JP2018134073A - 未分化細胞吸着剤、および細胞の分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】未分化マーカーが存在する細胞を吸着することが可能な吸着剤、当該吸着剤を用いて未分化マーカーが存在する細胞を高効率に分離する方法を提供すること。【解決手段】未分化マーカーに結合性を有するフコース結合性レクチンを水に不溶性の担体に固定化して得られる未分化細胞吸着剤、および当該吸着剤を未分化マーカーが存在する細胞を含む細胞混合物と接触させ、吸着剤に結合した細胞と結合しなかった細胞を分離する方法により、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、特定の構造を有する糖鎖に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化した、特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞の吸着剤、および未分化マーカーが存在する細胞の分離方法に関する。

近年、再生医療分野に関する研究が著しく進展しており、再生医療支援事業の市場規模は２０３０年に世界で５１兆円、国内でも５５００億円に達すると予測されている。ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導される細胞は、造血幹細胞などの血球系細胞、心筋細胞などの筋肉系細胞、神経幹細胞などの神経系細胞、網膜色素上皮細胞などの上皮系細胞など多岐に渡り、多能性幹細胞より誘導した医療用細胞を利用した再生医療の実現に対する期待が急速に高まりつつある。特に山中らにより樹立された人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞は、受精胚を使用するＥＳ細胞に比べて倫理的障壁が低く、自家組織から樹立できるという極めて大きなメリットがあり、ドナーに負担を与えることなく比較的容易に樹立可能であることが知られている。

しかしながら、ｉＰＳ細胞より作製された再生医療用細胞については、安全性評価、品質管理および安定大量供給システムが十分に整備されていないのが現状であり、特に、ｉＰＳ細胞の安全性評価は今後の大きな課題となっている。さらに、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞は、多様な体細胞に分化出来る能力を有している反面、分化させた細胞集団のなかに未分化状態の幹細胞（以下、未分化細胞）が残存する性質があることがわかっており、実用化にあたっては、目的とする細胞を純化精製すると同時に、腫瘍形成の可能性が高い未分化細胞を除去する方法の開発が必要不可欠である。

未分化細胞を除去する方法としては、例えば、非特許文献１に開示されている方法では、ｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する際に、通常は培養液に必要不可欠とされるグルコースおよびグルタミンを除去し、心筋細胞にとってエネルギー源となる乳酸を添加することにより、未分化ｉＰＳ細胞のみを選択的に除去し、心筋細胞のみを選別できるということが報告されている。また、特許文献１に開示されている方法では、ｉＰＳ細胞表面に存在する未分化マーカーに結合するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮレクチンのＣ末端へ緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）由来外毒素の触媒ドメイン（ＰＥ２３）を結合した融合タンパクを調製し、体細胞の分化誘導中に添加することで、未分化ｉＰＳ細胞の除去が可能であることが報告されている。

しかしながら、いずれの方法も未分化ｉＰＳ細胞から分化細胞への誘導培養時に未分化ｉＰＳ細胞の除去を同時に行うため、長期の処理時間が必要であることや、培養中ではｉＰＳ細胞や分化細胞の好適な培養細胞密度が限られていることから、大量細胞の処理には適さず、処理効率が低いといった問題点があった。また、後者の方法で未分化細胞除去を行った体細胞などを生体移植する場合、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに融合タンパクとして付与した毒素ユニットの遊離が引き起こす生理的影響や免疫応答反応については不明な部分が多く、臨床展開を図る上での懸念材料となっていた。

このような状況下、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導した細胞を大量に調製して臨床展開を図る上で、調製した大量の細胞に含まれる未分化細胞を短時間で効率良く除去し、目的の分化細胞を確実に純化できる技術の開発が求められている。

特開２０１４−１２６１４６号公報

Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．，２３（４），６６３−６７４，２０１６

本発明の課題は、未分化細胞の表面に存在する未分化マーカーを利用し、特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を吸着分離することが可能な吸着剤、および当該吸着剤を用いて特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を高効率に吸着分離する方法を提供することである。

本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の構造を有する糖鎖に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化して得られる細胞吸着剤を作製し、作製した該吸着剤を特定の糖鎖構造を未分化マーカーとして有する細胞を含む細胞混合物と接触させたのち、吸着剤に結合した細胞と結合しなかった細胞を分離することで、未分化マーカーが存在する細胞を高効率に除去できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の（１）から（７）に記載した発明を提供するものである。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が、水に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする、細胞の吸着剤。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
（２）水に不溶性の担体に、親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、（１）に記載の吸着剤。
（３）水に不溶性の担体の、水に膨潤させた状態での粒径が１００μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする、（１）に記載の吸着剤。
（４）以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程からなることを特徴とする、（１）から（３）に記載の吸着剤の製造方法：
（Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。
（５）（１）から（３）に記載の吸着剤と、
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程と、
吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞混合物中の細胞と、吸着剤に結合しない細胞混合物中の細胞とを分離する工程を含む工程からなることを特徴とする、細胞の分離方法。
（６）（５）に記載の方法において、吸着剤を充填してなるカラムを用いることを特徴とする、細胞の分離方法。
（７）（５）または（６）に記載の方法により、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する未分化細胞と分化細胞を含む細胞混合物から、未分化細胞を分離して分化細胞を精製する方法。
（８）（１）から（３）に記載の吸着材を充填してなるカラム。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の吸着剤は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質が水に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする。本発明の吸着剤に使用するタンパク質は、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメイン（ＹＰ＿００２２３２８１８）に由来するレクチンであり、より詳しくは、このレクチンを形質転換大腸菌で発現させたものである。本発明の吸着剤に使用するタンパク質は前記レクチンと同様に、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖など、フコースを含む複数種の糖鎖に高い結合性を有する。本発明の吸着剤に使用するタンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加してもよく、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加してもよい。

また、本発明の吸着剤に使用するタンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なタンパク質タグや、本発明の吸着剤を作製する際に有用な担体固定化用タグを付加してもよい。前記タンパク質タグとしては、ポリヒスチジン、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼや、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグを、また、前記担体固定化用タグとしては、例えば配列番号２で示されるシステインを含むオリゴペプチドや、リジンを含むオリゴペプチドからなる担体固定化用タグを例示することができる。これらタンパク質タグや担体固定化用タグの長さは、本発明の吸着剤に使用するタンパク質がＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、特に制限はない。さらに本発明の吸着剤に使用するタンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。

本発明の吸着剤は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質が水に不溶性の担体に固定化されていることから、前記糖鎖構造を有する細胞を吸着することができる。一方、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなるＨタイプ１型糖鎖やＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなるＨタイプ３型糖鎖は、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの未分化細胞に特異的に存在する未分化マーカーとして知られている糖鎖である（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１１， ２８６（２３）：２０３４５−５３．）。従って、本発明の吸着剤を用いることにより、Ｈタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖を有する未分化細胞を吸着分離することができる。また、本発明の吸着剤を用いることにより、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの未分化細胞以外に、未分化マーカーとして知られている糖鎖が存在する細胞、例えば、２１０２Ｅｐ細胞やＮＴ２／Ｄ１細胞などのヒト胎児性がん細胞を選択的に吸着剤に吸着させて、これらのがん細胞を分離することができる。

本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の原料に特に制限はなく、シリカゲルや金薄膜を蒸着させたガラスなどの無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサンなどの多糖類を原料とした水に不溶性の多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナンなどの水溶性多糖類を架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスチレンなどの合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体を例示することができる。これらの担体の中では、水酸基を有し、後述する親水性高分子による修飾が容易に行える点で、アガロース、セルロース、デキストラン、プルランなどの電荷をもたない多糖系担体および架橋多糖系担体や、ポリ（メタ）アクリレートやポリウレタンなどの親水性合成高分子系担体および架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。

また、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体は、細胞の非特異吸着を抑制する点で、前記担体表面を親水性高分子で修飾することが好ましく、親水性高分子が担体に共有結合で固定されていることがより好ましい。担体の表面を修飾する親水性高分子としては、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン、デンプンなどの中性多糖類や、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリビニルアルコールなどの水酸基を有する合成高分子を例示することができる。これら親水性高分子の中では、親水性が高く、担体表面への共有結合による固定が容易に行える点で、デキストラン、プルランおよびデンプンなどの中性多糖類が好ましく、デキストランおよびプルランがより好ましい。デキストランおよびプルランの分子量に特に制限はないが、担体表面の親水性修飾が十分に行える点で、数平均分子量が１０，０００から１，０００，０００のものが好ましい。担体に親水性高分子を共有結合で固定する方法は、一般的な共有結合形成反応であれば特に制限はされず、例えば、担体表面の水酸基とエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることで担体にエポキシ基を導入したのち、エポキシ基と親水性高分子の水酸基を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。

本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の形状に特に制限はなく、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状のいずれであってもよいが、吸着剤への細胞吸着を効率的に行える点で粒子状の担体であることが好ましく、真球状の粒子状担体であることがより好ましい。

本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の、水に膨潤させた状態での粒径は、担体から作製される吸着剤をカラムに充填した場合に分離対象の細胞が吸着剤表面と十分接触し、かつ吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を淀みなく通過できる点で、好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下であり、さらに好ましくは１５０μｍ以上３００μｍ以下である。粒径が１００μｍ以下の場合には、吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を通過しづらくなり、細胞の回収率が低下する。また、粒径が１０００μｍ以上の場合には、吸着剤に結合する細胞と吸着剤表面の接触が不十分となり、吸着剤に結合する細胞と結合しない細胞の分離効率が低下する。水に不溶性の担体の粒径は、例えば、ベックマンコールター（株）製の精密粒度分布測定装置（製品名「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３」）などを用いて測定することができる。或いは、光学顕微鏡を用いて目盛り付きスライドグラスの画像を撮影したのち、同じ倍率で測定対象の複数個の粒子の画像を撮影し、物差しを用いて撮影した複数個の担体の粒径を測定し、その平均値を算出することで求めることができる。

本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体の細孔の有無に特に制限はなく、多孔性または無孔性のいずれであってもよい。また、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体は、本発明の吸着剤に使用するタンパク質を担体に固定化するための活性官能基導入が容易に行える点で、水酸基を有する粒子状担体であることが好ましい。さらに、本発明の吸着剤に使用する水に不溶性の担体は市販品を使用してもよく、例えば、ポリ（メタ）アクリレートを原料としたトヨパール（東ソー製）や、アガロースを原料としたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料としたセルフィア（旭化成製）を使用することができる。

本発明の吸着剤の製造方法は、以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程からなることを特徴とする。
（Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、前記（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、前記（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。

以下に工程（Ａ）から工程（Ｃ）の詳細を説明する。

工程（Ａ）は、担体表面の水酸基とエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることにより担体にエポキシ基を導入する工程（Ａ−Ｉ）と、エポキシ基と親水性高分子の水酸基を塩基性条件下で反応させる工程（Ａ−ＩＩ）の２つからなる工程である。

工程（Ａ−Ｉ）で使用することができるエポキシ基含有化合物は、担体にエポキシ基が導入することができれば特に制限はなく、エピクロロヒドリンやエピブロモヒドリンなどのハロヒドリン類、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類を例示することができる。これらの中では、短時間でエポキシ基が導入できる点で、エピクロロヒドリンなどのハロヒドリン類が好ましい。これらのエポキシ基含有化合物は単独で使用することもできるが、数種の混合物を使用することもできる。

工程（Ａ−Ｉ）で使用することができる溶媒に特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。有機溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などを例示することができる。これらの溶媒の中ではエポキシ基含有化合物の溶解性が高い点で、水と１，４−ジオキサン、水とジメチルホルムアミド、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒が好ましい。溶媒の使用量に特に制限はないが、担体の分散性を高める点で、担体の含水重量に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、前述の有機溶媒と水の混合比率にも特に制限はないが、反応液全体に対する前述の有機溶媒の比率が２０から８０重量％であることが好ましい。エポキシ基含有化合物の使用量は、使用量が少ない場合にはエポキシ基の導入量が低下し、工程（Ａ−ＩＩ）における親水性高分子との反応が十分に起こらない可能性が高くなることから、担体の重量に対して０．１から１０倍量を使用することが好ましい。工程（Ａ−Ｉ）の反応温度は１０から７０℃が好ましく、より好ましくは２０から５０℃である。反応液の撹拌方法は担体の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法あるいは反応容器全体を攪拌することが好ましい。また、撹拌速度については担体が懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。

工程（Ａ−Ｉ）の反応は、反応容器に担体、溶媒およびエポキシ基含有化合物を添加し、攪拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、反応を促進させる目的で反応液に塩基を添加することが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液中の塩基濃度が０．０１Ｍから３．０Ｍであることが好ましい。塩基を添加後、反応温度を２０から５０℃に維持したまま、さらに２から２４時間撹拌を継続することが好ましい。反応後、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的のエポキシ基を導入した担体を得ることができる。

工程（Ａ−ＩＩ）で使用することができる親水性高分子は、前述のとおりである。工程（Ａ−ＩＩ）で使用することができる溶媒に特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。これらの溶媒の中では親水性高分子の溶解性が高い点で水が好ましい。溶媒の使用量に特に制限はないが、担体の分散性を高める点で、担体の含水重量に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、親水性高分子の溶液を工程（Ａ−ＩＩ）の溶媒として使用してもよい。親水性高分子の使用量は、使用量が少ない場合には担体表面に導入したエポキシ基との反応が十分に起こらない可能性が高くなることから、担体の重量に対して０．１から２０倍量を使用することが好ましい。また、親水性高分子の溶液を溶媒として使用する場合の親水性高分子の濃度に特に制限はなく、親水性高分子の溶媒への溶解度および溶解時の粘度を考慮して適宜設定すればよい。工程（Ａ−ＩＩ）の反応温度は１０から７０℃が好ましく、より好ましくは２０から５０℃である。反応液の撹拌方法は担体の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法あるいは反応容器全体を攪拌することが好ましい。また、撹拌速度については担体が懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。

工程（Ａ−ＩＩ）の反応は、反応容器にエポキシ基を導入した担体、溶媒および親水性高分子、あるいは親水性高分子溶液を添加し、攪拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、反応を促進させる目的で反応液に塩基を添加することが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液中の塩基濃度が０．０１Ｍから１．０Ｍであることが好ましい。塩基を添加後、反応温度を２０から５０℃に維持したまま、さらに２から２４時間撹拌を継続することが好ましい。反応後、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的の親水性高分子を共有結合で固定した担体を得ることができる。

工程（Ｂ）は、親水性高分子を共有結合で固定した担体に前記（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程である。

親水性高分子を共有結合で固定した水に不溶性の担体に、前記（１）の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質（以下、前記タンパク質）を固定化するため官能基は、一般的なタンパク質固定化用の官能基であれば特に制限されず、エポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基および活性エステル基、アミノ基、マレイミド基、ハロアセチル基などを例示することができる。また、担体に前記官能基を導入する方法は、一般的な官能基導入方法であれば特に制限はされず、例えば、担体にエポキシ基を導入する方法としては、担体の水酸基と前述の工程（Ａ−Ｉ）で使用することができるエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。その他の例として、担体にホルミル基を導入する方法としては、担体の水酸基をグルタルアルデヒドなどの２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、担体を過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。また、前述の方法によりエポキシ基を導入した担体と、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、α−チオグリセロールなどの化合物を反応させることで隣接する水酸基を導入した担体を、過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。他の例として、担体にカルボキシル基を導入する方法としては、担体の水酸基とモノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸などのハロ酢酸と塩基性条件下で反応させる方法の他に、前述の方法によりエポキシ基を導入した担体を、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸類、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸などのアミノ基含有カルボン酸類、チオグリコール酸やチオリンゴ酸などの含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。さらに、担体に導入したカルボキシル基を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの縮合剤存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、活性エステル基であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへ誘導する方法を例示することができる。他の例として、担体にアミノ基を導入する方法としては、前述の方法によりエポキシ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルを、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２−アミノエチル）アミンなどの少なくとも２つ以上のアミノ基を有する化合物と反応させる方法を例示することができる。他の例として、担体にマレイミド基を導入する方法としては、水酸基および／またはアミノ基を有する担体と、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸などのマレイミド基を有するカルボン酸類をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法を例示することができる。さらに、前述のマレイミド基を有するカルボン酸類のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を例示することができる。他の例として、担体にハロアセチル基を導入する方法としては、例えば、水酸基を有する担体や、前述の方法によりアミノ基を導入した担体と、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミドなどの酸ハロゲン化物を反応させる方法や、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸などのハロゲン化酢酸をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法をあげることができる。さらに、前述のハロゲン化酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法をあげることができる。

工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、前記タンパク質を固定化する工程である。工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に前記タンパク質を固定化する方法は、一般的なタンパク質の固定化方法であれば特に制限はされず、例えば、配位結合やアフィニティー結合などを利用し、共有結合を形成せずにタンパク質を担体に固定化する方法、タンパク質に固定化用活性官能基を導入したのち、固定化用活性官能基と担体を反応させて担体に固定化する方法、担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させ、共有結合を形成させて担体に固定化する方法をあげることができる。

共有結合を形成せずにタンパク質を担体に固定化する方法としては、アビジン−ビオチンのアフィニティー結合を利用し、ビオチンを導入したタンパク質をストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケア製）などのアビジンが固定化された担体に固定化する方法を例示することができる。タンパク質へのビオチンの導入方法としては、例えば、９−（ビオチンアミド）−４，７−ジオキサノナン酸−Ｎ−スクシンイミジルなどの活性エステル基を有するビオチン化試薬とタンパク質のアミノ基を反応させる方法や、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−［２−（Ｎ−マレイミド）エチル］ピペラジン塩酸塩などのマレイミド基を有するビオチン化試薬とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。

また、タンパク質に導入した固定化用活性官能基と担体を反応させ、共有結合を形成させて固定化する方法としては、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸 ３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩などのマレイミド基と活性エステル基の双方を有する化合物の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させてタンパク質にマレイミド基を導入したのち、メルカプト基が導入された担体と反応させる方法を例示することができる。さらに、担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させて担体に固定化する方法としては、担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、担体に導入したアミノ基とタンパク質のカルボキシル基を反応させる方法、担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、ハロアルキル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。これらの固定化方法の中では、短時間に高収率で担体へのタンパク質固定化が行える点で、担体に導入したホルミル基、活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、および、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が好ましく、固定化反応をｐＨが中性付近で行うことが可能でありタンパク質の変性を抑制できることが可能である点で、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法がより好ましく、官能基の安定性が高い点で、担体に導入したマレイミド基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が、ことさらに好ましい。

前記固定化用官能基を導入した担体と、緩衝液に溶解した前記タンパク質を反応させることで、本発明の吸着剤を作製することができる。前記タンパク質を溶解する緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）などの市販の緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。前記タンパク質を担体に固定化する際の反応温度およびｐＨは、活性官能基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮した上で反応温度については０℃以上５０℃以下、ｐＨについてはｐＨ４以上ｐＨ１０以下の範囲の中から適宜設定すればよく、前記タンパク質の失活を抑制する点で、反応温度については１５℃以上４０℃以下、ｐＨについてはｐＨ５以上ｐＨ９以下の範囲が好ましい。

水に不溶性の担体への前記タンパク質の固定化量は、分離対象となる細胞と前記タンパク質の結合性を考慮したうえで適宜設定すればよく、１ｍＬの担体あたり０．０１ｍｇ以上３０ｍｇ以下が好ましく、０．０５０ｇ以上１０ｍｇ以下がより好ましい。また、水に不溶性の担体への前記タンパク質の固定化量は、固定化反応時の前記タンパク質の使用量や担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。前記タンパク質の担体への固定化量は、固定化反応液および反応後の洗浄液を回収して未反応の前記タンパク質を求めたのち、固定化反応に使用した前記タンパク質量から未反応の前記タンパク質を差し引くことで算出することができる。

本発明の細胞分離方法は、本発明の吸着剤と「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程と、吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞と吸着剤に結合しない細胞とを分離する工程、の２工程を含む工程からなることを特徴とする。

本発明の細胞分離方法では、前記タンパク質、すなわち、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」に結合性を有するタンパク質と、前記糖鎖構造を有する細胞を溶液中で接触させる代わりに、前記タンパク質を粒子状担体に固定化した吸着剤を用いることにより、前記糖鎖構造を有する細胞が吸着剤に結合するため、溶液中で分離を行う場合に比べて、効率的に細胞分離を行うことができる。

本発明の吸着剤と細胞の接触方法は特に制限されず、分離対象となる細胞を含む細胞混合物中に吸着剤を添加し、一定時間振盪する方法を例示することができるが、吸着剤に結合した細胞の再遊離や、吸着剤との過剰な接触による細胞へのダメージを避けることができる点で、吸着剤をカラムに充填して細胞と接触させることが好ましい。この場合、吸着剤をカラムに充填した後、上部より分離対象細胞を含む細胞混合物を通液するだけで、吸着剤に分離対象となる前記糖鎖構造を有する細胞のみを結合させ、吸着剤に結合しなかった細胞をカラム下部より回収することが可能となる。

本発明の分離方法で用いる細胞混合物を調製するための溶離液としては、細胞死と細胞凝集を防ぐために有効な成分を添加したものであることが好ましい。本発明の吸着剤を充填したカラムに通液する細胞混合物を調製するための溶離液の組成としては、市販のＭＡＣＳバッファ（ＰＢＳに０．５％ＢＳＡと２ｍＭ ＥＤＴＡを添加したもの）を例示することができる。この場合、ＢＳＡによる細胞分離時における細胞へのダメージの軽減と吸着剤への非特異吸着を抑制する効果、ＥＤＴＡによる細胞の凝集防止効果を期待することができる。

本発明の吸着剤は、前記タンパク質の固定化量が吸着剤１ｍＬあたり０．０５ｍｇ以上３０ｍｇ以下であれば、前記糖鎖構造を有する細胞を少なくとも１００万個以上結合することが可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した心筋細胞を用いた再生医療においては、一人あたり１０億個の臨床グレードの心筋細胞が必要であり、０．１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１００万個、１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１０００万個の未分化幹細胞を完全に除去する技術が必要となる。これらのような大量の細胞中に混在する未分化細胞を分離除去する場合でも、本発明の吸着剤を少量（それぞれ１ｍＬまたは１０ｍＬ）用いることにより、短時間で効率良く未分化細胞を除去することができる。また、例えば患者一人あたり１００億〜１０００億個の膨大な医療用細胞が必要とされる赤血球や血小板を未分化幹細胞から誘導する場合、１％の未分化幹細胞が混入していると仮定した場合であっても、本発明の吸着剤を１００ｍＬから１０００ｍＬ用いることにより赤血球や血小板などの血球系細胞に残存する未分化細胞を分離することができる。

さらに本発明の細胞分離方法は、既存の細胞分離技術であるフローサイトメトリーや磁気ビーズ法、背景技術に記載した未分化細胞除去技術と比べても、上記大量細胞からの未分化ｉＰＳ細胞除去処理を５から３０分程度の極めて短時間行うことができ、目的の分化細胞を大量に処理、精製する場合にも極めて有効な未分化細胞の分離方法である。

本発明の吸着剤は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質を水に不溶性の担体に固定化したものであり、当該吸着剤を用いることにより、前記糖鎖構造を未分化マーカーとして有する未分化細胞を含む細胞混合物から、未分化細胞だけを選択的に吸着分離することができる。また、本発明の吸着剤を充填したカラムに未分化細胞を含む細胞混合物を通液することにより、未分化マーカーが存在する細胞を高効率に分離することができる。

実施例１３および比較例１における、吸着剤Ｇ１に結合したＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞と、ＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞が結合しなかった吸着剤Ｇ０の蛍光顕微鏡画像である。 参考例１における、コールターカウンターＺ２シリーズで測定したＳＰ２／０細胞の細胞直径と頻度のグラフである。 実施例１４における、吸着剤Ａ２にＲａｍｏｓ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞のクロマトグラムである。 実施例１４における、吸着剤Ｂ２にＳＰ２／０細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞のクロマトグラムである。 比較例２における、吸着剤Ａ０にＲａｍｏｓ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞のクロマトグラムである。 比較例２における、吸着剤Ｂ０にＳＰ２／０細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞のクロマトグラムである。 実施例１５および比較例３における、吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１、Ａ０に、Ｒａｍｏｓ細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１５および比較例３における、吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１、Ａ０に、Ｋ５６２細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１５および比較例３における、吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１、Ａ０に、２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１６および比較例４における、吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ａ０、Ｂ０、Ｄ０に、Ｒａｍｏｓ細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１６および比較例４における、吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ａ０、Ｂ０、Ｄ０に、Ｋ５６２細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１６および比較例４における、吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ａ０、Ｂ０、Ｄ０に、２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、各細胞の流出率を示したグラフである。 実施例１７および比較例５における、吸着剤Ａ２、Ｄ１、Ｅ１、Ａ０に、２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、細胞流出率を示したグラフである。 実施例１７および比較例５における、吸着剤Ａ２、Ｄ１、Ｅ１、Ａ０に、２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、吸着剤１ｍＬあたりの吸着細胞数を示したグラフである。 実施例１８および比較例６における、吸着剤Ｄ１、Ｄ０に、培養日数の異なる２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、細胞流出率を示したグラフである。 実施例１８および比較例６における、吸着剤Ｄ１、Ｄ０に培養日数の異なる２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞と流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを示したものである。 実施例１８および比較例６における、吸着剤Ｄ１、Ｄ０に培養日数の異なる２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞と流出細胞のＴＲＡ−１−６０陽性率を示したグラフである。 実施例１８および比較例６における、吸着剤Ｄ１、Ｄ０に培養日数の異なる２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合の、アプライ細胞と流出細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を示したグラフである。 実施例１９および比較例７における、吸着剤Ｄ１、Ｅ１、Ｄ０に、２１０２Ｅｐ細胞あるいは２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を示したグラフである。 実施例１９および比較例７における、吸着剤Ｄ１、Ｅ１、Ｄ０に２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを示したものである。 実施例１９および比較例７における、吸着剤Ｄ１、Ｅ１、Ｄ０から流出した２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を示したグラフである。 実施例１９および比較例７における、２１０２Ｅｐ細胞の流出率と、流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率との相関を示したグラフである。 実施例２０および比較例８における、吸着剤Ｅ１、Ｄ０に２０１Ｂ７細胞あるいは２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、２０１Ｂ７細胞の細胞流出率を示したグラフである。 実施例２０および比較例８における、吸着剤Ｅ１、Ｄ０に２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の混合物を通液した場合の、流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを示したものである。 実施例２０および比較例８における、吸着剤Ｅ１、Ｄ０から流出した２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を示したグラフである。 実施例２０および比較例８における、２０１Ｂ７細胞の流出率と流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率との相関を示したグラフである。 実施例２１および比較例９における、吸着剤Ｅ１、Ａ０にＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合物を通液した場合の、ＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を示したグラフである。

以下、実施例、比較例、調製例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ システインタグを有するレクチンの作製
実施例１では、大腸菌を用いて、システインを含むオリゴペプチドからなる担体固定化用タグ（以下、システインタグ）を付加したレクチンを作製した。

（１）プラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
以下（ａ）から（ｅ）記載の方法により、配列番号３に示したレクチンのアミノ酸配列をコードした配列番号４のポリヌクレオチドを作製した。

（ａ）以下の試薬組成および反応条件にて、１段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）
・各３０ｎＭ 配列番号５から２８に示したプライマー
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を５サイクル実施した。

（ｂ）次に、（ａ）の反応液を用いて、以下の試薬組成および反応条件にて、２段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）
・各５００ｎＭ 配列番号２９と３０に示したプライマー
・１μＬ １段階目のＰＣＲ反応液
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。

（ｃ）２段階目のＰＣＲ反応後の（ｂ）の反応液をアガロースゲル電気泳動で泳動後、目的物に相当する０．５ｋｂｐのバンドを切り出し、そこからゲル抽出キットを用いてＰＣＲ産物を精製した。

（ｄ）前記（ｃ）で得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、消化後のＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２８（＋）の制限酵素ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイトに、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）を用いてライゲーションしてプラスミドを調製後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを得た。

（ｅ）前記（ｄ）で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを培養し、集菌したのち、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（５．６ｋｂｐ）を得た。当該方法で得られたプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに挿入されているレクチンをコードする塩基配列を分析した結果、塩基配列は設計どおりであることを確認した。

（２）大腸菌を用いたレクチンの作製
前記（１）で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより、以下（ｆ）から（ｊ）記載の方法で、システインタグを付加したレクチンを作製した。
（ｆ）組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ／Ｋｍ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になるように植菌後、３７℃で培養した。
（ｇ）前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ／Ｋｍ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、一晩培養した。
（ｈ）培養終了後、培養液を氷冷したのち、遠心分離により集菌した。集めた菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク製）を用いて処理し、可溶性画分を１５０ｍＬ得た。

（ｉ）前記（ｈ）で得られた可溶性画分の溶液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した担体（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、メルク製、担体容積１５ｍＬ）を充填したカラムに通液し、可溶性画分に含まれるシステインタグを付加したレクチンを吸着させた。担体に吸着したシステインタグを付加したレクチンを１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させることにより、目的のシステインタグを付加したレクチンを含む溶出液を５０ｍＬ得た。
（ｊ）前記（ｉ）で得られたシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを含む溶出液を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）に対して透析することにより、目的のシステインタグを付加したレクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を７５ｍＬ得た。

得られたＤ−ＰＢＳ（−）溶液中のシステインタグを付加したレクチン濃度を紫外線吸収法により測定し、２８０ｎｍにおける吸光度が１．０の場合のシステインタグを付加したレクチン濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとして濃度を算出した結果、濃度は１．２ｍｇ／ｍＬであった。

（３）システインタグを付加したレクチンの糖鎖への親和性評価
前記（２）で得られたシステインタグを付加したレクチンの糖鎖に対する結合性評価は、表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトとしてシステインタグを付加したレクチン、固相としてＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）またはルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）を用い、各糖鎖に対する結合性を測定した。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（和光純薬）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識された各糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により糖鎖をセンサーチップ上に固定して作製した。

糖鎖親和性の測定はカイネティクス解析により行った。緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、結合反応は流速３０μＬ／分、結合時間は６分間、解離時間は３分間とした。センサーチップの再生は２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１５秒で行った。アナライトタンパク質の濃度は１〜１００ｎＭで行った。解析は解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．１）を用いて行い、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数を算出した。システインタグを付加したレクチンの各糖鎖に対する結合性評価（解離定数）の結果を表１に示した。

調製例１ 無孔ポリウレタン粒子の作製
窒素置換した１リットルの円筒状ガラスフラスコ中に、ポリカーボネートジオール（東ソー製、Ｎ−９８０、１，６−ヘキサンジオール系、数平均分子量＝１，０００、水酸基価＝１１２．２ｍｇＫＯＨ／ｇ）４５０．０ｇと、分散媒としてのイソオクタン（東京化成製）６００ｇ、分散安定剤（東ソー製、Ｎ−５７４１）１５．０ｇを秤量した。

次に、撹拌を開始して、ポリカーボネートジオールをイソオクタン中に懸濁・分散させた状態で、ヘキサメチレンジイソシアネート（東ソー製、ＨＤＩ、数平均分子量＝１６８．２、イソシアネート含量＝４９．９６％）１５１．４ｇを加えて、９０℃で３時間反応させた。

反応液を逐次分析し、末端イソシアネート基の濃度が３．２％に達した時点で、架橋剤としてフレーク状のトリメチロールプロパン（三菱化学製）４０．３ｇ（ポリカーボネートジオールのモル数に対して１．００倍のモル量に相当）を加え、９０℃で、さらに３時間反応させた。その後、固形分を濾別し、ウェットケーキを５００ｇのイソオクタンで３回洗浄・濾別した後に乾燥し、ポリウレタン樹脂の粒子６００ｇを調製した。

この粒子を超音波リング付きの振動ふるいを用いて分級し、５００μｍ〜７１０μｍの範囲の粒子を３２０ｇ回収した。レーザー回折式粒度分布計（マイクロトラック・ベル製、ＭＴ−３２００ＩＩ型、水分散で計測）で計測した、ポリウレタン樹脂粒子の平均粒径は５８０μｍ、粒度範囲は４９８〜７０４μｍであった。以下、調製例１で作製したポリウレタン樹脂粒子を細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｂ０とする。

調製例２ 多孔性架橋セルロース粒子の作製
１６０．７ｇの５Ｍ ＮａＯＨ水溶液と７４．６ｇの尿素と１０３．７ｇの水を混合することで８重量％ＮａＯＨ−２２重量％尿素混合水溶液を調製した。調製した３００ｍＬのＮａＯＨ−尿素混合水溶液に２４．０ｇの濾紙粉末（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製、Ｃタイプ）を添加したのち、１５℃に冷却した振盪機内で２時間撹拌することにより透明な８％セルロース溶液を調製した。

次に室温にて、１Ｌ容ステンレスビーカーに０．８５％のエチルセルロース（ｃＰ４５グレード、関東化学製）を含む４００ｍＬのトルエン（関東化学製）からなる連続相を添加し、室温にて連続相を撹拌した状態でセルロース溶液を滴下し、セルロース溶液が連続相に分散したセルロース分散液を得た。

撹拌を３０分間継続後、目的の粒径を持つセルロース液滴が生成したことを光学顕微鏡にて確認したのち、容器を氷冷し、溶液中の温度が４℃になってからさらに６０分間、撹拌を継続した。次に分散液に２００ｍＬのメタノール（関東化学製）を２０分間かけて滴下し、メタノール滴下終了後、さらに１０分間撹拌を継続することでセルロースゲルを得た。得られたセルロースゲルをエタノール（関東化学製）と水で洗浄することにより未架橋８％セルロース粒子を約２８０ｍＬ得た。次に、得られた未架橋８％セルロース粒子をグラスフィルター上で吸引ろ過し、サクションドライしたセルロース粒子（１７７．１ｇ）を得た。グラスフィルター上のセルロース粒子全量を１Ｌ容のガラス製フラスコに添加したのち、４８７．５ｇの２５重量％硫酸ナトリウム水溶液を添加し、反応溶液を５０℃に設定したオイルバス中、撹拌羽根を用いて３０分間撹拌振盪したのち、５８５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（関東化学製）及び３．２５ｍＬの４８％ＮａＯＨ水溶液（関東化学製）及び４．１０ｍＬのエピクロロヒドリン（東京化成製）を添加した。その後、３０分間隔で、初回添加量を含めて合計８回、３．２５ｍＬの４８％ＮａＯＨ水溶液及び４．１０ｍＬのエピクロロヒドリンを添加する操作を繰り返したのち、さらに１７．５時間、反応を継続させることで未架橋８％セルロース粒子のエピクロロヒドリンによる架橋反応を進行させた。架橋反応終了後、溶液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、ろ液が中性になるまで水で洗浄することにより目的の架橋７％セルロース粒子を得た。得られた架橋７％セルロース粒子をステンレス製標準ふるいにより湿式分級し、架橋８％セルロース粒子を１５０ｍＬ得た。前述のレーザー回折式粒度分布計で計測した、このセルロース粒子の水に湿潤した状態での平均粒径は２２０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。以下、調製例２で作製したセルロース粒子を細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｃ０とする。

実施例２ 吸着剤Ａ１の作製
実施例２では、担体として市販多孔性合成高分子系担体（トヨパールＨＷ−４０ＥＣ、東ソー製）を用い、実施例１で作製した担体固定化用システインタグを付加したレクチンを固定化するための官能基（マレイミド基）の導入およびレクチン固定化を行うことにより、細胞の吸着剤Ａ１を製造した。

トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）は水で懸濁したものをステンレス製標準ふるいにより１５０−２５０μｍの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。なお、１５０−２５０μｍに分級したトヨパールＨＷ−４０ＥＣを細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ａ０とする。水に湿潤した状態での吸着剤Ａ０の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に５．０ｇのトヨパールＨＷ−４０ＥＣと、予め調製した１０．０ｍＬのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液（ナガセケムテックス製デナコールＥＸ−８２１から調製、濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３０℃の振盪機内で３０分間振盪したのち、反応容器に１０４μＬ（１５６ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の４８％（約１８．１Ｍ）ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振盪機内で８時間振盪することによりトヨパールＨＷ−４０ＥＣのエポキシ化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、濾別したエポキシ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣウェットケーキの全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの０．５Ｍ エチレンジアミン水溶液（東京化成製エチレンジアミンから調製）を添加したのち、５０℃の振盪機内で３時間振盪することによりエポキシ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣのアミノ化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、濾別したアミノ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣウェットケーキの全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの３−マレイミドプロピオン酸 Ｎ−スクシンイミジル／ＤＭＳＯ溶液（和光純薬製３−マレイミドプロピオン酸 Ｎ−スクシンイミジルから調製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３５℃の振盪機内で４時間振盪することによりアミノ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣのマレイミド化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で２０ｍＬのＤＭＳＯで３回、３０ｍＬの水で５回洗浄することにより、目的のマレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣを調製した。

次にマレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣへのレクチン固定化を行なった。レクチン固定化には、実施例１で作製したレクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を濃縮したものを使用した。また、マレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣは水で懸濁したものをグラスフィルターでろ過したものを使用した。

９２０μＬのレクチン溶液（濃度９．７５ｍｇ／ｍＬ）に、５．０２ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）と６０μＬの０．１Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、和光純薬製）水溶液を添加して、担体固定化用レクチン溶液を調製した。

１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に４．５ｇのマレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣウェットケーキ（スラリー状態では６．０ｍＬに相当）を添加したのち、６．０ｍＬの固定化用緩衝液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加した。次に、６．０ｍＬの担体固定化用レクチン溶液（レクチン仕込み濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ−担体）を添加し、３５℃で１５時間振盪することによりマレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣへのレクチン固定化を行い、吸着剤Ａ１を作製した。レクチン固定化終了後、吸着剤Ａ１をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて洗浄液中のレクチン量を測定し、固定化反応前のレクチン仕込み量から回収レクチン量を差し引くことにより、１ｍＬ当りの吸着剤Ａ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．２３ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ａ１の平均粒径は１７７μｍ、粒度範囲は１５０〜２６０μｍであった。

実施例３ 吸着剤Ａ２の作製
実施例３では、担体として市販多孔性合成高分子系担体（トヨパールＨＷ−４０ＥＣ、東ソー製）を用い、実施例２とは異なる方法により担体へのマレイミド基の導入を行ったのち、レクチン固定化を行うことにより、細胞の吸着剤Ａ２を製造した。

トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）は水で懸濁したものをステンレス製標準ふるいにより１５０−２５０μｍの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。次に、サクションドライしたトヨパールＨＷ−４０ＥＣを１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に８．０ｇ秤量し、予め調製した５０ｍＭのターシャリーブトキシカリウム（東京化成製、ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液を５０．０ｍＬ追加し、２５℃の振盪機内で１．０時間撹拌することで担体表面へ水酸基を導入した。このスラリーをグラスフィルターで水洗・濾別した。

さらに、濾別した担体を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に全量秤量し、予め調製した３６０ｍＭのグルタルアルデヒド水溶液（東京化成製から調製）を５０．０ｍＬ追加し、２５℃の振盪機内で１．０時間撹拌して反応させた。このスラリーをグラスフィルターで水洗・濾別した。

続いて、濾別した担体を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に全量秤量し、予め調製した３６０ｍＭのトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（東京化成製から調製）を５０．０ｍＬ追加し、２５℃の振盪機内で１．０時間撹拌して官能基をアミノ化した。このスラリーをグラスフィルターで水洗・濾別した。

引き続き、濾別した担体を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に全量秤量し、予め調製した２６．４ｍＭのＮａＢＨ４水溶液（シグマアルドリッチ製から調製）を５０．０ｍＬ追加し、２５℃の振盪機内で１２．０時間撹拌して還元反応させた。このスラリーをグラスフィルターで水洗・濾別した。

濾別した担体を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に全量秤量し、予め１８．８ｍＭの濃度で調製したＮ−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオネート（和光純薬製）のＤＭＳＯ溶液を５０．０ｍＬ追加し、３５℃の振盪機内で４．０時間撹拌し、担体にマレイミド基を導入した。このスラリーをグラスフィルターで水洗・濾別した。

次に実施例２と同様の方法でレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ａ２を作製した。なお、レクチン固定化反応の前後における上清を採取し、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて上清に含まれるレクチン量を測定し、反応前後の差から、１ｍＬの吸着剤Ａ２あたりのレクチン固定化量を計算した結果、固定化量は０．２０ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ａ２の平均粒径は１８５μｍ、粒度範囲は１５０〜２４０μｍであった。

実施例４ 吸着剤Ｂ１の作製
担体として調製例１で作製した無孔ポリウレタン粒子（粒径：５００〜７１０μｍ）を用いた以外は、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｂ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｂ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．１５ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｂ１の平均粒径は５８０μｍ、粒度範囲は４９８〜７０４μｍであった。

実施例５ 吸着剤Ｂ２の作製
担体として調製例１で作製した無孔ポリウレタン粒子（粒径：５００〜７１０μｍ）を用いた以外は、実施例３と同様の方法で担体へのレクチン固定化用官能基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｂ２を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｂ２のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．１７ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｂ２の平均粒径は５８０μｍ、粒度範囲は４９８〜７０４μｍであった。

実施例６ 吸着剤Ｃ１の作製
担体として調製例２で作製した架橋８％セルロース粒子（粒径：１５０〜２５０μｍ）を用いた以外は、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｃ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｃ１の１ｍＬ当りのレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は１．１３ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｃ１の平均粒径は２１０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

調製例３ 親水性高分子が固定されたトヨパールＨＷ−４０ＥＣの作製−１
トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）はステンレス製標準ふるいにより１５０−２５０μｍの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に１０．０ｇのトヨパールＨＷ−４０ＥＣ、１０．８ｍＬ（５４ｍｍｏｌ）の５Ｍ ＮａＯＨ水溶液（関東化学製）、５．０ｍＬの水を添加したのち、５．０ｇ（５４ｍｍｏｌ）のエピクロロヒドリン（東京化成製）と５．０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、関東化学製）の混合溶液を添加し、３０℃の振盪機内で３時間振盪することによりトヨパールＨＷ−４０ＥＣのエポキシ化を行なった。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。エポキシ化したトヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１５．０ｇの４０重量％デキストラン水溶液（分子量４０，０００、東京化成製）を添加したのち、３０℃の振盪機内で３０分間振盪した。次に、反応容器に１．０５ｍＬ（１．５８ｇ、１９ｍｍｏｌ）の４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振盪機内でさらに１８時間振盪することにより、エポキシ化トヨパールにＨＷ−４０ＥＣにデキストランを固定した。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄することにより、目的のデキストラン修飾トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（ＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ）を調製した。以下、調製例３で作製したＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｄ０とする。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ｄ０の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

実施例７ 親水性高分子が固定された吸着剤Ｄ１の作製
調製例３で作製したＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用い、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｄ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｄ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．２５ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｄ１の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

実施例８ 吸着剤Ｄ２の作製
担体として調製例３で作製したＤＥＸ４０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用いた以外は、実施例３と同様の方法で担体へのレクチン固定化用官能基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｄ２を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｄ２のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．１２ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｄ１の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１００〜２５０μｍであった。

調製例４ 親水性高分子が固定されたトヨパールＨＷ−４０ＥＣの作製−２
調製例３において、４０重量％デキストラン水溶液（分子量４０，０００、東京化成製）の代わりに、３０重量％デキストラン水溶液（分子量４５０，０００〜６５０，０００、シグマアルドリッチ製）を用いた以外は調製例３と同様の方法でデキストランを固定することにより、目的のデキストラン修飾トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ）を調製した。以下、調製例４で作製したＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｅ０とする。

実施例９ 親水性高分子が固定された吸着剤Ｅ１の作製
調製例４で作製したＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用い、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｅ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｅ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．４１ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ｅ１の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

実施例１０ 親水性高分子が固定された吸着剤Ｅ２の作製
担体として調製例４で作製したＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用いた以外は、実施例３と同様の方法で担体へのレクチン固定化用官能基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｅ２を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｅ２のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．３５ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ｅ２の平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

調製例５ 親水性高分子が固定されたポリウレタン粒子の作製
担体として調製例１で作製した無孔ポリウレタン粒子（粒径：５００〜７１０μｍ）を用いた以外は、調製例３と同様の方法でデキストラン（分子量４０，０００、東京化成製）を固定することにより、目的のデキストラン修飾ポリウレタン粒子（ＤＥＸ４０ポリウレタン粒子）を調製した。以下、調製例５で作製したＤＥＸ４０ポリウレタン粒子を細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｆ０とする。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ｆ０の平均粒径は５８０μｍ、粒度範囲は４９８〜７０４μｍであった。

実施例１１ 親水性高分子が固定された吸着剤Ｆ１の作製
調製例５で作製したＤＥＸ４０ポリウレタン粒子を用い、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｆ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｆ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．１２ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤Ｆ１の平均粒径は５８０μｍ、粒度範囲は４９８〜７０４μｍであった。

調製例６ 親水性高分子が固定されたセルロース粒子の作製
担体として調製例２で作製した架橋８％セルロース粒子（粒径：１５０〜２５０μｍ）を用いた以外は、調製例４と同様の方法でデキストラン（分子量４５０，０００−６５０，０００、シグマアルドリッチ製）を固定することにより、目的のデキストラン修飾セルロース粒子（ＤＥＸ５５０セルロース粒子）を調製した。以下、調製例６で作製したＤＥＸ５５０セルロース粒子を細胞吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ｇ０とする。なお、水に湿潤した状態での吸着剤Ｇ０の平均粒径は２２０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。

実施例１２ 親水性高分子が固定された吸着剤Ｇ１の作製
調製例６で作製したＤＥＸ５５０セルロース粒子を用い、実施例２と同様の方法で担体へのマレイミド基の導入およびレクチン固定化を行うことにより、吸着剤Ｇ１を作製した。１ｍＬ当りの吸着剤Ｇ１のレクチン固定化量を算出した結果、固定化量は０．７６ｍｇ／ｍＬ−吸着剤であった。

調製例１から６および実施例２から１２で作製した吸着剤を表２にまとめた。

実施例１３ 吸着剤Ｃ１および吸着剤Ｇ１への細胞の吸着実験
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有するヒト胎児性がん細胞であるＮＴ２／Ｄ１細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１９７３）およびＥｍｂｒｙｏｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｃｌ．４／Ｄ３細胞（コスモバイオ製、以下２１０２Ｅｐ細胞と記載）の培養は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、和光純薬製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製）を用い、直径６ｃｍのシャーレ（コーニング製）または直径１０ｃｍのシャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さないヒトバーキットリンパ腫細胞であるＲａｍｏｓ細胞（ＪＣＲＢ９１１９）は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、和光純薬製）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（和光純薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。

２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き１００μｍのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。実施例６で作製した吸着剤Ｃ１および実施例１２で作製した吸着剤Ｇ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。

接着系細胞であるＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞は、培養終了後にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ製）で処理して剥離したのち、遠心分離により細胞を回収した。浮遊細胞であるＲａｍｏｓ細胞は、培養終了後に遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞をＭＡＣＳバッファで懸濁したのち、３５μｍのセルストレーナー（コーニング製）で処理することによりシングルセル化し、その細胞密度をコールターカウンター（ベックマンコールター製）で測定した。吸着剤を充填したカラムに、細胞添加数が０．４〜０．５×１０＾６個（０．８〜１．０×１０＾６個／ｍＬ−吸着剤）となるように調製した細胞懸濁液を５０μＬ添加したのち、カラムに１．０ｍＬのＭＡＣＳバッファを通液して吸着剤を洗浄し、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この細胞液を流出細胞液と記載する）。回収した流出細胞液中の細胞濃度をコールターカウンターで測定し、それぞれのカラムについて細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝シリンジカラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

表３に吸着剤への各細胞の吸着実験の結果を示した。また、図１に、カラムから取り出した吸着剤Ｇ１に結合したＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞と、ＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞が結合しなかった吸着剤Ｇ０の蛍光顕微鏡画像を示した。なお、蛍光顕微鏡画像の撮影は、上記操作で回収したＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞を、血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地に懸濁したのち、蛍光染色試薬であるＢＣＥＣＦ−ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で静置することにより蛍光染色試薬を各細胞内に取り込ませた後、各細胞をＭＡＣＳバッファで洗浄後、シャーレ上で各吸着剤と接触させ、吸着剤に結合しなかった各細胞をＭＡＣＳバッファ洗浄したのち、シャーレを蛍光顕微鏡で観察することで行った。

表３の結果から、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有するＮＴ２／Ｄ１細胞および２１０２Ｅｐ細胞は吸着剤Ｃ１および吸着剤Ｇ１に強く結合するため流出率が低く、前記糖鎖を有さないＲａｍｏｓ細胞は吸着剤Ｃ１および吸着剤Ｇ１に結合しないため流出率が高くなることが明らかとなった。

比較例１ 吸着剤Ｃ０および吸着剤Ｇ０への細胞の吸着実験
調製例２で作製した吸着剤Ｃ０および調製例６で作製した吸着剤Ｇ０を用いた以外は、実施例１３と同様の方法で、細胞の吸着実験を行った。表３の結果から、前記糖鎖を有さないＲａｍｏｓ細胞および前記糖鎖を有するＮＴ２／Ｄ１細胞と２１０２Ｅｐ細胞は、いずれもレクチンを固定化してない吸着剤Ｃ０および吸着剤Ｇ０には結合しないため、流出率が高くなることが明らかとなった。

参考例１ 粒径の異なる担体への細胞の通液実験
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さないマウス骨髄腫細胞であるＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＤＳファーマバイオメディカル製、以下、ＳＰ２／０細胞と記載）を浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にてＧＩＴ培地（日本製薬製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。細胞を５０ｍＬチューブに回収後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファにて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、ＭＡＣＳバッファで懸濁を行い、セルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去してシングルセル化し、均一な１．０ｘ１０＾７個／ｍＬのＳＰ２／０細胞懸濁液を調製した。

次に、５．０ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。粒径が１００〜３００μｍのトヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）と、粒径が５０〜１５０μｍのトヨパールＨＷ−４０Ｃ（東ソー製）を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに４．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：２ｍＬ）。また、コントロールとして、担体を充填しないカラムを用意した。

次に、それぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した１．０ｘ１０＾７／ｍＬのＳＰ２／０細胞懸濁液をシリンジカラム上部より２００μＬずつ、すなわち、１．０ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。次に、シリンジカラム上部よりＭＡＣＳバッファを４ｍＬアプライし、針部からの流出液を別容器に回収した（以下、この細胞液を流出細胞液と記載する）。回収した流出細胞液中の細胞濃度をコールターカウンターＺ２シリーズ（ベックマンコールター製）で測定し、それぞれのカラムについて細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝シリンジカラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。細胞流出率を表４に示す。また、ＳＰ２／０細胞の細胞直径をコールターカウンターＺ２シリーズ（ベックマンコールター製）で測定した結果を図２に示す。ＳＰ２／０細胞の平均細胞直径は１１．０μＭ、分散度は１１．９％であり、通常の動物細胞と同等の大きさであった。

表４の結果から、粒径が１００〜３００μｍのトヨパールＨＷ−４０ＥＣを充填したカラムに細胞を通液した場合、細胞流出率は約７０％と高いことが明らかとなった。このことから、粒径が１００〜３００μｍの担体および担体から作製される吸着剤は、一般的な大きさを持つ動物細胞が十分接触し、且つ、細胞が吸着剤の隙間を淀みなく通過するのに適した粒径であることが明らかとなった。また、理論上、粒径１００〜３００μｍの真球状粒子を最密充填した場合、粒子間の隙間を通過可能な細胞の大きさは１５．５〜４６．５μｍと見積もられ、本実施例の結果を裏付けるものであった。

一方、表４の結果から、粒径が５０〜１５０μｍのトヨパールＨＷ−４０Ｃを充填したカラムに細胞を通液した場合、細胞流出率は約３０％となり、粒径が１００〜３００μｍであるトヨパールＨＷ−４０ＥＣに比べて低いことが明らかとなった。この結果の原因として、理論上、粒径が５０〜１５０μｍの真球状粒子を最密充填した場合、粒子間の隙間を通過可能な細胞の大きさは７．８〜２３．３μｍと見積もられることから、粒径が５０〜１５０μｍの粒子状担体および担体から作製される吸着剤では、担体および吸着剤間の隙間が狭いために、細胞の目詰まりが生じていることが考えられた。

実施例１４ 吸着剤Ａ２および吸着剤Ｂ２への細胞の吸着実験
前述のＳＰ２／０細胞およびＲａｍｏｓ細胞を浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にてＧＩＴ培地（日本製薬製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。また、接着細胞培養用フラスコ（コーニング製、Ｆａｌｃｏｎ）にて、２１０２Ｅｐ細胞を実施例１３と同様の手法で１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

次に、以下の手順によりＳＰ２／０細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、Ｒａｍｏｓ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（同）、２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＧｒｅｅｎまたはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで、それぞれ蛍光染色した。

まず、ＳＰ２／０細胞については、細胞を５０ｍＬチューブに回収後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、細胞ペレットをＤ−ＰＢＳに懸濁し、再び、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞ペレットを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度１０μＭで溶解した液に懸濁し、培養シャーレに移し替え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に細胞を５０ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ＧＩＴ培地に懸濁し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養を行った。

また、Ｒａｍｏｓ細胞については、細胞を５０ｍＬチューブに回収後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、細胞ペレットをＤ−ＰＢＳに懸濁し、再び、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞ペレットを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度１０μＭで溶解した液に懸濁し、培養シャーレに移し替え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に細胞を５０ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ＧＩＴ培地に懸濁し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養を行った。

また、２１０２Ｅｐ細胞については、まずフラスコ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳを導入して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳを廃棄した。次にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＧｒｅｅｎまたはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度１０μＭで溶解した液を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、和光純薬製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製）を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次にＤ−ＭＥＭ培地を廃棄した後、再び新しいＤ−ＭＥＭ培地を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養を行った。

次に細胞の回収と調製を以下の方法で行った。ＳＰ２／０細胞とＲａｍｏｓ細胞については、まず細胞を５０ｍＬチューブに回収後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファにて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、ＭＡＣＳバッファで懸濁を行い、セルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去して、均一なＳＰ２／０細胞懸濁液とＲａｍｏｓ細胞懸濁液を調製した。２１０２Ｅｐ細胞については、培養フラスコ中のＤ−ＭＥＭ培地を廃棄してＤ−ＰＢＳを導入した後、細胞をリンスしてＤ−ＰＢＳ液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー製）を導入し、数分間放置することで２１０２Ｅｐ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブへと回収した。細胞を遠心分離して沈降後、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファにて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、ＭＡＣＳバッファで懸濁を行い、セルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去して均一な２１０２Ｅｐ細胞懸濁液を調製した。以上により、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２．０ｘ１０＾７個／ｍＬのＳＰ２／０細胞、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した３．７ｘ１０＾６個／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した２．０ｘ１０＾７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した３．７ｘ１０＾６個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をそれぞれ得た。

次に、５．０ｍＬ容ファルコンピペット（コーニング製、Ｆａｌｃｏｎ）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例３で作製した吸着剤Ａ２および実施例５で作製した吸着剤Ｂ２を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに８．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：４ｍＬ）。

次に異なる蛍光色素で染色した細胞の混合液である、細胞混合液Ｘと細胞混合液Ｙを調製した。
・細胞混合液Ｘ：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２．０ｘ１０＾７／ｍＬのＳＰ２／０細胞とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した２．０ｘ１０＾７／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞を１：１で混合した細胞混合液。
・細胞混合液Ｙ：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した３．７ｘ１０＾６／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した３．７ｘ１０＾６／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞を１：１で混合した細胞混合液。

次に以下の手順で、各吸着剤を充填したカラムに細胞混合液およびキャリア液をアプライした。

・吸着剤Ａ２を充填したカラム：
細胞混合液Ｙをピペット上部より４００μＬ、すなわち、カラムあたりＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色したＲａｍｏｓ細胞７．４ｘ１０＾５個とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞７．４ｘ１０＾５個をアプライした。細胞液が浸透した後、ＭＡＣＳバッファを８ｍＬをアプライした。

・吸着剤Ｂ２を充填したカラム：
細胞混合液Ｘをピペット上部より４００μＬ、すなわち、カラムあたりＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色したＳＰ２／０細胞４．０ｘ１０＾６個とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した２１０２Ｅｐ細胞４．０ｘ１０＾６個をアプライし、細胞液が浸透した後、ＭＡＣＳバッファを８ｍＬアプライした。

各カラム下部の針部より流出した細胞液は、それぞれ１ｍＬずつのフラクションとして、合計で８ｍＬの流出液をディープウェルプレート（サンプラテック製）に回収した。回収した流出細胞液はフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダーで励起波長４９２ｎｍおよび励起波長５４１ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、検出波長５３０ｎｍおよび検出波長５８０ｎｍでの蛍光強度をそれぞれ測定した。

また、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した３．７ｘ１０＾６／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した２．０ｘ１０＾７／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の希釈系列をそれぞれ作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長４９２ｎｍ、検出波長５３０ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した細胞の細胞濃度と蛍光強度の検量線を作成した。同様に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２．０ｘ１０＾７／ｍＬのＳＰ２／０細胞、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した３．７ｘ１０＾６／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の希釈系列をそれぞれ作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍでの蛍光スキャンを行うことで、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した細胞の細胞濃度と蛍光強度の検量線を作成した。

このようにして得られた各フラクションの蛍光強度と検量線から、分取した各１ｍＬずつのフラクション中に含まれる細胞数を算出した。

横軸をフラクション数、縦軸を細胞数とした場合の細胞分離クロマトグラムを図３（吸着剤Ａ２）および図４（吸着剤Ｂ２）に示す。また、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでのそれぞれの細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数（５ｍＬ流出分まで）／導入細胞数」として算出したものを表５に示す。

図３および表５の結果から、吸着剤Ａ２（ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化したＨＷ−４０ＥＣ）にＲａｍｏｓ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の細胞混合物を通液した場合、Ｒａｍｏｓ細胞のみが流出しやすい傾向が認められ、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでの細胞流出率はＲａｍｏｓ細胞が６１％、２１０２Ｅｐ細胞が８％となった。

また、図４および表５の結果から、吸着剤Ｂ２（ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化したポリウレタン粒子）にＳＰ２／０細胞と２１０２Ｅｐ細胞の細胞混合物を通液した場合、ＳＰ２／０細胞のみが流出しやすい傾向が認められ、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでの細胞流出率はＳＰ２／０細胞が５１％、２１０２Ｅｐ細胞が１２％となった。

これらの結果から、トヨパールＨＷ−４０ＥＣまたはポリウレタン粒子いずれの吸着剤を用いた場合も、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化することで、複数の細胞の混合物から２１０２Ｅｐ細胞のみを選択的に吸着できることが明らかとなった。

比較例２ 吸着剤Ａ０および吸着剤Ｂ０への細胞の吸着実験
実施例２に記載の吸着剤Ａ０および調製例１で作製した吸着剤Ｂ０を用い、以下の手順で各吸着剤を充填したカラムに細胞混合液およびキャリア液のアプライを行った。その他の方法については実施例１４と同様の方法で細胞の吸着実験を行った。

・吸着剤Ａ０を充填したカラム：
まず細胞混合液Ｙをピペット上部より４００μＬ、すなわち、カラムあたりＣｅｌｌ ＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎで染色したＲａｍｏｓ細胞７．４ｘ１０＾５個とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞７．４ｘ１０＾５個をアプライした。細胞液が浸透した後、ＭＡＣＳバッファを８ｍＬアプライした。

・吸着剤Ｂ０を充填したカラム：
まず細胞混合液Ｘをピペット上部より４００μＬ、すなわち、カラムあたりＣｅｌｌ ＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅで染色したＳＰ２／０細胞４．０ｘ１０＾６個とＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した２１０２Ｅｐ細胞４．０ｘ１０＾６個をアプライし、細胞液が浸透した後、ＭＡＣＳバッファを８ｍＬアプライした。

横軸をフラクション数、縦軸を細胞数とした場合の細胞分離クロマトグラムを図５（吸着剤Ａ０）と図６（吸着剤Ｂ０）に示す。また、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでのそれぞれの細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数（５ｍＬ流出分まで）／導入細胞数」として算出しものを表５に示す。

図５および表５の結果から、吸着剤Ａ０（ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していないＨＷ−４０ＥＣ）にＲａｍｏｓ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の細胞混合物を通液した場合、両細胞とも流出しやすい傾向が認められ、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでの細胞流出率はＲａｍｏｓ細胞が６６％、２１０２Ｅｐ細胞が６１％となった。

また、図６および表５の結果から、吸着剤Ｂ０（ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していないポリウレタン粒子）にＳＰ２／０細胞と２１０２Ｅｐ細胞の細胞混合物を通液した場合、両細胞とも流出しやすい傾向が認められ、５ｍＬ流出分までの初期フラクションでの細胞流出率はＳＰ２／０細胞が６９％、２１０２Ｅｐ細胞が８２％となった。

これらの結果から、トヨパールＨＷ−４０ＥＣまたはポリウレタン粒子のいずれの吸着剤を用いた場合も、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化しない場合は、複数の細胞の混合物から２１０２Ｅｐ細胞のみを選択的に吸着できないことが明らかとなった。

実施例１５ 吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１への細胞の吸着実験
前述のＲａｍｏｓ細胞と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さないヒト慢性骨髄性白血病細胞であるＫ５６２細胞（ＪＣＲＢ００１９）を浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にてＧＩＴ培地（日本製薬製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

また、接着細胞培養用フラスコ（コーニング製、Ｆａｌｃｏｎ）にて、２１０２Ｅｐ細胞を前述と同様の１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ−ＭＥＭ培地で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

次に、Ｒａｍｏｓ細胞とＫ５６２細胞を実施例１４と同様の手法でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで蛍光染色し、回収、洗浄、シングルセル化した後に細胞懸濁液を調製した。また、２１０２Ｅｐ細胞についても同様の手順により、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで蛍光染色した後に回収、洗浄、シングルセル化し、細胞懸濁液を調製した。それぞれ６．７ｘ１０＾６個／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞、７．０ｘ１０＾６個／ｍＬのＫ５６２細胞、６．０ｘ１０＾６個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を得た。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例２で作製した吸着剤Ａ１、実施例３で作製した吸着剤Ａ２、実施例７で作製した吸着剤Ｄ１および実施例９で作製した吸着剤Ｅ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。

次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製したＲａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞、２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬずつ、すなわち、Ｒａｍｏｓ細胞は１．３ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、Ｋ５６２細胞は１．４ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、２１０２Ｅｐ細胞は１．２ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した。（以下、この細胞液を流出細胞液と記載する）。実施例１４と同様の手法での蛍光強度測定結果から、それぞれの流出細胞液中のＲａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞、２１０２Ｅｐ細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

各細胞の流出率を表６、Ｒａｍｏｓ細胞の細胞流出率のグラフを図７、Ｋ５６２細胞の細胞流出率のグラフを図８、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率グラフを図９に示す。Ｒａｍｏｓ細胞を吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ４３％、５２％、８３％と９６％であった。また、Ｋ５６２細胞を吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ９％、７％、８６％と９９％であった。また、２１０２Ｅｐ細胞を吸着剤Ａ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ１２％、７％、９％と８％であった。

以上の結果から、親水性高分子であるデキストランを固定していない担体にＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ａ１、Ａ２には、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない細胞であるＲａｍｏｓ細胞が約５０〜６０％結合し、前記糖鎖を有さない細胞であるＫ５６２細胞および前記糖鎖を有する２１０２Ｅｐ細胞が約９０％結合することが明らかとなった。

一方、デキストランを固定した担体にＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｄ１、Ｅ１には、前記糖鎖を有さない細胞であるＲａｍｏｓ細胞およびＫ５６２細胞は結合しないため、流出率は約８０〜１００％と高いが、前記糖鎖を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞は吸着剤Ｄ１および吸着剤Ｅ１に強く結合するため、流出率は１０％以下と低くなることが明らかとなった。

比較例３ 吸着剤Ａ０への細胞の吸着実験
実施例２に記載の吸着剤Ａ０を用いた以外は、実施１５と同様の方法で、細胞の吸着実験を行った。各細胞の流出率を表６、Ｒａｍｏｓ細胞の細胞流出率のグラフを図７、Ｋ５６２細胞の細胞流出率のグラフを図８、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率グラフを図９に示す。吸着剤Ａ０に「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞をアプライした場合の細胞流出率は６９％であり、２１０２Ｅｐ細胞は吸着剤Ａ０には結合しないため流出率が高くなることが明らかとなった。また、前記糖鎖を有さない細胞であるＲａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞を吸着剤Ａ０にアプライした場合の細胞流出率は、それぞれ８５％、７９％であり、２１０２Ｅｐ細胞の場合と同様に、Ｒａｍｏｓ細胞およびＫ５６２細胞も吸着剤Ａ０には結合しないため、流出率が高くなることが明らかとなった。

実施例１６ 吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１への細胞の吸着実験
実施例１４と同様の手法にて、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞、２１０２Ｅｐ細胞のそれぞれを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎでで蛍光染色し、回収、洗浄、シングルセル化して細胞懸濁液を調製した。これにより、１．１ｘ１０＾７個／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞、１．４ｘ１０＾７個／ｍＬのＫ５６２細胞、３．５ｘ１０＾６個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を得た。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例７で作製した吸着剤Ｄ１、実施例８で作製したＤ２、実施例９で作製した吸着剤Ｅ１、実施例１０で作製したＥ２および実施例１１で作製したＦ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。

それぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製したＲａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞、２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラム上部より１００μＬずつ、すなわち、Ｒａｍｏｓ細胞は２．２ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、Ｋ５６２細胞は２．８ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、２１０２Ｅｐ細胞は７．０ｘ１０＾５個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部からの流出液を別容器に回収した。実施例１４と同様の手法での蛍光強度測定結果からそれぞれの流出細胞液中のＲａｍｏｓ細胞、Ｋ５６２細胞、２１０２Ｅｐ細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

各細胞の流出率を表７、Ｒａｍｏｓ細胞の細胞流出率のグラフを図１０、Ｋ５６２細胞の細胞流出率のグラフを図１１、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率グラフを図１２に示す。Ｒａｍｏｓ細胞を吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ９２％、１０４％、７８％、１０２％、５９％であった。Ｋ５６２細胞を吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ９１％、９８％、５８％、８６％、７０％であった。２１０２Ｅｐ細胞を吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１にアプライした場合の流出率はそれぞれ１％、１９％、２％、１０％、３４％であった。

以上の結果から、親水性高分子であるデキストランを固定した担体にＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１には、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない細胞であるＲａｍｏｓ細胞およびＫ５６２細胞は結合しないため、流出率は約６０〜１００％と高いが、前記糖鎖を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞は吸着剤Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１に強く結合するため、流出率は１〜３５％以下と低くなることが明らかとなった。

また、ＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化方法の異なる吸着剤を比較すると、２１０２Ｅｐ細胞の吸着について、吸着剤Ｄ１とＥ１は吸着剤Ｄ２とＥ２よりも流出率が低かったことから、レクチンを固定化する方法として、実施例３に記載の方法よりも実施例２に記載の方法で行うことにより、前記糖鎖を有する細胞の吸着能力が優れた吸着剤が作製できることが明らかとなった。

比較例４ 吸着剤Ａ０、Ｂ０、Ｄ０への細胞の吸着実験
実施例２に記載の吸着剤Ａ０、調製例１で作製した吸着剤Ｂ０、調製例３で作製した吸着剤Ｄ０を用いた以外は、実施１６と同様の方法で、細胞の吸着実験を行った。

各細胞の流出率を表７、Ｒａｍｏｓ細胞の細胞流出率のグラフを図１０、Ｋ５６２細胞の細胞流出率のグラフを図１１、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率グラフを図１２に示す。Ｒａｍｏｓ細胞を吸着剤Ａ０、Ｂ０、Ｄ０にアプライした場合の流出率はそれぞれ９３％、８６％、１０４％であった。Ｋ５６２細胞を吸着剤Ａ０、Ｂ０、Ｄ０にアプライした場合の流出率はそれぞれ９１％、７２％、８６％であった。２１０２Ｅｐ細胞を吸着剤Ａ０、Ｂ０、Ｄ０にアプライした場合の流出率はそれぞれ６０％、６３％、８８％であった。以上の結果から、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞、前記糖鎖を有さない細胞であるＲａｍｏｓ細胞およびＫ５６２細胞は、吸着剤Ａ０、Ｂ０、Ｄ０に結合しないため、流出率が高くなることが明らかになった。

実施例１７ 吸着剤Ａ２、Ｄ１、Ｅ１への細胞の吸着実験
実施例１４と同様の手法にて２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで蛍光染色し、回収、洗浄、シングルセル化して、６．０ｘ１０＾７個／ｍＬの細胞濃度の２１０２Ｅｐ細胞懸濁液を調製した。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例３で作製した吸着剤Ａ２、実施例７で作製した吸着剤Ｄ１、実施例９で作製した吸着剤Ｅ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。

次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞をアプライ細胞量（Ａ）＝８０μＬ、（Ｂ）＝４００μＬ、（Ｃ）＝８００μＬの条件でアプライした。すなわち、アプライ細胞量（Ａ）は９．６ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、アプライ細胞量（Ｂ）４．８ｘ１０＾７個／ｍＬ−吸着剤、アプライ細胞量（Ｃ）は９．６ｘ１０＾７個／ｍＬ−吸着剤の条件で２１０２Ｅｐ細胞をカラム上部にアプライした。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを、アプライ細胞量（Ａ）のものについては３ｍＬ、アプライ細胞量（Ｂ）のものについては２．６ｍＬ、アプライ細胞量（Ｃ）のものについては２．２ｍＬ導入し、細胞液アプライ時の流出液とＭＡＣＳバッファアプライ時の流出液を混合し、合計約３ｍＬの細胞液としたのち、別容器に回収した。実施例１４と同様の手法での蛍光強度測定結果から、２１０２Ｅｐ細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を表８、グラフを図１３に示す。ＨＷ−４０ＥＣにレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ａ２、Ｄ１、Ｅ１に細胞を通液した場合、アプライ細胞量が（Ａ）と（Ｂ）の場合について流出率が約２割以下と良好な細胞吸着性を示したが、（Ｃ）の場合は６割以上の流出率となり、吸着剤あたりの吸着可能細胞数を超えたために細胞がオーバーフローした結果であると考えられた。また、この結果から算出した吸着剤１ｍＬあたりの吸着細胞数の数値を表８、グラフを図１４に示す。ＨＷ−４０ＥＣにレクチンを固定化した吸着剤である吸着剤Ａ２、Ｄ１、Ｅ１の場合は、最大でそれぞれ３．９ｘ１０＾７個／ｍＬ−吸着剤（吸着剤Ａ２、アプライ細胞量（Ｂ））、３．９ｘ１０＾７個／ｍＬ−吸着剤（吸着剤Ｄ１、アプライ細胞量（Ｂ））、３．７ｘ１０＾７個／ｍＬ−吸着剤（吸着剤Ｅ１、アプライ細胞量（Ｂ））と、１ｍＬの吸着剤あたり１０＾７個オーダーの細胞数が吸着可能であることが明らかとなった。

比較例５ 吸着剤Ａ０への細胞の吸着実験
吸着剤Ａ０を用いた以外は、実施例１７と同様の方法で細胞吸着実験を行った。２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を表８、グラフを図１３に示す。ＨＷ−４０ＥＣにレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ａ０に細胞を通液した場合、いずれのアプライ細胞量でも流出率が８割以上となり、殆どの細胞が吸着されずに流出していることが示された。また、この結果をもとに算出した吸着剤１ｍＬあたりの吸着細胞数の数値を表８、グラフを図１４に示す。吸着剤Ａ０の場合、１ｍＬの吸着剤あたりの吸着細胞数は、アプライ細胞量が（Ａ）の場合は１．６ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、アプライ細胞量が（Ｂ）の場合は３．３ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤、アプライ細胞量が（Ｃ）の場合は６．２ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤であり、１０＾６個オーダーの細胞数しか吸着できないことが明らかとなった。

実施例１８ 吸着剤Ｄ１への２１０２Ｅｐ細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
接着細胞培養用フラスコ（コーニング製）にて、２１０２Ｅｐ細胞を前述の１０％ＦＢＳと抗生物質溶液添加Ｄ−ＭＥＭ培地で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。カラム通液試験実施日より１日前、２日前、３日前、４日前にそれぞれ継代した２１０２Ｅｐ細胞を準備しておき、カラム通液試験当日、それぞれの細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離回収することで、培養期間がそれぞれ１日目、２日目、３日目、４日目となるような２１０２Ｅｐ細胞を用意した。

次に、それぞれの培養日数で準備した２１０２Ｅｐ細胞の回収と調製を以下の方法で行った。まず培養フラスコにＤ−ＰＢＳを導入した後、細胞をリンスしてＤ−ＰＢＳ液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ製を導入し、数分間放置することで２１０２Ｅｐ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブへと回収した。それぞれの細胞を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離して沈降後、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファに懸濁し、再び遠心後上清を廃棄することで細胞洗浄を行った。ＭＡＣＳバッファに懸濁した２１０２Ｅｐ細胞をセルストレーナーで濾過することで、凝集塊の無い均一な２１０２Ｅｐ細胞懸濁液を得た。それぞれの細胞懸濁液は血球計算盤で細胞数をカウントした後、ＭＡＣＳバッファで希釈することで、各細胞懸濁液濃度を３．０ｘ１０＾７／ｍＬに調整した。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例７で作製した吸着剤Ｄ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。

次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製した３．０ｘ１０＾７／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞懸濁液をそれぞれ１００μＬ、すなわち６．０ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤の条件で２１０２Ｅｐ細胞をカラム上部にアプライした。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを１ｍＬ導入し、針部から流出した約１ｍＬの細胞液を別容器に回収した。回収した流出細胞液は血球計算盤で細胞数をカウントし、「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として、アプライした細胞数に対する比率である流出率をそれぞれ算出した。細胞流出率を表９、グラフを図１５に示す。

吸着剤Ｄ１を充填したカラムでは２１０２Ｅｐ細胞の流出率は７％（培養日数１日の細胞）、１２％（培養日数２日の細胞）、１０％（培養日数３日の細胞）、１７％（培養日数４日の細胞）と低く、吸着剤に２１０２Ｅｐ細胞が強く吸着されるために流出率が低いことが明らかとなった。

次に、以下の方法でフローサイトメトリー（日本ＢＤ製 ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ、以下ＦＡＣＳと記載）により、各アプライ細胞と流出細胞のＴＲＡ−１−６０陽性率、およびＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を測定した。まず各細胞液を遠心分離して細胞を沈降後、上清を廃棄して細胞ペレットをＭＡＣＳバッファにて懸濁することで細胞の洗浄を行った。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁した。Ａｎｔｉ−ＴＲＡ−１−６０ ＰＥ（ノバスバイオロジカル製）を５μＬおよびｒＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣ（和光純薬製）を５μＬ添加し、室温で１時間反応した。蛍光試薬反応後、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに懸濁した。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁することで、ＦＡＣＳ測定用細胞サンプルとした。

各アプライ細胞と流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図１６に示す。横軸をＦＩＴＣの蛍光強度、縦軸をＰＥの蛍光強度として解析を行った。図１６中のＱ１とＱ２をＴＲＡ−１−６０陽性の細胞集団、Ｑ２とＱ４をＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性の細胞集団とし、ＴＲＡ−１−６０陽性率（％）＝（Ｑ１＋Ｑ２）／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３＋Ｑ４）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率（％）＝（Ｑ２＋Ｑ４）／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３＋Ｑ４）として陽性率の算出を行った。

陽性率解析結果を表１０、ＴＲＡ−１−６０陽性率のグラフを図１７、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率のグラフを図１８に示す。ＴＲＡ−１−６０陽性率は培養日数による違いは見られず、全ての細胞集団で９９％以上の高い値を示し、元々２１０２Ｅｐ細胞がＡｎｔｉ−ＴＲＡ−１−６０抗体と強い結合性を有することが明らかとなった。また、カラムにアプライした２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はそれぞれ７５％（培養日数１日の細胞）、６０％（培養日数２日の細胞）、６８％（培養日数３日の細胞）、５９％（培養日数４日の細胞）であった。一方、回収した流出細胞のＴＲＡ−１−６０陽性率は全ての細胞集団で９９％以上の高い値であったが、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率はそれぞれ５７％（培養日数１日の細胞）、４５％（培養日数２日の細胞）、４７％（培養日数３日の細胞）、３９％（培養日数４日の細胞）であり、それぞれアプライした細胞と比べ１〜２割の陽性率低下が認められた。これらの結果から、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｄ１に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合、アプライした２１０２Ｅｐ細胞の内、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の高い細胞集団が吸着し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の低い細胞集団が流出していることが明らかとなった。

比較例６ 吸着剤Ｄ０への２１０２Ｅｐ細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
調製例３で作製した吸着剤Ｄ０を用いた以外は、実施例１８と同様の方法で細胞吸着実験とＦＡＣＳ解析を行った。アプライする細胞は培養３日目の２１０２Ｅｐ細胞を用いた。細胞流出率を表９、グラフを図１５に示す。レクチンを固定化していない吸着剤Ｄ０を充填したカラムでは２１０２Ｅｐ細胞の流出率は５９％であり、吸着剤Ｄ０には２１０２Ｅｐ細胞が結合しないため、多くの細胞が流出していることが明らかとなった。

また、各アプライ細胞と流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図１６、陽性率解析結果の数値を表１０、ＴＲＡ−１−６０陽性率のグラフを図１７、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率のグラフを図１８に示す。ＴＲＡ−１−６０陽性率はアプライ細胞も流出細胞も９９％と高い陽性率を示した。また、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率についてはアプライ細胞で６８％、流出細胞で６７％とほとんど違いが認められなかった。これらの結果から、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤Ｄ０に２１０２Ｅｐ細胞を通液した場合、２１０２Ｅｐ細胞が結合せず素通りするために、アプライ細胞と同じＴＲＡ−１−６０陽性率、ＢＣ２ＬＣＮ陽性率を持つ細胞が流出していることが明らかとなった。

実施例１９ 吸着剤Ｄ１、Ｅ１への２１０２Ｅｐ細胞およびスパイク細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
実施例１４と同様の手法にて、２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで蛍光染色し、回収、洗浄、シングルセル化して、、１．２６ｘ１０＾７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を得た。また、実施例１５と同様の手法にてＫ５６２細胞を回収、洗浄、シングルセル化して、１．１６ｘ１０＾７個／ｍＬのＫ５６２細胞の細胞懸濁液を得た。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例７で作製した吸着剤Ｄ１および実施例９で作製した吸着剤Ｅ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。各吸着剤を充填したカラムは同じものを２本ずつ用意し、それぞれのカラムを垂直に立てた状態で、以下の方法で片方には２１０２Ｅｐ細胞を単独、もう片方には２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞の混合細胞をアプライした。
（２１０２Ｅｐ細胞を単独でアプライの場合）
上記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞を１５０μＬ、すなわち３．８ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。
（２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞混合物をアプライの場合）
上記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞５００μＬとＫ５６２細胞５００μＬの混合細胞液を調製した後、この細胞液を１００μＬ、すなわち（１．３ｘ１０＾６個の２１０２Ｅｐ細胞と１．２ｘ１０＾６個のＫ５６２細胞）／ｍＬ−吸着剤の条件でカラム上部にアプライした（アプライ時の細胞比率は２１０２Ｅｐ：Ｋ５６２＝５２％：４８％）。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを２ｍＬ導入し、針部から流出した約２ｍＬの細胞液を別容器に回収した。実施例１４と同様の手法での蛍光強度測定結果から、２１０２Ｅｐ細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

細胞流出率の表１１、グラフを図１９に示す。２１０２Ｅｐ細胞を単独でアプライした場合、細胞流出率は１９％（吸着剤Ｄ１）、４％（吸着剤Ｅ１）、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率は２７％（吸着剤Ｄ１）、１６％（吸着剤Ｅ１）であった。これらの結果から、２１０２Ｅｐ細胞、または２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞との混合細胞を吸着剤Ｄ１および吸着剤Ｅ１を充填したカラムに通液した場合、吸着剤に２１０２Ｅｐ細胞が強く吸着されるために流出率が低くなることが明らかとなった。

次に、実施例１８と同様の方法でＦＡＣＳにて各流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率、および、混合細胞の流出細胞中における２１０２Ｅｐ細胞の割合を解析した。

混合細胞をアプライした場合の各流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図２０に示す。図２０中、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ陽性の細胞集団、すなわち２１０２Ｅｐ細胞をＰ３ゲート部分、また、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色されておらず、なおかつＢＣ２ＬＣＮレクチン反応性を示さない細胞集団として、Ｋ５６２細胞をＰ２ゲート部分に設定した。混合細胞をアプライしたカラムにおける流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞の比率は、細胞比率（％）＝Ｐ３／（Ｐ２＋Ｐ３）として算出した。また、ＦＩＴＣの蛍光強度が低いＱ１ゲートに含まれる細胞集団はＢＣ２ＬＣＮレクチン陰性の細胞集団、ＦＩＴＣの蛍光強度が高いＱ２ゲートに含まれる細胞集団はＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性の細胞集団とし、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率（％）＝Ｑ２／（Ｑ１＋Ｑ２）として流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の算出を行った。

混合細胞をアプライしたカラムにおける流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞の比率を表１１に示す。細胞アプライ時の細胞比率は２１０２Ｅｐ：Ｋ５６２＝５２％：４８％であったが、流出細胞中の細胞比率は２１０２Ｅｐ：Ｋ５６２＝１３．８％：８６．２％（吸着剤Ｄ１）、０．３％：９９．７％（吸着剤Ｅ１）となり、流出細胞中に含まれる２１０２Ｅｐ細胞の割合が極度に低下していることが確認された。以上の結果から、ＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｄ１および吸着剤Ｅ１に混合細胞を通液した場合、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞のみが選択的に吸着分離できることが確認された。

また、流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果の数値を表１１、グラフを図２１に示す。アプライした２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は５３％であったが、２１０２Ｅｐ細胞を単独でアプライした場合の流出した２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は２３％（吸着剤Ｄ１）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性細胞数が僅少のため定量不能（吸着剤Ｅ１）、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合の流出した２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は２７％（吸着剤Ｄ１）、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性細胞数が僅少のため定量不能（吸着剤Ｅ１）と、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の大きな低下が認められた。また、表１１に示した２１０２Ｅｐ細胞の流出率と流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率との相関を図２２に示す。細胞流出率と流出細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率には相関が認められ、細胞流出率が低いほど流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率も低いことが確認され、吸着剤Ｄ１および吸着剤Ｅ１を充填したカラムに通液した場合、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の高い細胞集団が吸着剤と強く結合し、吸着されていることが明らかとなった。

比較例７ 吸着剤Ｄ０への２１０２Ｅｐ細胞およびスパイク細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
調製例３で作製した吸着剤Ｄ０を用いた以外は、実施例１９と同様の方法で細胞吸着実験とＦＡＣＳ解析を行った。細胞流出率を表１１、グラフを図１９に示す。２１０２Ｅｐ細胞を単独でアプライした場合、細胞流出率は１００％、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合、２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率は８２％であった。これらの結果から、２１０２Ｅｐ細胞、または２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞との混合細胞を、吸着剤Ｄ０を充填したカラムに通液した場合、吸着剤に２１０２Ｅｐ細胞がほとんど吸着していないことが明らかとなった。

また、混合細胞をアプライした場合の流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図２０、流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞とＫ５６２細胞の細胞比率を表１１に示す。細胞アプライ時の細胞比率は２１０２Ｅｐ：Ｋ５６２＝５２％：４８％であったが、流出細胞中の細胞比率は２１０２Ｅｐ：Ｋ５６２＝３７．７％：６２．３％となり、流出細胞中に含まれる２１０２Ｅｐ細胞の割合の顕著な減少は認められなかった。以上の結果から、吸着剤Ｄ０に混合細胞を通液した場合、２１０２Ｅｐ細胞のみを選択的に吸着分離できないことが確認された。また、流出細胞中の２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果の数値を表１１、グラフを図２１に示す。アプライした２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は５３％であったが、２１０２Ｅｐ細胞を単独でアプライした場合の流出した２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は５４％、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合の流出した２１０２Ｅｐ細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は４７％と、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の大きな低下は認められなかった。

これらの結果から、ＢＣ２ＬＣＮレクチン固定化を行っていない吸着剤である吸着剤Ｄ０を充填したカラムに通液した場合、２１０２Ｅｐ細胞が結合せず素通りするために、アプライ細胞と同じＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を持つ細胞が流出していることが明らかとなった。

実施例２０ 吸着剤Ｅ１への２０１Ｂ７細胞およびスパイク細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
接着細胞培養用シャーレ（コーニング製）にて、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞（特許実施許諾契約およびＭＴＡ契約を締結後、京都大学ＣｉＲＡより分譲）のフィーダーフリー培養を行った。

まずｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ製）をＤ−ＰＢＳに３μｇ／ｍＬで希釈した溶液を調製し、シャーレに導入して４℃で一晩以上放置することで、シャーレ培養面へのｉＭａｔｒｉｘ−５１１のコーティングを行った。コーティングを行ったシャーレのｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を廃棄した後、ｉＰＳ細胞培養用培地であるＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（味の素製）を導入しリンス後、凍結バイアルより解凍した２０１Ｂ７細胞をロックインヒビター Ｙ−２７６３２（和光純薬製）を１０μＭ添加した同培地に懸濁して播種した。一晩培養後、Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を廃棄し、Ｙ−２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地へと培地交換を行った。その後、シャーレは毎日ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地にて培地交換を行い、適当な細胞密度になったところで、細胞回収と継代を行った。細胞回収については以下のようにして行った。まず、シャーレにＤ−ＰＢＳを導入し細胞をリンスした後、Ｄ−ＰＢＳを廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した剥離溶液を導入して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認した後、剥離溶液を廃棄、１０μＭ Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。回収した細胞の細胞数は血球計算盤でカウントし、Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地にて、１０＾４〜１０＾５／ｍＬの濃度で播種し、Ｙ−２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地にて適当な細胞密度になるまで培養を継続した。また、前述のＫ５６２細胞を浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にてＧＩＴ培地（日本製薬製）で同様に５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

次に、２０１Ｂ７細胞を以下の手順でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで蛍光染色した。まず、シャーレ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳを導入して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳを吸引廃棄した。次にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度２０μＭで溶解した液を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。培地を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。

次にそれぞれの細胞の回収と調製を以下の方法で行った。２０１Ｂ７細胞については、まず、シャーレにＤ−ＰＢＳを導入し細胞をリンスした後、Ｄ−ＰＢＳを廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した剥離溶液を導入して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認した後、剥離溶液を廃棄、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を導入し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。また、Ｋ５６２細胞についてはシャーレから直接５０ｍＬチューブへと回収を行った。それぞれの細胞を遠心分離して沈降後、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファにて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、最終的に、数ｍＬのＭＡＣＳバッファに懸濁した２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれセルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去し、５．０ｘ１０＾６個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞と６．０ｘ１０＾６個／ｍＬのＫ５６２細胞の細胞懸濁液を得た。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。実施例９で作製した吸着剤Ｅ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。各吸着剤を充填したカラムは同じものを５本用意し、それぞれのカラムを垂直に立てた状態で、以下の方法で１本には２０１Ｂ７細胞を単独、残り４本には混合比率を変えた２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物をアプライした。
（２０１Ｂ７細胞を単独でアプライの場合）
上記の方法で調製した５．０ｘ１０＾６個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞を１００μＬ、すなわち１．０ｘ１０＾６個／ｍＬ−吸着剤の条件でアプライした。
（２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物をアプライの場合）
下記混合比率（ｉ）〜（ｉｖ）の条件で細胞混合物を調製し、カラムへアプライした。
混合比率（ｉ）
２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ１８％：８２％の細胞数比率で混合したものを調製し、（４．０ｘ１０＾５個の２０１Ｂ７細胞と１．８ｘ１０＾６個のＫ５６２細胞）／ｍＬ−吸着剤の条件でカラム上部にアプライした。
混合比率（ｉｉ）
２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ４７％：５３％の細胞数比率で混合したものを調製し、（１．０ｘ１０＾６個の２０１Ｂ７細胞と１．１ｘ１０＾６個のＫ５６２細胞）／ｍＬ−吸着剤の条件でカラム上部にアプライした。
混合比率（ｉｉｉ）
２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ７８％：２２％の細胞数比率で混合したものを調製し、（１．６ｘ１０＾６個の２０１Ｂ７細胞と４．６ｘ１０＾５個のＫ５６２細胞）／ｍＬ−吸着剤の条件でカラム上部にアプライした。
混合比率（ｉｖ）
２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ１０％：９０％の細胞数比率で混合したものを調製し、（４．４ｘ１０＾５個の２０１Ｂ７細胞と４．１ｘ１０＾６個のＫ５６２細胞）／ｍＬ−吸着剤の条件でカラム上部にアプライした。

次に、カラム上部よりＭＡＣＳバッファを２ｍＬ導入し、針部から流出した細胞液約２ｍＬを別の容器に回収した。回収した流出細胞液はフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダーで励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍで蛍光スキャンを行い、検出波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。また、調製した５．０ｘ１０＾６個／ｍＬの２０１Ｂ７細胞溶液の希釈系列を作製し、同様にフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注して蛍光スキャンを行うことで、細胞濃度定量用の検量線を作成した。流出細胞液の蛍光強度と検量線よりそれぞれの流出細胞液中の２０１Ｂ７細胞濃度を定量し、２０１Ｂ７細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

２０１Ｂ７細胞の細胞流出率を表１２、グラフを図２３に示す。２０１Ｂ７細胞を単独でアプライした場合、流出率は７．９％と、良好な２０１Ｂ７細胞の吸着を示した。また、２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合も同様に、細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては流出率４．７％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては流出率９．７％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては流出率１１．４％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては流出率１３．０％と良好な２０１Ｂ７細胞の吸着性を示した。これらの結果から、２０１Ｂ７細胞、または２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞との混合細胞を、吸着剤Ｅ１を充填したカラムに通液した場合、吸着剤に２０１Ｂ７細胞が強く吸着されるために流出率が低くなることが明らかとなった。

また、以下の方法でＦＡＣＳにて、各流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率、および、２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合における流出細胞中の２０１Ｂ７細胞の割合を解析した。まず各細胞液を遠心分離して細胞を沈降後、上清を廃棄して細胞ペレットをＭＡＣＳバッファにて懸濁することで細胞の洗浄を行った。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁した。ｒＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣ（和光純薬製）５μＬを添加し、室温で１時間反応した。蛍光試薬反応後、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁した。再び遠心分離して細胞を沈降した後、上清を廃棄して、細胞ペレットをＭＡＣＳバッファ１ｍＬに再懸濁することで、ＦＡＣＳ測定用細胞サンプルとした。

混合細胞をアプライした場合の各流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図２４に示す。図２４中、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ陽性の細胞集団、すなわち２０１Ｂ７細胞をＱ１とＱ２ゲート部分、また、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色されておらず、なおかつＢＣ２ＬＣＮレクチン反応性を示さない細胞集団として、Ｋ５６２細胞をＱ３ゲート部分に設定した。混合細胞をアプライしたカラムにおける流出細胞中の２０１Ｂ７細胞の比率は、細胞比率（％）＝（Ｑ１＋Ｑ２）／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３）として算出した。また、ＦＩＴＣの蛍光強度が低いＱ１ゲートに含まれる細胞集団はＢＣ２ＬＣＮレクチン陰性の細胞集団、ＦＩＴＣの蛍光強度が高いＱ２ゲートに含まれる細胞集団はＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性の細胞集団とし、２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率（％）＝Ｑ２／（Ｑ１＋Ｑ２）として流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の算出を行った。

混合細胞をアプライしたカラムにおける流出細胞中の２０１Ｂ７細胞の比率を表１２に示す。細胞アプライ時の細胞比率は細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝１８％：８２％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝４７％：５３％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝７８％：２２％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝１０％：９０％であったが、流出細胞中の細胞比率は、細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝０．０８％：９９．９２％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝０．２５％：９９．７５％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝０．７１％：９９．２９％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝０．１０％：９９．９０％であり、流出細胞中に含まれる２０１Ｂ７細胞の割合が極度に低下していることが確認された。以上の結果から、親水性高分子が固定されたトヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｅ１に混合細胞を通液した場合、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２０１Ｂ７細胞のみが選択的に吸着分離できることが確認された。

また、流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果を表１２、グラフを図２５に示す。アプライした２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は９６％であったが、２０１Ｂ７細胞を単独でアプライした場合の流出した２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は５５％、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合の流出した２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性細胞数が僅少のため定量不能（細胞混合比率（ｉ）、細胞混合比率（ｉｉ）、細胞混合比率（ｉｖ））、７７％（細胞混合比率（ｉｉｉ）と、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の大きな低下が認められた。表１２に示した２０１Ｂ７細胞の流出率とＦＡＣＳで解析した各流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率との相関を図２６に示す。細胞流出率と流出細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率には相関が認められ、細胞流出率が低いほど流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率も低いことが確認され、吸着剤Ｅ１を充填したカラムに通液した場合、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の高い細胞集団が吸着剤と強く結合し、吸着されていることが明らかとなった。

比較例８ 吸着剤Ｄ０への２０１Ｂ７細胞およびスパイク細胞の吸着実験とＦＡＣＳ解析
吸着剤Ｄ０を用いた以外は、実施例２０と同様の方法で細胞吸着実験とＦＡＣＳ解析を行った。

２０１Ｂ７細胞の細胞流出率を表１２、グラフを図２３に示す。２０１Ｂ７細胞を単独でアプライした場合、流出率は１００％と、２０１Ｂ７細胞が吸着されずに流出していることが明らかとなった。また、２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合も同様に、細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては流出率８９．３％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては流出率７８．２％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては流出率１００．０％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては流出率８４．４％と２０１Ｂ７細胞が吸着されずに流出していることが明らかとなった。これらの結果から、２０１Ｂ７細胞、または２０１Ｂ７細胞とＫ５６２細胞との混合細胞を、吸着剤Ｄ０を充填したカラムに通液した場合、吸着剤に２０１Ｂ７細胞が吸着されないことが明らかとなった。

混合細胞をアプライした場合の各流出細胞をＦＡＣＳで解析したドットプロットを図２４、混合細胞をアプライしたカラムにおける流出細胞中の２０１Ｂ７細胞の比率を表１２に示す。細胞アプライ時の細胞比率は細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝１８％：８２％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝４７％：５３％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝７８％：２２％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝１０％：９０％であったが、流出細胞中の細胞比率は、細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝１１％：８９％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝３３％：６７％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝６９％：３１％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては２０１Ｂ７：Ｋ５６２＝６％：９４％であり、細胞アプライ時の細胞比率と大きく変わらないことが確認された。以上吸着剤Ｄ０に混合細胞を通液した場合、２０１Ｂ７細胞のみを選択的に吸着分離できないことが確認された。

また、流出細胞中の２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率解析結果の数値を表１２、グラフを図２５に示した。アプライした２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は９６％であり、２０１Ｂ７細胞を単独でアプライした場合の流出した２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は９７％、Ｋ５６２細胞との混合細胞をアプライした場合の流出した２０１Ｂ７細胞のＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率は、細胞混合比率（ｉ）でアプライしたものについては９７％、細胞混合比率（ｉｉ）でアプライしたものについては９５％、細胞混合比率（ｉｉｉ）でアプライしたものについては９３％、細胞混合比率（ｉｖ）でアプライしたものについては９５％であり、ＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率の大きな低下は認められなかった。

これらの結果から、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ｄ０を充填したカラムに通液した場合、２０１Ｂ７細胞が結合せず素通りするために、アプライ細胞と同じＢＣ２ＬＣＮレクチン陽性率を持つ細胞が流出していることが明らかとなった。

実施例２１ 吸着剤Ｅ１へのＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞のスパイク細胞の吸着実験
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有さない正常ヒト皮膚線維芽細胞であるＮＨＤＦ細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ製）の培養は、線維芽細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ製）を用い、直径１５ｃｍのシャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。また、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞を、実施例１４と同様の手法で接着細胞培養用フラスコ（コーニング製、Ｆａｌｃｏｎ）にて、１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

次に、以下の手順によりＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで蛍光染色した。まずフラスコ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳを導入して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳを廃棄した。次にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎを無血清ＲＰＭＩ培地に終濃度１０μＭで溶解した液を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、線維芽細胞増殖培地２を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に線維芽細胞増殖培地２を廃棄した後、再び新しい線維芽細胞増殖培地２を導入し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養を行った。また、実施例１４と同様の手法で２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで蛍光染色した。

次に、以下の手順によりＮＨＤＦ細胞の回収、洗浄、シングルセル化を行った。まず、培養フラスコ中の線維芽細胞増殖培地２を廃棄してＤ−ＰＢＳを導入した後、細胞をリンスしてＤ−ＰＢＳ液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー製）を導入し、数分間放置することでＮＨＤＦ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブへと回収した。細胞を遠心分離して沈降後、細胞ペレットを前述のＭＡＣＳバッファにて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返した後、ＭＡＣＳバッファで懸濁を行い、セルストレーナーで濾過することで凝集塊を除去して２．７ｘ１０＾６個／ｍＬの均一なＮＨＤＦ細胞懸濁液を調製した。また、実施例１４と同様の手法にて、２１０２Ｅｐ細胞を回収、洗浄、シングルセル化して、１．７ｘ１０＾７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞懸濁液を得た。

次に、このようにして調製した２．７ｘ１０＾６個／ｍＬのＮＨＤＦ細胞懸濁液２．０ｍＬと１．７ｘ１０＾７個／ｍＬの２１０２Ｅｐ細胞懸濁液６００μＬを混合し、スパイクテスト用のＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を調製した。

次に、２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製 セルストレーナチューブ蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを２本作製した。実施例９で作製した吸着剤Ｅ１を前述のＭＡＣＳバッファで置換したのち、５０％懸濁液を調製し、作製したカラムにそれぞれ２．０ｍＬ、４．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：それぞれ１．０ｍＬ、２．０ｍＬ）。

次にそれぞれのカラムを垂直に立てた状態で、上記の方法で調製したＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を１００μＬ、すなわちカラムあたり２．１ｘ１０＾５個のＮＨＤＦ細胞と３．９ｘ１０＾５個の２１０２Ｅｐ細胞の条件で、カラム上部にアプライした。

次にカラム上部より、吸着剤容量が１．０ｍＬのカラムにはＭＡＣＳバッファを２．０ｍＬ、吸着剤容量が２．０ｍＬのカラムにはＭＡＣＳバッファを４．０ｍＬ導入し、針部からの流出液（それぞれ２．０ｍｌと４．０ｍｌ）を別容器に回収した。実施例１４と同様の手法での蛍光強度測定結果からそれぞれの流出細胞液中のＮＨＤＦ細胞、２１０２Ｅｐ細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝カラムあたりの流出細胞数／導入細胞数」として算出した。

ＮＨＤＦ細胞および２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を表１３、細胞流出率のグラフを図２７に示す。ＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を吸着剤Ｅ１にアプライした場合の、ＮＨＤＦ細胞の流出率はそれぞれ７１％（吸着剤容量：１．０ｍＬ）、８２％（吸着剤容量：２．０ｍＬ）であり、一方２１０２Ｅｐ細胞の流出率はそれぞれ１９％（吸着剤容量：１．０ｍＬ）、１５％（吸着剤容量：２．０ｍＬ）であった。以上の結果から、トヨパールＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した吸着剤Ｅ１にＮＨＤＦ細胞および２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を通液した場合、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞である２１０２Ｅｐ細胞のみが選択的に吸着分離できることが確認された。

比較例９ 吸着剤Ａ０へのＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞のスパイク細胞の吸着実験
実施例２に記載の吸着剤Ａ０を用いた以外は、実施例２１と同様の方法で細胞吸着実験を行った。ＮＨＤＦ細胞および２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率を表１３、細胞流出率のグラフを図２７に示す。ＮＨＤＦ細胞と２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を吸着剤Ａ０にアプライした場合の、ＮＨＤＦ細胞の流出率はそれぞれ１０６％（吸着剤容量：１．０ｍＬ）、１０１％（吸着剤容量：２．０ｍＬ）、２１０２Ｅｐ細胞の流出率はそれぞれ９１％（吸着剤容量：１．０ｍＬ）、８４％（吸着剤容量：２．０ｍＬ）であった。ＨＷ−４０ＥＣにＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化していない吸着剤である吸着剤Ａ０にＮＨＤＦ細胞および２１０２Ｅｐ細胞の混合細胞液を通液した場合、ＮＨＤＦ細胞および２１０２Ｅｐ細胞の両者共に吸着剤に結合せず素通りするために流出率が高くなり、細胞が選択的に吸着分離できないことが確認された。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が、水に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする、細胞の吸着剤。
   （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
   （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に結合性を有するタンパク質。
2. 水に不溶性の担体に、親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤。
3. 水に不溶性の担体の、水に膨潤させた状態での粒径が、１００μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着剤。
4. 以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を含む工程からなることを特徴とする、請求項１から３に記載の吸着剤の製造方法：
   （Ａ）水に不溶性の担体に親水性高分子を共有結合で固定する工程、
   （Ｂ）工程（Ａ）で得られた親水性高分子を共有結合で固定した担体に、請求項１の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化するための官能基を導入する工程、
   （Ｃ）工程（Ｂ）で得られた官能基を導入した担体に、請求項１の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を固定化する工程。
5. 請求項１から３に記載の吸着剤と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞を含む細胞混合物とを接触させる工程と、
   吸着剤に結合した「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する細胞混合物中の細胞と、吸着剤に結合しない細胞混合物中の細胞とを分離する工程を含む工程からなることを特徴とする、細胞の分離方法。
6. 請求項５に記載の方法において、吸着剤を充填してなるカラムを用いることを特徴とする、細胞の分離方法。
7. 請求項５または６に記載の方法により、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」を有する未分化細胞と分化細胞を含む細胞混合物から、未分化細胞を分離して分化細胞を精製する方法。
8. 請求項１から３に記載の吸着材を充填してなるカラム。

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