材的成本。10、在重组流感疫苗制备环节,使用的核酸酶能够有效去除产品中核酸的残留和污染,降低液体粘度,提高后续柱层析效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明poET5.1-HA1-HA2-A图谱;
图2附图为本发明poET5.1-HA3-HA4-B图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
昆虫细胞Expisf9-ZY为本公司研发人员从市售的昆虫细胞Expisf9中筛选获得的无弹状病毒的昆虫细胞,现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2022年8月19日,保藏编号为CGMCCNo.45248。
ExpiSfTM Enhancer,购自赛默飞世尔科技有限公司。
Rigose Q HiRes、Rigose SP HiRes和Finedex 200pg,购自嘉兴千纯生物科技有限公司。
ESF AFTM昆虫细胞培养基,购自Expression symtems公司。
甲型H1N1(A/Washington/19/2020)购自美国疾病控制与预防中心。
甲型H3N2(A/Darwin/11/2021)购自澳大利亚维多利亚传染病参考实验室。
乙型Yamagata系(B/Singapore/INFTT-16-0610/2016)购自澳大利亚维多利亚传染病参考实验室。
乙型Victoria系(B/Conecticut/01/2021)购自美国疾病控制与预防中心。
KM小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
核酸酶,购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
本发明所需药剂为常规实验药剂,采购自市售渠道;未提及的实验方法为常规实验方法,在此不再一一赘述。
实施例1
(1)构建重组质粒:
(11)构建重组质粒:
将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至poET5.1的载体的多克隆位点上,其中甲型H1N1病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,甲型H3N2病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA1-HA2-A的结构(如图1所示)。
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至poET5.1的载体的多克隆位点上,其中乙型Victoria系病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,乙型Yamagata系病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA3-HA4-B的结构(如图2所示)。
在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA,均将编码的氨基酸的N端的原有信号肽替换为外源信号肽。
所述外源信号肽均为Melittin信号肽。
(12)质粒的转化:
取出大肠杆菌化学感受态细胞DH5α立即放在冰上,将10μL质粒DNA(基因合成干粉溶解后稀释10倍使用)冰浴45min,热激60s,添加已复温的LB培养基,置于37℃摇床220r/min温育培养,培养2h后取出10μL菌液涂平板,LB培养基平板置于37℃培养16h。培养结束后使用无菌接种环挑取正常的菌斑5个单菌落然后加入到含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养16h,取5mL菌液进行质粒的小量提取,溶解于20μL无菌水,并对pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B质粒目的基因进行鉴定。鉴定无误后进行菌种保藏。
所用引物序列如表1所示。
(13)菌体发酵培养:
一级菌种培养:接5μL保藏的菌接种至含有30mL LB液体培养基的100mL三角瓶中,37℃,160r/min培养12h。
二级菌种扩大培养:接3mL已活化的一级菌种接种至含有250mL LB液体培养基的3L挡板三角瓶,37℃,160r/min培养18h。
菌体收获:取50mL无菌的离心瓶,将培养好的菌液分装入离心瓶,4℃,10000g离心5min,弃上清。用生理盐水重悬菌体,然后置于4℃,10000g离心10min,弃上清,并收获菌体。
(14)质粒DNA提取:
采用PureLinkHiPure质粒DNA大量提取试剂盒从菌体中纯化高纯度的质粒DNA,使质粒DNA浓度控制为0.9mg/mL。
(2)构建重组杆状病毒:
(21)昆虫细胞的准备:
a.细胞复苏培养:
从-80℃超低温冰箱中取出冻存的50ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:23℃,6min。
b.待冻存袋解冻后,将昆虫细胞Expisf9-ZY转移到无菌的15ml离心管内,加入20ml昆虫细胞培养基,600g离心5min,弃去上清。
所述昆虫细胞培养基为ESF AFTM培养基。
c.用10ml昆虫细胞培养基重悬离心管内细胞沉淀,然后将昆虫细胞培养基补足至20ml,后转移至125ml的细胞摇瓶培养,该过程细胞复苏需要60min,27℃,摇床130r/min培养。
(22)转染质粒的准备:
将重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比0.1:1混合,且重组质粒DNA的总浓度达到70μg。
(23)转染络合物准备:
e.置于18℃下孵育30min,得转染络合物。
(24)转染与收毒:
缓慢的将所述转染络合物滴入复苏好的昆虫细胞Expisf9-ZY,于28℃下,135rpm孵育培养120h,待昆虫细胞出现时结束培养,此时即为P0代重组杆状病毒。将P0代重组杆状病毒毒种、乳糖与胎牛血清按照体积比100:0.5:1混合,然后转移至100ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1.5×107cell/ml。
(3)重组杆状病毒的培养:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养:
从超低温冰箱中取出冻存的100ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:23℃,10min。
移至无菌的离心杯中,800g离心15min,弃掉上清,保留沉淀,然后用100ml细胞复苏培养基重悬昆虫细胞Expisf9-ZY,使重悬后细胞密度大于0.5×106cells/ml,将重悬的昆虫细胞Expisf9-ZY放入无菌的500ml的细胞培养瓶内于28℃悬浮培养,摇床转速135r/min。当昆虫细胞Expisf9-ZY密度生长达到10×106cells/ml时进行传代,传代时昆虫细胞Expisf9-ZY接种密度为1×106cells/ml。
细胞复苏培养基配方:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比90:10的比例混合后使用。
(32)P1代重组病毒种子液制备:
将P0代重组杆状病毒按照MOI 7接种至1000ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞活率控制在20×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12μm,于28℃,培养72h,细胞活率在85%时收毒,即为P1代重组病毒种子液。将P1代重组杆状病毒毒种、乳糖与胎牛血清按照体积比100:0.5:1混合,然后转移至100ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1.5×107cell/ml。。
所述种子液培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比60:40的比例混合后使用。
(33)生物反应器发酵:
将细胞密度0.1×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按10%的接种量接种至50LWAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的60%,在28℃条件下将细胞培养至8h时排出8L的昆虫细胞,然后然后以100ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共10L的发酵培养基和5ml ExpiSfTMEnhancer蛋白增强剂。将P1代重组病毒种子液按MOI 7接种至生物反应器,待培养192h,细胞活率在40%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液。
50L WAVE生物反应器参数为:摇速10r/min,摇动角度4°,通气流速为0.1L/min,溶氧度50%,初始pH值7.4。
外源营养物质(棉籽水解物)制备方法:
将5g棉籽粉与50mL蒸馏水置于250mL玻璃三角瓶中,添加5%(E/S,以底物重量计)的复合酶,混匀后,将溶液pH调到7.5。复合酶(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶),复合酶配比分别为1:0.5:5。在55℃恒温振荡器中酶解320min,水解完成后,于90℃灭酶15min,冷却至25℃,抽滤,将制备的水解液经过30KD的超滤膜超滤冻干保存,即得到棉籽水解物。
(4)重组杆状病毒的纯化:
(41)样品预处理:
细胞发酵结束后,将发酵液分装至300ml的无菌离心杯中,于20℃下,2000r/min离心5min后弃掉沉淀,将离心后的上清分装留存备用。
(42)核酸酶处理:
将(41)的上清样品、核酸酶和MgCl2按照体积比:20:0.05:0.03混合,于23℃条件下,反应60min,反应结束后用pH 7.0的PBST缓冲液洗滤4次。
(43)样品浓缩与缓冲液置换处理:
将含有目标蛋白的发酵液置于磷酸盐缓冲液中,目的蛋白发酵液与缓冲液的体积比为1:4,混合均匀后,采用截留分子量10kD的超滤膜包进行浓缩处理,流速控制在200ml/min,将发酵液浓缩到30倍时进行5次浓缩换液处理,待样品浓缩完后,加入1mM PMSF溶液,收集浓缩液。
(44)柱纯化层析:
所述重组流感亚单位疫苗病毒液先经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化(平衡缓冲液:20mM PB溶液,1.0mM EDTA二钠,0.01%Triton X-100,5%甘油,pH5.9;洗脱缓冲液:20mM PB溶液,100mMNaCl,0.05%TritonX-100,5%甘油,pH 7.03。),最后经过Finedex 200pg(平衡缓冲液:20mM PB溶液,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH7.03)进行再次纯化。
(45)病毒灭活:
将纯化后目的蛋白液与β-丙内酯按体积比1000:1混合,β-丙内酯的质量浓度2mg/L,于4℃灭活96h,37℃水浴0.5h,以达到分解β-丙内酯的目的。
(46)过滤除菌:
过0.22μm的滤膜,得到重组流感HA抗原蛋白溶液。
(5)将制备好的重组流感HA抗原蛋白溶液进行杆状病毒和弹状病毒(N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因)检测,重组流感HA抗原蛋白溶液均检测不出目的基因条带,表明样品中无杆状病毒和无弹状病毒污染,即为合格的半样品。
检测引物信息如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.27。
(6)鼻喷剂的制备:
鼻喷剂包括如下组分,按重量分数计,具体为HA抗原蛋白50份,壳聚糖0.01份,甘油0.5份,0.9%NaCl 0.1份和注射用水5份进行乳化,于5000r/min,乳化3min,对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验。
(7)分装处理:
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中,每瓶含5ml,使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在80mg范围,即得重组流感亚单位疫苗。
实施例2
(1)构建重组质粒:
(11)构建重组质粒:
将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,其中甲型H1N1病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,甲型H3N2病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA1-HA2-A的结构(如图1所示)。
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,其中乙型Victoria系病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,乙型Yamagata系病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA3-HA4-B的结构(如图2所示)。
在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA,均将编码的氨基酸的N端的原有信号肽替换为外源信号肽;
外源信号肽均为GP64信号肽。
(12)质粒的转化:
取出大肠杆菌化学感受态细胞DH5α立即放在冰上,将2μL质粒DNA(基因合成干粉溶解后稀释100倍使用)冰浴15min,热激60s,添加已复温的LB培养基,置于37℃摇床180r/min温育培养,培养1h后取出5μL菌液涂平板,LB培养基平板置于37℃培养18h。培养结束后使用无菌接种环挑取正常的菌斑5个单菌落然后加入到含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养18h,收取2mL菌液进行质粒的小量提取,溶解于60μL无菌水,并对pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B质粒目的基因进行鉴定。鉴定无误后进行菌种保藏。
所用引物序列如表1所示。
(13)菌体发酵培养:
一级菌种培养:接10μL保藏的菌接种至含有15mL LB液体培养基的100mL三角瓶中,37℃,220r/min培养6h。
二级菌种扩大培养:接15mL已活化的一级菌种接种至含有500mL LB液体培养基的3L挡板三角瓶,37℃,220r/min培养12h。
菌体收获:取500mL无菌的离心瓶,将培养好的菌液分装入离心瓶,25℃,500g离心30min,弃上清。用生理盐水重悬菌体,然后置于25℃,500g离心20min,弃上清,并收获菌体。
(14)质粒DNA提取:
采用PureLinkHiPure质粒DNA大量提取试剂盒从菌体中纯化高纯度的质粒DNA,使质粒DNA浓度控制为1.5mg/mL。
(2)构建重组杆状病毒:
(21)昆虫细胞的准备:
a.细胞复苏培养:
从-80℃超低温冰箱中取出冻存的100ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:27℃,10min。
b.待冻存袋解冻后,将昆虫细胞Expisf9-ZY转移到无菌的50ml离心管内,加入10ml昆虫细胞培养基,100g离心5min,弃去上清。
所述昆虫细胞培养基为ESF AFTM培养基。
c.用30ml昆虫细胞培养基重悬离心管内细胞沉淀,然后将昆虫细胞培养基补足至100ml,后转移至500ml的细胞摇瓶培养,该过程细胞复苏需要30min,27℃,摇床110r/min培养。
(22)转染质粒的准备:
将重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比1:0.1混合,且重组质粒DNA的总浓度达到0.1μg。
(23)转染络合物准备:
e.置于30℃下孵育5min,得转染络合物。
(24)转染与收毒:
缓慢的将所述转染络合物滴入复苏好的昆虫细胞Expisf9-ZY,于27℃下,100rpm孵育培养24h,待昆虫细胞出现时结束培养,此时即为P0代重组杆状病毒。将P0代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比200:0.1:0.1混合,然后转移至30ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为2×107cell/ml。
(3)重组杆状病毒的培养:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养:
从超低温冰箱中取出冻存的50ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:27℃,6min。
移至无菌的离心杯中,50g离心20min,弃掉上清,保留沉淀,然后用80ml细胞复苏培养基重悬昆虫细胞Expisf9-ZY,使重悬后细胞密度大于0.5×106cells/ml,将重悬的昆虫细胞Expisf9-ZY放入无菌的250ml的细胞培养瓶内于27℃悬浮培养,摇床转速120r/min。当昆虫细胞Expisf9-ZY密度生长达到6×106cells/ml时进行传代,传代时昆虫细胞Expisf9-ZY接种密度为0.3×106cells/ml。
细胞复苏培养基配方:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比80:20的比例混合后使用。
(32)P1代重组病毒种子液制备:
将P0代重组杆状病毒按照MOI 2接种至1000ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞活率控制在0.3×105cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径13μm,于27℃,培养48h,细胞活率在60%时收毒,即为P1代重组病毒种子液。将P1代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比200:0.1:0.1混合,然后转移至30ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为2×107cell/ml。
所述种子液培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比70:30的比例混合后使用。
(33)生物反应器发酵:
将细胞密度1×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按5%的接种量接种至50LWAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的50%,在27℃条件下将细胞培养至24h时排出8L的昆虫细胞,然后以200ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共15L新鲜的发酵培养基和0.5ml ExpiSfTMEnhancer蛋白增强剂。将P1代重组病毒种子液按MOI 5接种至生物反应器,待培养96h,细胞活率在85%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液。
所述发酵培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比60:40的比例混合后使用。
50L WAVE生物反应器参数为:摇速30r/min,摇动角度9°,通气流速为0.4L/min,溶氧度35%,初始pH值7.0。
外源营养物质(棉籽水解物)制备方法:
将20g棉籽粉与100mL蒸馏水置于250mL玻璃三角瓶中,添加0.5%(E/S,以底物重量计)的复合酶,混匀后,将溶液pH调到6.5。复合酶(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶),复合酶配比分别为0.5:5:0.5。在45℃恒温振荡器中酶解60min,水解完成后,于100℃灭酶5min,冷却至30℃,抽滤,将制备的水解液经过10KD的超滤膜超滤冻干保存,即得到棉籽水解物
(4)重组杆状病毒的纯化:
(41)样品预处理:
细胞发酵结束后,将发酵液分装至500ml的无菌离心杯中,于25℃下,10000r/min离心10min后弃掉沉淀,将离心后的上清分装留存备用。
(42)核酸酶处理:
将(41)的上清样品、核酸酶和MgCl2按照体积比:30:0.5:0.03混合,于23℃条件下,反应10min,反应结束后用pH 7.0的PBST缓冲液洗滤5次。
(43)样品浓缩与缓冲液置换处理:
将含有目标蛋白的发酵液置于磷酸盐缓冲液中,目的蛋白发酵液与缓冲液的体积比为0.5:3,混合均匀后,采用截留分子量30kD的超滤膜包进行浓缩处理,流速控制在100ml/min,将发酵液浓缩到10倍时进行7次浓缩换液处理,待样品浓缩完后,加入2mM PMSF溶液,收集浓缩液。
(44)柱层析:
所述重组流感亚单位疫苗病毒液先经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化(平衡缓冲液:20mM PB溶液,1.0mM EDTA二钠,0.01%Triton X-100,5%甘油,pH5.9;洗脱缓冲液:20mM PB溶液,100mMNaCl,0.05%TritonX-100,5%甘油,pH 7.03。),最后经过Finedex 200pg(平衡缓冲液:20mM PB溶液,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH7.03)进行再次纯化。
(45)病毒灭活:
将纯化后目的蛋白液与β-丙内酯按体积比5000:0.1混合,β-丙内酯的质量浓度0.1mg/L,于15℃灭活48h,37℃水浴2h,以达到分解β-丙内酯的目的。
(46)过滤除菌:
过0.45μm的滤膜,得到重组流感HA抗原蛋白溶液。
(5)将制备好的重组流感HA抗原蛋白溶液进行杆状病毒和弹状病毒(N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因)检测,重组流感HA抗原蛋白溶液均检测不出目的基因条带,表明样品中无杆状病毒和无弹状病毒污染,即为合格的半样品。
检测引物信息如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.27。
(6)鼻喷剂的制备:
所述鼻喷剂包括如下组分,按重量分数计,具体为HA抗原蛋白100份,壳聚糖0.1份,甘油0.01份,0.9%NaCl 0.5份和注射用水10份进行乳化,于8000r/min,乳化10min,对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验。
(7)分装处理:
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中,每瓶含5ml,使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在20mg范围,即得重组流感亚单位疫苗。
实施例3
(1)构建重组质粒:
(11)构建重组质粒:
将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,其中甲型H1N1病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,甲型H3N2病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成pOET5.1-HA1-HA2-A的结构(如图1所示)。
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至poET5.1的载体的多克隆位点上,其中乙型Victoria系病毒的HA基因连在多克隆位点BamHI和KpnI之间,乙型Yamagata系病毒的HA基因连在多克隆位点EcoRI和NotI之间,形成poET5.1-HA3-HA4-B的结构(如图2所示)。
在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA的N端,均将目的基因原有信号肽替换为外源信号肽。
外源信号肽均为HIV-ENV信号肽。
(12)质粒的转化:
取出大肠杆菌化学感受态细胞DH5α立即放在冰上,将5μL质粒DNA(基因合成干粉溶解后稀释10倍使用)冰浴30min,热激60s,添加已复温的LB培养基,置于37℃摇床200r/min温育培养,培养0.5h后取出5μL菌液涂平板,LB培养基平板置于37℃培养18h。培养结束后使用无菌接种环挑取正常的菌斑10个单菌落然后加入到含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养20h,取5mL菌液进行质粒的小量提取,溶解于30μL无菌水,并对poET5.1-HA1-HA2-A和poET5.1-HA3-HA4-B质粒目的基因进行鉴定。鉴定无误后进行菌种保藏。
所用引物序列如表1所示。
(13)菌体发酵培养:
一级菌种培养:接5~10μL保藏的菌接种至含有20mL LB液体培养基的100mL三角瓶中,37℃,180r/min培养6h。
二级菌种扩大培养:接15mL已活化的一级菌种接种至含有500mL LB液体培养基的3L挡板三角瓶,37℃,180r/min培养18h。
菌体收获:取500mL无菌的离心瓶,将培养好的菌液分装入离心瓶,15℃,8000g离心15min,弃上清。用生理盐水重悬菌体,然后置于15℃,8000g离心15min,弃上清,并收获菌体。
(14)质粒DNA提取:
采用PureLinkHiPure质粒DNA大量提取试剂盒从菌体中纯化高纯度的质粒DNA,使质粒DNA浓度控制为1.0mg/mL。
(2)构建重组杆状病毒:
(21)昆虫细胞的准备:
a.细胞复苏培养:
从-80℃超低温冰箱中取出冻存的50ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:30℃,5min。
b.待冻存袋解冻后,将昆虫细胞Expisf9-ZY转移到无菌的25ml离心管内,加入15ml昆虫细胞培养基,300g离心20min,弃去上清。
所述昆虫细胞培养基为ESF AFTM培养基。
c.用25ml昆虫细胞培养基重悬离心管内细胞沉淀,然后将昆虫细胞培养基补足至75ml,后转移至500ml的细胞摇瓶培养,该过程细胞复苏需要30min,27℃,摇床120r/min培养。
(22)转染质粒的准备:
将重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比0.5:0.5混合,且重组质粒DNA的总浓度达到20μg。
(23)转染络合物准备:
e.置于25℃下孵育30min,得转染络合物。
(24)转染与收毒:
缓慢的将所述转染络合物滴入复苏好的昆虫细胞Expisf9-ZY,于28℃下,120rpm孵育培养96h,待昆虫细胞出现时结束培养,此时即为P0代重组杆状病毒。将P0代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比150:0.2:0.5混合,然后转移至50ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1×107cell/ml。
(3)重组杆状病毒的培养:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养:
从超低温冰箱中取出冻存的50ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:30℃,5min。
移至无菌的离心杯中,50g离心20min,弃掉上清,保留沉淀,然后用80ml细胞复苏培养基重悬昆虫细胞Expisf9-ZY,使重悬后细胞密度大于0.5×106cells/ml,将重悬的昆虫细胞Expisf9-ZY放入无菌的250ml的细胞培养瓶内于28℃悬浮培养,摇床转速120r/min。当昆虫细胞Expisf9-ZY密度生长达到6×106cells/ml时进行传代,传代时昆虫细胞Expisf9-ZY接种密度为0.3×106cells/ml。
细胞复苏培养基配方:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比70:30的比例混合后使用。
(32)P1代重组病毒种子液制备:
将P0代重组杆状病毒按照MOI 0.01接种至500ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞活率控制在20×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12μm,于28℃,培养48h,细胞活率在80%时收毒,即为P1代重组病毒种子液。将P1代重组杆状病毒毒种、乳糖和胎牛血清按照体积比150:0.2:0.5混合,然后转移至50ml细胞冻存袋进行冻存处理,冻存密度为1×107cell/ml。
所述种子液培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比90:10的比例混合后使用。
(33)生物反应器发酵:
将细胞密度8×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按1%的接种量接种至50LWAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的30%,在28℃条件下将细胞培养至24h时排出10L的昆虫细胞,然后以150ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共12L的发酵培养基和3ml ExpiSfTMEnhancer蛋白增强剂。将P1代重组病毒种子液按MOI 0.01接种至生物反应器,待培养120h,细胞活率在50%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液。
所述发酵培养基:ESF AFTM昆虫细胞培养基与外源营养物质(棉籽水解物)按照体积比50:50的比例混合后使用。
50L WAVE生物反应器参数为:摇速20r/min,摇动角度6°,通气流速为0.2L/min,溶氧度40%,初始pH值6.0。
进一步的,外源营养物质(棉籽水解物)制备方法:
将10g棉籽粉与90mL蒸馏水置于500mL玻璃三角瓶中,添加1%(E/S,以底物重量计)的复合酶,混匀后,将溶液pH调到7.0。复合酶(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶),复合酶配比分别为5:2:0.5。在50℃恒温振荡器中酶解120min,水解完成后,于90℃灭酶30min,冷却至20℃,抽滤,将制备的水解液经过10KD的超滤膜超滤冻干保存,即得到棉籽水解物。
(4)重组杆状病毒的纯化:
(41)样品预处理:
细胞发酵结束后,将发酵液分装至250ml的无菌离心杯中,于4℃下,500r/min离心30min后弃掉沉淀,将离心后的上清分装留存备用。
(42)核酸酶处理:
将(41)的上清样品、核酸酶和MgCl2按照体积比:10:0.5:0.01混合,于37℃条件下,反应120min,反应结束后用pH 7.0的PBST缓冲液洗滤3次。
(43)样品浓缩与缓冲液置换处理:
将含有目标蛋白的发酵液置于磷酸盐缓冲液中,目的蛋白发酵液与缓冲液的体积比为2:7,混合均匀后,采用截留分子量100kD的超滤膜包进行浓缩处理,流速控制在300ml/min,将发酵液浓缩到50倍时进行3次浓缩换液处理,待样品浓缩完后,加入0.05mM PMSF溶液,收集浓缩液。
(44)柱纯化层析:
所述重组流感亚单位疫苗病毒液先经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化(平衡缓冲液:20mM PB溶液,1.0mM EDTA二钠,0.01%Triton X-100,5%甘油,pH5.9;洗脱缓冲液:20mM PB溶液,100mMNaCl,0.05%TritonX-100,5%甘油,pH 7.03。),最后经过Finedex 200pg(平衡缓冲液:20mM PB溶液,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH7.03)进行再次纯化。
(45)病毒灭活:
将纯化后的目的抗原蛋白液与β-丙内酯按体积比500:0.1混合,β-丙内酯的质量浓度5mg/L,于4℃灭活12h,37℃水浴1h,以达到分解β-丙内酯的目的。
(46)过滤除菌:
过0.22μm的滤膜,得到重组流感HA抗原蛋白溶液。
(5)将制备好的重组流感HA抗原蛋白溶液进行杆状病毒和弹状病毒(N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因)检测,重组流感HA抗原蛋白溶液均检测不出目的基因条带,表明样品中无杆状病毒和无弹状病毒污染,即为合格的半样品。
检测引物信息如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.27。
(6)鼻喷剂的制备:
所述鼻喷剂包括如下组分,按重量分数计,具体为抗原蛋白200份,壳聚糖0.3份,甘油0.1份,0.9%NaCl 0.3份和注射用水20份进行乳化,于10000r/min,乳化5min,对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验。
(7)分装处理:
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中,每瓶含5ml,使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在40mg范围,即得重组流感亚单位疫苗。
实施例4产品特性对比
实验组1为重组流感亚单位疫苗,其中所使用的细胞为Expisf9,在蛋白表达阶段(生物反应器发酵)采用50L带搅拌桨的玻璃罐生物反应器进行发酵,其余操作同实施例1;
实验组2为重组流感亚单位疫苗,其中所使用的细胞为Expisf9-ZY,在蛋白表达阶段(生物反应器发酵)采用50L带搅拌桨的玻璃罐生物反应器进行发酵,其余操作同实施例1;
实验组3为重组流感亚单位疫苗,其中所使用的细胞为Expisf9,在蛋白表达阶段(生物反应器发酵)采用50L WAVE生物反应器进行发酵,其余操作同实施例1;
实验组4为本发明实施例1制备的重组流感亚单位疫苗,其中所使用的细胞为Expisf9-ZY在蛋白表达阶段(生物反应器发酵)采用50L WAVE生物反应器进行发酵;
实验组5为本发明实施例1制备的重组流感亚单位疫苗,其中所使用的重组杆状病毒HA基因自身的信号肽未进行替换,其余同实验组4。其产品特性对比见表5。
表5产品特性对比
结果表明,实验组2、实验组4和实验5的冻存的细胞数和细胞存活率均高于实验组1和实验组3的,说明Expisf9-ZY细胞的存活性能好于Expisf9细胞,本发明采用新型的细胞复苏方式,可以自动识别复苏终点以最大限度的提高复苏后细胞的活性,同时减少过程中人工处理误差和批次间差异;抗原蛋白表达量高低依次为:实验组4>实验组2>实验组3>实验组1>实验5,其中以实验组4抗原蛋白含量最高,表明该种制备方式有利于细胞的繁殖与杆状病毒扩增,利于蛋白的表达;实验组2和实验组4产品中不存在杆状病毒和弹状病毒的风险,表明筛选的Expisf9-ZY制备的重组流感亚单位疫苗安全性高于Expisf9;从实验1至实验4可知,以Expisf9-ZY为基质生产的重组杆状病毒毒种(P0代和P1代)的稳定性比以Expisf9为基质生产的重组杆状病毒毒种(P0代和P1代)的稳定性强,表明Expisf9-ZY细胞的生产性能好于Expisf9细胞;实验组1-4(进行了信号肽替换)比实验组5(含有自身信号肽)的毒种(P0代和P1代)的滴度、蛋白表达量均高,说明HA基因结构的优化有利于提高HA抗原蛋白的表达。
实施例5重组流感亚单位疫苗鼻喷制剂免疫效果的研究
共设6组,其中:
其一,阴性对照组为:未接种鼻喷疫苗,未攻毒;
其二,阳性对照组为:未接种鼻喷疫苗,攻毒;
其三,实验组1为:接种本发明实施例1制备的重组流感亚单位疫苗后在攻毒,其中所使用的杆状病毒DNA为flashBAC GOLD制备的重组流感HA抗原蛋白;
其四,实验组2为:接种重组流感亚单位疫苗后在攻毒,其中所使用的杆状病毒DNA替换为杆状病毒flashBAC ULTRA制备的重组流感HA抗原蛋白,其余操作同实施例1;
其五,实验组3为:接种以Bac-to-Bac表达系统DH10Bac制备的重组流感HA抗原蛋白后在攻毒;
其六,实验组4为:接种市售四价流感亚单位疫苗后在攻毒。
本发明选用出生和体重接近的SPF级KM小鼠。
免疫对象:选取3~4周龄KM小鼠,雌雄各半,每组90只,每组4个重复。
本发明选用毒株为:甲型H1N1(A/Washington/19/2020),甲型H3N2(A/Darwin/11/2021),乙型Yamagata系(B/Singapore/INFTT-16-0610/2016)和乙型Victoria系(B/Conecticut/01/2021)。
免疫地点:在中逸安科生物技术股份有限公司SPF级动物房进行。
免疫计划:小鼠每日鼻喷连续进行7天,每次喷剂使用量为0.1ml,早晚各一次。免疫7天后进行攻毒实验,以350μL/只(107EID50)的剂量对KM小鼠的颈部皮下进行接毒。记录免疫后21天的小鼠的体重(若小鼠体重减轻≥25%,则为不符合要求项)、存活率、抗体效价,考察整个培养过程是否存在过敏反应或异常毒性。产品应用效果研究结果见表6。
表6应用效果研究
结果表明,从阴性对照组和阳性对照组可知,未接种鼻喷疫苗小鼠体内无抗体产生,小鼠攻毒后无存活;与实验组4相比,实验组1、实验组2和实验组3中小鼠的体重、存活率、抗体水平均高于实验组4,说明接种重组流感亚单位疫苗鼻喷制剂能产生明显的免疫防护效果,免疫防护效果从高到低依次为:实验组1>实验组2>实验组4>实验组3,其中以实验组1的所使用的杆状病毒DNA为flashBAC GOLD制备的重组流感HA抗原蛋白免疫效果最佳。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,其特征在于,将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上,经过多级高密度发酵和纯化,获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白;
甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
乙型Yamagata系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
乙型Victoria系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
具体步骤如下:
构建重组质粒:
构建重组质粒:
将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,形成pOET5.1-HA1-HA2-A;
将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上,形成pOET5.1-HA3-HA4-B;
在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA,均将编码的氨基酸的N端的原有信号肽替换为外源信号肽;
所述外源信号肽为Melittin信号肽、GP64信号肽、HIV-ENV信号肽中任选一种;
将pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B进行目的基因的鉴定;
构建重组杆状病毒:
将重组质粒DNA、flashBAC GOLD杆状病毒基因组DNA添加到TransIT®-Insect转染试剂中,混合均匀,18~30℃孵育5~30min,得转染络合物;
将所述转染络合物滴入昆虫细胞Expisf9-ZY,于27~28℃下,100~135r/min孵育培养24~120h,此时即为P0代重组杆状病毒;
所述昆虫Expisf9-ZY细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.45248;
重组杆状病毒的培养:
将P0代重组杆状病毒依次经过种子液培养和发酵培养进行增殖培养,得重组流感抗原蛋白收获液;
重组杆状病毒的纯化:
将所述重组流感抗原蛋白收获液依次经核酸酶处理、样品浓缩与缓冲液置换处理、柱纯化层析、病毒灭活和过滤除菌,得重组流感HA抗原蛋白溶液;
(5)半成品检测:
将步骤(4)的重组流感HA抗原蛋白液进行杆状病毒和弹状病毒检测,如未检出即为合成半成品;
其中,进行弹状病毒检测时为检测弹状病毒的N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因;
(6)鼻喷剂的制备:
所述鼻喷剂包括如下组分,按重量分数计,HA抗原蛋白50~200份、壳聚糖0.01~0.3份、甘油0.01~0.5份、0.9%NaCl 0.1~0.5份和注射用水5~20份;
制备方法为:将上述组分于5000~10000r/min,乳化3~10min,对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验;
(7)分装处理:
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中,每瓶含5ml,使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在20~80mg范围,即得重组流感亚单位疫苗。
2.如权利要求1所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中,重组质粒pOET5.1-HA1-HA2-A和pOET5.1-HA3-HA4-B按体积比0.1~1:0.1~1混合,且重组质粒DNA的总质量达到0.1~70µg。
3.如权利要求1所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)的具体操作为:
(31)昆虫细胞Expisf9-ZY复苏培养:
从超低温冰箱中取出冻存的30~100ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9-ZY置于自动干热式复苏仪上复苏,复苏仪参数设置为:23~30℃,5~10min;
解冻后的冻存细胞移至无菌的离心杯中,50~1000g离心5~20min,弃掉上清,保留沉淀,然后用20~100ml细胞复苏培养基重悬昆虫细胞Expisf9-ZY,使重悬后细胞密度大于0.5×106cells/ml,将重悬的昆虫细胞Expisf9-ZY放入无菌的250~500ml的细胞培养瓶内于27~28℃悬浮培养,摇床转速100~135r/min,当昆虫细胞Expisf9-ZY密度生长达到6~10×106cells/ml时进行传代,传代时昆虫细胞Expisf9-ZY接种密度为0.3~1×106cells/ml;
细胞复苏培养基配方:ESF AF™昆虫细胞培养基与外源营养物质按照体积比70~90:30~10的比例混合后使用;
所述外源营养物质为棉籽水解物;
(32)P1代重组病毒种子液制备:
将P0代重组杆状病毒按照MOI 0.01~7接种至500~1000ml昆虫细胞Expisf9-ZY培养液中,接种时细胞活率控制在0.3×105~20×106cells/ml,细胞活率>98%,细胞直径12~15μm,于27~28℃,培养48~120h,细胞活率在60~85%时收毒,即为P1代重组病毒种子液;
生物反应器发酵:
将细胞密度0.1×106~8×106cells/ml的昆虫细胞Expisf9-ZY按1~10%的接种量接种至50L WAVE摇摆生物反应器中,50L WAVE生物反应器中培养基的装液量体积为反应袋的30~60%,在27~28℃条件下将细胞培养至8~24h时排出8~10L的昆虫细胞,然后以100 ~200ml/h的灌流速度部分更换WAVE生物反应器内培养基为新鲜的发酵培养基,共10~15L新鲜的发酵培养基和0.5~5ml ExpiSfTM Enhancer蛋白增强剂,将P1代重组病毒种子液按MOI 0.01~7接种至生物反应器,待培养24~192h,细胞活率在40~85%时收毒,即可获得重组流感抗原蛋白收获液;
50L WAVE生物反应器参数为:摇速10~30r/min,摇动角度4~9°,通气流速为0.1~0.4 L/min,溶氧度35~50%,初始pH值6.0~7.4。
4.如权利要求1所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)的具体操作为:
(41)样品预处理:
细胞发酵结束后,将发酵液分装至250~500ml的无菌离心杯中,于4~25℃下,500~10000r/min离心5~30min后弃掉沉淀,将离心后的上清分装留存备用;
(42)核酸酶处理:
将(41)的上清样品、核酸酶和MgCl2按照体积比:10~30:0.05~0.5:0.01~0.03混合,于23~37℃条件下反应,10~120min,反应结束后用pH 7.0的PBST缓冲液洗滤3~5次;
(43)样品浓缩与缓冲液置换处理:
将核酸酶处理的含有目标蛋白的混合液,采用截留分子量10~100kD的膜包进行浓缩处理,收集浓缩液;
(44)柱纯化层析:
所述重组流感亚单位疫苗病毒液先经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化,最后经过Finedex 200pg进行再次纯化;
当经过Rigose Q HiRes柱与Rigose SP HiRes柱串联纯化时,平衡缓冲液包括:20mMPB溶液,1.0mM EDTA二钠,0.01% Triton X-100,5%甘油,pH 5.9;洗脱缓冲液包括:20mMPB溶液,100mM NaCl,0.05% TritonX-100,5%甘油,pH 7.03;
当经过Finedex 200pg进行再次纯化时,平衡缓冲液包括:20 mM PB溶液,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH 7 .03;
(45)病毒灭活:
将纯化后目的蛋白液与β-丙内酯按体积比500~5000:0.1~1混合,β-丙内酯的质量浓度0.1~5mg/L,于4~15℃灭活12~96h,37℃水浴0.5~2h,以达到分解β-丙内酯的目的;
(46)过滤除菌:
将样品过0.22~0.45微米的滤膜,得到重组流感HA抗原蛋白溶液。
5.如权利要求1所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)为将重组流感HA抗原蛋白溶液进行杆状病毒和弹状病毒检测,若样品中无杆状病毒和弹状病毒污染,即为合格的半成品。
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