JP2017212902A - ＦｃγＲＩＩａをコードするポリヌクレオチド及びＦｃγＲＩＩａの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトＦｃγＲＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用してヒトＦｃγＲＩＩａを効率的に製造する方法の提供。【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列のうち少なくとも３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、大腸菌型コドンを用いて表されている前記ポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換し、それを培養し、得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収する、ヒトＦｃγＲＩＩａの製造方法。【選択図】図５

Description

本発明は、ヒトＦｃレセプターＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃレセプターＩＩａの製造方法に係る。特に本発明は、ヒトＦｃレセプターの一つであるヒトＦｃγＲＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃγＲＩＩａの製造方法に係る。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩのアミノ酸配列の相同性は、それぞれＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩ間で約２２％、ＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩＩ間で約２６％、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩ間で約４５％と大きく異なるものである。また、同様に機能面においても、ＦｃγＲＩは抗体への強い親和性を示し、ＦｃγＲＩＩｂは弱い親和性および免疫機構の抑制を示し、ＦｃγＲＩＩＩａは弱い親和性及びＡＤＣＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）による細胞障害作用を示すなど、それぞれ異なる機能を有している（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩａはマクロファージ、血小板、好中球、単球や樹状細胞などの細胞表面に存在しており、ＩｇＧ免疫複合体と結合後、免疫機能を活性化する重要な役割に関与するレセプターである。このＦｃγＲＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が１．５×１０^−６（Ｍ）であることが報告されている（非特許文献２および３）。ヒトＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１８）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から３３番目のセリン（Ｓｅｒ）までがシグナル配列（Ｓ）、３４番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２１８番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から２４０番目のチロシン（Ｔｙｒ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２４１番目のシステイン（Ｃｙｓ）から３１７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

遺伝子工学的手法を用いたＦｃγＲＩＩａの発現は、大腸菌を宿主とした例では非特許文献４および５が報告されている。しかしながら、非特許文献４および５では、大腸菌宿主で封入体（不溶性）として発現させた組換えＦｃγＲＩＩａを、再生（リフォールディング）させる調製方法等が報告されているが、ＦｃγＲＩＩａの発現量が極めて低く、工業的生産が困難であった。また動物細胞を宿主とした発現系では、培養にかかる時間が長く、生産性が必ずしも高くないため、培養コストが高い問題があった。

Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５ Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７ Ｓ．Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２１２，１３６１−１３６９，２０１５ Ｐ．Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９，７３７−７４９，２００１． Ｓ．Ｔ．Ｊｕｎｇ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７，２１−３０，２０１０．

本発明の課題は、ヒトＦｃγＲＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用してヒトＦｃγＲＩＩａを効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩａのうち、少なくとも細胞外領域の一部を含むアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に、大腸菌型のコドンを用いることで、大腸菌を宿主としたヒトＦｃγＲＩＩａの効率的製造を実現し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、大腸菌型コドンを用いて表されていることを特徴とする前記ポリヌクレオチド。

（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質の、一つ以上のアミノ酸残基が欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換されている、又は他のアミノ酸残基が一つ以上挿入されているタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、大腸菌型コドンを用いて表されていることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。

（Ｃ）配列番号２又は３に記載のヌクレオチド配列を含む、（Ａ）に記載のポリヌクレオチド。

（Ｄ）（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

（Ｅ）（Ｄ）に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。

（Ｆ）（Ｅ）に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収する、ヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列の製造方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩａのうち、細胞外領域（図１のＥＣ）の一部である、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質をポリヌクレオチドに変換する際、大腸菌型コドンを用いて変換されたものを特徴としている。前記タンパク質は、細胞外領域（図１のＥＣ）のうち、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含んでいればよく、また２０９番目のセリンから２１７番目のグリシンまでの全て又は一部を含んでいてもよく、さらに細胞外領域（図１のＥＣ）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。さらに前記タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩａのうち、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質の、一つ以上のアミノ酸残基が欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換されていてもよく、又は他のアミノ酸残基が一つ以上挿入されたものであってもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩａのうち、細胞外領域の一部である、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基、または、前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換されたもの又は他のアミノ酸残基が一つ以上挿入されたものを少なくとも含むタンパク質から、コードするアミノ酸は変えずに、大腸菌の翻訳機構において利用頻度が低いコドン（レアコドン）から利用頻度が高いコドンに変換することにより得られる。具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれレアコドンであるため、それらのコドンを避けるように変換すればよい。なお宿主におけるコドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することで可能である。本発明のポリヌクレオチドの一例として、配列番号２または３に記載の配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。

本発明のポリヌクレオチドの作製方法としては、
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩａのうち、少なくとも３４〜２０８番目アミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに対して、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法を用いて、大腸菌型コドンとなるよう変異を導入し、作製する方法や、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩａのうち少なくとも３４〜２０８番目のアミノ酸配列を大腸菌型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換したものを設計し、当該設計した配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成する方法、
が例示できる。なお前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）ベクター（本発明のベクター）で宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。

本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換して得られる本発明の形質転換体から、本発明のベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。

本発明において、宿主としては大腸菌を用いることができるが、その中でも大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）、Ｗ３１１０株、ＪＭ１０９株を用いるとヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を効率よく製造することができるので好ましい。

本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収することで、ヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ヒトＦｃγＲＩＩａの発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収するには、本発明の形質転換体におけるヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製してヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕してヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を抽出した後、精製すればよい。ヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、ヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を高純度に調製することができる。

得られたヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。

本発明は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＩＩａのアミノ酸配列のうち、細胞外領域の一部である３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基、または、前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換されたもの又は他のアミノ酸残基が一つ以上挿入されたものを少なくとも含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて表されているポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換することで、大腸菌でヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を効率的に製造することができる。

ヒトＦｃγＲＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 実施例２での抗体結合活性を示した図である。図中のエラーバーは誤差の最大、最小を示している。 実施例３でのヒトＩｇＧサブクラスへの特異性を示した図である。図中の白棒はヒトＦｃγＲＩＩａ（市販品）の結果であり、黒棒は実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の結果である。 比較例１で、ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列を大腸菌型コドン（Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｄｏｎ、上段）およびヒト型コドン（ｈｕｍａｎ ｃｏｄｏｎ、下段）を用いてポリヌクレオチドに変換したときの、ヌクレオチド配列を比較した図である。「＊」は同じヌクレオチド配列であることを示している。 実施例４で、大腸菌を形質転換する発現ベクターとして、ｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａ（比較例１、白棒）およびｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａ（実施例１、黒棒）を用いたときの、ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列生産性を比較した図である。

以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列発現ベクターの作製（大腸菌型コドン）
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列のうち、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸配列を基に、使用コドンを大腸菌に最適化するプログラムを用いた人工ＤＮＡ合成（株式会社ファスマック社製）により、コドンをヒト型から大腸菌型に変換した配列番号２に示すヌクレオチド配列を設計した。配列番号２の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｃｏＩ）およびリンカー配列Ｇｌｙを、および３’末端側にリンカー配列としてＧｌｙ、Ｇｌｙの２アミノ酸とタグ配列として６×Ｈｉｓの６アミノ酸の合計８アミノ酸を付与したアミノ酸配列と終止コドンと制限酵素消化サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ）をコードする配列番号３に示すポリヌクレオチド配列を設計した。

（２）設計した配列番号３に示したポリヌクレオチド配列を含んだ人工ＤＮＡ合成プラスミドから（株式会社ファスマック社製より購入）、配列番号３に示すポリヌクレオチド配列を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロース電気泳動にて切り出し、精製した。

（３）（２）で得られた精製ポリヌクレオチドをあらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。

（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａを抽出した。

（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａのうち、ＦｃγＲＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号４（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号５（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７に、それぞれ示す。なお配列番号６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、３４番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０８番目のプロリン（Ｐｒｏ）までがヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域（配列番号１の３４番目から２０８番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。

実施例２ ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の抗体結合確認
（１）実施例１で得られた、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種後、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始９０分後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。

（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌから１５０ｍＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて希釈系列を作製し固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、０．５％（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、および１５０ｍＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。

（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（４）で調製したヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列を含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

ガンマグロブリン（抗体）を様々な希釈系列にて固定化したプレートに対し、（４）で調製したヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列を含む溶液を一定量添加したときの、プレートへのガンマグロブリン（抗体）固定化量と抗体結合活性に相当する吸光度（４５０ｎｍ）との関係をまとめた図を図２に示す。なお図２において（−）は、ガンマグロブリン（抗体）の固定化を行なわなかったプレート（ネガティブコントロール）である。プレートへの抗体固定化量が減少するほど吸光度も減少していることから、ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列がヒト抗体と結合していることが確認できる。

実施例３ ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の特異性確認
実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列、および市販のヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）のヒトＩｇＧサブクラスへの特異性を評価した。固定化抗体をガンマグロブリン製剤からヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４（シグマアルドリッチ社製）に変更し、プレートへの固定化量を１０μｇ／ｗｅｌｌとした他は、実施例２（５）と同様の方法で評価した。

評価結果を図３に示す。実施例２で調製したヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列のＩｇＧサブクラスへの特異性は、市販のヒトＦｃγＲＩＩａと同様であった。したがって、ヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に大腸菌型のコドンを用いても、発現したヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の抗体への特異性に問題がないことが確認された。

比較例１ ＦｃγＲＩＩａ部分配列の発現ベクターの作製（ヒト型コドン）
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列のうち、３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸配列を基に、使用コドンをヒト型に最適化するプログラムを用いた人工ＤＮＡ合成（株式会社ファスマック社製）により、コドンをヒト型に変換した配列番号８に示すヌクレオチド配列を設計した。配列番号８の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｃｏＩ）およびリンカー配列Ｇｌｙを、および３’末端側にリンカー配列としてＧｌｙ、Ｇｌｙの２アミノ酸、およびタグ配列として６×Ｈｉｓの６アミノ酸の合計８アミノ酸を付与したアミノ酸配列と終止コドンと制限酵素消化サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ）をコードする配列番号９に示すポリヌクレオチド配列を設計した。
（２）設計した配列番号９に示したポリヌクレオチド配列を含んだ人工ＤＮＡ合成プラスミドから（株式会社ファスマック社製より購入）、配列番号９に示すポリヌクレオチド配列を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロース電気泳動にて切り出し、精製した。

（３）（２）で得られた精製ポリヌクレオチドをあらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）（３）で得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａを抽出した。
（５）作製した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａのうち、ＦｃγＲＩＩａ部分配列をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（５）と同様の方法で配列解析を行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６と同じであった。また当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示し、大腸菌型コドンを用いて変換したポリヌクレオチドの配列（実施例１、配列番号７）と配列を比較した結果を図４に示す。ヒト型コドンを用いた場合（ｈｕｍａｎ ｃｏｄｏｎ、配列番号１０）と大腸菌型コドンを用いた場合（Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｄｏｎ、配列番号７）とのヌクレオチド配列の相同性は約８２％であった。

実施例４ ＦｃγＲＩＩａ細胞外領域の発現量比較
（１）実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａ、または比較例１で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始９０分後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で好気的に振とう培養した。

（４）（２）の培養開始から１６時間後、２４時間後に培養液２ｍＬを採取した。採取した培養液は遠心分離により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の濃度を、実施例２（５）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。なおヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の濃度は、濃度既知のＦｃγＲＩＩａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて検量線を作製して算出した。

結果を図５に示す。培養液あたりのヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列の発現量で比較したところ、発現ベクターとして、大腸菌型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換し作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ２ａ（実施例１）のほうが、ヒト型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換し作製した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ２ａ（比較例１）よりも、発現量が約１．５倍増大していた。すなわちヒトＦｃγＲＩＩａ部分配列をポリヌクレオチドに変換する際、大腸菌型コドンを用いて変換し、当該変換したポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を培養することで、ヒトＦｃγＲＩＩａまたはその部分配列を高効率に製造できることがわかる。

Claims (6)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、大腸菌型コドンを用いて表されていることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
2. 配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３４番目のグルタミンから２０８番目のプロリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質の、一つ以上のアミノ酸残基が欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換されている、又は他のアミノ酸残基が一つ以上挿入されているタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、大腸菌型コドンを用いて表されていることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
3. 配列番号２又は３に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
5. 請求項４に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
6. 請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列を回収する、ヒトＦｃγＲＩＩａ又はその部分配列の製造方法。

Images