JP5669081B2 - 生体分子固定化担体および生体分子担体固定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体分子を固定化した担体および生体分子を担体に固定化する方法に関し、特に、生体分子および／または膜接着分子固定化磁性微粒子、前記生体分子および／または前記膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体ならびに生体分子の分離剤に関する。

磁性微粒子は磁気により回収することができるため、従来、この磁性体微粒子に酵素や抗体等の生体分子を固定する試みがなされている。例えば、特開平１０−７５７８０号公報や特開平１１−２４３９５１号公報には、化学的手法により酵素を直接的に固定した磁性体微粒子が開示されている（特許文献１および２）。また、特開２００５−２８９８２２号公報には、ペプチドがアンカリングされた磁性細菌由来の膜融合型磁気微粒子（マグネトソーム）が開示されており（特許文献３）、特開２００６−７５１０３号公報には、アンカータンパク質Ｍｍｓ１３とＩｇＧ結合ペプチドとの融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現させた磁性細菌由来の膜融合型マグネトソームが開示されている（特許文献４）。

一方、細胞接着性を有するポリペプチドが従来いくつか知られており、例えば、細胞外糖鎖であるシンデカン結合ラミリン由来ポリペプチド（非特許文献１）、インテグリンリガンド配列であるフィブロネクチン由来Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＤＧ）トリペプチド配列（非特許文献２）、あるいは、細胞膜接着性を有するポリペプチドとして、ヘリコバクター・ピロリ由来のα１，３−フコース転移酵素およびα１，４−フコース転移酵素のＣ末端側に存在するポリペプチド（非特許文献３および４）を挙げることができる。このヘリコバクター・ピロリ由来のα１，３／α１，４−フコース転移酵素Ｃ末端ポリペプチドは、αーヘリックス構造をとって細胞膜に接着することが知られている（非特許文献３）。

特開平１０−７５７８０号公報 特開平１１−２４３９５１号公報 特開２００５−２８９８２２号公報 特開２００６−７５１０３号公報

Pierschbacher, M. et al. 1984, Nature, 309, 30-33 望月麻友美、門谷裕一、野水基義、2005. 蛋白質核酸酵素, 50, 374-382 J. Biol. Chem. 2003, 278, 21893-21900 J. Biol. Chem. 2007, 282, 9973-9982

しかしながら、特許文献１や特許文献２において開示された磁性微粒子は、化学的手法を用いているため、固定化反応時に酵素が失活してしまう虞がある他、繰り返しの使用について具体的に示されておらず、その耐久性や生体分子の活性持続性が疑問視される。また、分子の配向を制御することが極めて困難である。

また、特許文献３や特許文献４おいて開示された磁気微粒子では、アンカータンパク質として極めて疎水性が高い膜貫通型ペプチドが用いられており、さらに、特許文献３では、磁気微粒子上にアンカリングされる有用タンパク質として、酵素等の生体分子を用いた磁気微粒子の成功例について開示されておらず、特許文献４では、膜貫通型ペプチドと目的タンパク質とを融合タンパク質として発現させるため、不溶化や凝集が起こりやすいといった問題がある。そこで、高濃度の界面活性剤を用いて処理をすることにより可溶化させて凝集を防止する必要があるが、界面活性剤により酵素等が失活してしまい、酵素等の活性を保持した状態でこの磁気微粒子を用いるのは困難である。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ヘリコバクター・ピロリ由来フコース転移酵素Ｃ末端ポリペプチドを含む膜接着ペプチドを有する生体分子やこの膜接着ペプチドと種々の生体分子とを有する膜接着分子を固定化させてなる生体分子を固定化した担体および生体分子を担体に固定化する方法、特に生体分子固定化磁性微粒子、前記生体分子および／または前記膜接着分子をプローブとしたプローブ固定化担体ならびに生体分子固定化磁性微粒子を応用してなる生体分子の分離剤を提供することを目的としている。

本発明者等は、上記既知のヘリコバクター・ピロリ由来α１，３／α１，４−フコース転移酵素Ｃ末端ポリペプチドが有する、細胞膜に強固に接着する特性、電荷が高いゆえに水溶性溶媒に可溶化である特性および細胞膜接着時にα−ヘリックス構造をとる特性から、リン脂質を含む有機膜（生体膜、生体膜模倣膜）にも同様に強固に接着するとともにα−ヘリックス構造による分子配向の制御が可能であることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 配列番号１に示すアミノ酸配列および配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列のいずれかを含む膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子を、リン脂質を含む有機膜で被覆された担体に接着させてなる、生体分子固定化担体。
［２］ 前記担体が磁性微粒子、もしくは前記膜接着ペプチドを有する生体分子および／または前記膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体である、［１］に記載の生体分子固定化担体。
［３］ 前記生体分子が酵素または糖鎖である、［１］または［２］に記載の生体分子固定化担体。
［４］ 前記酵素が糖転移酵素または糖加水分解酵素である、［３］に記載の生体分子固定化担体。
［５］ 配列番号１に示すアミノ酸配列および配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列のいずれかを含む膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子を、リン脂質を含む有機膜で被覆された磁性微粒子に接着させてなる、生体分子の分離剤。
［６］ 担体に生理活性を保持した状態で生体分子を直接または間接に固定化する方法であって、担体に固定するための固定リガンドをリン脂質に修飾するリン脂質修飾ステップと、前記固定リガンドを修飾したリン脂質を用いて担体表面に有機膜を形成して被覆させる担体被覆ステップと、配列番号１に示すアミノ酸配列および配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列のいずれかを含む膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または前記膜接着ペプチドをリンカーとして融合ないし結合した生体分子を前記有機膜に接着させる接着ステップとを有する生体分子担体固定化方法。

本発明によれば、耐久性に優れ、生体分子の活性を保持した状態で配向の制御が可能であり、膜接着分子が可溶化性を有するために取り扱い易い生体分子固定化担体、特に、生体分子固定化磁性微粒子および前記膜接着ペプチドを有する生体分子および／または前記膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体を提供することができ、また、生体分子固定化磁性微粒子を応用してなる生体分子の分離剤を提供することができる。さらに、生体分子担体固定化方法を提供することができる。

実施例１（２）における生体膜摸倣磁性微粒子の作製工程を示す図である。 実施例１（２）において、膜接着ペプチドを介してフコース転移酵素を生体膜摸倣磁性微粒子に固定化して、フコース転移酵素固定化磁性微微粒子を作製する工程を示す図である。 実施例１（３）［３−１］のラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）に対するフコース転移反応の検討において、フコース転移酵素の活性測定を糖質分析装置にて行ったクロマトグラフであり、図中、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、反応時間を各々５，１５，３０，６０分で行った時のクロマトグラフを示す。 実施例１（３）［３−１］のラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）に対するフコース転移反応の検討において、フコース転移酵素の活性測定を糖質分析装置にて行ったクロマトグラフのデータをグラフに表した図である。 実施例１（３）［３−２］のＯ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討における反応工程を示す図である。 実施例１（３）［３−２］のＯ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討において、反応後のＯ−結合型糖アミノ酸をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ａ；Ｒ＝Ｈ）を用いて測定したスペクトルチャート、（ｂ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ｂ；Ｒ＝ＣＨ_３）を用いて測定したスペクトルチャートである。 実施例１（３）［３−２］のＯ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討において、反応前後のＯ−結合型糖アミノ酸をＲＰ−ＨＰＬＣにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ａ；Ｒ＝Ｈ）をフコース転移反応前に測定したスペクトルチャート、（ｂ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ｂ；Ｒ＝Ｈ）をフコース転移反応後に測定したスペクトルチャート、（ｃ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ａ；Ｒ＝ＣＨ３）をフコース転移反応前に測定したスペクトルチャート、（ｄ）はＯ−結合型糖アミノ酸（１ｂ；Ｒ＝ＣＨ_３）をフコース転移反応後に測定したスペクトルチャートである。 実施例１（３）［３−３］のＮ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討における反応工程を示す図である。 実施例１（３）［３−３］のＮ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討において、反応前後のＮ−結合型糖アミノ酸をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）はフコース転移反応前に測定したスペクトルチャート、（ｂ）はフコース転移反応後に測定したスペクトルチャートである。 実施例１（４）のフコース転移酵素固定化磁性微粒子の繰り返し使用の検討において、フコース転移酵素の活性測定を糖質分析装にて行ったクロマトグラフである。図中、（ａ）〜（ｅ）は、使用回数が１〜５回目のクロマトグラフである。 実施例１（４）のフコース転移酵素固定化磁性微粒子の繰り返し使用の検討において、フコース転移酵素の活性測定を糖質分析装置にて行ったクロマトグラフのデータをグラフに表した図である。 実施例１（５）のフコース転移酵素固定化磁性微粒子の遊離実験における工程を示す図である。 実施例１（５）のフコース転移酵素固定化磁性微粒子の遊離実験において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色した結果を示す写真図である。 実施例２（２）のフコース転移酵素非特異的吸着ウェルおよびフコース転移酵素固定化マイクロアレイのＯ−結合型４糖アミノ酸に対するフコース転移反応の検討において、反応後のＯ−結合型５糖アミノ酸をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）はフコース転移酵素非特異的吸着ウェルについてのスペクトルチャート、（ｂ）はフコース転移酵素固定化マイクロアレイについてのスペクトルチャートである。 比較例１（２）において、非特異的にシアリダーゼが吸着した磁性微粒子を繰り返し使用してシアリダーゼの活性測定を糖質分析装置にて行った結果を示す図である。 実施例３おいて、水溶液中の膜接着ペプチドを円二色性（ＣＤ）分析した結果を示す図である。 実施例３おいて、膜構造を模倣したミセル中の膜接着ペプチドを円二色性（ＣＤ）分析した結果を示す図である。 実施例４（１）におけるソルテースＡ（ＳｒｔＡ）を用いた膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴの調製工程を示す図である。 実施例４（４）のマルトース結合タンパク融合ガラクトース転移酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）固定化磁性微粒子の活性測定において、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチルグルコサミン（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ）のガラクトース転移反応後にＲＰ−ＨＰＬＣにて測定したペクトルチャートである。図中、（ａ）はＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子を用いて測定したスペクトルチャート、（ｂ）はＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を用いて測定したスペクトルチャートである。 比較例２（１）において、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンの調製工程を示す図である。 比較例２（２）のＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンを繰り返し使用してガラクトース転移酵素活性を行った結果を示す図である。 実施例５（２）の膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの生成工程を示す図である。 実施例５（４）のＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子およびＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子における膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したペクトルチャートである。図中、（ａ）はＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子を用いて測定したスペクトルチャート、（ｂ）はＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を用いて測定したスペクトルチャートである。 実施例６のＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を用いた抗体分離剤としての検討において、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子と生体膜摸倣磁性微粒子とＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子との、アッセイキットによる発色を示す写真図である。図中、（ａ）は生体膜摸倣磁性微粒子を用いた場合、（ｂ）はＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子を用いた場合、（ｃ）はＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を用いた場合を示す。 実施例７（２）で作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイを示す写真図である。 実施例７（２）で作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイにおいて、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。 実施例９（３）の遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴとＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子との活性測定において、反応後の４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）は遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴについてのスペクトルチャート、（ｂ）はＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子についてのスペクトルチャートである。 実施例１０（４）のｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子とｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子との活性測定において、反応後のＮ−アセチルガラクトサミンが１つ転移した化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートである。図中、（ａ）はｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子についてのスペクトルチャート、（ｂ）はｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子についてのスペクトルチャートである。

以下、本発明に係る生体分子固定化坦体および生体分子担体固定化方法について詳細に説明する。

本発明に係る生体分子固定化担体は、配列番号１に示すアミノ酸配列および配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列のいずれかを含む膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子を、リン脂質を含む有機膜で被覆された担体に接着させてなる。

この配列番号１に示すアミノ酸配列および配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列のいずれかを含む膜接着ペプチドは、水性溶媒中でいわゆるランダム構造をとって可溶化し、中性かつリン脂質存在下においてα−ヘリックス構造をとるという可逆性を有している。すなわち、中性条件下において、α−ヘリックス構造をとりつつ有機膜に接着するが、これをｐＨ１０程度のアルカリ条件にすることでランダム構造をとり、有機膜から脱離する。また、単にｐＨを下げて中性に戻すのみでは、再びα−ヘリックス構造に戻ることはなく、リン脂質存在下において再びα−ヘリックス構造をとるようになることが発明者等により明らかにされている。

膜接着ペプチドの立体構造解析を行う場合、その方法は特に限定されないが、本発明に係る実施形態においては、円二色性（円偏光二色性；ＣＤ）を測定する方法により立体構造解析を行っている。

本発明にいう「接着」とは、一般には、くっつけることやくっつくこと、二つの物体の表面どうしが接触し、離れなくなることをいう（三省堂「大辞林 第二版」）が、本発明においては「固定」や「固定化」と置換可能に用いられる。すなわち、膜接着ペプチドの膜接着部位と有機膜の表面とが接触してくっつく場合の他、例えば、膜接着部位が有機膜に入り込み、あるいは貫通して、本発明における膜接着ペプチドの膜接着部位と有機膜とが離れなくなる場合等をも含む趣旨である。

また、本発明にいう「膜接着ペプチドを有する」とは、膜接着ペプチドが膜接着能を有する膜接着部位の一部となる場合のみならず、膜接着ペプチドが膜接着部位の全部となる場合をも含む意味である。また、例えば、ヘリコバクター・ピロリ由来フコース転移酵素のように、生体分子が膜接着ペプチドを生来有する場合の他、例えば、マルトース結合タンパク融合ガラクトース転移酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）、Ｏ−結合型糖ペプチドあるいはＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２）等に膜接着ペプチドを融合ないし結合させてなる膜接着分子のように、生体分子に膜接着ペプチドを融合ないし結合させることにより生体分子が膜接着ペプチドを有する場合がある。

本発明における生体分子は、膜接着ペプチドを生来有する分子または膜接着ペプチドと融合ないし結合することができる分子であって、かつ生体内で合成、代謝、蓄積される分子であれば特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、ペプチド、酵素、レセプター、糖化合物（単糖、オリゴ糖、多糖、糖鎖複合体、糖タンパク質、糖脂質、およびそれら誘導体等）、脂質（脂肪酸、リン脂質、糖脂質、グリセリド等）、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、ウイルス、天然低分子（ホルモン分子や抗生物質、毒物、ビタミン類、生理活性物質、二次代謝産物等）、合成低分子（天然低分子の合成物、およびそれら誘導体等）等を挙げることができる。本発明に係る実施形態においては、酵素や糖鎖を好適な生体分子として用いており、さらに糖転移酵素や糖加水分解酵素を好適な酵素として用いている。

本発明における膜接着分子は、膜接着ペプチドと生体分子とを有しており、この膜接着ペプチドと生体分子との独立した２つの物質が融合ないし結合した分子である。なお、この場合の生体分子は、膜接着ペプチドを有していて１つの物質である場合がある。

本発明における膜接着分子は、膜接着ペプチドの膜接着能や生体分子の機能を損なわないのであれば、その構成として他の物質を含んでも、あるいは含まなくてもよい。なお、本発明に係る実施形態においては、膜接着ペプチドと生体分子との間にＨｅｐｔａｄ Ｒｅｐｅａｔと呼ばれる（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ）の７残基からなる繰り返し配列や、（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）の５残基からなる配列を有している場合がある。

本発明における膜接着分子は、遺伝子組み換え技術や酵素反応にて、あるいはリンカー等を用いて膜接着ペプチドと生体分子とを融合ないし結合させて調製することができる。例えば、生体分子がタンパク質の場合、遺伝子組み換え技術を用いて膜接着ペプチドと生体分子とを融合させて膜接着分子として発現させることで調製すること、あるいは酵素等を用いて膜接着ペプチドとタンパク質とを融合ないし結合させて調製すること等が可能である。例えば、アミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）を有するペプチドとアミノ酸配列ＧＧＧ（Ｇｌｙ−Ｇｉｙ−Ｇｌｙ；トリグリシン）を有するペプチドとを結合させる性質を有する酵素であるソルテースＡ（ＳｒｔＡ）等を用いて調製することができる。

また、例えば、生体分子が糖鎖である場合、遺伝子組み換え技術により、膜接着ペプチドをコードする配列に糖鎖付加のためのコンセンサス配列を連結し、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞ないし酵母細胞等の糖鎖付加能を有する細胞において発現させることにより糖ペプチドとして膜接着ペプチドを調製すること、あるいは好適なリンカーを用いて膜接着ペプチドと糖鎖とを融合ないし結合させて調製すること等が可能である。

本発明における生体分子および膜接着分子は、アルカリ性条件下において、リン脂質を含む有機膜で被覆された坦体から遊離し、中性かつリン脂質存在下において再び固定化が可能なものであり、これを繰り返しても膜接着ペプチドの分子の接着性、酵素活性あるいは糖鎖の機能は保持される。

精製により生体分子や膜接着分子を得る場合、その精製方法としては、当業者により適宜選択することができる方法であれば特に限定されず、各種クロマトグラフィーや質量分析等のあらゆる方法を適用することができる。本発明に係る実施形態においては、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）が用いられている。

本発明におけるリン脂質とは、分子内にリン酸基とアシル基および／またはアルキル基からなる疎水基を２以上有するものをいい、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンまたはこれらの誘導体の１または２以上の混合物等を挙げることができる。本発明に係る実施形態においては、ホスファチジルコリンを好適なリン脂質として用いている。

また、本発明におけるリン脂質を構成する脂肪酸は特に限定されないが、例えば、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−およびγ−リノレイン酸、エルシン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸等の飽和または不飽和脂肪酸を挙げることができる。

ここで、本発明における「リン脂質を含む有機膜」とは、例えば、担体に固定化するための固定リガンドをリン脂質に修飾（結合）したものが担体に結合されて形成される有機膜（生体膜模倣膜）のみならず、例えば、リン脂質を含むポリマーを形成させて吸着させることにより形成される有機膜（生体膜模倣膜）や、リン脂質がそのまま担体に結合することにより形成される有機膜（生体膜模倣膜）をいう。換言すれば、リン脂質が有機膜（生体膜模倣膜）の一部を構成する場合のみならず、リン脂質が有機膜（生体膜模倣膜）の全部を構成する場合をも含むことを意味する。

前記固定リガンドをリン脂質に修飾する場合、この固定リガンドはリン脂質や担体に応じて適宜選択することができるが、例えば、リン脂質のアシル基および／またはアルキル基の末端に修飾（結合）可能なチオール基、エポキシ基、トシル基、活性化エステル、アミノ基、ブロモアセトアミド等を挙げることができる。また、前記リン脂質を含むポリマーを用いる場合、担体に応じて適宜選択することができるが、例えば、ホスホコリン基を分散させたメタクリレートポリマー等を挙げることができる。なお、本発明に係る実施形態においては、ホスファチジルコリンを好適なリン脂質として用い、ホスファチジルコリンのアルキル基の末端に修飾（結合）可能なチオール基を好適な固定リガンドとし、これを担体に結合させて有機膜（生体膜模倣膜）を形成している。

本発明における担体は、リン脂質を含む有機膜で被覆することができるものであれば、適宜目的に応じて選択することができるが、例えば、磁性微粒子、スチレン系重合性モノマー、アクリル系重合性モノマー、メタクリル系重合性モノマーおよびビニル系重合性モノマー等の重合性モノマーが重合されてなる有機高分子化合物、金属酸化物、金属、半導体化合物、アガロース、セファロース、木板、ガラス板、シリコン基板、木綿布、レーヨン布、アクリル布、絹布、ポリエステル布、上質紙、中質紙、アート紙、ボンド紙、再生紙、バライタ紙、キャストコート紙、ダンボール紙、レジンコート紙等を挙げることができる。本発明に係る実施形態においては、磁性微粒子や有機高分子化合物（プラスチック基板）、ガラス基板を好適な担体として用いている。

本発明において磁性微粒子を担体として用いる場合、磁性微粒子は適宜選択して使用することができるが、例えば、金属または酸化物のものを挙げることができ、化学的に安定である鉄酸化物のフェライト微粒子やマグネタイト微粒子、マグヘマイト微粒子等を挙げることができる。さらに、Ａｇ、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｙ、ＳｍおよびＺｎ等の元素を含有し、目的に応じて適正に選択できるものであってもよい。なお、本発明に係る実施形態においては、フェライト微粒子である銀被覆磁性微粒子を好適な磁性微粒子として用いている。また、磁性微粒子の粒径は特に限定されないが、１０ｎｍ 〜 ５００ｎｍであることが好ましい。

本発明に係る生体分子固定化磁性微粒子は、膜接着ペプチドを有する生体分子および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子と、リン脂質を含む有機膜で被覆された磁性微粒子とから構成されている。詳細には、膜接着ペプチドの接着性や生体分子の機能を保持した状態で、生体分子および／または膜接着分子が磁性微粒子を被覆する有機膜に固定化されている。生体分子および／または膜接着分子の配向を制御することも可能である。生体分子の活性を保持し、かつ磁気により回収することができることから、様々な用途に用いることができる。なお、本発明に係る実施形態においてはマイクロアレイや生体分子の分離剤を構成するものとして用いている。

本発明に係る膜接着ペプチドを有する生体分子および／または膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体は、生体分子および／または膜接着分子であるプローブとリン脂質を含む有機膜で被覆された担体とから構成されている。詳細には、生体分子および／または膜接着分子が坦体を被覆する有機膜に固定化されており、生体分子および／または膜接着分子がプローブとしての機能を有している。

本発明において膜接着ペプチドを有する生体分子および／または膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体の担体は、リン脂質を含む有機膜で被覆する担体にプローブが固定され、かつこのプローブ固定化担体を用いて標的物質を検出あるいは分離するのに支障のないものであれば、例えば上記記載の担体等を適宜選択して用いることができるが、好適には、固相担体を挙げることができ、マイクロアレイの場合であれば、標的物質の検出や汎用性の観点から、ガラス基板やプラスティック基板が好ましく、さらにはアルカリ成分などが含まれない無アルカリガラス基板や石英基板がより好ましい。本発明に係る実施形態においては、９６穴プレートおよびスライドガラス嵌め込み型のＭＴＰ−Ｓｌｉｄｅ−ＡｄａｐｔｏｒＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いている。

本発明において酵素を生体分子として用いる場合の酵素は特に限定されないが、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ等を挙げることができる。本発明においては転移酵素または加水分解酵素が好ましく、糖転移酵素または糖加水分解酵素がより好ましい。また本発明においては任意の糖転移酵素を用いることができるが、例えば、フコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、シアリダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、β−グルクロニルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ等を挙げることができる。本発明に係る実施形態においては、フコース転移酵素、マルトース結合タンパク融合ガラクトース転移酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２）およびシアリダーゼを用いている。

また、本発明における糖鎖は特に限定されないが、Ｏ−結合型糖鎖、Ｎ−結合型糖鎖、およびＯ−結合型とＮ−結合型との組み合わせからなる糖鎖のいずれであってもよい。ここで、Ｏ−結合型糖鎖とは、タンパク質の一次構造に存在するセリン残基、またはスレオニン残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称するものである。例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒのＯＨ基にＧａｌＮＡｃがＣ−Ｏ結合を介して結合した糖鎖を挙げることができる。また、Ｎ−結合型糖鎖とは、タンパク質の一次構造に対するアスパラギン残基に結合したＮ−アセチルガラクトサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称するものである。例えば、Ａｓｎ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のＡｓｎのＮＨ_２基にＣ−Ｎ結合を介して結合したＧｌｃＮＡｃを還元末端とする糖鎖を挙げることができる。

また、本発明に係る生体分子担体固定化方法は、膜接着ペプチドをリンカーとして融合ないし結合した生体分子を、リン脂質を含む有機膜に生理活性を保持した状態で生体分子を直接または間接に固定化する方法であり、より詳細には、膜接着ペプチドの親水性アミノ酸側鎖と有機膜の親水基とを接触させることにより、膜接着ペプチド（生体分子が有する場合がある）と有機膜（生体膜模倣膜）とを介して生体分子を有機膜に固定化させる方法である。本発明者等は、鋭意研究の結果、当該膜接着ペプチドがα−ヘリックス構造をとり一定方向に親水性アミノ酸側鎖が配向すること、坦体を被覆する当該有機膜の親水基が表面方向に配向した状態となること、そして、膜接着ペプチドの親水性アミノ酸側鎖と有機膜の親水基とが結合することによって、生体分子を配向制御して有機膜（生体膜、生体膜模倣膜）に固定化させることができるとの知見を得、本発明に係る生体分子担体固定化方法を完成したのである。

本発明に係る生体分子担体固定化方法を用いて、膜接着ペプチド（生体分子が有する場合がある）と有機膜（生体膜模倣膜）とを介して生体分子を有機膜に固定することにより、生体分子の配向を制御することができるとともに、生理活性を保持した状態で有機膜に固定化することができ、固定化してできた物質を繰り返し使用した場合でも生体分子の生理活性が失われないという効果を奏することができる。また、リン脂質を含む有機膜は、あらゆる坦体に容易に被覆させて形成することができるため、本発明に係る生体分子担体固定化方法により、各種生体分子と各種坦体とのあらゆる組み合わせの膜接着分子固定化坦体を製造することが可能となる。

一方、本発明に係る膜接着分子のｉｎ ｖｉｖｏ製造方法は、
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするプライマーを設計してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ断片増幅工程、
(ii)生体分子を発現するベクターを構築する生体分子発現ベクター構築工程、
(iii)ＤＮＡ断片と生体分子発現ベクターとから膜接着分子を発現するベクターを構築する膜接着分子発現ベクター構築工程、
(iv)膜接着分子発現ベクターを導入して発現細胞株を作製する発現細胞株作製工程、
(v)発現細胞株を培養して膜接着分子を回収する膜接着分子回収工程。
以上各工程(i)〜(v)を有している。

工程(i)のＤＮＡ断片増幅工程とは、常法に従って配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするプライマーを設計し、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡ断片を増幅する工程である。例えば、プライマーのアリーニング部位を絞り込み、ターゲット領域の配列を用いてＢｌａｓｔサーチを行い、ダウンロードした配列の相同性解析を行ってプライマーを設計し、プライマーの確認を行ってＰＣＲを行う等の手法が挙げられる。なお、ＰＣＲの効率等を考慮すれば、ＤＮＡ断片は約５００ 〜 １０００塩基程度が増幅サイズとして好適である。

目的とするＤＮＡ断片の塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）により確認することができる。また、自動塩基配列決定装置（例えば、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＰＲＩＳＭ ３７７もしくはＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＰＲＩＳＭ ３１０；いずれもＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）等を用いることができる。また、ＤＮＡ断片は、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）および／または終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。

工程(ii)の生体分子発現ベクター構築工程とは、常法に従って生体分子発現ベクターを構築する工程である。例えば、Ｂｅｒｇ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７２，６９，２９０４−２９０９に記載の方法に従って生体分子発現ベクターを構築することができる。ここで、本発明で用いられるベクターは当業者が適宜選択することでき、特に限定されないが、例えば、ｐＣＯＳ１、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ等を用いることができる。

また、生体分子発現ベクターの構築においては、常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・ポリペプチドチェーン・エロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ−１α）を用いることができる。ＨＥＦ−１αプロモーターを含有する発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Mizushima, S. et al. (1990) Nuc. Acid Res. 18, 5322）が挙げられる。また、遺伝子プロモーターとしては、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーターや、哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いることができる。

また、生体分子発現ベクターは選択マーカー遺伝子を含むことができる。例えば、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３’）IIまたはI（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等が挙げられる。

工程(iii)の接着分子発現ベクター構築工程とは、(i)の工程において増幅したＤＮＡ断片と(ii)の工程において構築した生体分子発現ベクターとを用いて、常法に従って膜接着分子発現ベクターを構築する工程である。例えば、工程(ii)と同様の手法により膜接着分子発現ベクターを構築することができる。

工程(iv)の発現細胞株作製工程とは、(iii)の工程において構築した膜接着分子発現ベクターを、常法に従い、細胞に導入して発現細胞株を作製する工程である。膜接着分子発現ベクターを導入する細胞は当業者が適宜選択することができ、動物細胞、大腸菌、酵母等、特に限定されないが、大腸菌が好ましい。細胞の具体的な例としては、例えば、ＪＭ１０９やＤＨ５α等を挙げることができる。なお、本発明に係る実施形態においては、大腸菌ＪＭ１０９菌株を好適な細胞として用いている。

また、膜接着分子発現ベクターの導入には公知の方法、例えばリン酸カルシウム法（Chen, C. et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 2745-272）、リポフェクション法（Felgner, PL. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417）、エレクトロポレーション法（Potter, H. (1988) Anal. Biochem. 174, 361-373）等を用いることができる。エレクトロポレーション法については遺伝子導入装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いることができる。

工程(v)の膜接着分子回収工程とは、(iv)の工程において作製した発現細胞株を常法に従って培養し、発現細胞株内に発現した膜接着分子をアルカリ性条件下において可溶化させて回収する工程である。発現細胞株の粉砕方法は、公知の方法を用いることができるが、本発明に係る実施形態においては、超音波粉砕装置を用いて粉砕する方法を好適として用いている。

次に、本発明に係る生体分子固定化坦体の製造方法は、
(i)坦体にリン脂質を含む有機膜を被覆させて生体膜摸倣坦体を形成する生体膜模倣担体形成工程、
(ii)膜接着ペプチドを有する生体分子および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子を作製する固定化生体分子作製工程、
(iii)膜接着ペプチドをリンカーとして用いて中性かつリン脂質存在下において膜接着分子を生体膜摸倣坦体へ固定化する固定化工程。
以上各工程(i)〜(iii)を有している。

工程(i)の生体膜模倣担体形成工程とは、リン脂質を含む有機膜を、例えば磁性微粒子や固相坦体等の坦体に被覆して生体膜模倣担体を形成する工程である。具体的には、担体の表面にリン脂質の疎水基を結合させることによってリン脂質の疎水基が担体方向に配列し、その結果、リン脂質の親水基が外方向に配列するため、担体の表面が生体膜様の有機膜に被覆される。本発明においてはこのように、担体の表面が生体膜様の有機膜に被覆されたものを生体膜模倣担体としている。また、必要に応じて、担体に固定するための固定リガンドをリン脂質に修飾してもよい。

工程(ii)の固定化生体分子作製工程とは、膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または前記膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで作製する工程である。つまり、前述の通り、膜接着ペプチドと生体分子との独立した２つの物質が融合ないし結合した融合分子のみならず、膜接着ペプチドを有する１つの物質である生体分子を作製する場合も含まれる。

工程(iii)の固定化工程とは、工程(i)の生体膜模倣担体形成工程により形成した生体膜模倣担体と、工程(ii)の固定化生体分子作製工程により作製した生体分子および／または膜接着分子とを、生体分子および／または膜接着分子が有する膜接着ペプチドを介して中性領域下で固定化する工程である。すなわち工程(iii)の固定化工程においては、本発明に係るリン脂質を含む有機膜に生理活性を保持した状態で生体分子を固定化する生体分子担体固定化方法が用いられている。

以下、本発明に係る膜接着分子固定化担体および生体分子担体固定化方法の実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞フコース転移酵素固定化磁性微粒子の作製と酵素活性の測定
ヘリコバクター・ピロリ由来のα−１，３フコース転移酵素は、前記膜接着ペプチドをＣ末端側に有する。そこで、このフコース転移酵素を生体膜摸倣（有機膜被覆）磁性微粒子へ提示し、得られたフコース転移酵素固定化磁性微粒子の酵素活性を測定した。

（１）フコース転移酵素の発現および精製
ヘリコバクター・ピロリＪ９９Ｂ株由来α−１，３フコース転移酵素を組み換え大腸菌にて発現し、精製した。具体的には、ヘリコバクター・ピロリＪ９９Ｂ株由来フコース転移酵素を発現する組み換え大腸菌（Taylor, D. E. et al. J. Biol. Chem. 2003, 278, 21893-21900）を２倍希釈したＹＴ培地２Ｌ中にて、３７℃，８時間培養した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度１ｍＭとなるように添加し、２０℃，２０時間培養した。培養液を１０，０００×ｇにて２０分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体を１ｍＭのメルカプトエタノールと１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを含む２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬに懸濁し、冷却下にて超音波破砕装置により菌体の超音波破砕を２分間、５回行った。再び１０，０００×ｇにて２０分間遠心後、上清を回収して、ニッケルカラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）によりアフィニティー精製を行った。フコース転移酵素を含む画分を、２５ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を用いて透析により置換し、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）のアルカリ性条件下にて陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により精製を行った。得られた精製物を限外濾過にて濃縮し、精製フコース転移酵素を得た。

（２）フコース転移酵素固定化磁性微粒子の作製
本実施例１（１）で精製して得られたフコース転移酵素を生体膜模倣磁性微粒子へ提示し、フコース転移酵素固定化磁性微微粒子を作製した。具体的には、直径２００ｎｍの銀被覆磁性微粒子（フェライト微粒子；日立マクセル社）１ｍｇを１００μＬのエタノールにて３回洗浄した後、アルキル鎖末端にチオールを有する８０ｍＭのホスファチジルコリンリンカー４０μＬ中にて室温下で１６時間反応させ、生体膜模倣磁性微粒子を作製した。これを図１に示す。

次に、本実施例１（１）で得られた精製フコース転移酵素を１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈して調製したフコース転移酵素溶液１００μＬ（７３４μｇ）を本実施例１（２）で作製した生体膜模倣磁性微粒子に添加し、４℃にて２時間攪拌した。その後、生体膜模倣磁性微粒子を１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬで５回洗浄し、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してフコース転移酵素が磁性微粒子に固定化されたフコース転移酵素固定化磁性微粒子を得た。これを図２に示す。

（３）フコース転移酵素活性の測定
［３−１：ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを用いたフコース転移酵素活性の測定］
つづいて、本実施例１（２）にて得られたフコース転移酵素固定化磁性微粒子の、ヒトミルクオリゴ糖であるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）に対するフコース転移酵素活性を測定した。具体的には、本実施例１（２）にて作製したフコース転移酵素固定化磁性微粒子１ｍｇを、１Ｍの塩化マンガン０．５μＬと、２００ｍＭのグアノシン５’−２リン酸−β−Ｌ−フコース（ＧＤＰ−フコース）２．５μＬと、４０ｍＭのＬＮｎＴ２５μＬと、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５μＬと、超純水１７μＬとを含む混合液中において、室温下で６０分間反応させた。５，１５，３０，６０分毎に糖質分析装置（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；Ｄｉｏｎｅｘ社）にて分析を行い、フコシル化された５糖を定量することでフコース転移酵素活性を測定した。各々の反応時間が５，１５，３０，６０分時の測定結果を表すクロマトグラフを図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に、これをグラフ化したものを図４に各々示す。

図３に示すように、矢印で示したフコシル化された５糖のピークが検出され、経時的に高くなっていることから、磁性微粒子に固定化されたフコース転移酵素によってＬＮｎＴがフコシル化されたことが確認された。また図４に示すように、フコース転移酵素により１５分間で４．３２ｍＭの５糖が産生されていることが確認された。そこで、１分間あたりの５糖の生産量を換算したところ２．８８Ｕ／ｍＬと高値であり、フコース転移酵素の活性が高いことが確認された。

［３−２：Ｏ−結合型糖アミノ酸を用いたフコース転移酵素活性の測定］
本実施例１（２）にて得られたフコース転移酵素固定化磁性微粒子の、Ｏ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移酵素活性を測定した。具体的には、５７６ｍＵ／ｍＬのフコース転移酵素固定化磁性微粒子１ｍｇを、１ｍｇのＯ−結合型糖アミノ酸（図５中に示すＲがＨのもの；以下、「１ａ」という。）またはＯ−結合型糖アミノ酸（図５中に示すＲがＣＨ_３のもの；以下、「１ｂ」という。）と、１０ｍＭの塩化マンガンと、２００ｍＭのＧＤＰ−フコース５μＬと、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５μＬと、超純水４０μＬとを含む混合液中において、室温下で１６時間反応させた。Ｏ−結合型糖アミノ酸がフコシル化される反応を図５に示す。この反応溶液をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；Ｂｒｕｋｅｒ社）および逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ；ＨＩＴＡＣＨＩ社）に供し、フコシル化されたＯ−結合型糖アミノ酸を検出した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの測定は、マトリックス剤として２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ；Naruchi, K. et al. J. Org. Chem. 2006, 71, 9609-9621）を用いて行った。そのスペクトルチャートを図６に示す。具体的には、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ａ中のセリン残基に付加されたＯ−結合型糖鎖について測定した結果を図６（ａ）に示し、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ｂ中のトレオニン残基に付加されたＯ−結合型糖鎖について測定した結果を図６（ｂ）に示す。一方、ＲＰ−ＨＰＬＣの測定は、逆相カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ジーエルサイエンス社）を、溶出液として２５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．８）と１０％の酢酸アンモニウムを含むシアン化メチル（ｐＨ５．８）とを用いて、流速１．０ｍＬ／分にて行った。そのスペクトルチャートを図７に示す。具体的には、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ａを用いた場合における反応前と反応後の測定結果を図７（ａ）、（ｂ）に示し、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ｂを用いた場合における反応前と反応後の測定結果を図７（ｃ）、（ｄ）に示す。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析では、図６（ａ）に示すように、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ａ中のセリン残基に付加されたＯ−結合型糖鎖がフコシル化されたもの（以下、「Ｏ−結合型糖アミノ酸２ａ」という。）の２２８１．８８のピークが検出された。同様に、図６（ｂ）に示すように、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ｂ中のトレオニン残基に付加されたＯ−結合型糖鎖がフコシル化されたもの（以下、「Ｏ−結合型糖アミノ酸２ｂ」という。）の２２９５．８９のピークが検出された。一方、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、反応後、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ａに相当するピークはほとんど検出されず、フコシル化されたＯ−結合型糖アミノ酸２ａに相当するピークが検出され、９８％のＯ−結合型糖アミノ酸１ａがフコシル化されていることが確認された。同様に、図７（ｃ）、（ｄ）に示すように、反応後、Ｏ−結合型糖アミノ酸１ｂに相当するピークはほとんど検出されず、フコシル化されたＯ−結合型糖アミノ酸２ｂに相当するピークが検出され、９９％のＯ−結合型糖アミノ酸１ｂがフコシル化されていることが確認された。以上より、フコース転移酵素固定化磁性微粒子によってＯ−結合型糖アミノ酸がフコシル化されることが示された。

［３−３：Ｎ−結合型糖アミノ酸を用いたフコース転移酵素活性の測定］
同様に、本実施例１（２）にて作製したフコース転移酵素固定化磁性微粒子の、Ｎ−結合型糖アミノ酸に対するフコース転移酵素活性を測定した。具体的には、５７６ｍＵ／ｍＬのフコース転移酵素固定化磁性微粒子１ｍｇを、１０ｍＭのＮ−結合型糖アミノ酸５μＬと、１Ｍの塩化マンガン０．５μＬと、２００ｍＭのＧＤＰ−フコース５μＬと、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５μＬと、超純水３４．５μＬとを含む溶液中において、室温で１６時間反応させた。Ｎ−結合型糖アミノ酸がフコシル化される反応を図８に示し、図８中、１はＮ−結合型糖アミノ酸を、２はフコシル化されたＮ−結合型糖アミノ酸を各々示す。前記反応溶液を本実施例１（３）３−２と同様にしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、フコシル化されたＮ−結合型糖アミノ酸（図８中の２）を検出した。そのスペクトルチャートを図９に示す。具体的には、反応前と反応後の測定結果を図９（ａ）および（ｂ）に示す。

図９（ａ）、（ｂ）に示すように、反応前にはフコシル化前のＮ−結合型糖アミノ酸に相当するピークが検出され（ａ）、反応後にはフコシル化されたＮ−結合型糖アミノ酸の２２６８．８１９のピークが検出された（ｂ）。以上より、フコース転移酵素固定化磁性微粒子によってＮ−結合型糖アミノ酸がフコシル化されることが示された。

以上、本実施例１（３）［３−１］〜［３−３］より、フコース転移酵素は、活性を保持した状態で生体膜模倣磁性微粒子に固定化することができ、これをフコース転移酵素固定化磁性微粒子として使用できることが示された。

（４）ＬＮｎＴを用いた繰り返し使用および保存の検討
次に、本実施例１（２）にて調製したフコース転移酵素固定化磁性微粒子について、繰り返し使用できるか否かを検討した。具体的には、本実施例１（３）［３−１］の方法と同様に、本実施例１（２）にて作製した５７６ｍＵ／ｍＬの活性を有するフコース転移酵素固定化磁性微粒子１ｍｇを、１０ｍＭの塩化マンガンと、１０ｍＭのＧＤＰ−フコースと、２０ｍＭのＬＮｎＴとを含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中、室温下で１５分間反応させた。これを５回繰り返し、各々について、糖質分析装置（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；Ｄｉｏｎｅｘ社）を用いてフコシル化された５糖を定量することでフコース転移酵素活性を測定した。１〜３回目は、反応終了後に１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄した後に次の活性測定を行った。４回目は、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬでの５回洗浄に加えて１Ｍの塩化ナトリウム１００μＬで５回洗浄した後に活性測定を行った。５回目は、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄した後４℃に保存し、翌日に活性測定を行った。使用回数１〜５回目の測定結果を示すクロマトグラフを図１０（ａ）〜（ｅ）に、これをグラフ化したものを図１１に各々示す。

図１０（ａ）〜（ｅ）に示すように、全ての使用において、矢印で示すフコシル化された５糖のピークが同様に確認された。また、図１１に示すように、磁性微粒子に固定化されたフコース転移酵素は繰り返し使用しても活性が低下せずに保持されていることが確認された。また、５回目の結果から、翌日でも活性が保持されていることが確認された。以上より、フコース転移酵素固定化磁性微粒子は、フコース転移酵素の活性を保持した状態で繰り返し使用でき、その活性を保存できることが示された。

（５）フコース転移酵素固定化磁性微粒子のフコース転移酵素の遊離実験
フコース転移酵素固定化磁性微粒子のフコース転移酵素の遊離実験を行った。具体的には、図１２に示すように、本実施例１（２）にて調製した５７６ｍＵ／ｍＬのフコース転移酵素固定化磁性微粒子１ｍｇを、０．４％（ｗ／ｖ）のトライトンＸ−１００を含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）または１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中において、室温下で２０分間反応させた。これら各反応溶液についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色を行った。その結果を図１３（写真）に示す。図１３中、Ｍは分子量マーカーを流したレーン、Iはフコース転移酵素を泳動させたレーン、IIはトライトンＸ−１００を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて処理した反応溶液を泳動させたレーン、IIIはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）にて処理した反応溶液を泳動させたレーンを各々示す。

図１３に示すように、トライトンＸ−１００を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて処理した溶液を泳動させたレーンIIでは、フコース転移酵素に相当する泳動バンドは検出されなかったが、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）にて処理した溶液では、フコース転移酵素に相当する泳動バンドが検出された。つまり、フコース転移酵素は、トライトンＸのような界面活性剤中では、固定化された生体膜模倣磁性微粒子から遊離せず、アルカリ水溶液中では遊離することが示された。

ここで、フコース転移酵素は、本実施例１（１）に示すように、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）のアルカリ性条件下において、限外濾過により濃縮し、沈殿を生じることなく精製フコース転移酵素が得られている。また、本実施例１（２）に示すように、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）の中性条件下において、この精製フコース転移酵素溶液を生体膜模倣磁性微粒子に加えて反応させることにより、接着に必要な構造である膜接着ペプチド部分のα−ヘリックス構造を誘起させ、膜接着ペプチドを介したフコース転移酵素の磁性微粒子への固定化に成功している。

以上より、フコース転移酵素は、中性条件下において活性を保持した状態で膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して磁性微粒子に固定化され、アルカリ性条件下において遊離して可溶化することから、この固定化と遊離化とを可逆的に利用できることが示された。

＜実施例２＞フコース転移酵素固定化マイクロアレイの作製と酵素活性の測定
９６穴プレートの各ウェルをアルキル鎖末端にチオールを有するホスファチジルコリンリンカーで被覆することにより生体膜模倣ウェルを作製し、これに膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してフコース転移酵素をウェルに固定化して得られるフコース転移酵素固定化マイクロアレイの酵素活性を測定した。

（１）フコース転移酵素固定化マイクロアレイの作製
９６穴プレートの各ウェルにアルキル鎖末端にチオールを有する８０ｍＭのホスファチジルコリンリンカー１００μＬを加え、室温下で１６時間反応させ、生体膜模倣ウェルを作製した。つづいて、この生体膜模倣ウェルを１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄後、実施例１（１）と同様の手法により得られた精製フコース転移酵素を１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈して調製したフコース転移酵素溶液１００μＬ（７３４μｇ）を添加し、４℃にて２時間攪拌した。その後、生体膜模倣ウェルを１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄し、フコース転移酵素が有する膜接着ペプチドと、有機膜（生体膜模倣膜）とを介して、フコース転移酵素固定化マイクロアレイを作製した。

（２）フコース転移酵素活性の測定
つづいて、本実施例２（１）にて得られたフコース転移酵素固定化マイクロアレイの、Ｏ−結合型４糖アミノ酸に対するフコース転移酵素活性を測定した。具体的には、実施例１（２）にて作製したフコース転移酵素固定化マイクロアレイに、１Ｍの塩化マンガンを１μＬと、２００ｍＭのＧＤＰ−フコースを５μＬと、１ｍＭのＯ−結合型４糖アミノ酸１０μＬと、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０μＬと、超純水７４μＬとを混合して、室温下で１時間反応させた。この反応溶液１μＬをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ社）に供し、実施例１（３）［３−２］と同様に１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢ１μＬをマトリックス剤として用い、フコシル化されたＯ−結合型５糖アミノ酸を検出した。また、コントロールとして、アルキル鎖末端にチオールを有するホスファチジルコリンリンカーで被覆しないフコース転移酵素非特異的吸着ウェルに前記溶液を加えてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。フコース転移酵素非特異的吸着ウェルを用いた結果を図１４（ａ）に、フコース転移酵素固定化マイクロアレイを用いた結果を図１４（ｂ）に各々示す。

図１４（ａ）に示すように、フコース転移酵素非特異的吸着ウェルにおいては、Ｏ−結合型４糖アミノ酸のピーク（１１５０．９６７に相当するピーク）は検出されたものの、フコシル化されたＯ−結合型５糖アミノ酸のピーク（１２９７．１９５に相当するピーク）は全く検出されず、フコース転移酵素の活性は全く確認されなかった。一方、図１４（ｂ）に示すように、フコース転移酵素固定化マイクロアレイは、Ｏ−結合型５糖アミノ酸のピーク（１２９７．１９５に相当するピーク）が検出され、フコース転移酵素の活性が確認された。すなわち、フコース転移酵素は、活性を保持した状態で生体膜模倣ウェルに固定化することができ、フコース転移酵素固定化マイクロアレイとして使用できることが示された。

以上より、膜接着ペプチドを有する生体分子や膜接着ペプチドと生体分子とを有する膜接着分子が固定化された、これらをプローブとするプローブ固定化マイクロアレイに糖鎖を分注していくだけで、糖鎖のトリミングが可能となることが示された。

＜比較例１＞シアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子の作製と酵素活性の測定
膜接着ペプチドの非存在下、生体膜摸倣していない（有機膜を被覆していない）磁性微粒子を用いて生体分子非特異的吸着磁性微粒子を作製し、その活性を測定した。

（１）シアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子の作製
具体的には、まず、直径が２００ｎｍの銀被覆磁性微粒子（日立マクセル社；フェライト微粒子）１ｍｇを１００μＬのエタノールにて３回洗浄後、アルキル鎖末端にチオールを有するホスファチジルコリンリンカーで被覆せずに、これにＶｉｖｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のシアリダーゼ（ＳＩＧＭＡ社）を１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈した溶液１００μＬ（７４μｇ）を添加し、４℃にて２時間攪拌した。次いで、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬで５回洗浄し、非特異的にシアリダーゼを吸着させたシアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子を得た。

（２）シアリダーゼ活性の測定
つづいて、本比較例１（１）にて得られたシアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子の、４−メチルウンベリフェリルシアル酸に対するシアリダーゼ活性を測定した。具体的には、本比較例１（１）にて作製したシアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子１ｍｇを、２ｍＭの塩化カルシウムと、２０ｍＭの４−メチルウンベリフェリルシアル酸とを含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中において、室温下で１０分間反応させた後、糖質分析装置（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；Ｄｉｏｎｅｘ社）にてこの反応溶液の分析を行い、遊離シアル酸を定量することでシアリダーゼ活性を測定した。活性測定は、各活性測定終了後に１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄し、次の活性測定を行うという手順で繰り返し３回行った。その結果を図１５に示す。

図１５に示すように、シアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子は、繰り返しの使用によりシアリダーゼ活性が低下してしまい、活性が保持されなかった。なお、磁性微粒子からのシアリダーゼの脱離の有無を確認するため、前記反応溶液を実施例１（５）と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、シアリダーゼ非特異的吸着磁性微粒子からのシアリダーゼの脱離は確認されなかった。以上より、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して生体分子が磁性微粒子に特異的に固定化されることによって、活性状態を保持できることが示された。

＜実施例３＞膜接着ペプチドの立体構造および膜接着性の解析
水溶液中またはミセル溶液中における膜接着ペプチドの立体構造解析を行い、膜接着性を検討した。

具体的には、まず、ヘリコバクター・ピロリＪ９９Ｂ株由来α−１，３フコース転移酵素のＣ末端側に存在する、膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドをペプチド自動合成装置（ＡＰＥＸ３９６２；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ社）により調製し、ＲＰ−ＨＰＬＣにて測定して精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣの測定は、実施例１（３）［３−２］と同様の条件で行った。精製して得た膜接着ペプチドの水溶液中における立体構造解析には、膜接着ペプチドを６２．５μＭになるように水６００μＬで溶かしたもの（ｐＨ７．０）をサンプルとして用いた。一方、膜接着ペプチドのミセル溶液中における立体構造解析には、１５６μＭの前記４２残基ポリペプチド２４０μＬと１００μＭのドデシルホスホコリン３６０μＬとを混合したものをサンプルとして用いた。

次に、これらのサンプルを用いてＣＤ解析を行った。ＣＤ解析には円二色性分散計Ｊ−８２０（日本分光社）を用い、測定を波長１９０〜２５０ｎｍ、１０回積算することにより行った。その結果を図１６および図１７に示す。

図１６および図１７に示すように、膜接着ペプチドは、水溶液中ではランダムな構造をとるが、膜構造を模倣したミセル中ではα−へリックス構造をとることが明らかとなった。以上より、膜接着ペプチドは、水溶液中で可溶化し、膜構造を有する条件下ではα−へリックス構造を誘起して膜接着性を発揮することが示された。

＜実施例４＞マルトース結合タンパク融合ガラクトース転移酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）固定化磁性微粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ作製と酵素活性の測定
実施例３において、膜接着ペプチドの膜接着性が確認されたことから、生体分子としてマルトース結合タンパク融合ガラクトース転移酵素（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）を用い、これに膜接着ペプチドを融合させたＭＢＰ−ＧａｌＴを生体膜模倣磁性微粒子へ提示することにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微微粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製し、その活性を測定した。

（１）ＭＢＰ−ＧａｌＴと膜接着ペプチドの調製
ソルテースＡ（ＳｒｔＡ）は、図１８に示すように、アミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）とＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＧ（Ｇｌｙ−Ｇｉｙ−Ｇｌｙ；トリグリシン）を有するペプチドとを結合させる性質を有する酵素である。この酵素を用いることにより、Ｃ末端にアミノ酸配列ＬＰＥＴＧを有する生体分子とトリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドとを結合させることができる。つまり、ＳｒｔＡを用いて、Ｃ末端にＬＰＥＴＧを有するＭＢＰ−ＧａｌＴとトリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドとを融合させて、膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴを調製し、これを生体膜摸倣磁性微粒子へ提示することにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を作製することができる。

そこで、ＭＢＰ−ＧａｌＴと、トリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドとを調製した。具体的には、ＭＢＰ−ＧａｌＴは、Ｓ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ等の方法（Susumu Nishiguchi, Shin-Ichiro Nishimura. Chem. Commun. 2001, 1944-1945）により調製した。また、トリグリシンをＮ末端に含む前記４２残基のポリペプチドは、実施例３と同様の手法により調製し、ＲＰ−ＨＰＬＣにて測定して精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣの測定は、逆相カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２００ｍｍ×２５０ｍｍ；ジーエルサイエンス社）を、溶出液として０．１％ＴＦＡ含有超純水と０．１％ＴＦＡ含有シアン化メチルとを用いて、流速１０ｍＬ／分にて行った。

（２）ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の作製
本実施例４（１）で得られたＭＢＰ−ＧａｌＴとトリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドとをＳｒｔＡにより結合させ、得られた膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴを生体膜摸倣磁性微粒子へ提示することにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、まず、本実施例４（１）で得られた４μＭのＭＢＰ−ＧａｌＴを１００μＬと、本実施例４（１）で得られた１ｍＭのトリグリシンをＮ末端に含む前記４２残基のポリペプチド４μＬと、１Ｍのトリス塩酸緩衝液 （ｐＨ７．５）１０μＬと、１Ｍの塩化カルシウム１μＬと、２Ｍの塩化ナトリウム１５μＬと、超純水６８μＬとの混合液に１．８ｍＭのＳｒｔＡを２μＬ加え、３７℃で２０時間反応させた。この反応液をＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−５０（ミリポア社）に移し、１０，０００×ｇにて１分間遠心することで未反応のトリグリシンをＮ末端に含む前記４２残基のポリペプチドを除き、フィルターに残った５０μＬの膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴを含む酵素反応液を得た。

この酵素反応液に、実施例１（２）と同様の手法により作製した生体膜摸倣磁性微粒子１ｍｇを加え、４℃にて２時間撹拌した後、溶液を全て除去し、生体膜摸倣磁性微粒子を５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで７回洗浄した。これにより、膜接着ペプチドをＣ末端に有するＭＢＰ−ＧａｌＴを生体膜摸倣磁性微粒子に提示することができ、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してＭＢＰ−ＧａｌＴが磁性微粒子へ固定化されたＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を得た。

（３）ＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子の作製
コントロールとして、４μＭのＭＢＰ−ＧａｌＴを１００μＬと水１００μＬとの混合液を、ホスホコリンリンカーで被覆していない（生体膜摸倣していない）銀被覆磁性微粒子に加えて上記と同様の操作をすることにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴが非特異的に吸着したＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子を作製した。

（４）ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子およびＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子のＭＢＰ−ＧａｌＴ活性の測定
つづいて、本実施例４（２）にて得られたＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子および本実施例４（３）にて得られたＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子の、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチルグルコサミン（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ）に対するＭＢＰ−ＧａｌＴ活性を測定した。具体的には、１Ｍの塩化マンガン１０μＬと、２５ｍＭのウリジン５’−２リン酸−α−Ｄ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）２５μＬと、２．５ｍＭの４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃを２００μＬと、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬと、１０％（ｗ／ｖ）のトライトンＸ−１００を１μＬとを、超純水７１４μＬに混合して基質溶液を調製した。本実施例４（２）および（３）で作製したＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子１ｍｇおよびＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子１ｍｇに、この基質溶液を５０μＬずつ加え、室温で３０分反応させた。各々、反応液５０μＬを超純水４５０ｍＬに希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。コントロールであるＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子の測定結果を図１９（ａ）に、膜接着ペプチドを介したＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の測定結果を図１９（ｂ）に各々示す。

図１９（ａ）に示すように、ＭＢＰ−ＧａｌＴ非特異的吸着磁性微粒子では、４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃに相当するピークが主に検出され、４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃにガラクトースが結合した４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−（β１，４）−Ｇａｌに相当するピークはわずかしか検出されず、ＭＢＰ−ＧａｌＴの酵素活性は認められなかった。一方、図１９（ｂ）に示すように、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子は、４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃに相当するピークとともに４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ−（β１，４）−Ｇａｌに相当するピークが検出され、ＭＢＰ−ＧａｌＴの酵素活性が認められた。以上より、膜接着ペプチドを融合させたＭＢＰ−ＧａｌＴは、活性を保持した状態で生体膜摸倣磁性微粒子に固定化することができ、これをＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子として使用できることが示された。

以上より、実施例１と本実施例４より、膜接着ペプチドを有するフコース転移酵素と、膜接着ペプチドを融合させたＭＢＰ−ＧａｌＴとを生体膜摸倣磁性微粒子に固定化することができ、それぞれの活性が確認されたことから、膜接着ペプチドを有する生体分子のみならず、膜接着ペプチドを融合させた膜接着分子を用い得ることが示された。そして、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して生体分子が磁性微粒子に固定化されていれば、生体分子の活性を保持した状態で固定化された生体分子固定化磁性微粒子を得られることが示された。

＜比較例２＞ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製と酵素活性の測定
（１）ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンのｉｎ ｖｉｔｒｏ作製
実施例４で用いたＭＢＰ−ＧａｌＴをシアノブロミド（ＢｒＣＮ）活性化セファロース４Ｂに固定化することにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンをｉｎ ｖｉｔｒｏで作製した（図２０）。具体的には、実施例４（１）と同様の手法（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，１９４４−１９４５）により得られた２μＭのＭＢＰ−ＧａｌＴを５００μＬと、０．３ｍＬのＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）とを含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）中において４℃にて１６時間反応させた。この反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ・０．４５μｍｂ・Ｆｉｌｔｅｒ−Ｕｎｉｔ（ミリポア社）にて１０００×ｇで３分間遠心してＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンを得た。

（２）ＭＢＰ−ＧａｌＴ活性の測定
つづいて、本比較例２（１）にて得られたＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジンの、糖供与体であるＵＤＰ−Ｇａｌに対するＭＢＰ−ＧａｌＴ活性を測定した。具体的には、本比較例２（１）にて作製した０．２Ｕの活性を有するＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化セファロースレジン０．３ｍＬを、ＵＤＰ−Ｇａｌを１３ｍＭと、２−アミノピリシル−Ｎ−アセチルグルコサミンがポリアクリルアミドポリマーに結合した１０ｍＭの受容体とを含む５０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．５）中において、３７℃で２４時間反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で分画することにより酵素活性測定を行った。この酵素活性測定操作を繰り返し８回行った。その活性測定結果を図２１に示す。なお、図２１中の収率（％，●）は、受容体であるＮ−アセチルグルコサミンが結合したポリアクリルアミドポリマーにガラクトースが導入された化合物の割合（変換率）を示す。一方、図２１中の相対活性（％，▲）は、初回の酵素活性値を１００％として換算した相対値を示す。

図２１に示すように、測定回数が増すに従って酵素活性の低下が認められ、活性が保持されなかった。以上より、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介さなければ、坦体に固定化されたＭＢＰ−ＧａｌＴは酵素活性を保持できないことが示された。

＜実施例５＞Ｏ−結合型糖ペプチド（ムチン型ペプチド）固定化磁性微粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ作製と固定化の確認
糖鎖を有する膜接着ペプチド（糖ペプチド）であるＯ−結合型糖ペプチド（ムチン型ペプチド）を生体分子として用い、このＯ−結合型糖ペプチドのＣ末端に膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドを組み込んだ膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ法により作製し、これを生体膜模倣磁性微粒子へ提示することでＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を作製して、その活性を測定した。

（１）Ｏ−結合型糖ペプチドと膜接着ペプチドの調製
Ｏ−結合型糖ペプチド（ムチン型ペプチド）は、Ｎａｒｕｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００６，７１，９６０９−９６２１に記載の方法により調製し、トリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドは、実施例３と同様の手法により調製し、実施例４（１）と同様の手法によりＲＰ−ＨＰＬＣにて測定して精製した。

（２）Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子の作製
本実施例５（１）で得られたＯ−結合型糖ペプチド（Ｃ末端にＳｒｔＡ認識配列を含む）とトリグリシンをＮ末端に含む膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドとをＳｒｔＡにより結合させ、得られた膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドを生体膜摸倣磁性微粒子へ提示することにより、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、本実施例５（１）で得られた１０ｍＭのＯ−結合型糖ペプチド２．５μＬと、本実施例５（１）で得られた１０ｍＭのトリグリシンをＮ末端に含む前記４２残基のポリペプチド２．５μＬと、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を２．５μＬと、１００ｍＭの塩化カルシウム２．５μＬと、３Ｍの塩化ナトリウムを２．５μＬと、超純水３５．５μＬとの混合液に１．８ｍＭのＳｒｔＡを１μＬ加え、３７℃で２０時間反応させた。この反応液をＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（ミリポア社）に移し、１４，０００×ｇにて２０分間遠心することでＳｒｔＡを除き、濾過してペプチド混合液を得た。この混合液を実施例４（１）と同様の手法によりＲＰ−ＨＰＬＣにて測定して精製し、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドを得た。この生成工程を図２２に示す。

得られた膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドに、実施例１（２）と同様の手法により作製した生体膜摸倣磁性微粒子１ｍｇを加え、４℃にて２時間撹拌した後、溶液を全て除去し、生体膜摸倣磁性微粒子を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄した。これにより、膜接着ペプチドをＣ末端に有するＯ−結合型糖ペプチドを生体膜摸倣磁性微粒子に提示することができ、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してＯ−結合型糖ペプチドが磁性微粒子へ固定化されたＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を得た。

（３）Ｏ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子の作製
コントロールとして、ホスホコリンリンカーで被覆していない（生体膜摸倣していない）銀被覆磁性微粒子へ膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの提示を行い、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子の作製を試みた。具体的には、本実施例５（２）で得られた膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドに、１００μＬのエタノールにて３回洗浄した直径が２００ｎｍの銀被覆磁性微粒子（日立マクセル社；フェライト微粒子）１ｍｇを加え、４℃にて２時間撹拌した後、溶液を全て除去し、銀被覆磁性微粒子を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄した。

（４）Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子およびＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子における膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化の確認
Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子およびＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子において膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドが固定化されているか否かを確認した。具体的には、本実施例５（２）および（３）で作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子およびＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子を、チップの先で少量とりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用ターゲットに点着した。これに１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢ１μＬを混合し、乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより測定した。その結果を図２３に示す。

図２３（ａ）に示すように、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子においては、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドに相当するピークが確認されず、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化は示されなかった。一方、図２３（ｂ）に示すように、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子においては、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドに相当するピーク（５２７６．０４５のピーク）が確認され、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化が示された。

＜実施例６＞Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を用いた抗体分離剤としての検討
生体膜模倣磁性微粒子に膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して固定化されたＯ−結合型糖ペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、抗体分離剤としての検討を行った。具体的には、実施例５（２）と同様の手法により作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子と、終濃度１％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）との混合液に、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を含む、ムチン型糖ペプチドＭＵＣ１を認識する１次抗体ＶＵ−３Ｃ６（Ｅｘａｌｐｈａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を１０００倍希釈した溶液を１００μＬ加え、室温下で１時間反応させた後、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を０．２ＭのＮａＣｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎとを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄することにより回収し、これに１０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲート−マウスモノクローナル抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ混合して、室温下で１時間さらに反応させた。

反応後、再びＯ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を０．２ＭのＮａＣｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎとを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄することにより回収し、ＴＭＢ−Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｓｙｓｔｅｍ 試薬（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ添加した後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、発色を確認した。また、コントロールとして、実施例１（２）と同様の手法により作製したホスホコリンリンカーで被覆した生体膜摸倣磁性微粒子と、実施例５（３）と同様の手法により作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子とについて、上記と同様の操作を行って発色を確認した。その結果を図２４（写真）に示す。

図２４の（ａ）〜（ｃ）に示すように、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子を用いた場合に強い発色を呈したが、コントロールとして用いた生体膜摸倣磁性微粒子とＯ−結合型糖ペプチド固定化銀被覆磁性微粒子とを用いた場合はほとんど発色を呈さなかった。以上より、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化磁性微粒子は抗体分離剤としての実用が可能であることが示された。

＜実施例７＞Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの作製
実施例６において、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化担体が抗体分離剤として実用可能であることが示されたことから、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの作製を試みた。

（１）Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの基板の作製
Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの基板を調製するため、金被覆したチップを実施例２（１）と同様の手法によりホスホコリンリンカーで被覆した後、スライドガラスに固定化してＭＴＰ−Ｓｌｉｄｅ−ＡｄａｐｔｏｒＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ社）に嵌め込んだ。点着部位をエタノール５μＬと超純水５μＬと５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５μＬとの混合液で５回洗浄することにより、Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの基板を作製した。

（２）Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの作製と固定化の確認
実施例５（１）と同様の手法により調製した５００μＭの膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチド５μＬを、本実施例７（１）で作製したＯ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイの基板に点着した。５分静置した後、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５μＬで５回洗浄した。実施例１（３）［３−２］と同様の手法によりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて測定した結果、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化が確認された。Ｏ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイを図２５（写真）に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて測定したスペクトルチャートを図２６に示す。

図２５および図２６に示すように、作製されたＯ−結合型糖ペプチド固定化マイクロアレイにおいて、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドに相当するピーク（５２９２．２２８のピーク）が確認され、膜接着ペプチド融合Ｏ−結合型糖ペプチドの固定化が示された。

＜実施例８＞膜接着ペプチド融合生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ作製
生体膜模倣磁性微粒子に固定可能な、膜接着ペプチドを融合させた生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ法による作製を試みた。具体的には、生体分子として、糖鎖末端に存在してシアル酸を加水分解する酵素であるヒト由来シアリダーゼＮＥＵ２を用い、このヒト由来シアリダーゼＮＥＵ２のＣ末端に膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドを組み込んだ膜接着ペプチド融合シアリダーゼをｉｎ ｖｉｖｏ法により作製した。

実施例１（１）において上記４２残基のポリペプチドを有するヘリコバクター・ピロリＪ９９Ｂ株由来α−１，３フコース転移酵素を調製する際に用いたベクターから、前記４２残基のポリペプチドを切り出すよう、下記のとおりプライマーを設計し、ＰＣＲ法にて下記の反応条件でその配列を増幅させた。
プライマー；
５‘ＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＴ３’（配列番号３）
５‘ＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴ（配列番号４）
反応条件；
９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクル

また、小腸由来ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）よりシアリダーゼＮＥＵ２をクローニングし、シアリダーゼＮＥＵ２を構築したベクターを得た（Monti, E et al. JBC. 2004, 279, 3169-3179）。

上記４２残基のポリペプチドをコードする断片と、上記シアリダーゼＮＥＵ２を構築したベクターとを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより処理し、膜接着ペプチドをＣ末端に融合したシアリダーゼＮＥＵ２の発現ベクターを構築した。このベクターを大腸菌ＪＭ１０９菌株に形質転換し、大腸菌変異株を作製した。ＬＢ寒天培地にて３７℃で一晩培養後、コロニーを２．５ｍＬのＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した。この培養液を５０ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が０．７になるまで３７℃で２時間培養後、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２５ｍＭになるよう添加して、２０℃で２０時間培養した。

この培養液を１０，０００×ｇにて２０分間遠心して菌体を回収し、１ｍＭのメルカプトエタノールと１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを含む２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬに懸濁して、冷却下、超音波破砕装置により菌体の超音波破砕を２分間、５回行った。再び１０，０００×ｇにて１０分間遠心後、上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、活性測定を行い、膜接着ペプチド融合シアリダーゼを確認した。次いで、回収した上清をアルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、Ｎｉカラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供した後、アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、限外濾過にて濃縮し、精製膜接着ペプチド融合シアリダーゼを得ることができた。

＜実施例９＞ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子のｉｎ ｖｉｖｏ作製と酵素活性の測定
実施例８において、膜接着ペプチドを融合させた生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ法による作製が確認されたことから、生体分子としてＭＢＰ−ＧａｌＴを用い、このＭＢＰ−ＧａｌＴのＣ末端に膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドを組み込んだ膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴをｉｎ ｖｉｖｏ法により作製し、これを生体膜模倣磁性微粒子へ提示することでＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を作製して、その活性を測定した。

（１）膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴのｉｎ ｖｉｖｏ法による作製
実施例８で調製した膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドをコードする断片と、ＭＢＰ−ＧａｌＴを構築したベクター（Susumu Nishiguchi, Shin-Ichiro Nishimura. Chem. Commun. 2001, 1944-1945）とを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより処理し、膜接着ペプチドをＣ末端に融合したＭＢＰ−ＧａｌＴの発現ベクターを構築した。このベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、大腸菌変異株を作製した。２×ＹＴ培地４ｍＬにて３７℃で一晩培養後、この培養液を２００ｍＬの２×ＹＴ培地に植え継ぎ、さらに３７℃で２時間培養した。培養液にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるよう添加して、２０℃で２０時間培養した。

この培養液を１０，０００×ｇにて２０分間遠心して菌体を回収し、１ｍＭのメルカプトエタノールと１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを含む２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬに懸濁して、冷却下、超音波破砕装置により菌体の超音波破砕を２分間、５回行った。再び１０，０００×ｇにて２０分間遠心後、上清を回収して、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により精製を行った。次いで、吸着画分をアルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、Ｎｉカラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供した後、アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、限外濾過にて濃縮し、精製膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴ（１．６ｍｇ/ｍＬ）を得た。

（２）ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の作製
本実施例９（１）で得られた膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−Ｇａｌを生体膜摸倣磁性微粒子へ提示することにより、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、実施例１（２）と同様の手法により作製した生体膜模倣磁性微粒子に、本実施例９（１）で得られた膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−Ｇａｌ溶液１００μＬ（１６０μｇ）を添加し、４℃で２時間攪拌した後、溶液を全て除去し、この生体膜摸倣磁性微粒子を１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで５回洗浄した。これにより、膜接着ペプチドをＣ末端に有するＭＢＰ−ＧａｌＴを生体膜摸倣磁性微粒子に提示することができ、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してＭＢＰ−ＧａｌＴが磁性微粒子へ固定化されたＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子を得た。

（３）ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の活性測定
つづいて、本実施例９（２）にて得られたＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の、４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃに対するＭＢＰ−ＧａｌＴ活性を測定し、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して磁性微粒子に固定化したＭＢＰ−ＧａｌＴが活性を有しているかを確認した。具体的には、本実施例９（２）で作製したＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子に、実施例４（４）と同様の手法により調製した基質溶液を５０μＬ加え、室温で２時間反応させた後、この反応液１μＬに１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢ１μＬを混合し、その活性を実施例１（３）［３−２］と同様の手法によりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより測定した。なお、コントロールとして、磁性微粒子に固定化していない遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴの活性を同様に測定した。遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴの測定結果を図２７（ａ）に、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子の測定結果を図２７（ｂ）に各々示す。

図２７（ａ）および（ｂ）に示すように、遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴとＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子のいずれについても、ガラクトースが転移した化合物に相当するピーク（４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃの５６４．６６２および５６４．６５８のピーク）しか検出されなかった。すなわち、遊離の膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴと同様、ＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子についても活性が確認された。

以上より、膜接着ペプチド融合ＭＢＰ−ＧａｌＴは、活性を保持した状態で生体膜摸倣磁性微粒子に固定化することができ、これをＭＢＰ−ＧａｌＴ固定化磁性微粒子として使用できることが示された。

＜実施例１０＞Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２(ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２)固定化磁性微粒子のｉｎ ｖｉｖｏ作製と酵素活性の測定
スレオニンまたはセリン側鎖水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンを転移する酵素であるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素２(ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２)を生体分子として用い、このｐｐＧａｌＮＡｃＴ２のＣ末端に膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドを組み込んだ膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２をｉｎ ｖｉｖｏ法により作製し、これを生体膜模倣磁性微粒子へ提示することでｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子を作製して、その活性を測定した。

（１）膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２のｉｎ ｖｉｖｏ法による作製
小腸由来ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）よりｐｐＧａｌＮＡｃＴ２をクローニングし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を構築したベクターを得た（Tabak, LA et al. JBC. 2006, 281, 8613-8619）。このベクターと、実施例８で調製した膜接着ペプチドを含む４２残基のポリペプチドをコードする断片とを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより処理し、膜接着ペプチドをＣ末端に融合したｐｐＧａｌＮＡｃＴ２の発現ベクターを構築した。このベクターをメタノール資化性酵母に形質転換し、酵母変異株を作製した。ＹＰＡＤ培地５０ｍＬにて３７℃で一晩培養後、この培養液を５００ｍＬのＹＰＡＤ培地に植え継ぎ、２４時間ごとにメタノール２．５ｍＬを添加することにより計７２時間、２０℃でさらに培養した。

この培養液を１０，０００×ｇにて２０分間遠心して菌体を除去し、膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む上清を回収し、アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、Ｎｉカラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供した後、アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）、限外濾過にて濃縮し、精製膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２（１．５ｍｇ/ｍＬ）を得た。

（２）ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子の作製
本実施例１０（１）で得られた膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を生体膜摸倣磁性微粒子へ提示することにより、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、実施例１（２）と同様の手法により作製した生体膜模倣磁性微粒子に、本実施例１０（１）で得られた膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２溶液４０μＬ（６０μｇ）を添加し、４℃で２時間撹拌した後、溶液を全て除去し、この生体膜摸倣磁性微粒子を５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬで７回洗浄した。これにより、膜接着ペプチドをＣ末端に有するｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を磁性微粒子に提示することができ、膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介してｐｐＧａｌＮＡｃＴ２が磁性微粒子へ固定化されたｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子を得た。

（３）ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子の作製
コントロールとして、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を４０μＬ（６０μｇ）と銀被覆磁性微粒子とを混合して上記と同様の操作をすることにより、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２が非特異的に吸着したｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子を作製した。

（４）ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子およびｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子の活性測定
つづいて、本実施例１０（２）にて得られたｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子および本実施例１０（３）にて得られたｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子の、ＭＵＣ５ＡＣムチンに対するｐｐＧａｌＮＡｃＴ２活性を測定した。具体的には、１００ｍＭの塩化マンガンを５μＬと、１０ｍＭのウリジン５’−２リン酸−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを１０μＬと、１０ｍＭのＭＵＣ５ＡＣムチンペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡ−ＮＨ２）を１．２５μＬと、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５μＬとを、超純水３６．２５μＬに混合して基質溶液を調製した。本実施例１０（２）および（３）で作製したｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子１ｍｇおよびｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子１ｍｇに、この基質溶液を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。反応液１μＬに１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢ１μＬを混合し、その活性を実施例１（３）［３−２］と同様の手法によりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより測定した。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子の測定結果を図２８（ａ）に、コントロールであるｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子の測定結果を図２８（ｂ）に各々示す。

図２８（ｂ）に示すように、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２非特異的吸着磁性微粒子では、Ｎ−アセチルガラクトサミンが１つ転移した化合物に相当するピーク（１６２９．３２５のピーク）はわずかしか検出されず、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２の酵素活性はほとんど認められなかった。一方、図２８（ａ）に示すように、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子は、Ｎ−アセチルガラクトサミンが１つ転移した化合物に相当するピーク（１６２９．４０７のピーク）が検出され、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２の酵素活性が認められた。

以上より、膜接着ペプチド融合ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２は、活性を保持した状態で生体膜摸倣磁性微粒子に固定化することができ、これをｐｐＧａｌＮＡｃＴ２固定化磁性微粒子として使用できることが示された。

以上のような本実施例によれば、耐久性に優れ、生体分子の活性を保持した状態で配向の制御が可能であり、膜接着分子が可溶化性を有するために取り扱い易い生体分子固定化担体、特に、生体分子固定化磁性微粒子および前記膜接着ペプチドを有する生体分子および／または前記膜接着分子をプローブとするプローブ固定化担体を提供することができる。例えば、生体分子に糖鎖を用いた生体分子固定化マイクロアレイの場合、プローブである糖鎖を認識、結合するタンパク質（マーカー）の釣り上げをすることが可能である。癌等に特異的に発現する糖鎖を膜接着ペプチドと有機膜（生体膜模倣膜）とを介して固定化すれば、患者の血清を流すだけで癌種を特定できる診断ツールとしての利用が可能である。

なお、本発明に係る生体分子固定化担体および生体分子担体固定化方法は、上記実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。

Claims (13)

1. 膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または膜接着ペプチドと融合ないし結合した生体分子(以下、膜接着生体分子と総称する)を、リン脂質を含む有機膜で被覆された担体に接着させてなる、生体分子固定化担体であって、
   前記膜接着ペプチドは、ヘリコバクター・ピロリ由来α１，３／α１，４−フコース転移酵素Ｃ末端ポリペプチドからなり、前記膜接着生体分子は、アルカリ性条件下に置いて膜接着ペプチドをランダム構造にして可溶化した物を中性条件下にてα−ヘリックス構造をとって前記リン脂質を含む有機膜に接着させた物である、生体分子固定化担体。
2. 前記膜接着ペプチドは、ＤＲＬＬＱＮＡＳＰＬＬＥＬＳＱＮＴＴＦＫＩＹＲＫＡＹＱＫＳＬＰＬＬＲＴＩＲＲＷＶＫＫで示されるアミノ酸配列からなる請求項１に記載の生体分子固定化担体。
3. 前記膜接着ペプチドのα−ヘリックス構造をとるアミノ酸配列は、ＫＩＹＲＫＡＹＱＫＳＬＰＬＬＲＴＩＲＲＷＶＫＫで示されるアミノ酸配列である請求項１に記載の生体分子固定化担体。
4. 前記生体分子固定化担体は、アルカリ性条件下に置かれると、前記膜接着生体分子が、リン脂質を含む有機膜で被覆された坦体から遊離し、遊離した後に中性かつリン脂質存在下に、リン脂質を含む有機膜で被覆された坦体と共に置かれると、前記担体への接着が可能なものである請求項１に記載の生体分子固定化担体。
5. 前記有機膜で被覆される担体が磁性微粒子であり、かつ前記生体分子固定化担体が前記膜接着生体分子をプローブとするプローブ固定化担体である、請求項１〜４のいずれかに記載の生体分子固定化担体。
6. 前記生体分子が酵素または糖鎖である、請求項１〜５のいずれかに記載の生体分子固定化担体。
7. 前記酵素が糖転移酵素または糖加水分解酵素である、請求項６に記載の生体分子固定化担体。
8. 担体に生体分子の生理活性を保持した状態で生体分子を直接または間接に固定化させる方法であって、
   （１）膜接着ペプチドを有する生体分子、および／または膜接着ペプチドを融合ないし結合した生体分子(以下、膜接着生体分子と総称する)をアルカリ性条件下に置いて膜接着ペプチドをランダム構造にして可溶化するステップ、但し、前記膜接着ペプチドは、ヘリコバクター・ピロリ由来α１，３／α１，４−フコース転移酵素Ｃ末端ポリペプチドからなる、
   （２）リガンドを修飾したリン脂質を用い、前記リガンドを介して担体表面にリン脂質を含む有機膜を形成して、有機膜被覆担体を得るステップと、
   （３）前記可溶化した膜接着生体分子を前記有機膜被覆担体の有機膜に接着させて生体分子固定化担体を得る接着ステップ、但し、前記接着ステップはｐＨを中性条件として、α−ヘリックス構造をとる膜接着ペプチドを前記有機膜に接着させる、と
   を有する生体分子担体固定化方法。
9. 前記膜接着ペプチドは、ＤＲＬＬＱＮＡＳＰＬＬＥＬＳＱＮＴＴＦＫＩＹＲＫＡＹＱＫＳＬＰＬＬＲＴＩＲＲＷＶＫＫで示されるアミノ酸配列からなる請求項８に記載の生体分子固定化方法。
10. 前記膜接着ペプチドのα−ヘリックス構造をとるアミノ酸配列は、ＫＩＹＲＫＡＹＱＫＳＬＰＬＬＲＴＩＲＲＷＶＫＫで示されるアミノ酸配列である請求項８に記載の生体分子固定化方法。
11. 前記有機膜で被覆される担体が磁性微粒子であり、かつ前記生体分子固定化担体が前記膜接着生体分子をプローブとするプローブ固定化担体である、請求項８〜１０のいずれかに記載の生体分子固定化方法。
12. 前記生体分子が酵素または糖鎖である、請求項８〜１１のいずれかに記載の生体分子固定化方法。
13. 前記酵素が糖転移酵素または糖加水分解酵素である、請求項１２に記載の生体分子固定化方法。

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