KR20230163036A - 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC(Photosystem I subunit VII) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 콩 유래 PSaC 유전자는 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절할 수 있으므로, 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성이 조절된 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC 유전자 및 이의 용도{PSaC gene from Glycine max controlling disease resistance against Soybean mosaic virus and uses thereof}
본 발명은 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC(Photosystem I subunit VII) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
콩(Glycine max)은 장미목(Rosales) 콩과(Leguminosae)에 속하는 한해살이 쌍떡잎 식물로, 한반도를 포함하는 아시아 동북부 지역이 원산지로 알려져 있으며, 전 세계적으로 550속 13,000종이 알려져 있고, 우리나라에는 36속 92종이 자생하고 있다. 콩은 단백질과 지방의 공급원으로 사용되고 있으며, 현재는 공업용 소재로도 각광받고 있는 작물이다.
콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus, SMV)는 포티바이러스과(Potyviridae) 포티바이러스속(Potyvirus)에 속하는 바이러스로, 진딧물을 통해충매전염되며 콩에서 최대 43%의 종자전염이 이루어지는 것으로 보고되어 있다. 이 바이러스는 콩 생산량과 직접적으로 관련있는 꼬투리 수의 감소, 꼬투리 당 종자수의 감소, 종자의 크기 및 중량의 감소와 콩 껍질의 얼룩생성 등을 초래한다.
한편, 광합성은 명반응 및 암반응으로 나뉘는데, 명반응에서는 광계 I(photosystem I), 시토크롬(cytochrome), 광계 II(photosystem II) 및 ATPase 합성을 통해 NADPH와 ATP를 생성하고, 암반응에서는 NADPH와 ATP를 이용한 켈빈 회로(calvin cycle)를 통해 포도당을 합성한다. 엽록체는 광합성에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 방어 관련 호르몬을 합성하고 원형질연락사(plasmodesmata)의 투과성을 조절하기 때문에, 어떤 바이러스는 식물체의 엽록체를 표적으로 하여 숙주의 방어 기작을 감소시킨다고 알려져 있다. 또한, 어떤 RNA 바이러스는 엽록체의 특정 단백질을 자신의 복제를 위해 사용하기도 한다. 따라서, 바이러스에 대한 저항성이 낮은 식물체가 바이러스에 감염되면 엽록체의 단백질 기능에 문제가 생겨 광합성 과정이 감소하게 되는 반면, 바이러스에 대한 저항성이 높은 식물체는 광합성 관련 유전자의 발현이 증가하기도 한다.
식물에서 유전자 매개 저항성(gene mediated resistance)은 바이러스 감염을 예방하거나 줄이는 방어 기전 중 하나로, 식물 저항성 유전자는 열성과 우성으로 분류된다. 열성 저항성 유전자는 바이러스 증식이 바이러스와 숙주 요소 사이의 불화합적인(incompatible) 상호작용에 의해 제대로 발현되지 않는 수동적인 저항성을 제공하는 반면, 우성 저항 유전자(R 유전자)는 병원체 작동인자나 비병원성(avirulence, Avr) 요소를 인지하는 저항 단백질(R 단백질)을 암호화하여 능동적인 저항성을 제공한다.
특히, 콩 모자이크 바이러스는 국내에 11개 계통(G1 to G7, G5H, G6H, G7H, G7a)들이 보고되어 있으며, 현재까지 알려진 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성 유전자로는 Rsv1, Rsv3 및 Rsv4가 알려져 있으나, 이러한 저항성 유전자를 극복하는 계통들이 계속 보고되고 있어, 새로운 저항성 유전자 탐색에 대한 연구가 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1552140호에는 '콩 모자이크 바이러스에 대한 내성이 증진된 콩 형질전환 식물체 및 그 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1964658호에는 '콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 GmPAP2.1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 PSaC 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 콩 식물체에서 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus, SMV) 감염에 의해 발현양에 차이를 보이는 PSaC 유전자를 선발하였고, PSaC 유전자 과발현 콩 형질전환체 및 PSaC 유전자 녹다운 콩 형질전환체를 제조하여 SMV에 대한 병 저항성을 평가한 결과, PSaC 유전자 과발현 콩 형질전환체는 비형질전환체에 비해 SMV에 대한 병 저항성이 증가하는 반면, PSaC 유전자 녹다운 콩 형질전환체는 비형질전환체에 비해 SMV에 대한 병 저항성이 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물체의 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체을 재분화하는 단계;를 포함하는, 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 콩 유래 PSaC 유전자는 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절할 수 있으므로, 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성이 조절된 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 콩 품종 L29에 G5H(비병원성 SMV 계통) 또는 G7H(병원성 SMV 계통)을 각각 감염시킨 후 유전자의 발현양을 분석한 히트맵(heat map)이다. Mock; 인산염 버퍼 처리군, hpi; 감염 후 시간(hour post infection).
도 2는 콩 모자이크 바이러스 감염에 의해 발현양이 변화하는Glyma.18G155300 유전자의 염기서열을 Soybase database assembly 4 v.1(https://soybase.org)를 통해 분석하여 표적 단백질을 예측한 결과이다.
도 3은 PSaC 유전자를 과발현하는 형질전환체의 G7H(병원성 SMV 계통)에 대한 병 저항성을 분석한 결과로, A는 PSaC 유전자의 과발현을 위해 제작된 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP::PSaC)의 모식도이고, B는 상기 벡터를 콩 품종 Lee74의 초엽에 접종시킨 후, GFP의 발현 정도를 자외선으로 확인한 결과이고, C 및 D는 GFP의 RNA 발현양 및 단백질 발현양을 측정한 결과이다. Healthy; 아무것도 처리하지 않은 대조군, dpi; 감염 후 일(day post infection).
도 4는 PSaC 유전자를 과발현하는 형질전환체의 G5H(비병원성 SMV 계통)에 대한 병 저항성을 분석한 결과로, A는 PSaC 유전자의 과발현을 위해 제작된 SMV 감염성 벡터(G5H::eGFP::PSaC)의 모식도이고, B는 상기 벡터를 콩 품종 Lee74의 초엽에 접종시킨 후, GFP의 발현 정도를 자외선으로 확인한 결과이고, C는 상기 벡터를 콩 품종 Lee74의 초엽에 접종시킨 후, GFP의 단백질 발현양을 측정한 결과이다. Healthy; 아무것도 처리하지 않은 대조군.
도 5는 PSaC 유전자를 녹다운시킨 형질전환체의 G7H(병원성 SMV 계통)에 대한 병 저항성을 분석한 결과로, A는 PSaC 유전자의 발현양을 측정한 결과이고, B는 식물체의 표현형을 관찰한 것이고, C는 PSaC 유전자 녹다운용 벡터(BPMV-PSaC)를 콩 품종 Lee74의 초엽에 접종시킨 후, GFP의 발현 정도를 자외선으로 확인한 결과이고, D 및 E는 GFP의 RNA 발현양 및 단백질 발현양을 측정한 결과이다. Healthy; 아무것도 처리하지 않은 대조군, Mock; 인산염 버퍼 처리군, BPMV-EV; 공벡터 처리군, BPMV; bean pod mottle virus.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물체의 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 PSaC 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 방법은, 상기 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질 감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체을 재분화하는 단계;를 포함하는, 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 콩 유래 PSaC 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시키면 비형질전환체에 비해 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된, 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 식물체는 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 증가된 것이 특징이다.
상기 식물체는 콩과(Leguminosae)에 속하는 식물들일 수 있으며, 예를 들면, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 땅콩, 렌즈콩, 동부, 팥 등일 수 있으며, 콩 모자이크 바이러스의 숙주 식물이면 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자가 과발현되면 콩 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
콩(대두) 품종 Lee74(Rsv-null) 및 L29(+Rsv3)는 국립식량과학원 중부작물부 재배환경과에서 분양받았으며, 25℃, 70% 상대습도, 16시간/8시간 광조건으로 설정된 생장 챔버에서 배양하였다.
2. PSaC 유전자 과발현용 바이러스 벡터 제작 및 바이러스 감염
하기 표 1의 프라이머를 사용하여 콩 품종 L29의 cDNA로부터 PSaC 유전자의 CDS 서열을 클로닝한 후, Seo 등(2009, Plant Pathol. J. 25:54-61)에 기술된 방법에 따라 GFP(green fluorescent protein)가 태그된 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP 또는 G5H::eGFP)의 GFP 코딩 서열 하류에 삽입하여 PSaC 유전자 과발현용 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP::PSaC 또는 G5H::eGFP::PSaC)를 제조하였다(도 3A, 도 4A).
본 발명에서 사용한 프라이머 정보
용도 프라이머 서열 서열번호
PSaC 유전자
클로닝용		 F: 5'-gcacgcgtATGTCACATTCAGTAAAGATTTA-3' 3
R: 5'-gcacgcgtATAAGCTAGACCCATGCTTTGAGT-3' 4
PSaC 유전자
발현양 측정용		 F: 5'-ACTCAATGTGTCCGAGCCTG-3' 5
R: 5'-CAGTCCTCTATTCTTGGGGCA-3' 6
GFP 유전자
발현양 측정용		 F: 5'-GACGACGGCAACTACAAGAC-3' 7
R: 5'-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3' 8
Actin11 유전자
발현양 측정용		 F: 5'-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3' 9
R: 5'-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3' 10
이후, 콩 품종 Lee74의 초엽에 상기 PSaC 유전자 과발현용 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP::PSaC 또는 G5H::eGFP::PSaC) 10 ㎍을 럽-접종(rub-inoculation)하였다. PSaC 유전자가 삽입되지 않은 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP 또는 G5H::eGFP) 접종군을 대조군으로 이용하였다. 접종 7일 또는 14일 후에 감염된 식물체에 휴대용 UV 광원으로 자외선을 조사하여 GFP의 전신 발현(systemic expression)을 확인하였고, 각 초엽에서 추출한 총 RNA와 단백질을 이용하여 GFP의 발현양을 측정함으로써, SMV 바이러스의 증식 정도를 분석하였다.
3. PSaC 유전자 녹다운용 바이러스 벡터 제작 및 바이러스 감염
Zhang 등(2010, Plant Physiol. 153:52-65)에 기술된 방법에 따라 BPMV(bean pod mottle virus) 침묵 벡터에 PSaC 유전자의 CDS 서열을 안티센스 방향으로 삽입하여 PSaC 유전자 녹다운용 벡터(BPMV-PSaC)를 제조하였다.
콩 품종 Lee74의 초엽에 상기 녹다운용 벡터(BPMV-PSaC) 10 ㎍을 럽-접종하였다. PSaC 유전자가 삽입되지 않은 BPMV 공벡터(BPMV-EV) 접종군을 대조군으로 이용하였다. 이후, G7H::eGFP 벡터로 감염된 식물을 이용한 즙액 접종(sap-inoculation)을 통해 SMV 감염을 유도하였다. 접종 14일 후에 각 초엽에서 총 RNA를 추출하고 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 PSaC 유전자의 발현양을 측정하였고, 감염된 식물체에 휴대용 UV 광원으로 자외선을 조사하여 GFP의 전신 발현을 확인하였으며, 각 초엽에서 추출한 총 RNA와 단백질을 이용하여 GFP의 발현양을 측정함으로써, SMV 바이러스의 증식 정도를 분석하였다.
4. qRT-PCR 및 웨스턴 블랏 수행
TRIzol(Sigma)을 이용하여 초엽으로부터 총 RNA를 추출하였고, GoScript 키트(Promega)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 SYBR Green(Promega)으로 수행하였고, 상대적 정량화는 2-ΔΔCt 방법을 통해 분석하였다. Actin11 유전자를 내부 대조군(internal control)로 사용하였으며, 상기 표 1의 프라이머를 사용한 qRT-PCR을 수행하여 GFP 유전자의 발현양을 측정하였다.
또한, Alazem 등(2018, Viruses. 10:581)에 기술된 방법에 따라 초엽 0.1 g으로부터 단백질을 추출하였고, 항-GFP 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하여 GFP 단백질의 발현양을 측정하였다.
실시예 1. 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus, SMV) 감염에 의한 유전자 발현 차이 분석
콩 품종 L29은 Rsv3 유전자를 가지고 있어 G5H(비병원성 SMV 계통)에 대한 저항성은 있으나, G7H(병원성 SMV 계통)에 대한 저항성은 없다고 알려져 있다. 콩 품종 L29에 G5H 또는 G7H을 각각 감염시킨 후 얻은 RNA-seq. 결과를 이용하여 유전자의 발현 변화를 분석하였다.
그 결과, G5H 감염에 의해 발현양이 증가하는 유전자들 중에서, G7H 감염 초기에는 발현이 증가하나 G7H 감염 후기에는 발현이 감소하는 Glyma.18G155300 유전자를 확인함으로써, Glyma.18G155300 유전자가 SMV에 대한 저항성과 관련이 있음을 유추할 수 있었다(도 1).
이에, Glyma.18G155300 유전자의 염기서열을 Soybase database assembly 4 v.1(https://soybase.org) 및 Pfam v. 33.1(http://pfam.xfam.org/)을 통해 분석한 결과, PSaC(Photosystem I subunit VII) 유전자를 암호화할 것으로 예측되었다(도 2).
실시예 2. PSaC 유전자 과발현 형질전환체 제조 및 SMV에 대한 병 저항성 분석
2-1. G7H(병원성 SMV 계통)에 대한 병 저항성 분석
GFP(green fluorescent protein)가 태그된 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP)에 PSaC 유전자의 CDS 서열을 삽입하여 PSaC 유전자 과발현용 SMV 감염성 벡터(G7H::eGFP::PSaC)를 제조하였다(도 3A). 콩 품종 Lee74(Rsv-null)의 초엽에 G7H::eGFP::PSaC 벡터를 럽-접종(rub-inoculation)하여 PSaC 유전자 과발현 형질전환체를 제조하였고, 동시에 SMV 감염을 유도하였다. 접종 14일 후, 휴대용 UV 광원으로 자외선을 조사하여 GFP의 전신 발현(systemic expression)을 확인하였고, 접종 7일 또는 14일 후, 초엽으로부터 총 RNA와 단백질을 추출하여 GFP의 발현양을 각각 측정하여 SMV 바이러스의 증식 정도를 분석하였다.
그 결과, 벡터 대조군(G7H::eGFP)은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(Healthy)보다 GFP의 발현양이 증가한 반면, PSaC 유전자 과발현 형질전환체(G7H::eGFP::PSaC)는 벡터 대조군(G7H::eGFP)보다 GFP의 발현양이 감소하는 것을 확인함으로써(도 3B, C, D), PSaC 유전자가 G7H(병원성 SMV 계통)의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다.
2-2. G5H(비병원성 SMV 계통)에 대한 병 저항성 분석
GFP가 태그된 SMV 감염성 벡터(G5H::eGFP)에 PSaC 유전자의 CDS 서열을 삽입하여 PSaC 유전자 과발현용 SMV 감염성 벡터(G5H::eGFP::PSaC)를 제조하였다(도 4A). 콩 품종 Lee74의 초엽에 G5H::eGFP::PSaC 벡터를 럽-접종하여 PSaC 유전자 과발현 형질전환체를 제조하였고, 동시에 SMV 감염을 유도하였다. 접종 14일 후, 휴대용 UV 광원으로 자외선을 조사하여 GFP의 전신 발현을 확인하였고, 초엽으로부터 단백질을 추출하여 GFP의 발현양을 측정하여 SMV 바이러스의 증식 정도를 분석하였다.
그 결과, 벡터 대조군(G5H::eGFP)은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(Healthy)보다 GFP의 발현양이 증가한 반면, PSaC 유전자 과발현 형질전환체(G5H::eGFP::PSaC)는 벡터 대조군(G5H::eGFP)보다 GFP의 발현양이 감소하는 것을 확인함으로써(도 4B, C), PSaC 유전자가 G5H(비병원성 SMV 계통)의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. PSaC 유전자 녹다운(knockdown) 형질전환체 제조 및 SMV에 대한 병 저항성 분석
BPMV(bean pod mottle virus) 침묵 벡터에 PSaC 유전자를 안티센스 방향으로 삽입하여 PSaC 유전자 녹다운용 벡터(BPMV-PSaC)를 제조하였다. 콩 품종 Lee74의 초엽에 상기 녹다운용 벡터를 럽-접종하여 PSaC 유전자의 녹다운을 유도하였고, G7H::eGFP로 감염된 식물을 이용한 즙액 접종(sap inoculation)을 통해 SMV 감염을 유도하였다. 접종 14일 후, 초엽으로부터 총 RNA를 추출하여 PSaC 유전자의 발현양을 측정하였고, 접종 12일 후 각 식물체의 표현형을 확인하였다. 또한, 접종 10일 후, 휴대용 UV 광원으로 자외선을 조사하여 GFP의 전신 발현을 확인하였고, 초엽으로부터 총 RNA와 단백질을 추출하여 GFP의 발현양을 각각 측정하여 SMV 바이러스의 증식 정도를 분석하였다.
그 결과, PSaC 유전자가 녹다운된 형질전환체(BPMV-PSaC)는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(Healthy) 또는 벡터 대조군(BPMV-EV)보다 PSaC 유전자의 발현양이 감소한 것을 확인함으로써, PSaC 유전자의 발현이 저해되는 것을 확인하였고(도 5A), 벡터 대조군 및 PSaC 유전자가 녹다운된 형질전환체는 전형적인 BPMV의 얼룩 반점 증상이 나타날 뿐, 음성 대조군과 유사한 표현형을 나타내는 것을 확인하였다(도 5B). 또한, PSaC 유전자가 녹다운된 형질전환체는 인산염 버퍼 처리군(Mock)보다는 GFP의 발현양이 증가하였으나, 벡터 대조군의 GFP의 발현양과 유의미한 차이가 없는 것을 확인하였다(도 5C, D, E).
상기 결과를 바탕으로, 콩 식물체에서 PSaC 유전자를 과발현시키면 SMV 바이러스에 대한 병 저항성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> PSaC gene from Glycine max controlling disease resistance against Soybean mosaic virus and uses thereof <130> PN22071 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 240 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 atgtcacatt cagtaaagat ttatgataca tgtataggat gtactcaatg tgtccgagcc 60 tgcccaacgg atgtattaga aatggtacct tgggacggat gtaaagctaa acaaatagct 120 tctgccccaa gaacagagga ctgtgttggt tgtaagaggt gtgaatccgc ctgtccgaca 180 gatttcttaa gtgttagagt ttatttatgg catgaaacaa ctcaaagcat gggtctagct 240 240 <210> 2 <211> 80 <212> PRT <213> Glycine max <400> 2 Met Ser His Ser Val Lys Ile Tyr Asp Thr Cys Ile Gly Cys Thr Gln 1 5 10 15 Cys Val Arg Ala Cys Pro Thr Asp Val Leu Glu Met Val Pro Trp Asp 20 25 30 Gly Cys Lys Ala Lys Gln Ile Ala Ser Ala Pro Arg Thr Glu Asp Cys 35 40 45 Val Gly Cys Lys Arg Cys Glu Ser Ala Cys Pro Thr Asp Phe Leu Ser 50 55 60 Val Arg Val Tyr Leu Trp His Glu Thr Thr Gln Ser Met Gly Leu Ala 65 70 75 80 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcacgcgtat gtcacattca gtaaagattt a 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcacgcgtat aagctagacc catgctttga gt 32 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actcaatgtg tccgagcctg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cagtcctcta ttcttggggc a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gacgacggca actacaagac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tccttgaagt cgatgccctt 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atcttgactg agcgtggtta ttcc 24 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctggtcctg gctgtctcc 19

Claims (7)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물체의 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 병 저항성을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 방법.
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체을 재분화하는 단계;를 포함하는, 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 콩 유래 PSaC 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 증가된 것을 특징으로 하는, 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 제조된, 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 콩(Glycine max) 유래 PSaC(Photosystem I subunit VII) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)에 대한 저항성 조절용 조성물.
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