JPWO2014148562A1 - がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.がん細胞の培養上清の存在下でiPS細胞を培養すること含む、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法。
2.iPS細胞がヒト由来である、前記1に記載の方法。
3.2週間〜2ヶ月間培養を行う、前記1または2に記載の方法。
4.得られた細胞集団ががん細胞を含む、前記1〜3のいずれかに記載の方法。
5.前記1〜4のいずれかに記載の方法により得られた細胞集団。
6.前記5に記載の細胞集団中のがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞を得る方法。
7.前記6に記載の方法より得られたがん幹細胞。
8.がん治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)前記5に記載のがん幹細胞を含む細胞集団または前記7に記載のがん幹細胞と、がん治療薬の候補物質とを接触させる工程、および
(2)前記細胞集団または細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。
9.前記細胞集団または細胞の増殖を阻害する候補物質を選択する工程をさらに含む、前記8に記載の方法。
10.前記5に記載のがん幹細胞を含む細胞集団と、がん治療薬の候補物質とを接触させる、前記8または9に記載の方法。
11.ヒアルロン酸の存在下でCD44発現細胞を含む細胞集団を非接着培養にて培養すること含む、CD44発現細胞の濃縮方法。
12.細胞集団がヒト由来である、前記11に記載の方法。
13.2〜20日間培養を行う、前記11または12に記載の方法。
14.前記11〜13のいずれかに記載の方法によりCD44発現細胞が濃縮された細胞集団。
iPS細胞は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル由来の細胞が挙げられる。iPS細胞は、好ましくは霊長類または齧歯類由来であり、さらに好ましくはヒトまたはマウス由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。iPS細胞としては、iPS-MEF-Ng-20D17、iPS-MEF-Ng-178B-5、iPS-MEF-Fb/Ng-440A-3、iPS-MEF-Ng-492B-4、iPS-Stm-FB/gfp-99-1、iPS-Stm-FB/gfp-99-3、iPS-Hep-FB/Ng/gfp-103C-1、iPS-L1、iPS-S1、253G1、409B2、454E2、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A、Nips-B2などを用いることができる。
CD44は、1回膜貫通型糖蛋白質ヒアルロン酸レセプターであり、グリオーマ等のがん細胞の表面に特異的に高発現し、ヒトすい臓がん、前立腺がん、乳がんなどのがん幹細胞マーカーであることが知られている。CD44は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の配向性制御(細胞遊走、浸潤)などの機能を有する。
(1)マウスiPS細胞の培養
マウスiPS細胞(iPS-MEF-Ng-20D17、理研セルバンクより購入)はDMEM培地 (15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 1000U/ml LIF, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)をもちい37℃、5%CO2下、MEF細胞上で培養維持した。本実験に用いたマウスiPS細胞は、未分化状態ではGFP遺伝子を安定に発現し、分化すると発現しなくなる(Okita, K. et al. Nature 448: 313-317 (2007)、参照により本明細書に含まれる)。
マウスルイス肺がん細胞株LLC細胞は10%血清を含むDMEM培地で培養した。マウス胚性癌腫細胞P19-CL6細胞は10%血清を含むαMEM培地(10%FCS, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)で培養した。マウス悪性黒色腫細胞B16-F10細胞、及び乳がん細胞BALB MC.E12細胞は10%血清を含むMEM培地(10%FCS, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)で37℃、5%CO2下で培養した。各々の細胞をコンフルエント状態まで培養し、その培養上精を回収、0.45μmのフィルターをもちいて濾過し、コンディションドメディウムとした。
7x105個のマウスiPS細胞を60mm径のゼラチンコートディッシュに播種しなおし、DMEM培地 (15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)で培養した。細胞を播種した翌日より毎日、培地の半量を各種がん細胞より調整したコンディションドメディウムに置き換え4週間培養した。マウスiPS細胞に増殖が確認された場合はトリプシン処理により細胞を回収し、7x105個の細胞をDMEM培地 (15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)を用いて、新しい60mm径のゼラチンコートディッシュに播種しなおし、8時間後に当量のコンディションドメディウムを加え培養を継続した。本培養を4週間継続した。誘導後の細胞はDMEM培地 (15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)で維持した。
0.4μg/ml マイトマイシンCを処理して増殖阻害を誘導した各種がん細胞(1.5x105個)を60mm径ゼラチンコートディッシュに播種し、翌日マウスiPS細胞(5x105個)を播種した。マウスiPS細胞の増殖が見られた場合は継代を行い、4週間誘導を行った。コントロールとして、フィーダー細胞であるMEF細胞と共培養したiPS細胞を用いた。
iPS細胞より誘導したがん幹細胞の造腫瘍能の評価はヌードマウス(Balb/c Slc-nu/nu 6-8週齢 メス)を用いて行った(図1)。4x106個のmiPS-LLCcm細胞を100μlのDMEM培地(10%血清を含む)に懸濁し、ヌードマウスの背中に皮下注射により移植した。4週間後、形成された腫瘍を切除し、10%中性ホルマリン緩衝液(和光純薬)で24時間固定後、パラフィン包埋し、3μmの厚さの切片を作成し、ヘマトキシリン/エオシン染色を行った。他の細胞についても同様に実験を行った。
c:共培養
腫瘍切片はキシレンを用いて脱パラフィン処理し、10mMクエン酸緩衝液(pH6)中で95℃5分加熱し、その後プロテアーゼK消化(37℃、30分)により抗原の賦活化を行った。抗GFP抗体(岡山大学佐藤あやの准教授より提供、1:200)、抗サイトケラチン抗体(抗pan-Cytokeratin(AE1/AE3)抗体、Santa Cruz社 1:200)、抗CD31抗体(Santa Cruz社 1:200)を用いて染色を行った。ビオチン化二次抗体(Vector社)、ABC reagent (Vector社)、DAB(Vector社)により発色させ、対比染色としてヘマトキシリン染色をおこなった。
1.4x105個のmiPS-LLCcm細胞をMatrigel(登録商標)(BD社)コートした8 ウェル チャンバースライド(BD社)に播種し、EGM2培地(Takara社)を用いて24時間培養し、血管管腔様構造を形成させた。その後、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、抗CD31抗体(Santa Cruz社 1:200)、Texas Red標識二次抗体をもちいて免疫染色を行った。DAPIにより細胞の核を染色し、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で観察した。
miPS-LLCcm細胞がヌードマウスに形成した腫瘍より公知の方法で初代培養を行い、miPS-LLCcm primary細胞を樹立した。この細胞は、GFP陽性の細胞とGFP陰性の細胞(GFP陽性細胞より分化した細胞と考えられる)を含んでいる。この細胞を、トリプシン処理により、単細胞まで分離し、2 x 104個/mlで非表面処理ディッシュに播種した(浮遊培養)。培地は、血清を含まないDMEM培地 ( 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)を使用した。培養は7〜10日行い、スフェロイドの形成を観察した。形成されたスフェロイドはGFP陽性であった。この結果は、スフェロイドは足場非依存的に、単一の細胞より形成され、且つ、未分化状態であることを示しており、miPS-LLCcm細胞の自己複製能を示すものである(図5)。スフェロイドをトリプシンにより単一細胞まで分離したのち、1x105個以上の細胞数でヌードマウスに移植すると、再び悪性腫瘍を形成した。その形態は、初代の腫瘍と同様の、GFP陽性細胞、CK陽性細胞、および両者が陰性の細胞からなり、新生血管に富んだものであった。(図6)。この結果は、miPS-LLCcm細胞は移植を繰り返しても形態的に同様の腫瘍を形成していることを示している。
上記(8)のスフェロイドより回収した細胞1x105個をヌードマウスの尾静脈より移植し、4週間後、肺に形成された腫瘍を観察した。その腫瘍より公知の方法で初代培養を行いmiPS-LLCcm LMT細胞を樹立した。この細胞は、DMEM培地 (15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有)で維持した。miPS細胞、miPS-LLCcmスフェロイド、miPS-LLCcm LMTスフェロイド、およびLLC細胞よりRNeasy kit (50) (QIAGEN)を使用しRNAを精製し、RT-PCRによりp53遺伝子およびMMP2遺伝子の発現量を比較した。
miPS細胞(フィーダー培養およびフィーダーレス培養)、miPS-LLCcm細胞、miPS-LLCcm primary細胞、およびmiPS-LLCcmスフェロイド、並びにそれらが形成するテラトーマおよび悪性腫瘍内での幹細胞マーカー遺伝子の発現を、RT-PCRによって確認した。RNeasy kit (50) (QIAGEN)(細胞からの精製)およびTRIzol(Invitrogen)(組織からの精製)を使用した。未分化マーカー遺伝子は Takahashi, Yamanakaの報告(Cell 126, 663-676, 2006、参照により本明細書に含まれる)に提示されているものを検証した。対照として、フィーダーに用いたMEF細胞の発現を確認した。その結果、本発明で得られた細胞群では、未分化マーカー遺伝子の発現が確認され、また、腫瘍においてもテラトーマと比較して発現が上昇しているものが多く見られた(図8)。
本実験で得た細胞集団について、RNeasy kit (50) (QIAGEN)を用いた方法、もしくはTRIzol (Invitorogen)を用いた方法でRNAを抽出した。その後、50μg以下のRNAに対してDNase I処理を行い、再度RNeasy kit (50) (QIAGEN) にて精製を行った。
(1)がん細胞の培養上清(コンディションドメディウム)の調製
表2に示すがん細胞株を、10% FBS,1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地あるいはRPMI1460培地で、接着培養用ディッシュ(直径100 mm, TPP社製)を用いて、37℃、5% CO2条件下で培養した。
ヒトiPS細胞(201B、RIKEN BRC)(Takahashi, K. et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872 (2007)、参照により本明細書に含まれる)をLaminin-5(リプロセル社製)コートしたディッシュ(直径60 mm, TPP社製)に播種し、5 ng/mlのbFGFを含むRepro FF2培地(リプロセル社製)を用いて、37℃、2% CO2条件下で培養した。フィーダレスで未分化安定状態になるまで、毎日、培地を全量交換し、継代は一週間で一回の頻度でおこなった。
がん細胞株から回収したそれぞれのコンディションドメディウムと、Repro FF2またはRepro stem(リプロセル社製)、もしくはbFGFを添加していないヒトiPS幹細胞用培地(NON-ESSENTIAL AMINO ACID、200 mM L-GLUTAMINE、KSR、および0.1M 2-MERCAPTOETHANOL/PBSを含むDMEM-F12培地)とを1:1の比で混合し、分化誘導培地とした。未分化で安定な状態のヒトiPS細胞にそれぞれの誘導化培地を曝露し、分化を誘導した。分化誘導中は毎日、半量の培地交換を行い、2週間に1〜2回の継代をおこなった。分化誘導期間は少なくとも28日間、長くとも2か月間とした。培養は37℃、2% CO2条件下でおこなった。
(1)概略
ヒトグリオーマ由来U251MG細胞を用いた実験の概略を図19に示した。通常の接着系ディッシュ上で培養した細胞を継代する際、ヒアルロン酸(HA)を添加した培地中に移して非接着系ディッシュで培養し、さらに継代して非接着系ディッシュ上で細胞塊を作製した。細胞塊をヌードマウスに接種して担がんを作製した後、接着系ディッシュ上で初代培養(U251MG-P1とした)を行った。初代培養細胞を再びHA添加培地に継代して非接着ディッシュ上で培養した。
ヒトグリオーマ由来A172細胞およびU251MG細胞、並びにU251MG-P1細胞をそれぞれ非接着ディッシュ上でHAを添加した培地(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム(和光純薬社製 ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製)、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM)上と添加していない通常の培地(10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM)上で2〜5日間培養した。HAを添加しない場合には殆ど細胞が増殖しなかったが(図20にはU251MG-P1の結果のみを示した)、HAを添加した場合には細胞の密度が濃い部分が形成され、一部では細胞塊が形成された(図20.各右端)。またこれらの細胞は通常の接着系ディッシュ上では増殖が認められたので用いた細胞の状態は良好であると考えられた(図20.各左端)。
HA添加培地で作製したA172細胞、U251MG細胞、およびU251MG-P1細胞の細胞塊をAccutase溶液(Sigma-Aldrich社製)で懸濁して細胞を分散させた後、それぞれを再びHA添加培地、非接着系ディッシュ上で2週間培養した(図23)。いずれの細胞も再び細胞塊を形成し、細胞塊の周辺にはディッシュ表面に接着した細胞が観察され、細胞塊の自己複製能があることが示された。
A172細胞、U251MG細胞、およびU251MG-P1細胞を接着系ディッシュおよび通常培地上または非接着系ディッシュおよびHA添加培地上でそれぞれ培養した細胞からRNAを抽出し、CD44遺伝子発現量をqPCR法によって解析した(図24−1〜図24−3)。U251MG細胞とU251MG-P1細胞は、非接着系ディッシュおよび通常培地上で培養した細胞からもRNA抽出と比較を行った。
HA添加培地で5日間培養した後、スフェロイド培養(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウムおよびITS(Sigma-Aldrich社製)を添加した培地での培養)を2週間、非接着系ディッシュ(直径10 mm, 培地量10 ml)で行い、U251MG細胞をヌードマウスBalb/c-nu/nu、メス、4週齢に移植して4週間観察した(図26)。1〜3枚のディッシュから集めた細胞をそれぞれマウスの左腹部に移植した。右腹部には通常培養したU251MG細胞を107個、それぞれ移植した。ディッシュ2枚以上から集めた細胞の移植によって担がんが形成された。107個の細胞を移植後40日目の腫瘍体積(腫瘍短辺2x腫瘍長辺)/2)は、1642.8 mm3 (n=2)であった。通常培養したU251MG細胞では同条件で同細胞数を移植しても腫瘍が形成されなかったことから、本発明の方法により得られた細胞集団は腫瘍形成能を有していることが示された。
A172細胞およびU251MG細胞それぞれを、接着系ディッシュおよび通常培地上(A)、非接着系ディッシュおよび通常培地上(N)、および非接着系ディッシュおよびHA添加培地上(H)で培養し、CD44タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法によって比較した(図27)。細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動し、1次抗体として抗CD44マウスモノクローナル抗体(片山化学社製)およびHRP標識抗マウスIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いた。また、抗β−アクチン抗体(CSTジャパン社製)とHRP標識抗ラビットIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いて、構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。
U251MG-P1細胞がグリオーマ由来の細胞であることを確認するため、接着系ディッシュおよび通常培地上で、U251MG細胞、U251MG-P1細胞、およびU251MG-P2細胞(U251MG-P1細胞をヌードマウスに移植し、担がんを摘出して初代培養した細胞)を培養して、アストロサイトのマーカータンパク質であるGFAPタンパク質をウエスタンブロッティング法で検出した(図28)。また、GFAPを発現していない細胞(ヒト卵巣がん由来SkOv-3細胞)から抽出したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。それぞれの細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動して、抗GFAP抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)とHRP標識抗マウスIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いて検出した。構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。
SkOv-3細胞およびSkOv-3-P1細胞(SkOv-3細胞をマウスに接種後に担がんを摘出して初代培養した細胞)それぞれを、U251MG細胞と同様に、非接着ディッシュおよびHA添加培地(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム(和光純薬社製 ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製)、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640)上、または非接着ディッシュおよび通常培地(10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640)上で4日間培養した(図29)。
Claims (14)
- がん細胞の培養上清の存在下でiPS細胞を培養すること含む、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法。
- iPS細胞がヒト由来である、請求項1に記載の方法。
- 2週間〜2ヶ月間培養を行う、請求項1または2に記載の方法。
- 得られた細胞集団ががん細胞を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の方法により得られた細胞集団。
- 請求項5に記載の細胞集団中のがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞を得る方法。
- 請求項6に記載の方法より得られたがん幹細胞。
- がん治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)請求項5に記載のがん幹細胞を含む細胞集団または請求項7に記載のがん幹細胞と、がん治療薬の候補物質とを接触させる工程、および
(2)前記細胞集団または細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。 - 前記細胞集団または細胞の増殖を阻害する候補物質を選択する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 請求項5に記載のがん幹細胞を含む細胞集団と、がん治療薬の候補物質とを接触させる、請求項8または9に記載の方法。
- ヒアルロン酸の存在下でCD44発現細胞を含む細胞集団を非接着培養にて培養すること含む、CD44発現細胞の濃縮方法。
- 細胞集団がヒト由来である、請求項11に記載の方法。
- 2〜20日間培養を行う、請求項11または12に記載の方法。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の方法によりCD44発現細胞が濃縮された細胞集団。
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