KR101100912B1

KR101100912B1 - 종자의 저장성 및 발아율 관련 유전자 및 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR101100912B1
Application number: KR1020090052210A
Authority: KR
Inventors: 김우택; 김은유; 서지호
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2009-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2012-01-02
Also published as: KR20100133591A

Abstract

본 발명은 발아력이 증가된 애기장대 At1g30370 유전자 및 그 유전자를 과다발현시킨 형질 전환 식물체에 관한 것이다. 유전자는 리파아제 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하며 과다발현 식물체의 종자는 야생종 보다 높은 발아력을 가지고 있는 반면 유전자의 발현이 사라진 T-DNA 녹-아웃 돌연변이의 종자는 낮은 발아력을 보인다. 이처럼 발아율이 높은 과다발현체는 씨앗의 저장 능력이 탁월하여 벼나 옥수수에 도입시킨다면 씨앗의 저장기간이 증가된 신기능 작물 개발이 가능할 것으로 본다. 또한 과다발현체의 빠른 발아율은 식물체의 생장을 빠르게 하여 속성재배가 가능하게 되며, 이러한 특성은 바이오 매스로의 응용에 유용하게 이용될 수 있다.

식물, 발아율, 생장, 저장성, 형질전환, At1g30370

Description

종자의 저장성 및 발아율 관련 유전자 및 형질전환 식물체{Gene Implicated in Improvement of Storage Potential and Sprouting Rate of Seeds and Transformed Plants with the Same}

본 발명은 종자의 저장성 및 발아율 관련 유전자 및 형질전환 식물체에 관한 것이다.

지난 몇 년간, 식물지질의 구조와 그 기능에 있어서 다양한 연구가 있어왔다. 고등 식물에 있어서 지질 물질 대사는 세포 신장, 기공개폐, 화분의 성숙, 노화, 방어 기작처럼 다양한 세포 수준의 기능에 관여하는 중요한 역할을 한다. 이러한 과정은 여러 리파아제들에 의해 중재된 지질에서 파생된 신호 처리 네트워크와 관련이 있다. 리파아제는 지질을 가수분해하는 효소로 에스터라제 모티프를 가지고 있으며, 분해하는 기질에 따라 포스포리파아제, 갈락토리파아제 및 트리아실글리세롤 리파아제로 나눌 수 있다.

살아있는 유기체에 있는 포스포리파아제는 인지질의 가수분해 위치에 따라 분류되어 포스포리파아제 A(PLA), 포스포리파아제 C(PLC) 및 포스포리파아제 D(PLD)로 3개의 주된 형태로 나뉜다. 그 중에서도 PLA는 포스포리파아제 A1 (PLA1)와 포스포리파아제 A2(PLA2)로 나뉘는데, 이는 인지질의 가수분해가 그들의 sn-1과 sn-2 위치 중 어느 곳에 촉매 작용을 하느냐에 따라 유리지방산과 잘려진 인지질로 잘려지게 된다. PLC는 일반적으로 diacylgrycerol (DAG)을 포스포릴화 머리그룹과 포스포이노시티드로 나누는 효소 활성을 가진다. 반면에 PLD는 다양한 인지질을 기질로 사용하는데, 포스파티딕 산과 수용성 유리머리그룹으로 나누는 효소 활성을 갖는다. 또한 PLD는 고등식물에서 가장 연구가 활발히 되어있다. PLD는 다양한 식물 스트레스 반응을 포함한 세포 수준에서 일어나는 광범위한 과정에 관여한다는 보고가 있어왔다. PLD의 5가지 이성질체들 중에서 AtPLDδ은 그 기능을 애기장대에서 연구한 결과, 앱사이식산, 추위, 가뭄, 과도한 염과 같은 스트레스 상황에서 이 유전자가 관여한다는 것을 알게 되었다. 한편, PLA2는 세포 신장과 신초의 굴지성에 관련하여 중요한 역할을 하는 옥신 신호 전달 체계에 관여한다. 또한 PLA2가 세포내 산성화를 통해 식물 방어 기작에 작용한다는 것이 알려져 있다. 게다가, PLA2 활성은 PLD에 의해 파생된 PA에 의해 증가되는데, 이는 동물 체계에서의 이차 신호 전달자로 인식되고 있다.

애기장대에서 PLA1은 여러 유전자군으로 존재하며, 최소한 12개의 이성질체가 있다. 이는 다시 세포내에서 각 유전자의 발현 위치에 따라 3개의 군으로 분류가 된다. 엽록체에서 발현되리라 생각되는 단백질들은 클래스Ⅰ, 세포질은 클래스Ⅱ, 마이토콘드리아는 클래스Ⅲ로 분류된다. 그러나 고등 식물에서 이들 PLA1에 대한 생리적 역할에 대한 규명은 다른 포스포리파아제들에 비해 다소 부족하다. 그러나 최근 엽록체에서 발현되리라 생각되는 클래스Ⅰ군에서 3개, 세포질에서 발현되리라 생각되는 클래스Ⅱ군에서 한 개가 연구되었다. 그 결과 단백질 구조 분석 결과에 따른 효소의 분류와는 달리 클래스Ⅰ군의 DGL1과 DAD1의 경우 갈락토리파아제로 규명되었으며, 나머지 단백질은 트리아실글리세롤 리파아제로 밝혀졌다. 이 중 DAD1은 자스모닉산 생합성의 첫 단계에 관여해 리놀레익산을 잘라 내는데, 이는 애기장대에서 화분 성숙과 약의 열개, 꽃의 개화에 필요하다. DGL1은 DAD1과 유사한 기능을 가지고 있지만, DAD1과 발현 시간과 장소에 따른 차이가 있다. 마지막으로 클래스Ⅱ PLA1으로 분류가 된 하나의 단백질은 UV-B에 반응하여 그 발현 수준이 올라간다는 것이 밝혀졌다. 이는 클래스 Ⅱ PLA1단백질이 UV-B 처리에 의해 유도된 PR-1과 관련된 방어기작과 연관 되었으리라는 것을 제기할 수 있게 했다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물체의 발아촉진, 생장 촉진 및/또는 종자의 저장능력을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 바람직하게는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우에는 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체가 나오는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 식물체의 발아촉진, 생장 촉진 및/또는 종자의 저장능력을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 바람직하게는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우에는 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체가 나오는 것을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진을 위하여 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되 는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b)상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c)식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 NOS 서열이다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미 드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)GV3101이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있 다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마 토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진 방법을 제공한다:

식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클 로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열이 삽입된 식물 발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진 방법을 제공한다.

(b) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 발아능, 생장능 및 종자의 저장능력 등에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 발아력이 탁월하여 저장기간이 증가되고 속성재배가 가능한 신기능 식물체 및 바이오매스로의 응용에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: At1g30370 유전자의 클로닝 및 분석

3일된 애기장대의 유묘에서 총 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(Seo et al. Plant J 53: 895-908(2008)). 역전사 반응으로 합성된 cDNA 중에서 At1g30370 유전자만을 특이적으로 증폭시키기 위해 PCR에 사용된 프라이머 조합은 The Arabidopsis Information Resource(TAIR, http://www.arabidopsis.org)의 데이터베이스에서 At1g30370 유전자 cDNA의 염기서열을 검색한 후, 코딩 부위(CDS)의 5’쪽에는 BamHI을 태깅하고(5’-tcggatccatggagaacgcattggtc-3’, 서열번호3), 3’쪽에는 HindⅢ를 태깅하여(5’-gtaaaacgacggccagtgccaagctttc-3’, 서열번호4) 제작하였다. 증폭된 At1g30370 유전자의 cDNA는 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 라이게이션시켜 클로닝한 후, 시퀀싱 반응을 통해 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열은 TAIR에서 검색한 것과 정확히 일치하였으며, 태깅된 염기서열을 제외하면 총 1,590 bp 로 이루어진 CDS만을 포함하고 있었다(도 1a).

실시예 2: At1g30370 단백질의 아미노산 서열 분석

At1g30370/pGEM-T Easy 벡터의 염기서열을 BCM Search Launcher (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu)의 인 실리코 번역 도구를 이용해서 아미노산 서열을 확인해본 결과 TAIR의 데이터베이스와 일치하는 530개의 아미노산으로 이루어져 있으며(도 1b), 분자량은 약 60.8 kDa이고 등전점(Isoelectronic Point: pI) 값은 9.93임을 확인할 수 있었다. At1g30370의 아미노산 서열을 BLAST 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)에서 검색한 결과 기존 논문에서 알려진 대로(Ishiguro et al. Plant Cell 13: 2191-2209(2001); Hyun et al. 2008, Dev Cell 14: 183-192(2008)) 11개의 DAD1-유사 아실하이드롤레이즈 유전자들과 높은 상동성을 나타내었다. InterProScan 프로그램(http://www.ebi.ac.uk)을 이용해서 기능이 알려진 도메인을 찾아본 결과 다른 DAD1-유사 아실하이드롤레이즈와 공통적으로 리파아제 클래스Ⅲ 도메인을 가지고 있음을 확인함으로써 At1g30370 단백질이 리파아제 활성을 가질 있음을 예상할 수 있었다. 또한 단백질의 세포내 위치를 예측해 주는 TargetP 프로그램 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)을 이용해서 At1g30370 단백질이 마이토콘드리아로 타겟팅 될 가능성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: At1g30370 단백질의 발현 및 정제

At1g30370 단백질을 박테리아에서 발현시켜 정제하기 위해서 말토오스 결합단백질(Maltose Binding Protein, MBP)과 At1g30370을 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하였다. At1g30370 단백질은 마이토콘드리아로 가는 통과 펩타이드(transit peptide)를 N-말단 쪽에 가지고 있는 것으로 예측되었으므로 박테리아 시스템을 이용하여 발현 시키고자 할 때 그 활성이 나타나지 않는다. 따라서 이 단백질을 박테리아에 발현시키기 위해서는 통과 펩타이드를 제거해야 되는데 정확한 통과 펩타이드의 길이를 알고 있지 않기 때문에 다른 유사한 유전자들과의 상동 성을 비교하여 At1g30370 단백질을 5’쪽에서부터 순차적 삭제(serial deletion)를 한 단백질 3개를 제작하였다. 마이토콘드리아로 가는 통과 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 제외하기 위해서 5’쪽에 결합하는 세 종류의 특이적 프라이머를 BamHI을 태깅하여 제작하였다(5’-tcggatcctcagccgacgattttcttg-3’, 서열번호5; 5’-tcggatccgaaaaaatatccaaaatgtggcg-3’, 서열번호6; 5’-tcggatccatatccaaaatgtggcgtgag-3’, 서열번호7). 3’쪽은 HindⅢ를 태깅한 특이적 프라이머(5’-gcaagctttcataagctataaatagg-3’, 서열번호8)를 제작하고 각 프라이머 조합을 이용해 PCR을 수행하였다. 주형 DNA는 염기 서열이 이미 확인된 At1g30370/pGEM-T Easy 플라스미드를 사용하였다. 각 PCR 결과물과 pMAL-c2X 벡터(New England Biolabs)를 BamHI과 HindⅢ로 자른 후 라이게이션을 하여 각각 93번째 세린(#12-S93), 112번째 글루타민(#12-I114), 114번째 이소루신(#12-E112)까지 삭제시킨 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드를 제작하였다. 재조합된 각 플라스미드를 대장균 BL21-CodonPlus(DE3) RIL (Stratagene)에 도입하여 발현시킨 후, 아밀로스 컬럼 크로마토그래피(New England Biolabs)를 이용해 정제하였다. 정제된 각 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다(Bradford, Anal Biochem., 72:248-54(1976)).

실시예 4: At1g30370 단백질의 아실하이드롤레이즈 활성 측정

각각 93번째 세린(#12-S93), 112번째 글루타민(#12-I114), 114번째 이소루신(#12-E112)까지 삭제시킨 단백질을 대상으로 아실하이드롤레이즈 활성측정을 측 정하기 위해 지질 유사물질인 PNPB(p-NitroPhenyl Butryate; Sigma-Aldrich)를 기질로 사용하는 발색반응을 수행하였다 (Seo et al. Plant J 53: 895(2008)). 효소 활성 반응은 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 5.8, pH 6.6, pH 7.2 및 pH 8.0), 염화나트륨(0 mM, 25 mM 및 100 mM), Triton X-100(0% 및 0.05%; Sigma-Aldrich), 0.75 mM PNPB, 그리고 15 μg의 정제된 각 단백질을 이용하여 총 200 μl, 30℃ 조건에서 진행되었다. 반응 시작 후 정확히 30분 후에 405 nm 파장에서 흡광광도계 (VersaMax; Molecular Devices, http://www.moleculardevices.com)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 분석 결과 #12-I114에서 활성이 가장 높게 나타나 At1g30370 단백질이 아실하이드롤레이즈임을 확인하였고, #12-I114를 이용하여 다양한 조건에서의 단백질 활성을 측정하였다. 먼저 계면활성제인 Triton X-100 유무, pH별, 염 농도 별로 #12-I114 활성 실험 결과 모든 실험에서 Triton X-100이 있을 때, pH는 7에서 8일 때, 염은 있을 때보다 없을 때 그 활성이 높았으나 염 농도에 따른 큰 차이는 없었다(도 2).

실시예 5: At1g30370 이 과다발현된 형질전환체 제작

At1g30370 유전자를 애기장대에 과다 발현시키기 위해 At1g30370의 cDNA를 pBI-121 바이너리 벡터(Clontech)에 재조합하였다. At1g30370 cDNA의 5’쪽에 BglⅡ, 3'쪽에 SacI을 붙이기 위한 프라이머( 5’-gcagatctatggagaacgcattggtcaa-3’, 서열번호9), 5’-cggagctctcataagctataaataggttttggtc-3’, 서열번호10) 조합으로 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응물과 pBI-121 벡터를 BamHI과 SacI으로 자른 후 라이게이션 하였다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스에 형질전환시켰다(Joo et al. Planta 218:976-988(2004)). 애기장대 형질전환은 플로랄 딥(floral dip)방법으로 수행하였다(Clough and Bent. Plant J 16: 735-743(1998)). 형질전환시킨 식물체에서 종자를 받은 후 0.5 X MS, 25 mg/L 카나마이신 배지에서 독립적인 2개의 형질전환 라인을 선별하였다(#12-2, #12-3). 또한 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC, http://www.biosci.ohio-state.edu/~plantbio/Facilities/abrc/abrchome.htm)에서 At1g30370 유전자가 녹-아웃된 돌연변이(III23-3; ABRC Stock No. WiscDsLox 489-492N9)를 주문하여 표현형 분석에 사용하였다.

실시예 6: At1g30370 의 표현형 분석

0.5 X MS(비타민 B5 포함; Duchefa)와 1% 수크로오스(USB) 및 0.8% 아가(Phytoagar; Duchefa)를 포함하는 배지의 pH를 5.7로 맞추어 제조하여 뿌리 생장 관찰에 사용하였다. 동일한 시기에 수확한 야생종, 과다발현체 (#12-2, #12-3), 그리고 녹-아웃 돌연변이(III23-3)의 종자 표면을 소독하여 5일간 4℃의 멸균된 증류수에서 발아 준비를 시킨 다음, 배지에 각각 심었다. 종자를 심은 지 5일째가 될 때까지 22℃의 빛 조건에서 키운 후 뿌리 길이를 관찰하였다.

과다발현체의 경우 야생종에 비해 뿌리가 길어지고, T-DNA 녹-아웃 돌연변이의 경우 뿌리가 짧아지는 표현형을 나타냄으로써 At1g30370 유전자가 발아나 초기성장에 관여할 것임을 유추할 수 있었다(도 4a).

실시예 7: At1g30370 의 노화촉진( Accelerated aging ) 처리 및 발아력 분석

발아력의 차이를 더욱 크게 만들기 위해서 종자를 43℃, 100% 상대습도 상태로 2일 또는 3일간 처리하여 강제적으로 노화시키는 노화촉진 실험을 수행하였다 (Shivakumar et al. Plant J. 50:950-957(2007)). 노화촉진 처리를 한 야생종, 과다발현체 (#12-2, #12-3), 그리고 녹아웃 돌연변이(III23-3)의 종자를 뿌리 길이 관찰과 동일한 방법으로 심은 다음, 5일 후 떡잎이 열린 식물체의 개수를 세어서 기록하였다.

노화촉진의 효과를 눈으로 관찰하기 위해서 종자 외피 내부의 살아있는 조직을 붉게 염색하는 테트라졸리움 클로라이드(Sigma-Adrich)를 사용하였다(Oge et al. Plant Cell 20: 3022-3037(2008)). 테트라졸리움 클로라이드는 종자의 외피 내부의 살아있는 조직을 붉게 염색하는데 종자의 외피를 침투하지는 못하므로 발아가 일어나는 종자만을 선택적으로 붉게 염색할 수 있다. 따라서 염색 후 현미경으로 관찰하게 되면 발아가 시작된 종자는 붉게 염색이 되고 발아하지 못하는 종자는 염색되지 않는 특성을 보인다. 노화촉진 처리를 하거나 하지 않은 종자를 1% 테트라졸리움 클로라이드 용액에 넣고 30℃의 암조건에서 42시간동안 반응시킨 다음 해부현미경(40X; Leica)으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 100℃에서 5분간 끓여 발아력을 완전히 없앤 야생종 종자를 이용하였다.

노화촉진 처리시 야생종과 III23-3은 전혀 발아하지 못하는 상황에서도 과다발현체는 30-50%까지 발아할 수 있는 것을 확인하였다(도 5). 따라서 At1g30370 유전자는 애기장대 씨가 발아하는데 필요한 요소들을 보호함으로써 발아력을 보존해주는 생리적 역할을 담당할 것이라는 사실을 유추해 볼 수 있다.

테트라졸리움 클로라이드 염색의 경우, 끓여서 생리적 활성을 없앤 종자는 전혀 염색이 되지 않고 야생종은 일부가 염색되는 정상 조건에서 과다발현체는 강하게 염색이 되는 반면 III23-3은 야생종보다 약간 약하게 염색되는 것을 관찰하였다. 또한 노화촉진 처리를 하여 야생종과 III23-3이 전혀 염색되지 않는 조건에서도 과다발현체는 염색되는 것을 확인하였다(도 6). 이로써 At1g30370 유전자의 과다발현체는 매우 강한 발아력을 가지고 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a, 도 1b 및 도 1c는 각각 At1g30370 유전자의 염기서열, At1g30370 아미노산 서열 및 At1g30370 유전자가 삽입된 pBI-121 바이너리 벡터의 유전자 지도를 나타낸 그림이다. 도 1c에서, Nos-Pro 및 Nos-Ter은 각각 노팔린 씬타아제 프로모터 및 노팔린 씬타아제 터미네이터이고, NPT Ⅱ는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 Ⅱ 코딩 서열, CaMV 35S-Pro은 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다.

도 2는 At1g30370 단백질을 각각 93번째 세린(#12-S93), 112번째 글루타메이트(#12-I114), 114번째 이소루신(#12-E112)까지 삭제한 단백질을 대상으로 PNPB 분석을 통해 아실하이드롤레이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. TX100은 Triton X-100을 나타낸다.

도 3은 야생형(wild type)과 At1g30370의 과다발현체(#12-2, #12-3), T-DNA 녹-아웃 돌연변이(III23-3)를 정상 조건에서 5일 동안 키운 후 뿌리의 길이를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 4a-4b는 At1g30370 유전자가 씨의 발아에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 동일한 시기에 수확한 야생종과 과다발현체(#12-2, #12-3), T-DNA 녹-아웃 돌연변이 (III23-3)의 씨를 기본 발아배지인 MS-Agar 배지에 심은 후 발아상태를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4a의 왼쪽 사진과 같이 5일 후에는 과다발현체는 야생종에 비해 빨리 발아하여 떡잎이 모두 벌어졌으나 III23-3은 야생종 보다 오히려 늦게 발아하여 대부분 떡잎이 아직 벌어지지 않은 것을 확인하였다.

도 4a의 오른쪽 사진과 같이 발아력의 차이를 더욱 극대화 하기 위해서 씨를 강제적으로 노화시키는 노화촉진 처리를 한 결과(씨를 43℃, 100% 상대습도 상태로 2일간 처리), 이러한 차이는 더욱 커져서 5일 후 과다발현체는 80% 정도가 발아하였지만 야생종은 20%, III23-3은 거의 발아하지 못하는 것으로 나타났다. 도 4b는 이러한 차이를 나타낸 그래프이다.

도 5는 도 4에서의 표현형의 차이를 더욱 크게 하기 위해서 2일간 노화촉진 처리를 한 후 10일 뒤에 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 6은 At1g30370 유전자가 씨의 발아에 미치는 영향을 다시 한 번 관찰하기 위해서 각 씨를 1% 테트라졸리움 클로라이드로 염색한 결과를 나타낸 그림이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Yonsei University <120> Gene Implicated in Improvement of Storage Potential and Sprouting Rate of Seed and Transformed plants with the Same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1590 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggagaacg cattggtcaa aactccactg agaaagctaa gaagaagaag aactaaacgg 60 gtctggagat tgaagcagaa gctaaagctt gcatggaaat ctatcaagat ccgggtcaag 120 tcacatcttc cgggtttctt gtcaaccaag aaacacctct tccacattaa atcacgaaag 180 gaagaacaag atttgtctca agtggcccag aggatctgca aaatctccaa tgactcgacc 240 aaatcactgg cgtttctact tcagcttcca aaatactcag ccgacgattt tcttgaccgc 300 ggcgatctga tgactccagc tgcgtctcca agggaaaaaa tatccaaaat gtggcgtgag 360 cttcacggta gcaacaattg ggagaatctt cttgatcctc tgcatccatg gcttaggaga 420 gaagtaacca aatatggaga attcgtggaa tccgtttatg attcacttga tttcgatcct 480 ttatccgaat tctgtggaag ctctagatac aacaggaaca aactctttga agagcttggt 540 ttaaccagac atggttacaa ggtaacgaaa tacatctacg cgatgtctcg tgtcgacgtt 600 cctcagtggt 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ttggtaccaa gtggcacata agggtctgat ccttaacaaa 1500 cagactggcc ggtgggtgaa gcctgtccgt gcacctgaag acattccctc tccgttaccg 1560 accggaccaa aacctattta tagcttatga 1590 <210> 2 <211> 529 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Glu Asn Ala Leu Val Lys Thr Pro Leu Arg Lys Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Thr Lys Arg Val Trp Arg Leu Lys Gln Lys Leu Lys Leu Ala Trp 20 25 30 Lys Ser Ile Lys Ile Arg Val Lys Ser His Leu Pro Gly Phe Leu Ser 35 40 45 Thr Lys Lys His Leu Phe His Ile Lys Ser Arg Lys Glu Glu Gln Asp 50 55 60 Leu Ser Gln Val Ala Gln Arg Ile Cys Lys Ile Ser Asn Asp Ser Thr 65 70 75 80 Lys Ser Leu Ala Phe Leu Leu Gln Leu Pro Lys Tyr Ser Ala Asp Asp 85 90 95 Phe Leu Asp Arg Gly Asp Leu Met Thr Pro Ala Ala Ser Pro Arg Glu 100 105 110 Lys Ile Ser Lys Met Trp Arg Glu Leu His Gly Ser Asn Asn Trp Glu 115 120 125 Asn Leu Leu Asp Pro Leu His Pro Trp Leu Arg Arg Glu Val Thr Lys 130 135 140 Tyr Gly Glu Phe Val Glu Ser Val Tyr Asp Ser Leu Asp Phe Asp Pro 145 150 155 160 Leu Ser Glu Phe Cys Gly Ser Ser Arg Tyr Asn Arg Asn Lys Leu Phe 165 170 175 Glu Glu Leu Gly Leu Thr Arg His Gly Tyr Lys Val Thr Lys Tyr Ile 180 185 190 Tyr Ala Met Ser Arg Val Asp Val Pro Gln Trp Phe Leu Ser Ser Ala 195 200 205 Leu Gly Glu Thr Trp Ser Lys Asp Ser Asn Trp Met Gly Phe Val Ala 210 215 220 Val Ser Gly Asp Arg Glu Ser Leu Arg Ile Gly Arg Arg Asp Ile Val 225 230 235 240 Val Ala Trp Arg Gly Thr Val Thr Pro Thr Glu Trp Phe Met Asp Leu 245 250 255 Arg Thr Ser Met Glu Pro Phe Asp Cys Glu Gly Lys His Gly Lys Thr 260 265 270 Val Val Lys Val Gln Ser Gly Phe Leu Ser Ile Tyr Asn Ser Lys Ser 275 280 285 Glu Leu Thr Arg Tyr Asn Lys Glu Ser Ala Ser Glu Gln Thr Met Asp 290 295 300 Glu Val Lys Arg Leu Val Asn Phe Phe Lys Asp Arg Gly Glu Glu Val 305 310 315 320 Ser Leu Thr Ile Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Leu Met 325 330 335 Asn Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Asp Val Pro Ala Leu Ser Gly Asn Ile 340 345 350 Ser Val Ile Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Leu Ala Phe Lys 355 360 365 Glu Lys Leu Asn Ser Leu Gly Val Lys Val Leu Arg Val Val Asn Lys 370 375 380 Gln Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Gly Ile Val Phe Asn Lys Val Leu 385 390 395 400 Asn Lys Leu Asn Pro Ile Thr Ser Arg Leu Asn Trp Val Tyr Arg His 405 410 415 Val Gly Thr Gln Leu Lys Leu Asp Val Phe Ser Ser Pro Tyr Val Lys 420 425 430 Arg Asp Ser Asp Leu Gly Arg Ala His Asn Leu Glu Val Tyr Leu His 435 440 445 Val Leu Asp Gly Phe His Arg Lys Lys Ser Gly Phe Arg Val Asn Ala 450 455 460 Arg Arg Asp Val Ala Ser Val Asn Lys Ser Thr Asp Met Leu Leu Asp 465 470 475 480 His Leu Arg Ile Pro Glu Phe Trp Tyr Gln Val Ala His Lys Gly Leu 485 490 495 Ile Leu Asn Lys Gln Thr Gly Arg Trp Val Lys Pro Val Arg Ala Pro 500 505 510 Glu Asp Ile Pro Ser Pro Leu Pro Thr Gly Pro Lys Pro Ile Tyr Ser 515 520 525 Leu <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcggatccat ggagaacgca ttggtc 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtaaaacgac ggccagtgcc aagctttc 28 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcggatcctc agccgacgat tttcttg 27 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcggatccga aaaaatatcc aaaatgtggc g 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcggatccat atccaaaatg tggcgtgag 29 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcaagctttc ataagctata aatagg 26 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcagatctat ggagaacgca ttggtcaa 28 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggagctctc ataagctata aataggtttt ggtc 34

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물.
(a) 상기 제 1 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진용 조성물.
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 식물세포.
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질 전환된 식물체.
다음의 단계를 포함하는 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법:

(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부 터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 식물체의 발아촉진 또는 생장촉진 방법:

(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.