KR102024354B1 - 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 조절하는 애기장대 유래의 cml20 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 굴성을 조절하는 애기장대 유래의 CML20(calmodulin-like protein 20) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, CML20 단백질은 원형질연락사에서 칼로스의 축적을 조절하여 식물체의 굴성(tropism)을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 뿌리 성장을 조절할 수 있으므로, 농업분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 조절하는 애기장대 유래의 CML20 유전자 및 이의 용도{CML20 gene from Arabidopsis thaliana for controlling plant tropism and root growth and uses thereof}

본 발명은 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 조절하는 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물체에서 원형질연락사(plasmodesmata)는 이웃한 세포를 연결하는 심플라즈믹(symplasmic) 나노채널로 이루어져 있고, 짧은 거리의 분자 이동을 위한 경로를 제공한다. 상기 나노채널들은 식물세포의 세포벽에서 대사물질, 호르몬, 단백질 및 RNA 분자를 포함하는 신호 전달 물질의 세포 내 이동 또는 전달을 허용함으로써, 세포간 커뮤니케이션에서 중요한 역할을 한다. 칼로스(callose, β-1,3-글루칸)는 원형질연락사의 투과성(permeability) 조절에 중요한 인자 중 하나로, 원형질연락사의 목(neck) 부위에 축적되어 원형질연락사 채널을 수축시킨다.

GSL8(Glucan Synthase-like 8) 단백질은 세포판 형성, 기공 패터닝 및 배축(hypocotyl)의 굴성 반응동안에 칼로스를 합성하는 중요한 효소이다. 굴광성 반응동안, GSL8-매개 칼로스 축적 및 원형질연락사의 투과성은 옥신 농도구배의 형성과 유지에 필수적이다. 이전의 연구를 통해 GSL8이 결손된 애기장대 식물체는 원형질연락사에 칼로스 축적이 감소되어 과도한 투과성이 야기되고, 굴성 반응동안에 옥신 농도구배 형성이 파괴되어 배축의 굴성 반응이 불가능하였다(Han, X. et al., 2014, Developmental cell 28:132-146).

세포질의 칼슘이온에 의해 칼로스 합성이 유도된다는 것과, 세포질의 칼슐이온이 옥신 처리에 의해 일시적으로 증가된다는 보고가 있었다. 그러나, 어떻게 세포질의 칼슘이온이 원형질연락사의 칼로스를 조절하는지에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다. 식물체의 칼슘 결합 단백질로는 CaM(Calmodulin)와 CML(calmodulin-like), CDPKs(Ca2+-dependent protein kinases) 및 CBL(calcineurin-B like)의 세 개의 주요 패밀리가 있다. 본 발명에서는 GSL8 단백질과 상호작용하는 칼슘 결합 단백질을 조사하여 CML20 단백질을 동정하였고, 상기 단백질이 원형질연락사의 칼로스 축적 조절과 식물체의 뿌리 성장에 관여함을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1568911호에는 GSL8 칼로스 합성효소(callose synthase)의 발현조절을 통한 '칼로스 합성 조절을 통한 식물 생장 및 굴성의 조절방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1178470호에는 At5g47390 유전자를 이용한 '식물성장 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 조절하는 애기장대 유래 CML20 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 GSL8 칼로스 합성효소의 세포질 도메인과 결합하는 단백질을 동정하여, 칼슘 결합 단백질 중 하나인 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 확인하였고, 상기 CML20 유전자의 과발현 식물체 및 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체를 분석한 결과, CML20 유전자의 과발현 식물체에서 원형질연락사의 칼로스 축적이 증가되어 투과성이 감소되는 것을 확인하였고, 돌연변이 식물체에서는 원형질연락사의 칼로스 축적이 감소되어 원형질연락사의 투과성이 증진되는 것을 확인하였다. 또한, CML20 유전자의 과발현 식물체는 야생형에 비해 주근의 길이 및 곁뿌리의 수가 증가되어 있으며, 돌연변이 식물체에서는 주근의 길이 및 곁뿌리의 수가 감소되어 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 굴성(tropism) 및 뿌리 성장을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 굴성 및 뿌리 성장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 굴성 및 뿌리 성장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 굴성 및 뿌리 성장 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 CML20 단백질의 발현조절을 통해 원형질연락사의 칼로스 수준을 조절함으로써 식물체의 굴성을 조절할 수 있고, 뿌리 성장 또한 조절할 수 있으므로, CML20의 발현 수준을 조절하여 작물 또는 화훼식물의 광이용 형태 디자인 또는 작물의 생산성 조절 등에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

도 1은 GSL8과 상호작용하는 단백질을 동정하기 위한 Y2H 결과(A)와 CML20과 전체길이 GSL8의 in vivo 상호작용을 BiFC 분석으로 확인한 결과(B), 및 아닐린 블루로 염색한 칼로스와 BiFC 스팟의 위치를 확인한 결과(C)이다. 스케일 바; 10 μm.
도 2는 CML20 유전자의 발현수준에 따른 원형질연락사의 칼로스 축적(A) 및 투과성 분석 결과(B)이다. Col-0; 야생형, cml20-1 및 cml20-4; CML20 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이체, CML20OE#2 및 CML20OE#3; CML20 유전자의 과발현 식물체. p(*)<0.05, p(**)<0.01, p(***)<0.001, 스케일 바; 20 μm.
도 3은 GSL8의 발현이 억제된 애기장대(GSL8 RNAi 또는 ds8)에서 억제된 굴성 반응이 CML20 과발현에 의해 회복되는 것을 보여주는 결과이다. A; 굴광성, B; 굴중성, 화살표는 각각 빛 또는 중력 방향을 의미, C; A 및 B의 정량값, p(**)<0.01, p(***)<0.001. 스케일 바; 0.5 cm.
도 4는 덱사메타손 처리 유무에 따른 CML20 및 GSL8 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 dsGSL8 계통+dex의 배축에서 아닐린 블루를 이용한 칼로스 염색 결과로, (A)는 빛 조사 전의 염색 결과이고, (B)는 (A)를 정량화한 것이며, (C)는 5시간의 빛 조사 후의 염색 결과이다. p(**)<0.01, p(***)<0.001, 스케일 바; 20 μm.
도 6은 CML20 유전자의 발현수준에 따른 애기장대 식물체의 성장 표현형을 확인한 결과로, (A)는 23일령 식물체의 모습이고, (B)는 4일령 식물체의 뿌리 모습이고, (C)는 9일령 식물체의 뿌리 모습과 생성된 곁뿌리 수를 보여준다. p(*)<0.05, p(**)<0.01, p(***)<0.001, 스케일 바; 0.2 cm.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 굴성(tropism) 및 뿌리 성장을 조절하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 '굴성(tropism)'이란, 식물의 기관이 환경 특히, 광 자극에 반응해서 자극 방향으로, 혹은 반대 방향으로 굽는 운동을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 굴성은 구체적으로 굴중성(gravitropism) 또는 굴광성(phototropism)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물체의 굴성 조절 방법에 있어서, 상기 CML20 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 굴성 조절 및 뿌리 성장을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 CML20 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 굴성 및 뿌리 성장 조절 방법은, 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 향상시키는 것일 수 있고, 또는 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 억제시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 식물체의 굴성 조절 방법은 구체적으로는, 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 원형질연락사(plasmodesmata)에서 칼로스(callose)의 축적을 증가시켜 원형질연락사의 투과성(permeability) 감소 및 옥신의 심플라스믹(symplasmic) 확산 억제가 일어나 옥신의 농도구배가 형성되어 식물체의 굴성을 향상시키는 것일 수 있고, 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 원형질연락사에서 칼로스의 축적을 감소시켜 원형질연락사의 투과성을 증가시키고 이로인해 옥신의 농도구배가 형성되지 않아 식물체의 굴성을 억제시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 굴성 및 뿌리 성장 조절 방법에 있어서, 상기 뿌리 성장 조절은 주근(primary root)의 신장 및 곁뿌리(lateral root) 형성의 조절을 의미하며, 구체적으로는, 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자가 과발현되면, 야생형에 비해 주근이 길고 형성된 곁뿌리의 수가 증가되는 것일 수 있고, 반대로 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 억제되면, 야생형에 비해 주근이 짧고 곁뿌리의 수가 감소되는 것일 수 있다.

옥신(auxin)은 식물 호르몬의 일종으로 식물의 줄기 끝, 뿌리 끝의 생장점에 존재하는 정단 분열조직에서 생성된 세포들이 커지는 부위인 신장대(elongation zone)에서 길이 생장을 촉진하고, 줄기와 뿌리의 발달, 꽃과 과실의 발생, 그리고 굴성운동 등을 유도하는 물질로서, 특히, 내생성(endogenous) 옥신은 자엽(합성 부위)에 존재하지만 배축 후크(hypocotyl hook) 영역에 국한되어 있다.

칼로스(callose)는 식물 꽃가루 생성 및 발달, 체관 및 물관세포 형성 동안 다양한 기능을 수행하는 다당류로, 식물발달뿐 아니라 신호전달(원형질연락사), 세포질분열(cytokinesis) 시 세포판 형성, 각종 스트레스 대응(고온, 병해충, 상처 등)에서 중요한 기능을 수행하는 세포벽 베타-1,3-글루칸(beta-1,3-glucan)이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(Geneticin), 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 굴성(tropism) 및 뿌리 성장이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 애기장대 유래 CML20 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 있어서 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 굴성 및 뿌리 성장이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체는 CML20 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가된 경우에는 굴성 및 뿌리 성장이 증가된 것을 특징으로 하며, CML20 단백질 코딩 유전자의 발현이 감소된 경우에는 굴성 및 뿌리 성장이 억제된 것을 특징으로 한다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 굴성(tropism) 및 뿌리 성장 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자 또는 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환함으로써 식물체의 굴성 및 뿌리 성장을 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 CML20 유전자를 과발현하도록 엔코딩된 벡터라면 CML20 단백질의 과발현에 의해 식물체의 굴성 및 뿌리 성장이 향상될 수 있고, 상기 애기장대 유래 CML20 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 CML20 유전자의 발현을 저해하는 벡터라면 CML20 단백질의 발현 감소에 의해 식물체의 굴성 및 뿌리 성장이 감소될 수 있다.

본 발명의 용어 "유전자의 과발현" 및 "유전자 발현 저해/감소"는 각각 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상 및 이하로 CML20 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 성장 조건

본 발명에서, 야생형 애기장대(Col-0), 과발현 및 기능상실 돌연변이 식물체를 포함하는 모든 식물체는 16시간 명(22℃)/8시간 암(20℃) 주기의 성장챔버에서 성장시켰다. 세 개의 독립적인 T-DNA 삽입 cml20 돌연변이체(SALK_079974.49.50.x, CS1002907 및 CS1002889; 순차적으로 cml20-1, cml20-2 및 cml20-4)는 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC, http://abrc.osu.edu)로부터 구매하였다. T-DNA 삽입의 확인은 T-DNA left border 프라이머(LBb1.3 for SALK_079974.49.50.x; LB1 for CS1002907 및 CS1002889)와 CML20에 특이적인 프라이머(LP1/RP1 for SALK_079974.49.50.x; LP2/RP2 for CS1002907 및 CS1002889)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다.

PCR에 사용된 프라이머 정보

프라이머명	염기서열 (5'→3')
LBb1.3	ATTTTGCCGATTTCGGAAC (서열번호 3)
LB1	GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT (서열번호 4)
LP1	TAGATGATGATGTGCGCAGAG (서열번호 5)
RP1	AGGGTTCCATGATTGAAGAAG (서열번호 6)
LP2	ACGACTGTTAAACGTTGTGGG (서열번호 7)
RP2	CTGTGTCGTCAATCCATGATG (서열번호 8)

굴성 분석을 위한 유묘는 0.8%의 한천을 포함하는 1x MS(Murashige and Skoog) 배지의 암 조건에서 수직으로 성장시켰으며, 곁뿌리 분석을 위한 유묘는 페트리 디쉬 위에 0.8% 한천, 1% 수크로스를 포함하는 1/2 MS 배지에 수직적으로 성장시킨 후 사용하였다.

2. 벡터 컨스트럭트 및 형질전환

CML20 과발현 형질전환 식물체의 제조 또는 일시적 로컬라이제이션 분석을 위해서, 총 cDNA로부터 증폭한 PCR 산물을 pDONR207 플라스미드(Invitrogen, 미국)에 클로닝하였다. 상기 결과로 생성된 엔트리 클론을 게이트웨이 바이너리 벡터인 pMDC43 또는 pEG203로 클로닝하였다. 상기 벡터 컨스트럭트를 Col-0 또는 dsGSL8 RNAi 계통(한국등록특허공보 제1568911호)의 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 도입하였다. CML20 프로모터와 GUS 유전자의 융합 컨스트럭트 제조를 위해, 5' 플랭킹 서열(CML20의 시작 코돈의 상류 1.1kb 프로모터 지역)을 게노믹 DNA로부터 증폭하고, PCR 산물을 게이트웨이 바이너리 벡터인 pKGWFS7에 LR 반응을 통해 클로닝하였다. pCML20::gCML20:GFP 컨스트럭트를 위해, 2.4kb의 CML20 전장 서열을 pDONR207 플라스미드에 먼저 클로닝한 후, pMDC107 벡터에 LR 반응으로 다시 클로닝시켜 제조하였다. 모든 PCR 유래 컨스트럭트는 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다.

3. RNA 추출, RT-PCR 및 실시간 PCR

유전자 발현 분석을 위한 RNA 시료는 Qiagen RNeasy plant mini kit로 추출하였다. RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 및 실시간 PCR을 위한 제1가닥 cDNA는 1㎍의 총 RNA와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여, QuantiTect Reverse Transcription 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 합성하였다. RT-PCR 분석은 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 SsoFast^TM EvaGreen^® Supermix(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 ECO^TM Real-time PCR system(Illumina, 미국)으로 하기의 조건으로 수행하였다: 95℃ 10분 → 95℃ 10초, 55℃ 30초 및 72℃ 30초; 40회 반복. 각 유전자의 발현 수준은 ACTIN2의 발현 수준으로 표준화하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였으며, 상대적인 유전자 발현 수준은 2^-ΔΔt 방법으로 분석하였다. 실시간 PCR 분석을 위해, 5일령의 유묘를 덱사메타손을 포함하거나 포함하지 않은 새로운 MS 배지로 옮겨 5일간 배양시킨 후, 새롭게 자라난 뿌리 부분을 수거하여 RNA 추출에 사용하였다.

4. BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation) 분석

pDONR207 내의 GSL8 및 CML20의 LR 재조합은 각각 split-Venus YFP 데스티네이션 벡터인 pDEST-VYNE(R)^GW (Venus^N) 및 pDEST-^GWVYCE (Venus^C)로 이루어졌다. 재조합된 벡터는 아그로박테리움 균주 GV3101에 형질전환하였다. 5주령의 야생담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 아그로-인필트레이션하였으며, 48시간 후에 YFP 형광을 Olympus FV1000 공초점현미경(Olympus, 일본)을 사용하여 시각화하였다.

5. LCI ( Luciferase Complementation Imaging) 어세이

LCI 어세이를 위해서, 유전자의 코딩 서열을 포함하고 있는 엔트리(entry) 클론을 게이트웨이 데스티네이션 벡터 LUC ^N 및 LUC ^C 로 각각 클로닝시켰다. 상기 컨스트럭스로 인필트레이션된 6주령 야생담배 잎에 루시페린(luciferin)을 분사하였고, LUC 형광신호를 low-light cooled CCD 이미징 장치(Andor iXon; Andor, 북아일랜드)로 분석하였다.

6. Yeast Two Hybrid(Y2H)

GSL8의 아미노-말단 1.5kb의 cDNA를 Y2H 벡터인 pGBD-C3(Clontech, 미국)의 GAL4-결합 도메인에 융합시켰다. 애기장대 영양조직으로부터 준비된 cDNA 라이브러리 P02109(Clontech)를 GSL8과 결합하는 단백질의 동정을 위한 Y2H에 사용하였다. Y2H 분석은 제조사의 프로토콜을 일부 변형하여 수행하였다. 양성 콜로니로부터 분리한 플라스미드를 시퀀싱을 위해 대장균 DH5α 균주에 형질전환하였다. 효모에 재형질전환한 후 상호작용을 재확인하였다. 효모 균주 PJ69-4A로의 형질전환은 아세트산리튬(lithium acetate) 방법을 사용하였으며, 루신과 트립토판이 결여된 합성 dropout 고체배지에서 형질전환체를 선별하였다. 30℃에서 3~4일간 배양한 후, 효모 세포를 루신과 트립토판이 결여된 합성 dropout 액체배지에서 24시간 추가로 배양한 후, OD₆₀₀을 측정하여 효모 배양액 1㎖을 취하여 원심분리한 후, TE 버퍼(pH 7.4)에 재현탁하여 OD₆₀₀ 값이 0.33이 되도록 하였다. 상기 재현탁액 3㎕를 취하여 루신, 트립토판 및 히스티딘이 결여된 합성 dropout 배지위에 떨어뜨려 히스티딘 요구성을 확인하였다. 비특이적인 성장을 막기 위해 배지에 0.3mM의 3-amino-1,2,4-triazole(3-AT)를 첨가하였으며, 30℃에서 배양하며 효소 세포의 성장을 기록하였다.

7. 칼로스 염색

애기장대 배축을 칼로스 염색 버퍼(CSB)에 1시간 동안 두었다. CSB는 0.1%(w/v) 아닐린 블루(aniline blue)와 1M 글리신(pH 9.5)을 2:3의 부피비로 혼합하여 제조하였다. CSB에 담궈두었던 시료를 꺼내어 세척하고, 형광을 공초점현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.

8. 굴성 특이도 분석

애기장대 유묘는 MS 고체 플레이트에 수직으로 성장시켰다. 굴광성 분석을 위해, 3일령의 연화된(etiolated) 유묘를 새로운 MS 고체 배지로 옮긴 후, 저강도(2 μmol·m^-1)의 청색광에 3시간 동안 노출시켰다. 굴중성 반응(gravitropic response)의 경우, 3일령의 연화된 유묘를 새로운 MS 고체 배지로 옮긴 후 플레이트를 90도 회전시켜 6시간 동안 두었다. 자극 처리 기간동안 유묘의 곡률(curvature) 정도는 Image J 프로그램(https://imagej.nih.gov/ij/)을 이용하여 측정하였다. 각 실험은 20개체의 유묘를 사용하여 2회 반복 수행하였다.

9. 배축 로딩 어세이

3일령의 연화된 애기장대 유묘를 배축 로딩 어세이를 위해 사용하였다. 염색약 로딩을 위해, 5㎎/㎖의 HPTS(8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)를 포함하는 각각의 한천 블럭을 잘린 배축 위에 올려 5분간 두었다. 그 후 유묘를 15분간 세척하고, 상기 형광염료의 이동을 공초점현미경으로 관찰하였다.

실시예 1. CML20과 GSL8의 상호작용

원형질연락사에서 GSL8(glucan synthase-like 8) 효소에 의해 합성된 칼로스의 축적은 굴광성(phototropism) 동안 옥신 농도구배 형성에 중요한 역할을 한다(Han, X. et al., 2014, Developmental cell 28:132-146). 이러한 GSL8 단백질과 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해서, GSL8 단백질의 아미노 말단 1.5kb를 이용하여 애기장대 cDNA 라이브러리의 Y2H(yeast 2 hybrid) 동정을 수행하였다. 그 결과, CML20, CML19 및 CML9를 포함하는 몇몇의 칼슘 결합 단백질들이 확인되었으며, GSL8의 7개의 상동체 중 GSL10과 GSL11이 CML20(calmodulin-like protein 20)과 상호작용하는 것이 확인되었다(도 1A).

BiFC 분석을 통해 CML20과 전체길이 GSL8의 in vivo 상호작용을 추가로 확인하였으며(도 1B), 스팟으로 확인된 CML20/GSL8의 BiFC 신호는 아닐린 블루로 염색한 칼로스와 공동으로 위치하는 것으로 확인되었다(도 1C).

실시예 2. CML20의 원형질연락사 칼로스 축적 조절 기능

GSL8이 원형질연락사에서 칼로스의 축적 조절 및 원형질연락사의 트래픽킹에 관여된 칼로스 합성효소인 것을 고려하면, CML20이 GSL8과의 상호작용을 통해 원형질연락사의 SEL(size exclusion limit) 조절에 관여할 수 있으리라는 가설로 이어진다. 또한, 칼로스 합성의 양성 조절자로서 세포질의 칼슘의 기능이 보고된 바 있다. 이에 본 발명에서는, CML20 단백질의 원형질연락사 조절의 잠재적인 기능을 확인하기 위해서, CML20 유전자의 녹아웃(knock-out) 및 과발현 계통에서 배축의 칼로스 수준을 분석하였다.

그 결과, 세 개의 독립적인 T-DNA 삽입 cml20 돌연변이체(cml20-1, cml20-2 및 cml20-4)는 야생형(Col-0)과 비교하여 칼로스 스팟이 현저하게 감소된 것으로 확인되었다(도 2A). 반면, 35S::CML20-GFP로 형질전환된 두 개의 독립적인 과발현 식물체(CML20^OE)는 칼로스의 축적이 증가된 것으로 관찰되었다. 원형질연락사의 투과성을 확인하기 위해서 심플라즈믹 트레이서인 HPTS를 3일령의 연화된 유묘의 배축 끝에 로딩하여 분석한 결과, 과발현 식물체(CML20^OE)에서는 HPTS의 이동이 지체되는 것이 관찰되어 원형질연락사의 투과성이 제한되는 것을 보여주었으며, 녹아웃 돌연변이체에서는 HPTS의 이동이 야생형보다 광범위하게 이루어진 것으로 관찰되어 원형질연락사의 투과성이 증가되어 있음을 보여주었다(도 2B).

실시예 3. CML20의 굴성 반응 조절 기능

CML20이 배축의 굴성 반응(tropic response) 동안에 GSL8의 조절에 관여하는지 확인하기 위해, 굴광성 반응(phototropic response) 및 굴중성 반응(gravitropic response) 분석을 수행하였다.

야생형 애기장대의 유묘는 정상적인 굴성 반응을 보여준 반면, RNAi로 GSL8의 발현을 감소시킨 애기장대(이하 dsGSL8)의 유묘는 어떠한 굴성 반응도 보여주지 않았다. CML20의 과발현은 덱사메타손(dexamethasone, 이하 dex) 처리 조건하에서 dsGSL8 계통 유묘의 굴성 반응을 일부 회복시키는 것으로 관찰되었다(도 3). 이러한 굴성 반응의 회복이 RNAi 시스템의 억제에 의한 것인지 확인하기 위해, RT-PCR을 통해 GSL9의 전사체 수준을 분석하였다. 그 결과, dsGSL8 계통의 GSL8 RNA 수준은 CML20 과발현에 의해 변화되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, dsGSL8/CML20^OE 계통은 야생형 및 dsGSL8 계통과 비교하여 매우 증가된 CML20 전사체 수준을 보여주었지만, GSL8의 발현 수준은 CML20 과발현에 의해 변화되지 않았음을 보여주었다. RT-PCR과 qTR-PCR 결과를 통해, dex 처리는 야생형에서는 변화가 없었지만, dsGSL8 계통과 dsGSL8/CML20^OE 계통에서 GSL8 전사체 수준을 60~70% 감소시키는 것을 알 수 있었고, 이를 통해 CML20의 과발현은 RNAi 기술로 GSL8의 발현을 감소시킨 계통(dsGSL8)에서 dex에 유도되는 RNA 간섭에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 4). 흥미롭게도, dsGSL8 계통에서 dex 무처리 조건에 비해 처리 조건에서 CML20의 전사체 수준이 약하게 유도되는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 CML20 전사체가 원형질연락사의 투과성 증가에 대한 반응으로 원형질연락사의 투과성을 보상하기 위해 상향 조절되었음을 의미하였다(도 4).

아닐린 블루를 이용한 칼로스 염색을 통해 dsGSL8 계통+dex의 배축에 칼로스의 축적이 저해된 것이 확인되었고, CML20의 과발현을 통해 일부 회복됨을 알 수 있었다(도 5A-B). dsGSL8 계통+dex에서 굴광성 반응동안 파괴된 비대칭의 원형질연락사의 칼로스 스팟의 분포도 CML20의 과발현에 의해 회복되는 것으로 관찰되었다(도 5C). 상기의 결과를 통해, CML20이 원형질연락사의 칼로스 축적 조절 및 굴성 반응에 관여되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. CML20의 식물 발달 조절

이전의 연구에서 gsl8 식물체의 발달 저해가 보고된 바 있어, CML20 유전자의 녹아웃 돌연변이 또는 과발현이 식물체의 발달에 미치는 영향을 분석하였다.

cml20 돌연변이체와 과발현체(CML20^OE)에서 두드러진 차이가 관찰되었는데, 야생형과 과발현 식물체는 cml20 돌연변이체에 비해 증진된 성장 표현형을 보여주었다(도 6A). 또한, CML20 과발현식물체(CML20^OE)는 주근(primary root)의 길이 및 곁뿌리(lateral root)의 수가 야생형에 비해 증가된 반면, cml20 돌연변이체는 주근의 길이와 곁뿌리의 수가 야생형 및 과발현식물체에 비해 감소되어 있는 것이 관찰되었다(도 6B-C). 상기 결과를 통해, CML20 단백질이 잎의 성장, 주근 신장(elongation) 및 곁뿌리의 형성을 포함하는 식물체의 성장을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> CML20 gene from Arabidopsis thaliana for controlling plant tropism and root growth and uses thereof <130> PN18170 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 510 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtcgagta tatacagaac tgtttcgaga aaagagaaac cgagacgtca tcatggattg 60 acgacacaga agaagcaaga gattaaggaa gcttttgagc tatttgacac tgatggttct 120 ggtaccattg atgctaaaga gcttaatgtt gctatgaggg cgcttggttt tgaaatgacg 180 gaagagcaaa tcaacaaaat gatagctgat gtggataaag atggaagtgg agctatagat 240 tttgatgagt ttgttcatat gatgactgct aagattggtg aaagagacac aaaagaagag 300 ctcactaaag cattccagat cattgatctt gacaaaaatg ggaagatatc tccggatgat 360 atcaaacgca tggcaaagga cttgggtgag aatttcactg atgctgagat acgagagatg 420 gttgaagaag cagaccgaga ccgtgatggt gaagttaaca tggatgaatt catgaggatg 480 atgaggagaa ctgcttatgg tggtaactag 510 <210> 2 <211> 169 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ser Ser Ile Tyr Arg Thr Val Ser Arg Lys Glu Lys Pro Arg Arg 1 5 10 15 His His Gly Leu Thr Thr Gln Lys Lys Gln Glu Ile Lys Glu Ala Phe 20 25 30 Glu Leu Phe Asp Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ile Asp Ala Lys Glu Leu 35 40 45 Asn Val Ala Met Arg Ala Leu Gly Phe Glu Met Thr Glu Glu Gln Ile 50 55 60 Asn Lys Met Ile Ala Asp Val Asp Lys Asp Gly Ser Gly Ala Ile Asp 65 70 75 80 Phe Asp Glu Phe Val His Met Met Thr Ala Lys Ile Gly Glu Arg Asp 85 90 95 Thr Lys Glu Glu Leu Thr Lys Ala Phe Gln Ile Ile Asp Leu Asp Lys 100 105 110 Asn Gly Lys Ile Ser Pro Asp Asp Ile Lys Arg Met Ala Lys Asp Leu 115 120 125 Gly Glu Asn Phe Thr Asp Ala Glu Ile Arg Glu Met Val Glu Glu Ala 130 135 140 Asp Arg Asp Arg Asp Gly Glu Val Asn Met Asp Glu Phe Met Arg Met 145 150 155 160 Met Arg Arg Thr Ala Tyr Gly Gly Asn 165 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 attttgccga tttcggaac 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcgtggaccg cttgctgcaa ct 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tagatgatga tgtgcgcaga g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agggttccat gattgaagaa g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acgactgtta aacgttgtgg g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgtgtcgtc aatccatgat g 21

Claims (9)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리 성장을 억제하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 CML20 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 뿌리 성장이 억제된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 삭제
7. 제5항의 방법에 의해 제조된 뿌리 성장이 억제된 형질전환 식물체.
8. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 CML20(calmodulin-like protein 20) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 뿌리 성장 억제용 조성물.

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