JPH11243951A

JPH11243951A - 磁性粒子固定化セルラーゼ

Info

Publication number: JPH11243951A
Application number: JP5117298A
Authority: JP
Inventors: Shinnosuke Miyauchi; 信之助宮内; Masahito Shimomura; 雅人下村; Takeshi Yamauchi; 健山内
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 1999-09-14

Abstract

(57)【要約】【課題】高い活性を失うことなしに、回収容易で、再
利用可能な磁性粒子固定化セルラーゼを提供する。【解決手段】シランカップリング化合物により表面処
理され、次いでポリ不飽和カルボン酸類がグラフトされ
た磁性粒子にセルラーゼ酵素が結合固定化されているも
のとする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、磁性粒子
固定化セルラーゼに関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、セルラーゼ酵素の活性を維持し
たまま、その移動や回収が自在にでき、酵素反応のコン
トロールも容易とされる磁性粒子固定化セルラーゼと、
これを用いた繊維処理方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】従来より、酵素を固体担体に
固定化して、酵素反応のコントロールや、その移動、回
収を容易とすることが検討されてきている。このような
固定化酵素において、固体担体として磁性粒子を用いる
ことが注目されてきている。磁性粒子を担体とすること
によって、液媒体中への分散、液媒体中からの回収によ
る再利用が極めて容易となるからである。すでにこの出
願の発明者らによっても、グルコースオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、ウレアーゼという酵素がマグネタイト
粒子に固定化されたものが開発されている。

【０００３】しかしながら、このような磁性粒子への酵
素の固定化は全ての酵素について容易ではない。酵素に
よっては、固定化によって活性が全く失われてしまうも
のが少くないからである。また、キモトリプシンのよう
な加水分解しやすい酵素でも、固定化は容易ではない。
食品工業や繊維工業等において実用的にも重要な役割を
果たしているセルラーゼ酵素の場合も同様であって、そ
の活性を失わせることなしに、磁性粒子に固定化するこ
とは成功していないのである。

【０００４】そこでこの出願の発明は、以上のとおりの
従来技術の問題点を解消し、産業的利用価値の高いセル
ラーゼ酵素について、その活性を失わせることなく、磁
性粒子に固定化し、これを繊維処理等に利用することの
できる新しい技術手段を提供することを課題としてい
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記のとお
りの課題を解決するために、まず第１の発明として、シ
ランカップリング化合物により表面処理され、次いでポ
リ不飽和カルボン酸類がグラフトされた磁性粒子にセル
ラーゼ酵素が結合固定化されていることを特徴とする磁
性粒子固定化セルラーゼを提供する。

【０００６】また、この出願は、第２の発明として、シ
ランカップリング化合物が、メルカプト基、ヒドロキシ
ル基、エポキシ基およびアミノ基のうちの少くとも１種
のカップリング官能基を持つ磁性粒子固定化セルラーゼ
を、第３の発明として、ポリ不飽和カルボン酸類による
グラフトが、付加重合可能な不飽和カルボン酸によりグ
ラフトされたものである磁性粒子固定化セルラーゼを、
第４の発明として、磁性粒子がマグネタイトであるいず
れかの磁性粒子固定化セルラーゼを提供する。

【０００７】さらに、この出願は、第５の発明として、
上記のいずれかの磁性粒子固定化セルラーゼにより繊維
を処理することを特徴とする磁性粒子固定化セルラーゼ
による繊維処理方法を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、さらに詳しくこの出願の発
明について、その実施の形態を説明する。まず、この発
明の磁性粒子固定化セルラーゼにおいては、磁性粒子の
表面はシランカップリング化合物により処理されてい
る。この場合のシランカップリング化合物としては、従
来より知られている各種のものであってよいが、なかで
もカップリング官能基として、メルカプト基、ヒドロキ
シル基、エポキシ基、およびアミノ基のうちの少くとも
１種のものを持つものが好適に使用される。たとえばメ
ルカプトアルキルトリアルコキシシラン、エポキシアル
キルトリアルコキシシラン、アミノアルキルトリアルコ
キシシラン、メルカプトアルキルクロルジアルキルシラ
ン、グリシジルアルキルトリアルコキシシラン等の化合
物である。

【０００９】たとえばこのように例示されるシランカッ
プリング化合物は、磁性粒子表面の水酸基と反応して、
つまり表面の酵素原子と結合して、磁性粒子−Ｏ−Ｓｉ
の構造を形成すると考えられる。そして結合されたシラ
ンカップリング化合物のカップリング官能基が、ポリ不
飽和カルボン酸類のグラフトを可能にすることになる。

【００１０】シランカップリング化合物による表面処理
は、一般的には、不活性ガス雰囲気下において、磁性粒
子を有機溶媒、たとえばトルエン、ベンゼン、ヘキサン
等の炭化水素溶媒中に分散させてシランカップリング化
合物の添加により行うことができる。使用割合について
は、磁性粒子の種類、シランカップリング化合物の種類
と反応性により適宜としてよい。通常は、その重量比と
しては、シランカップリング化合物／磁性粒子が、０．
０１〜１．５程度とすることができる。

【００１１】グラフトするポリ不飽和カルボン酸類につ
いては、付加重合可能な、不飽和カルボン酸類によるも
のとするのが適当であって、たとえばアクリル酸、メタ
クリル酸、マレイン酸、それらの置換体のうちから選択
されることになる。これらは、カルボン酸とそのエステ
ル、アミド、ニトリル等との共成分によるグラフトであ
ってもよいが、好ましいのは、ポリアクリル酸のグラフ
トである。

【００１２】グラフトは、通常の重合手段により行われ
るが、水系媒体中でのレドックス重合によるグラフトが
より好ましい。触媒、使用量や反応時間等をコントロー
ルすることによりグラフト率を制御することができる。
セルラーゼの酵素活性を高いレベルに維持するために
は、グラフト率は、一般的に５０％以上、さらには６５
％以上で、６５〜８５％とするのが好ましい。

【００１３】セルラーゼの固定化は、酵素の持つアミノ
基による共有結合によるものと考えられるが、高い酵素
活性を維持した、磁性粒子固定化セルラーゼが得られ
る。なお、この発明における磁性粒子については各種の
ものであってよく、たとえばマグネタイト、フェライト
等がある。なかでも、マグネタイトが好適に使用される
ことになる。

【００１４】以上のとおりのこの発明の磁性粒子固定化
セルラーゼは、繊維処理等において有効に使用されるこ
とになる。たとえば繊維の酵素加工は、衣料の柔らかい
風合いを作りだすために、最近重要になってきている。
この酵素加工は繊維の加工過程で、最終的仕上げにおい
て、繊維の毛羽や堅さを除去するために使われる。この
加工によって、高強度の繊維を衣料として用いることが
できる。しかし、酵素は高価の上に、反応制御が難しい
という面を持っている。このような繊維の酵素加工に磁
気粒子にセルラーゼを固定化したこの発明の固定化酵素
は、有用である。すなわち、セルラーゼを固定化した磁
気粒子は水溶液に、きわめて良く分散し、さらに微粉末
を用いれば、各種繊維素材の間隙にも侵入させることが
できる。これらの性質を利用して、例を見ないきわめて
高度な酵素加工が可能となる。さらに繊維加工終了後、
直ちに磁性体の性質を活かして、回収可能で、これによ
って廃水処理工程をきわめて簡略できる。また繰り返し
利用も可能で、資源有効利用にも大いに貢献することに
なる。

【００１５】そこで以下実施例を示し、さらに詳しくこ
の発明について説明する。

【００１６】

【実施例】（実施例１）１．マグネタイト表面のシランカップリング剤による処
理戸田工業（株）製マグネタイトＭＡＴ−３０５、粒径
０．２３μｍを用いた。カップリング試薬は、関東化学
（株）製、γ−メルカプトトリメトキシシラン（ＭＴＭ
Ｓ）を用いた。

【００１７】マグネタイト５．０ｇを用い、あらかじめ
２００ｍｌのメタノール３００ｍｌで、ビーカー中で１
０分間洗浄し、これを４回繰り返したのち蒸留水で同様
の操作を４回繰り返した。洗浄したマグネタイトを真空
乾燥器で乾燥した。乾燥後メノウ乳鉢で粉砕した。この
中、３．０ｇを三またフラスコに秤り取り、１１０℃の
オイルバスで加熱し、２４時間乾燥した。終了後窒素ガ
スをパージしながら、溶媒としてトルエン１００ｍｌと
ＭＴＭＳ３．０ｍｌを入れた。さらに２４時間窒素雰囲
気下で攪拌し反応させた。反応後トルエン、メタノール
で洗浄し、乾燥後メノウ乳鉢で粉砕し次の行程の試料と
した。以下処理マグネタイトとする。２．アクリル酸のグラフト重合上記処理マグネタイトを用い、その表面に４価のセリウ
ム塩を用いて適当な水系媒体中で、レドックス重合によ
ってアクリルモノマーをグラフト重合した。１回の実験
には０．５ｇの処理マグネタイトを用い、ナス型フラス
コ中で、３ｍｌのアクリル酸、３ｍｌの硝酸、１０ｍｌ
の蒸留水を入れ凍結脱気、融解の操作を４回行った。こ
れらはすべて窒素中で行った。その後０．１１ｇの硝酸
セリウムアンモニウム０．１１ｇを入れ３０℃、各時間
（３０分、４５分、１時間）反応を行い少量のハイドロ
キノンで重合を停止させた。これを遠心分離器で、８０
００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上澄み液を除
きこれに蒸留水１０ｍｌを加え再び攪拌した後同条件で
遠心分離操作を行い、１０回繰り返した。その結果グラ
フト率が１３．８から７１．１％のポリアクリル酸をグ
ラフトしたマグネタイトが得られた。３．マグネタイト粒子表面へのセルラーゼの固定化固定化には、上記のグラフト率、１３．８，１７．９，
７１．１％のものを用い、セルラーゼ酵素固定化を行っ
た。

【００１８】実験手順（１）０．５ｇのマグネタイトをナス型フラスコに量
り、セルラーゼ１７ｍｇと０．０５Ｍ酢酸バッファー７
ｍｌを加え、４℃で５分間攪はんした。（２）５分後、縮合試薬ＣＭＣを０．０８ｇ加え、４℃
で１８時間攪はんした。（３）１８時間後、６０分間遠心分離器（４℃、１８０
００ｒｐｍ）し、上澄液を除去した。（４）酢酸バッファーを加えて攪はんし、遠心分離する
作業を４回繰り返した。（５）約２０ｍｌの酢酸バッファー中に保存した。（６）セルラーゼの固定化量を Lowry法によって測定し
た。（７）固定化セルラーゼの活性測定は Somogy-Nelson法
を用いて測定した。

【００１９】ａ．４０℃の水浴バス中で、１％基質溶液
（ＣＭＣ）を０．８ｍｌ試験管に取り分けた。ｂ．よく攪はんした保存溶液を０．２ｍｌ加えた。ｃ．１５分後、ソモギー試薬１ｍｌ加え攪はんし、熱湯
中に１５分間入れた。ｄ．１５分後、氷水で冷却し、ネルソン試薬１ｍｌと蒸
留水９．５ｍｌを加えた。

【００２０】ｅ．１５分間遠心分離（１２００ｒｐｍ）
し、５４０ｎｍの波長の吸光度を測定した。得られた結果を表１にまとめた。表よりマグネタイト粒
子表面にセルラーゼが固定化されることがわかる。固定
化量は、マグネタイト表面にグラフトしたポリアクリル
酸のグラフト量に関係なく一定であることがわかる。

【００２１】また活性化量はNativeの比活性が０．０８
４Ｕ／ｍｇであるので、これに比べて、ポリアクリル酸
の量が少ない時は比活性が半分以下に下がるが、粒子表
面のポリアクリル酸の量を増やすと、活性はほぼ１００
％保持できることがわかった。

【００２２】

【表１】

【００２３】（実施例２）実施例１において、表１のポ
リマー結合量７１．１％、固定化酵素量１０．６（比活
性０．０８４）の固定化セルラーゼについて、反応温度
と酵素活性との関係、ｐＨと酵素活性との関係を、遊離
酵素(Native)との対比として評価した。図１は、反応温
度との関係、図２はｐＨとの関係を示したものである。
（ａ）遊離酵素と、（ｂ）固定化セルラーゼとの間には
ほとんど差がないことが確認された。（実施例３）酵素を結合した磁気粒子による繊維加工用いた繊維：精
製セルロース５００ｍｌのビーカーに次の組成の液を入れ、布または
繊維を浸せきし、６０℃、１時間十分攪拌し繊維の減量
加工を行った。加工終了後ただちに磁石を近づけて、酵
素を回収した。酵素回収率は９８％を越える良い成績で
あった。酵素はビーカーの脇などに少し付着するので、
これを丁寧に回収すれば、１００％近くまで回収率は向
上できる（従来はｐＨを１０以上にするか、温度を１０
０℃にして酵素活性を失わせて反応を終了させてい
た。）溶液の組成：水３００ｍｌ酵素固定化磁気粒子（Ｎｏ１）０．５％（１．５ｇ）浴比１：３０ｐＨ６．０（酢酸バッファー）テンセルの性質：この処理によって強度４．３ｇ／ｄのものが３．９ｇ／ｄに落ち効果があった。（実施例４）実施例３について、磁性粒子固定化セルラ
ーゼを再利用し、その相対活性を評価した。

【００２４】その結果を図３に示した。再利用によって
も高い活性を維持することが確認された。

【００２５】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、高い酵素活性を失うことなしに、回収が
容易で再利用可能な磁性粒子固定化セルラーゼが提供さ
れ、このものは繊維処理等において有効に利用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）（ｂ）は、反応温度と酵素活性の関係を
示した図である。

【図２】（ａ）（ｂ）は、ｐＨと酵素活性との関係を示
した図である。

【図３】再利用回数と酵素活性との関係を示した図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シランカップリング化合物により表面処
理され、次いでポリ不飽和カルボン酸類がグラフトされ
た磁性粒子にセルラーゼ酵素が結合固定化されているこ
とを特徴とする磁性粒子固定化セルラーゼ。
【請求項２】シランカップリング化合物が、メルカプ
ト基、ヒドロキシル基、エポキシ基およびアミノ基のう
ちの少くとも１種のカップリング官能基を持つ請求項１
の磁性粒子固定化セルラーゼ。
【請求項３】ポリ不飽和カルボン酸類によるグラフト
が、付加重合可能な不飽和カルボン酸によりグラフトさ
れたものである請求項１または２の磁性粒子固定化セル
ラーゼ。
【請求項４】磁性粒子がマグネタイトである請求項１
ないし３のいずれかの磁性粒子固定化セルラーゼ。
【請求項５】請求項１ないし４のいずれかの磁性粒子
固定化セルラーゼにより繊維を処理することを特徴とす
る磁性粒子固定化セルラーゼによる繊維処理方法。