CN114656518A - 重组蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
在此公开了一种重组蛋白的纯化方法。具体地说是一种采用疏水电荷诱导层析纯化重组蛋白的方法，所述方法包括对包含目标重组蛋白和宿主细胞蛋白的料液进行疏水电荷诱导层析由此去除宿主细胞蛋白，所述疏水电荷诱导层析包括以下步骤：将料液上样到经平衡的疏水电荷诱导层析介质上使得目标重组蛋白与疏水电荷诱导层析介质结合；用含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液淋洗疏水电荷诱导层析介质，所述淋洗添加剂选自：氯化钠(NaCl)，谷氨酸，组氨酸和精氨酸盐酸；用洗脱缓冲液从疏水电荷诱导层析介质上洗脱目标重组蛋白并收集含有目标重组蛋白的洗脱液。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白类生物制品生产领域，更具体地说，涉及采用疏水电荷诱导层析的重组蛋白纯化工艺。
背景技术
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛应用于生产药用蛋白质。伴随着目标蛋白质的表达，大量的过程相关的杂质会被释放到发酵液中，例如宿主细胞蛋白质(Host CellProtein,HCP)和宿主DNA。其中，HCP是一类重要的污染物，会影响产品的稳定性、纯度和药效，还可能会引起机体的过敏反应。因此，在蛋白纯化过程中如何有效地去除HCP是下游工艺开发的重要组成部分。
疏水电荷诱导层析(Hydrophobic Charge Induction Chromatography，HCIC)是一种非特异性的混合模式层析，可用于抗体、Fc融合蛋白和无融合标签的其他重组蛋白的捕获和精纯步骤。HCIC层析作用原理如下：目标蛋白在相对温和、接近中性的pH条件下主要通过疏水相互作用与HCIC填料结合；通过降低流动相的pH，使填料配基的带电性质发生变化，与目标蛋白间产生静电排斥作用，从而使目标蛋白被洗脱下来。
在使用HCIC纯化蛋白质时，由于目标蛋白与填料是通过非特异性的疏水相互作用结合，上样料液中的多种HCP也能够与填料通过非特异性相互作用结合，在洗脱步骤，部分HCP和目标蛋白一同被洗脱下来，导致洗脱产品中的HCP残留量偏高，给后续的纯化步骤造成较大挑战。
发明内容
本发明解决的技术问题包括：在采用疏水电荷诱导层析的重组蛋白纯化工艺中有效降低宿主细胞蛋白含量，提高疏水电荷诱导层析的HCP去除效率。发明人发现，在HCIC工艺中，在淋洗缓冲液中添加氯化钠和几种氨基酸类添加剂能够有效降低洗脱产品中HCP的含量。
据此，本申请提供一种采用HCIC纯化重组蛋白的方法，所述方法包括对包含目标重组蛋白和HCP的料液进行HCIC从而去除HCP，所述HCIC包括以下步骤：
将料液上样到经平衡的HCIC介质上使得目标重组蛋白与HCIC介质结合；
用含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液淋洗HCIC介质，所述淋洗添加剂选自：氯化钠(NaCl)，谷氨酸，组氨酸和精氨酸盐酸；
用洗脱缓冲液从HCIC介质上洗脱目标重组蛋白并收集含有目标重组蛋白的洗脱液。
本发明有效降低了疏水电荷诱导层析洗脱产品的HCP水平。相比区别仅在于HCIC不包括所述含有淋洗添加剂的淋洗步骤的方法，本发明方法去除更多的宿主细胞蛋白。本发明方法适合任何重组蛋白、尤其是蛋白质类生物制剂产品，例如单克隆抗体及其片段、各种工程抗体及其片段、融合蛋白等等。针对不同分子，根据本申请的教导，经过简单优化即可得出优化的HCIC淋洗条件，在降低疏水电荷诱导层析洗脱产品中HCP水平的同时不会显著影响目标蛋白的收率。并且，本发明采用的淋洗添加剂，例如氯化钠、氨基酸或氨基酸盐酸盐，具有良好的安全性和生物相容性。
附图说明
图1：实施例1中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图2：实施例1中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图3：实施例1中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图4：实施例1中目标蛋白即单克隆抗体的收率和HCP残留量。
图5：实施例2中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图6：实施例2中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图7：实施例2中部分实验组的疏水电荷诱导层析图谱。
图8：实施例2中目标蛋白即Fc融合蛋白的收率和和HCP残留量。
图9：实施例3中目标蛋白即无标签重组酶的收率和HCP残留量。
具体实施方案
本文中，除非特别指定，名称、量词或单位前的“一”或“1”表示存在即数量上至少为一，因此涵盖复数含义。
本文中，除非特别指定，本文述及的各项技术特征，例如组分、含量、步骤、条件参数、参数值、组件、连接关系、工作关系等等，它们的组合方式不限于本文具体描述的各个实施方式和实施例，其他任意组合方式同样属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，以两端值表示的数值范围视同具体公开了两端值及两端值之间的所有实数及其两两组合而成的数值范围。此外，除非特别指定，当对同一技术特征或同一参数具体描述了多个可选数值范围或数值时，这些端值和数值可以任意组合，由此得出的范围只要包含在具体描述的最大连续范围之内则均属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，所述数值不论是否带有前行词“约”均涵盖该数值±20％的范围，包括±10％、±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％的范围。
本文中，除非特别指定，所有科学和技术术语的含义均符合本领域、尤其重组蛋白生产和研发领域公知或已知的含义，例如教科书、实验手册或现有技术文献中记载的含义。
具体地说，本文提供一种采用HCIC纯化重组蛋白的方法，所述方法包括对包含目标重组蛋白和HCP的料液进行HCIC从而去除HCP，所述HCIC包括以下步骤：
将料液上样到经平衡的HCIC介质上使得目标重组蛋白与HCIC介质结合；
用含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液淋洗HCIC介质，所述淋洗添加剂选自：NaCl，谷氨酸，组氨酸和精氨酸盐酸；
用洗脱缓冲液从HCIC介质上洗脱目标重组蛋白并收集含有目标重组蛋白的洗脱液。
相比区别仅在于HCIC不包括所述含有淋洗添加剂的淋洗步骤的方法，本发明方法去除更多的宿主细胞蛋白。本文中，“降低”和“去除”同义，都表示使得降低对象或去除对象例如HCP的含量减少的意思，包括减至为零的情形。
本文中，纯化的目标蛋白为“重组蛋白”，这是根据获得途径来定义的蛋白质类别，即重组表达的蛋白质，指利用基因重组技术在宿主细胞中表达产生的蛋白质。其获得通常包括从宿主细胞培养物中收获、分离和纯化重组表达的目标蛋白。HCP是需要纯化去除的主要杂质之一。本文中，表达目标重组蛋白的宿主细胞包括但不限于原核宿主细胞，真核宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、酵母宿主细胞和昆虫宿主细胞。本发明方法适用于通过HCIC降低各种宿主细胞来源的HCP。本发明一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明方法适用于纯化任何重组蛋白，例如单克隆抗体及其功能性片段、基因工程抗体及其功能性片段、非抗体类免疫球蛋白、Fc融合蛋白、以及无融合标签的任意重组蛋白，例如重组酶蛋白。
本发明的料液来自重组蛋白生产中收获的宿主细胞培养液，其中包含目标重组蛋白和HCP。料液的制备可按照HCIC介质供应商的建议或HCIC常规操作进行。一些实施方式中，上样到HCIC介质上的料液是经过澄清化的细胞培养收获液。一些实施方式中，澄清化包括一步或多步离心和/或过滤，例如连续流离心、膜过滤(例如0.1-10μm)、深层过滤。本领域技术人员知道如何根据目标蛋白的性质、重组表达系统的特性和生产条件等因素来设置合适的澄清化工艺。
本发明方法适用于各种HCIC介质。HCIC介质包括基质与配基，通常，HCIC介质主要根据配基来表征。基质材料的例子包括高孔隙率的亲水性介质，例如琼脂糖、纤维素、聚壳糖等。一些实施方式中，HCIC介质为采用纤维素基质的HCIC介质。HCIC介质的配基为特定pH条件下可电离的基团，例如基于吡啶基、咪唑基、酚酸基、烷基氨基及其衍生物等弱碱或弱酸性基团的配基，具体的例子包括基于巯基乙基吡啶(MEP，例如4-MEP)的配基(例如赛多利斯(Sartorius)公司的MEP HyperCelTM介质)、基于己胺基(HEA)的配基(例如赛多利斯公司的HEA HyperCelTM介质)、基于苯丙胺基(PPA)的配基(例如赛多利斯公司的PPA HyperCelTM介质)等。一些实施方式中，HCIC介质为基于吡啶基的配基，例如基于巯基乙基吡啶(例如4-MEP)的配基，例如赛多利斯公司的MEP HyperCelTM介质。一些实施方式中，HCIC介质是层析柱的形式。
在层析中，上样通常是将料液上样到已平衡的层析介质上。可选地，可以在平衡前对层析介质进行漂洗，例如用去离子水或平衡缓冲液进行漂洗，例如用约3-5倍柱体积的纯化水/平衡缓冲液进行漂洗。可选地，还可以在平衡前对层析介质进行消毒，例如用NaOH水溶液、例如1M的NaOH水溶液进行消毒。一些实施方式中，包括用约3-5倍柱体积的NaOH溶液进行消毒。消毒可以在前述平衡前的漂洗之前或者之后。
一些实施方式中，平衡缓冲液pH可以约为7.0-9.0、7.0-8.0、7.2-7.6或7.2-7.4。一些实施方式中，平衡缓冲液可以是例如Tris-醋酸缓冲液和磷酸盐缓冲液(PB)。可选地，平衡缓冲液可以另含100-150mM的盐，例如碱金属和碱土金属(例如钠、钾、镁、钙)的有机酸或无机酸盐，例如氯化钠。可用3-5倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡。本发明中，柱的制备与平衡可以参照层析介质供应商的建议或按照HCIC常规做法来实施。
一些实施方式中，上样后样品在层析柱中的保留时间约为1-10分钟，1-5分钟、3-8分钟、5-10分钟、5-8分钟。一些实施方式中，上述保留时间指样品在上样步骤中与填料的总接触时间。本领域技术人员知道如何根据层析柱的特征、料液的特征、目标蛋白的特征等确定合适的保留时间。
本发明中，在上样之后和洗脱之前包括对层析介质进行含有淋洗添加剂的淋洗，所述淋洗添加剂选自：NaCl，谷氨酸，组氨酸和精氨酸盐酸。一些实施方式中，淋洗添加剂为NaCl。一些实施方式中，NaCl在淋洗缓冲液中的浓度≤约1.0M，例如，可以约为0.1-1.0M，例如0.1-0.5M或0.5-1.0M，又例如0.5M。另一些实施方式中，淋洗添加剂为谷氨酸。一些实施方式中，谷氨酸在淋洗缓冲液中的浓度≤约0.5M，例如，可以约为0.1-0.5M，例如0.2-0.5M或0.3-0.5M。另一些实施方式中，淋洗添加剂为组氨酸。一些实施方式中，组氨酸在淋洗缓冲液中的浓度≤约0.5M，例如，可以约为0.1-0.5M，例如0.2-0.5M或0.3-0.5M。另一些实施方式中，淋洗添加剂为精氨酸盐酸。一些实施方式中，精氨酸盐酸在淋洗缓冲液中的浓度≤约1.0M，例如，约为0.1-1.0M，例如0.2-1.0M、0.1-0.5M或0.5-1.0M。如本文所述，针对具体的目标蛋白，淋洗添加剂的选择及其浓度可以进一步个性化优化，这样的个性化优化是本领域技术人员基于本申请的说明采用常规实验手段能够得出的。
一些实施方式中，含添加剂的淋洗缓冲液其pH约为5.5-6.5，例如约pH 5.5-6.0、约pH 6.0-6.5。淋洗缓冲液的例子包括但不限于具有所述pH的醋酸-醋酸钠缓冲液，例如浓度约为20-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液。一些实施方式中，可以用约3-5倍柱体积的含添加淋洗缓冲液进行淋洗。
一些实施方式中，在含添加剂的淋洗之前还包括用平衡缓冲液淋洗层析介质来去除未结合的杂质并促进目标蛋白与层析介质的结合。例如，可以用约3-5倍柱体积的平衡缓冲液淋洗层析柱。
一些实施方式中，可选性地，可以在含添加剂的淋洗之后包括附加的不含淋洗添加剂的淋洗步骤，即淋洗缓冲液中不含本文所述的淋洗添加剂，用以去除系统中残留的添加剂从而预防和避免可能的非期望的影响。一些实施方式中，附加的无添加剂淋洗其pH约为5.5-6.5，例如约pH 5.5-6.0、约pH 6.0-6.5。淋洗缓冲液的例子包括但不限于具有所述pH的醋酸-醋酸钠缓冲液，例如浓度约为20-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液。一些实施方式中，可以用约3-5倍柱体积的无添加剂淋洗缓冲液进行淋洗。
一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH约为3.0-5.0，例如约4.0-5.0或4.5-5.0或4.7-5.0。洗脱缓冲液的例子包括但不限于具有所述pH的醋酸-醋酸钠缓冲液，例如浓度约为20-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液。一些实施方式中，可以用例如约5-10倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
在完成了目标蛋白洗脱液的收集之后可对HCIC介质进行再生、净化(例如漂洗和消毒)和保存。一些实施方式中，层析介质的再生、净化和保存可在同一封闭系统中的同一次运行中接续在洗脱步骤之后连续进行。一些实施方式中，洗脱之后包括接续进行的再生、漂洗、消毒、再漂洗和保存。层析介质的再生溶液包括但不限于HAc溶液，例如1M HAc溶液。可采用约3-5倍柱体积的再生溶液进行再生。漂洗和再漂洗可用去离子水或平衡缓冲液进行，例如，可用约3-5倍柱体积的去离子水或平衡缓冲液进行漂洗和再漂洗。消毒可用NaOH溶液进行，例如1M的NaOH水溶液，可用3-5倍柱体积的NaOH溶液进行消毒。保存液的例子之一是含1M NaCl的20％乙醇溶液。可用3-5倍柱体积的保存溶液保存层析柱。
实施例
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更为详细地阐述。以下实施例仅为示例，对本发明技术方案不构成任何限定或限制。以下实施例中具体的材料、步骤、条件、数值或数值范围等技术参数仅是举例，并非穷举亦非限定。基于以下实施例，结合本文整体技术信息，根据实际条件和需求可对材料、步骤、条件、数值或数值范围等参数进行增减、改换而不至于显著影响本发明效果的实现，这是本领域技术人员容易想到和容易做到的，这些增减、改换所得的实施方式同样属于本申请保护的本发明范围之内。
实施例1单克隆抗体的疏水电荷诱导层析纯化
本实施例考察了添加氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的淋洗在单克隆抗体疏水电荷诱导层析工艺中的优化效果。
1、料液的制备
收获宿主细胞的培养液，其中宿主细胞为CHO，表达的目标蛋白为单克隆抗体(pI：7.94，分子量(Mw)＝146kDa)。经离心(1000g、10min，10000g、30min)和过滤(0.22μm)制取澄清后的细胞培养收获液作为直接上样到疏水电荷诱导层析柱的料液。
2、疏水电荷诱导层析(HCIC)
采用赛多利斯(Sartorius)公司的MEP HyperCel填料，各实验组的层析柱直径为0.5cm、柱高在10-15cm之间。在思拓凡(Cytiva)公司的
Pure M层析系统上进行疏水电荷诱导层析，具体的层析操作步骤和条件如表1所示。其中，“淋洗2”采用待测淋洗缓冲液即含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液，“对照”表示未执行“淋洗2”，如表2所示。
表1：疏水电荷诱导层析步骤与条件
| 步骤 | 溶液组分 | 体积(CV) | 保留时间(min) |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 消毒 | 1M NaOH | ≥3 | 8 |
| 平衡 | 50mM Tris-HAc,150mM NaCl,pH 7.4 | 5 | 5 |
| 上样 | 细胞培养收获液(澄清后) | 上样载量为10g/L填料 | 5 |
| 淋洗1 | 50mM Tris-HAc,150mM NaCl,pH 7.4 | 5 | 5 |
| 淋洗2 | 待测淋洗缓冲液(见表2) | 5 | 5 |
| 淋洗3 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0 | 3 | 5 |
| 洗脱 | 50mM NaAc-HAc,pH 4.7 | 5-10 | 5 |
| 再生 | 1M HAc | 3 | 8 |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 消毒 | 1M NaOH | ≥3 | 8 |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 保存 | 20％乙醇，1M NaCl | 5 | 5 |
表2：待测淋洗缓冲液
| 实验组 | 淋洗2待测缓冲液 | 淋洗2待测缓冲液关键要素 |
| 1 | 对照组 | 未执行 |
| 2 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M NaCl | 0.5M NaCl |
| 3 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,1.0M NaCl | 1.0M NaCl |
| 4 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M谷氨酸 | 0.5M谷氨酸 |
| 5 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M组氨酸 | 0.5M组氨酸 |
| 6 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.1M精氨酸盐酸 | 0.1M精氨酸盐酸 |
| 7 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.2M精氨酸盐酸 | 0.2M精氨酸盐酸 |
| 8 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M精氨酸盐酸 | 0.5M精氨酸盐酸 |
| 9 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,1.0M精氨酸盐酸 | 1.0M精氨酸盐酸 |
3、分析方法
1)蛋白质浓度的测定：对HCIC纯化前的澄清CHO细胞培养收获液，通过蛋白A亲和层析Protein A-HPLC方法进行滴度分析；对收集的HCIC洗脱液通过检测UV280吸收值进行测量。
2)HCP含量的测定：通过酶联免疫反应检测，试剂盒信息：CYGNUS technologies，CHO HCP ELISA Assay，3G，货号#F550-1。
3)按以下公式计算收率：
其中，“蛋白质”指目标蛋白；“洗脱液”指收集的含有目标蛋白的HCIC洗脱液，本文中亦称洗脱产品。
4、结果
不同实验组疏水电荷诱导层析洗脱产品的收率、残留HCP数据参见图4，相关层析图谱参见图1、图2、图3。由图4中的数据可知，对于此单克隆抗体而言，使用含0.5M NaCl或1.0M NaCl或0.5M谷氨酸或0.5M组氨酸或0.1M精氨酸盐酸或0.2M精氨酸盐酸或0.5M精氨酸盐酸的淋洗2缓冲液进行淋洗，目标蛋白的收率未受显著影响，同时，洗脱产品的HCP含量有效降低。在0.1M-1.0M浓度范围内，随精氨酸盐酸浓度升高，HCP去除效果增强；其中0.5M精氨酸盐酸的添加使洗脱产品中的HCP含量由对照组的25626ppm降低到11293ppm，降低50％以上。继续增加淋洗2缓冲液中的精氨酸盐酸浓度到1.0M，HCP水平进一步降低，但收率受到影响。以上数据表明，添加含氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的淋洗步骤能够提升洗脱产品的HCP去除效果，由此提示这是一种疏水电荷诱导层析工艺的优化策略。
实施例2Fc融合蛋白的疏水电荷诱导层析纯化
本实施例考察了添加氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的淋洗在Fc融合蛋白疏水电荷诱导层析工艺中的优化效果。
如实施例1所述制备料液，所不同的是目标蛋白为Fc融合蛋白(pI：6.6，Mw＝90kDa)。
如实施例1所述进行疏水电荷诱导层析和分析。
结果：
不同实验组疏水电荷诱导层析洗脱产品的收率、残留HCP数据参见图8，相关层析图谱参见图5、图6和图7。由图8的数据可知，对于此Fc融合蛋白而言，使用含0.5M NaCl或1.0M NaCl或0.5M谷氨酸或0.5M组氨酸或0.1M精氨酸盐酸或0.2M精氨酸盐酸的淋洗2缓冲液进行淋洗，目标蛋白的收率未受显著影响，同时，洗脱产品中的HCP含量有效降低。0.5M组氨酸的添加使洗脱产品中的HCP含量由对照组的40229ppm降低到12523ppm，降低65％以上。在0.1M-0.2M浓度范围内，随精氨酸盐酸浓度升高，HCP去除效果增强；但继续增加淋洗2缓冲液中的精氨酸盐酸浓度到0.5M或1.0M，导致目标蛋白在淋洗2步骤中提前被洗脱下来，洗脱步骤目标洗脱产品的收率和产品质量受到影响(HCP数值未展示在图8中)。以上数据表明，整体而言，洗脱前添加适当浓度氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的淋洗步骤能够提升洗脱产品的HCP去除效果，由此提示这是一种疏水电荷诱导层析工艺的优化策略。对于不同的蛋白分子，添加剂类型及其在淋洗缓冲液中的添加量可能需要个性化的调整与优化，这样的调整和优化是本领域技术人员基于本申请的说明采用常规实验手段能够得出的。
实施例3无标签重组酶蛋白的疏水电荷诱导层析纯化
本实施例考察了添加氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的淋洗在无标签重组蛋白疏水电荷诱导层析工艺中的优化效果。
1、料液的制备
如实施例1所述制备料液，所不同的是目标蛋白为无标签重组酶蛋白(pI：7.41，Mw＝56kDa)，所述酶是来自溶酶体的酶。
2、疏水电荷诱导层析(HCIC)
采用赛多利斯(Sartorius)公司的MEP HyperCel填料，各实验组的层析柱直径为0.5-0.8cm、柱高在10-15cm之间。在思拓凡(Cytiva)公司的
Pure M层析系统上进行疏水电荷诱导层析，具体的层析操作步骤和条件如表3所示。其中，其中，“淋洗2”采用待测淋洗缓冲液即含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液，“对照”表示未执行“淋洗2”，如表4所示。
表3：疏水电荷诱导层析步骤与条件
| 步骤 | 溶液组分 | 体积(CV) | 保留时间(min) |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 消毒 | 1M NaOH | 5 | 5 |
| 平衡 | 20mM PB,100mM NaCl,pH 7.2 | 5 | 5 |
| 上样 | 细胞培养收获液(澄清后) | 上样载量为50L/L填料 | 5 |
| 淋洗1 | 20mM PB,100mM NaCl,pH 7.2 | 5 | 5 |
| 淋洗2 | 淋洗2待测缓冲液(见表4) | 5 | 5 |
| 淋洗3 | 50mM NaAc-HAc,pH 5.8 | 5 | 5 |
| 洗脱 | 50mM NaAc-HAc,pH 5.0 | 5-10 | 5 |
| 再生 | 1M HAc | 3 | 5 |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 消毒 | 1M NaOH | 5 | 5 |
| 漂洗 | 去离子水 | 3 | 5 |
| 保存 | 20％乙醇，1M NaCl | 5 | 5 |
表4：待测淋洗缓冲液
| 实验组 | 淋洗2待测缓冲液 | 淋洗2待测缓冲液关键要素 |
| 1 | 对照组 | 未执行 |
| 2 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.5,0.5M NaCl | 0.5M NaCl |
| 3 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,1.0M NaCl | 1.0M NaCl |
| 4 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M谷氨酸 | 0.5M谷氨酸 |
| 5 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M组氨酸 | 0.5M组氨酸 |
| 6 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.1M精氨酸盐酸 | 0.1M精氨酸盐酸 |
| 7 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.2M精氨酸盐酸 | 0.2M精氨酸盐酸 |
| 8 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,0.5M精氨酸盐酸 | 0.5M精氨酸盐酸 |
| 9 | 50mM NaAc-HAc,pH 6.0,1.0M精氨酸盐酸 | 1.0M精氨酸盐酸 |
3、分析方法
1)蛋白质浓度的测定：对HCIC纯化前的澄清CHO细胞培养收获液，通过RP_HPLC方法进行滴度分析；对收集的HCIC洗脱液通过检测UV280吸收值进行测量。
2)HCP含量的测定：通过酶联免疫反应检测，试剂盒信息：CYGNUS technologies，CHO HCP ELISA Assay，3G，货号#F550-1。
3)按以下公式计算收率：
其中，“蛋白质”指目标蛋白；“洗脱液”指收集的含有目标蛋白的HCIC洗脱液，本文中亦称洗脱产品。
4、结果
不同实验组疏水电荷诱导层析洗脱产品的收率、残留HCP数据参见图9。由图9的数据可知，对于此无融合标签的重组酶蛋白而言，使用含0.5M NaCl或0.5M谷氨酸或0.5M组氨酸或0.1M精氨酸盐酸或0.2M精氨酸盐酸或0.5M精氨酸盐酸或1.0M精氨酸盐酸的淋洗2缓冲液进行淋洗，目标蛋白的收率未受显著影响，同时，洗脱产品中的HCP含量有效降低。0.5M和1.0M精氨酸盐酸的添加使洗脱产品中的HCP含量由对照组的216971ppm分别降低到66681ppm和67509ppm，降低65％以上。在0.1M-0.5M浓度范围内，随精氨酸盐酸浓度升高，HCP去除效果增强，继续增加淋洗2缓冲液中的精氨酸盐酸浓度到1.0M，目标洗脱产品的残留HCP水平无明显变化。本实施例中，与组氨酸和谷氨酸淋洗相比，使用精氨酸盐酸进行淋洗可以更加有效地去除HCP。使用较高浓度的氯化钠(1.0M NaCl)进行淋洗，虽然导致目标蛋白的收率降低，但是洗脱产品中的HCP得到更有效的去除。
综上可知，整体而言，在洗脱之前，采用含有适当浓度氯化钠、谷氨酸、组氨酸或精氨酸盐酸的缓冲液就淋洗能够有效提升洗脱产品的HCP去除效果，是疏水电荷诱导层析工艺的一种优化策略。并且，这一方法适用范围广，适用于任何重组蛋白，包括抗体、非抗体类Fc融合蛋白、无融合标签的重组蛋白等等。但对于不同蛋白分子，添加剂类型及其在淋洗缓冲液中的添加量可能需要个性化的调整与优化，这样的调整和优化是本领域技术人员基于本申请的说明采用常规实验手段能够得出的。
综上所述，上述各实施例是本发明的较佳实施例，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种采用疏水电荷诱导层析纯化重组蛋白的方法，所述方法包括对包含目标重组蛋白和宿主细胞蛋白的料液进行疏水电荷诱导层析由此去除宿主细胞蛋白，所述疏水电荷诱导层析包括以下步骤：
将料液上样到经平衡的疏水电荷诱导层析介质上使得目标重组蛋白与疏水电荷诱导层析介质结合；
用含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液淋洗疏水电荷诱导层析介质，所述淋洗添加剂选自：氯化钠(NaCl)，谷氨酸，组氨酸和精氨酸盐酸；
用洗脱缓冲液从疏水电荷诱导层析介质上洗脱目标重组蛋白并收集含有目标重组蛋白的洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，其中，当所述淋洗缓冲液包含NaCl为淋洗添加剂时，NaCl的浓度≤1.0M，例如0.1-1.0M、0.1-0.5M或0.5-1.0M；或者，当所述淋洗缓冲液包含谷氨酸为淋洗添加剂时，谷氨酸的浓度≤0.5M，例如0.1-0.5M、0.2-0.5M或0.3-0.5M；或者，当所述淋洗缓冲液包含组氨酸为淋洗添加剂时，组氨酸的浓度≤0.5M，例如0.1-0.5M、0.2-0.5M或0.3-0.5M；或者，当所述淋洗缓冲液包含精氨酸盐酸为淋洗添加剂时，精氨酸盐酸浓度≤1.0M，例如0.1-1.0M、0.2-1.0M、0.1-0.5M或0.5-1.0M。
3.如权利要求1所述的方法，其中，含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液其pH为5.5-6.5。
4.如权利要求1所述的方法，其中，洗脱缓冲液的pH为3.0-5.0。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述疏水电荷诱导层析介质具有基于吡啶基的配基。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述疏水电荷诱导层析介质具有基于巯基乙基吡啶的配基。
7.如权利要求1所述的方法，其中，在上样后和用含有淋洗添加剂的淋洗缓冲液淋洗疏水电荷诱导层析介质之前还包括用平衡缓冲液淋洗疏水电荷诱导层析介质。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组蛋白是哺乳动物宿主细胞表达的重组蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组蛋白选自单克隆抗体及其功能性片段、基因工程抗体及其功能性片段、非抗体类免疫球蛋白、Fc融合蛋白、或无融合标签的重组蛋白。
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Legal Events
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