KR101664451B1 - SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 조절을 통한 식물의 개화시기 조절 방법 - Google Patents

SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 조절을 통한 식물의 개화시기 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SVP-FLM-β 단백질 복합체가 주위 온도의 작은 변화를 감지하는 식물 개화 조절인자임을 규명한 것에 기초하여, SVP-FLM-β 단백질 복합체 형성을 조절하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개화 조절용 FLM-β RNAi 및 SVP RNAi를 이용하여 FLM-β와 SVP의 발현억제 또는 상호작용을 조절함으로써, 개화시기를 조절하여 갑작스런 기온 변화에 따른 작물 생산성 저하 및 생태계 변화를 막을 수 있는 효과가 있다.

Description

SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 조절을 통한 식물의 개화시기 조절 방법 {Method for Controlling Flowering Time by Regulating of SVP-FLM-beta Protein Complex Formation}
본 발명은 SVP-FLM-β 단백질 복합체가 주위 온도의 작은 변화를 감지하는 식물 개화 조절인자임을 규명한 것에 기초하여, SVP-FLM-β 단백질 복합체 형성을 조절하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference: RNAi)는 매우 특이적이고, 효율적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 메카니즘으로, 이는 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스로 구성되는 이중가닥 RNA를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적유전자의 발현을 억제한다. 선충에서 번역되지 않는 저분자의 RNA(non-coding RNA)가 발육단계에 있어서 유전자의 발현을 제어하는 것이 알려진 이후, 선충 게놈에 많은 저분자 RNA가 존재하는 것이 발견되었다(Fire et al., Nature 391:806-811, 1998). 이러한 저분자 RNA의 크기는 25nt 이하 정도로, 이를 miRNA(micro RNA)라고 하며, 선충에서는 200 종류 이상 존재한다. 식물에 있어서도 miRNA가 발견되었으며, 저분자 RNA(21 내지 25nt) 중 목적유전자의 배열과 완전히 일치하는 것을 소간섭 RNA(small interfering RNA 혹은 siRNA), 불완전한 일치를 나타내는 것을 마이크로 RNA(micro RNA 혹은 miRNA)라고 부른다. 이러한 저분자 RNA는 비번역(non-coding) RNA로부터 RNA 프로세싱 효소인 다이서(DICER)에 의한 절단에 의해 생기며, 절단 전의 RNA는 두 가닥 RNA(stem loop RNA)를 형성하고 있다. 그 후 목적 유전자 영역에 결합하여 RISC (RNA induced silencing complex) 등에 의해 발현제어가 일어난다. 식물에 있어서도 DICER 유사 단백질(Carpel factory/ Suspensor/ Short integument)이 존재하며, 최근에는 다양한 생물체에서 특정유전자의 발현을 녹아웃하는 도구로서 RNAi 방법을 많이 이용하고 있다.
일반적으로 식물의 개화시기는 환경조건에 따라 영향을 받거나 유전적으로 이미 결정되어 있으며, 대부분의 식물은 개화가 적합한 시기에 일어나도록 개화시기를 조절할 수 있는 메커니즘을 가지고 있다. 이러한 조절 메커니즘은 식물체 내부적 발달신호 및 빛, 온도와 같은 외부 환경요인에 의해 영향을 받는다(Poething et al.,Science, 250:923-930, 1990). 식물은 고착성 생물체로 다양한 환경적 스트레스에 노출되어 있기 때문에 주위로부터 많은 영향을 받는다. 이러한 환경 스트레스 중 가장 큰 영향을 미치는 것이 온도이다. 동결온도와 같은 저온을 감지하여 온도범위에 내성을 지닌 식물들은 많이 알려져 있으며, 식물은 낮은 온도와 같은 온도 스트레스에 노출되면 그에 부합되는 메커니즘을 가진다. 최근 밝혀진 바에 따르면, 식물은 저온에 감응하는 어떤 구별되는 메커니즘을 가진다는 것을 알 수 있다(Sharm. P et al., Bioessay 27:1048-59, 2005). 광범위한 온도변화에 대한 식물의 감응 메커니즘은 많이 알려져 있으며, 최근 주위온도의 미세한 변화가 저온에서 개화를 지연시키는데 영향을 미친다는 보고가 있다(Fitter et al., Science 296:1689-91, 2002; Cook et al., PNAS 109:9000-5, 2012; Craufurd et al., J. Exp. Bot. 60:2529-39, 2009).
종래의 개화시기를 조절하는 방법인 4℃ 이하 또는 37℃ 이상에서 개화시기 조절 기작은, 10℃-27℃ 범위의 대기온도에서 미세한 온도 변화에 의한 개화시기 조절 기작과는 별개이며, 현재 주위 온도 변화에 따른 개화시기 조절에 대한 분자 메커니즘은 아직까지 완전히 규명되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 애기장대로부터 주위온도의 작은 변화를 감지하여 개화시기를 조절할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, SVP-FLM-β 단백질 복합체가 주위온도 변화를 인지하여 식물의 개화시기를 조절할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대기의 미세한 온도 변화에 따른 개화시기를 조절할 수 있는 개화시기 조절 인자 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 억제시켜 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 개화시기 조절인자인 SVP-FLM-β 단백질 복합체 형성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물에서 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, SVP RNAi 및/또는 FLM-β RNAi가 도입되어 있는 개화시기가 촉진된 재조합 식물 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 식물체에 개화 촉진인자 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 식물체에서 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 SVP 및 FLM-β의 발현수준으로 확인하는 단계; 및 (c) SVP 및 FLM-β의 발현수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 후보물질을 개화시기 촉진인자로 선택하는 단계를 포함하는 개화시기 촉진인자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 개화 조절용 FLM-β RNAi 및 SVP RNAi를 이용하여 FLM-β와 SVP의 발현억제 또는 상호작용을 조절함으로써, 개화시기를 조절하여 갑작스런 기온 변화에 따른 작물 생산성 저하 및 생태계 변화를 막을 수 있는 효과가 있다.
도 1A는 svp-32, flm-3 및 flc-3 돌연변이체, 이중 돌연변이체 및 삼중 돌연변이체의 온도에 따른 개화시기를 나타낸 것이다.
도 1B는 svp-32, flm-3 및 flc-3 돌연변이체에서의 FT, SOC1 및 TSF 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 1C는 GVG:FLM-β 및 GVG:SVP 식물체에 30μM 덱사메타손(DEX) 처리 8시간 후의 FT, SOC1 및 TSF 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 1D는 svp-32, flm-3 및 flc-3 돌연변이체, 이중 돌연변이체 및 삼중 돌연변이체의 잎의 수 비율(16/23)을 나타낸 것이다.
도 2는 돌연변이체의 개화시기를 나타낸 것이다(RLN: rosette leaf number, CLN: cauline leaf number, TLN: total leaf number).
도 3A는 in vitro GST pull-down 분석에 의한 FLM-β와 SVP 단백질의 상호작용을 나타낸다. SVP-GST는 쿠마시 염색으로 확인하였고, FLM-β는 35S로 표지하여 확인한 것이다.
도 3B는 이분자형광상보법을 이용하여 양파표피에서의 SVP-nYFP와 FLM-β-cYFP 발현을 확인한 결과이다. 화살표는 핵이며, 스케일 바는 200μm이다.
도 3C는 상호 면역침강법을 이용한 FLM-β와 SVP 단백질의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 3D는 염색질 면역침강법을 이용하여 FT, SOC1 및 TSF 게놈 부위에 결합한 FLM을 확인한 결과이다. 16℃에서 pFLM:gFLM:GFP flm-3 (흰색) 및 pFLM:gFLM:GFP svp-32 flm-3 (검은색) 돌연변이체로 수행하였으며, GFP 및 cMyc 항체로 분석하였다.
도 4A는 각각 다른 온도의 야생형 Col에서 SVP(푸른색), FLC(보라색) 및 FLM-β(주황색)의 전사 수준을 나타낸 것이다.
도 4B는 온도에 따른 SVP의 안정성을 (-)MG132 및 (+)MG132 조건에서 확인하였다. 23℃로 배양한 pSVP:SVP:HA svp-32 식물에 사이클로헥시미드(CHX) 처리 하여 각각 다른 온도로 옮긴 후, SVP 단백질 양을 확인한 결과이다.
도 4C는 상호 면역침강법으로 분석한 온도에 따른 SVP-FLM-β 복합체 양을 나타낸 것이다. SVP:HA 및 FLM-β-GFP를 각각 다른 온도에서 애기장대의 엽육원형질체에 일시적으로 발현시킨 후, 항-HA 항체로 면역침강 시키고 GFP로 면역블롯을 수행하였다.
도 4C 및 3D는 FT, SOC1 및 TSF 게놈 부위에 결합한 SVP를 염색질 면역침강법을 이용하여 확인한 결과이다. pSVP:SVP:HA svp-32(푸른색), pSVP:SVP:HA svp-32 flc-3(보라색) 및 pSVP:SVP:HA svp-32 flm-3(주황색) 돌연변이체를 장일조건(도 3D)과 단일조건(도 3E)에서 온도를 변화시켜 측정하였다.
도 5는 7개의 miRNA 형질전환 식물체에서 SVP 및 FLM-β 유전자의 발현을 확인한 것이다.
도 6는 miRNA 형질전환 식물체의 개화시기를 비교한 사진이다.
도 7은 miRNA 형질전환 식물체들의 개화시기를 잎의 개수로 나타낸 결과이다(A: SVP miRNA 형질전환 식물체, B: FLM-β miRNA 형질전환 식물체).
도 8은 FLM 발현에 춘화 및 지베렐린 처리가 미치는 영향을 확인한 것이다. A, C는 돌연변이에서의 FLM 발현을 확인한 결과이며, B, D는 춘화 및 지베렐린 처리에 의한 FLM 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 GVG:FLM-β 및 GVG:SVP 형질전환 식물체에 덱사메타손을 처리한 결과이다.
도 10은 클로닝, ChIP-qPCR, RT-qPCT 및 염기서열분석에 사용한 프라이머를 나타낸 것이다(서열번호 49-139).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 식물의 주위온도 인지 및 변화에 대한 개화조절 기작을 결정하기 위해, 주위 온도 변화에 민감성을 가지는 개화시기 조절인자가 손실된 돌연변이체에서 개화촉진 유전자의 발현을 분석하고, 개화촉진 유전자인 FT(Flowering locus T), SOC1(Supressor of Overexpression of Constans1) 및 TSF(Twin Sister of FT)의 발현을 증가 또는 억제시키는 개화시기 조절인자를 선별하였다. 선별된 개화시기 조절인자의 상호작용을 조사하기 위해 시험관 내 GST 풀다운 분석, 이분자형광상보법, 상호 면역침강법 및 염색질 면역침강법 등의 다양한 방법을 수행하였으며, 그 결과 FLM-β 단백질과 SVP 단백질이 서로 결합하여 단백질 복합체를 형성한다는 것을 확인하였다. 또한, 서로 다른 온도에서의 SVP, FLM 및 FLC의 발현을 조사하여, 이 세 유전자의 작용온도 범위가 다르다는 것을 확인하였다.
온도 변화에 의한 FLM-β의 발현 조절은 RNA 수준에서 일어났지만, SVP의 경우 단백질 수준에서 발현 조절이 일어나는 것을 밝히고, 온도 변화에 의한 FLM-β 전사체 및 SVP 단백질의 감소에 따라 SVP-FLM-β 복합체도 감소한 것을 확인하였다. 즉, SVP-FLM-β 단백질 복합체는 작은 온도 변화에 의해 그 복합체 형성을 조절하는 것을 알 수 있었다. 또한, SVP-FLM-β 단백질 복합체가 온도 특이적으로 FT, SOC1 및 TSF 등과 같은 하위 개화촉진 유전자에 결합하여 이들의 발현에 영향을 준다는 것을 확인함으로써, SVP-FLM-β 단백질 복합체가 미세 온도 변화를 감지하여 개화시기를 조절하는 것을 알 수 있었다.
이에, SVP-FLM-β 단백질 복합체 형성을 조절하여 개화시기를 조절하고자, RNAi를 이용하여 SVP 또는 FLM-β의 발현이 억제되면 상기 SVP-FLM-β 단백질 복합체 형성도 억제되고, 온도 감응성 감소와 그에 따른 개화가 촉진된다는 것을 확인하였다. 이로써, 갑작스런 온도변화에 따른 식물의 생산성 저하 또는 생태계 변화에 SVP-FLM-β 복합체의 형성을 이용한 가능성을 제시하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 식물에서 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 증진시켜 식물의 개화시기를 지연시킬 수 있으며, 상기 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 증진은 SVP 및/또는 FLM-β의 발현을 증가시키는 물질의 도입 또는 처리에 의한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 억제시켜 식물의 개화시기를 촉진시킬 수 있으며, 상기 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 억제는 SVP 및/또는 FLM-β의 발현을 억제시키는 물질의 도입 또는 처리에 의한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 개화시기는 10℃-27℃ 범위의 대기온도에서 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SVP 및/또는 FLM-β의 발현을 억제시키는 물질은 SVP RNAi 및/또는 FLM-β RNAi인 것이 바람직하며, 상기 RNAi는 siRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 SVP RNAi는 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 31 내지 39로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시키는 것이 바람직하며, 상기 FLM-β RNAi는 서열번호 4 내지 6 및 서열번호 40 내지 48로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 상기 SVP 및 FLM-β에 대한 인공 miRNA의 표적부위 외에 인공 miRNA 도입으로 인해 SVP 및 FLM-β의 발현감소가 예상되는 추가 지역을 선별하였다(표 2).
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SVP RNAi는 서열번호 7/8; 9/10; 11/12; 13/14; 15/16 및 17/18로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA인 것이 바람직하며, 상기 FLM-β RNAi는 서열번호 19/20; 21/22; 23/24; 25/26; 27/28 및 29/30로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 SVP 및 FLM-β에 대한 인공 miRNA를 도입한 형질전환 식물체를 제작하여, SVP 및 FLM-β mRNA의 분해를 유도함으로써 SVP 및 FLM-β의 발현을 억제하고, 상기 형질전환 식물체가 온도 감응성이 감소하여 개화가 촉진되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, SVP RNAi 및/또는 FLM-β RNAi가 도입되어 있는 개화시기가 촉진된 재조합 식물에 관한 것이다. 본 발명에서는 상기 SVP RNAi 및 FLM-β RNAi 형질전환 식물체의 세대 진전을 통한 각각의 순종라인 확보와 개화시기 표현형을 확인하고자 한다.
본 발명에 있어서, 상기 SVP RNAi는 서열번호 7/8; 9/10; 11/12; 13/14; 15/16 및 17/18로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA에 의해 SVP 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하며, 상기 FLM-β RNAi는 서열번호 19/20; 21/22; 23/24; 25/26; 27/28 및 29/30으로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA에 의해 FLM-β 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 RNAi 벡터를 도입 또는 miRNA를 이용하여 상기 식물체를 형질전환시키는 방법으로서, 공지된 다양한 방법, 즉, 아그로박테리아-매개된 형질전환, 입자 총 충격(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(silicon cargide whiskers), 초음파 처리(sonication) 및 전기천공법(electroporation) 등이 알려져 있다. 이러한 방법들 중 가장 널리 사용되는 것은 아그로박테리움의 자연적인 형질전환 시스템(natural transformation system)을 이용하는 방법과 유전자 총을 이용하여 직접 DNA를 쏘아넣는 방법이다. 아그로박테리움은 Ti 또는 Ri 플라스미드를 갖고 있는데, 상기 플라스미드는 식물체에 외래 유전자로 형질전환시킬 수 있는 유전자들을 갖고 있다. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움을 통한 유전자 전이방법은 Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238(1989) 등과 같은 다수의 문헌에 기재되어 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"란 적당한 숙주세포로 외래 유전자를 도입하여 그것이 발현될 수 있게 하는 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 현재 식물세포를 형질전환시키기 위하여 개발된 벡터 중에서 가장 많이 쓰이는 벡터는 이원체 벡터(binary vector)다. 이원체 벡터는 2개의 플라스미드로 구성되어 있는데, 하나는 아그로박테리움 감염에 필요한 유전자와 T-DNA를 전달하는데 필요한 유전자가 들어 있고, 다른 하나에는 목적 유전자가 삽입될 수 있는 T-DNA가 들어 있다. 후자는 대장균과 아그로박테리움에서 염색체와 독립적으로 복제될 수 있을 뿐 아니라, 항생체 저항성 유전자를 갖고 있으며, 식물세포로의 유전자 전이에 필수적인 T-DNA의 양끝 말단 부위 (left boarder (LB) 및 right boarder (RB))를 지니고 있도록 제조되었다. 당업계에는 다양한 이원체 벡터가 공지되어 있다.
용어 식물(체)는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포, 식물조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 의해 개화가 조절될 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 식물체에 개화 촉진인자 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 식물체에서 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 SVP 및 FLM-β의 발현수준으로 확인하는 단계; 및 (c) SVP 및 FLM-β의 발현수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 후보물질을 개화 촉진인자로 선택하는 단계를 포함하는 개화시기 촉진인자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
식물재료 및 성장조건
본 발명에 사용된 모든 돌연변이는 컬럼비아(Col)background로 하며, 별도로 언급하지 않는다. 야생형 종자는 애기장대 생물학 자원센터(ABRC)로부터 획득하였다. 35S:CO, 35S:GI, gi-2, gFLM:GUS, gSVP:GUS, co-9, flc-3, flm-1(Ws), flm-3, fca-9, flk-1, fpa-2, ft-10, fve-4, fy-1(Ler), gi-3(Ler), ld-1, soc1-2, svp-32 및 tsf1-1은 이전에 공지된 방법으로 얻었다(Michaels et al., Plant Cell 11:949-956, 1999; Balasubramanian et al., PLoS Genet 2:e106, 2006; Scortecci et al., Plant J. 26:229-236, 2001; Lee et al., Genes Dev. 21:397-402, 2007; Baurle et al., Science 318:109-112, 2007; Lim et al., Plant Cell 16:731-740, 2004, Lee et al., Plant Cell 6:75-93, 1994; Simpson et al., Cell 113:777-787, 2003; Schomburg et al., Plant Cell 13:1427-1436, 2001; Kim et al., Nat. Genet. 36:167-171, 2004; Ausin et al., Nat. Genet. 36:162-166; Lee et al., Genes Dev. 14:2366-2376, 2000; Tamaguchi et al., Plant Cell Physiol. 46:1175-1189; Yoo et al., Plant Physiol. 139:770-778, 2005). 이중 돌연변이체의 homozygosity는 genotyping PCR을 통해 확인하였다. 야생형, 돌연변이체 및 형질전환 식물은 빛이 120mol m-2s-1강도로 제공되는, 장일조건(LD) [16시간(light)/8시간(dark)] 또는 단일 조건(SD)[9시간(light)/15시간(dark)]으로 27℃, 23℃, 16℃, 10℃ 및 5℃ 온도에서 토양 또는 MS 배지에서 성장시켰다. 개화시기는 총 잎의 합계로 측정하였다.
춘화처리는 종자를 4℃로 4주간 보관한 후, 23℃ 장일조건으로 토양 또는 MS 배지에서 성장시켰다. 지베렐린 처리는 23℃ 단일조건으로 토양 또는 MS 배지에서 성장시킨 후, 발아하면 100μM GA3용액을 개화할 때까지 매주 뿌려주었다. 온도 이동 실험은 23℃에서 6일간 재배한 식물을 10℃, 16℃ 또는 27℃로 옮겨 2일간 재배하였다(도 8).
형질전환 식물
pSVP:SVP:HA는 SVP의 ORF를 PCR로 증폭하여, 약 2.5kb SVP 프로모터가 들어있는 pCHF3 벡터에 클로닝 하여 제작하였다. GVG:FLM-β 및 GVG:SVP는 각각 유전자의 ORF를 PCR로 증폭하여, pTA7002 벡터에 클로닝 하였다. pTA7002 벡터는 덱사메타손으로 GVG(GAL4-VP16-GR)을 유도하여 표적유전자를 발현시키기 위해 사용하였다(Aoyama et al., Plant J. 11:605-612, 1997). 35S:SVP:HA는 pSVP:SVP:HA의 SVP:HA 부위를 PCR로 증폭하여 pCHF3 벡터에 클로닝하였다. Floral dip 방법을 변형하여 식물을 형질전환하였다(도 9).
Genomic FLM 서열분석
Genomic DNA 추출은 Plant DNA extraction kit(GeneAll, Korea)를 사용하였다. FLM-β 및 FLM-δ 전사물을 구별하기 위해, 1.5kb 게놈조각(인트론 1부터 엑손 4까지)을 Pfusion polymerase(MEB, MA)를 사용하여 PCR을 수행한 후, 염기서열분석을 하였다. 야생형의 FLM 염기서열 GenBank accession 번호는 다음과 같다: KF49688(Ler), KF496889(An-1), KF49690(JI-3), KF496891(KZ-9), KF49692(Tsu-0), KF496893(Rubezhnoe-1), KF49694(En-1), KF496895(Li-5), KF49696(Bla-2), KF496897(Sei-0), KF49698(Mh-0) 및 KF496899(Gr-3).
실시예 1: 개화시기 조절인자가 손실된 돌연변이체의 개화시기 확인 및 개화촉진 유전자에 대한 발현 분석
1-1 : 돌연변이체의 개화시기 확인
식물의 주위 온도 인지 및 변화에 대한 신호전달 메카니즘을 결정하기 위한 첫단계로서, 주위 온도 변화에 민감성을 가지는 개화시기 조절 인자가 손실된 돌연변이체를 선정하였다. 하루 동안의 온도범위인 5℃-27℃에서 flm, flc 및 svp 돌연변이체의 개화시기를 확인하였다(도 1A).
그 결과, 야생형 애기장대는 저온에서 개화가 지연되었으나, svp-32 돌연변이체는 모든 온도범위에서 개화가 되었으며(도 1A), flm-3은 10℃ 이하를 제외한 범위의 온도에서 개화가 되었고, flc-3은 16℃ 이하에서만 개화가 지연되었다. 이것은 SVP가 가장 넓은 온도 범위(5℃-27℃)에 작용한다는 것과 MADS box 단백질인 FLM, FLC 및 SVP가 서로 다른 온도에서 작용한다는 것을 나타낸다.
또한, svp 돌연변이를 포함하는 이중 돌연변이와 삼중 돌연변이들도 5℃-27℃ 온도 범위에서 개화가 되어, SVP가 다른 두 유전자에 비해 개화시기 조절에 미치는 영향이 가장 큰 것을 확인하였다(도 2).
1-2 : 돌연변이체의 개화촉진 유전자 발현 분석
실시간 정량 PCR 분석을 위해 RNA를 애기장대로부터 RNA Purification Reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하였다. RNA는 Nanodrop ND-200 분광 광도계(Nanodrop Technologies)로 측정하여 A260/A230>2.0 및 A260/A230>1.8의 RNA를 사용하였다. DNA 오염을 제거하기 위해, RNA 샘플에 DNaseI(NEB, USA)를 37℃에서 60분간 처리하였다. 1-2㎍ RNA는 cDNA를 합성하는데 사용하였으며, 실시간 정량 PCR 분석은 Roche SYBR Green Master mixture(Roche Applied Science, USA)를 사용하여 LightCycler 480(Roche Applied Science, USA)로 수행하였다. 레퍼런스 유전자로는 PP2AA3 및 SAND family 단백질을 사용하였다. 또한, GVG:FLM-β 및 GVG:SVP 식물에서 덱사메타손으로 GVG(GAL4-VP16-GR)을 유도하여 표적유전자를 발현시킨 후, 개화촉진 유전자의 발현을 분석하였다.
그 결과, 주위 온도 변화에 민감성을 가지는 개화시기 조절인자가 손실된 돌연변이체에서의 개화촉진 유전자(FT, TSF 및 SOC1) 발현은 svp-32는 모든 온도범위인 10℃-27℃에서 높게 발현되었으며, flm-3은 16℃-27℃에서 높게 나타났고, flc-3은 23℃-27℃에서 높게 나타났다(도 1B). 또한, 덱사메타손이 처리된 식물에서는 개화촉진 유전자의 발현 감소를 확인할 수 있었다.
실시예 2: 개화조절 인자 간의 상호작용 분석
본 실시예에서는 FLM-β 단백질과 SVP 단백질의 상호작용을 조사하였다.
2-1: 효모 투-하이브리드 분석
효모 투-하이브리드 분석은 FLC, FLM-β 및 SVP의 ORF를 PCR로 증폭하여 pGADT7 또는 pGBKT7 벡터(Clontech, USA)에 클로닝하여, 이전 기술한 방법으로 수행하였다(Lee et al., Plant Sci. 185-6:97-104, 2012).
그 결과, SD/-Trp/-Leu 배지 및 SD/-Trp/-Leu/-His/X-gal 배지에서 FLM-β와 SVP 단백질의 결합을 확인하였다.
2-2: 시험관 내 GST pull-down 분석
시험관 내 GST pull-down 분석을 수행하기 위해, SVP ORF를 pGEX-5x-1 벡터(Amersham Phamacia Biotech, USA)에 클로닝한 후, 20℃에서 IPTG로 SVP-GST 융합 단백질의 생산을 E. coli BL21(DE3)에서 유도하였다. 수용성 GST 융합 단백질은 글루타치온 세파로즈 비드(GE Healthcare, USA)에 고정시켰다. FLM-β ORF를 pGEM 벡터에 클로닝한 후, TNT T7 Quick Coupled 전사/번역 시스템(Promega, USA)을 사용하여 35S와 함께 시험관 내 번역을 수행하였다. 번역산물은 글루타치온 세파로즈 비드에 고정되어 있는 GST 융합 단백질과 반응시켰다.
그 결과, FLM-β와 SVP 단백질의 상호작용을 확인하였다(도 3A).
2-3: 이분자형광상보 분석
이분자형광상보 분석을 위해, FLM-β 및 SVP 단백질을 코딩하는 유전자를 pUC-SPYNE/pSPYNE-35S 및 pUC-SPYCE/pSPYCE-35S 벡터에 클로닝하였다(Walter et al., Plant J. 40:428-438, 2004). SVP-nYFP 및 FLM-β-cYFP 융합 단백질을 DNA particle delivery system(PDS-1000/He; Bio-Rad, USA)을 사용하여 양파 상피세포에 전달하였다. MS 배지에서 23℃ 및 16℃로 16-24시간 동안 어두운 상태로 배양 후, 세포를 confocal 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
그 결과, 양파의 핵에서 함께 발현되는 YFP(황색 형광 단백질)의 N 말단에 융합된 SVP와 YFP의 C 말단에 융합된 FLM-β가 23℃ 및 16℃에서 관찰되었다(도 3B).
2-4: 상호 면역침전법 분석
담배잎에서의 상호 면역침전법 분석은 이전에 공지된 방법에 따라 수행하였으며(Voinnet et al., Plant J. 33:949-956, 2003), 애기장대 원형질에서의 상호면역침전법 분석도 이전에 기술한 방법에 따라 수행하였다(Lee et al., Plant Cell Physiol. 53:1802-1814, 2012). 35S:SVP:HA 및 35S:FLM-β:GFP 플라스미드 DNA는 애기장대 엽육 원형질체에서 일시적으로 발현시켜, 6시간 후에 100μM 사이클로헥시미드(CHX)를 처리한 다음 27℃, 23℃, 16℃ 및 10℃에서 14시간 동안 배양하였다. 13,000 x g로 4℃에서 15분간 원심분리하여 추출한 단백질 상층액에 항-HA 항체(Sigma, H9658)를 반응시켰다. A/G PLUS-Agarose bead(Santa Cruz,sc-2003)와 혼합하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 분석하였다.
그 결과, 담배 잎에서 FLM-β와 SVP의 상호작용을 다시 한번 확인하였고(도 3C), 이로써, FLM-β와 SVP가 결합하여 주위 온도 변화에 따른 개화를 조절한다는 것을 확인하였다.
2-5: 염색질면역침강(ChIP) 분석
FLM 단백질과 SVP 단백질의 FT, TSF 및 SOC1 유전자의 게놈부위 결합을 분석을 수행하였다. 다양한 온도 및 빛의 조건으로 토양 또는 MS 배지에서 배양한 pFLM:gFLM:GFP, pSVP:gSVP:HA 및 35S:SVP:HA의 세포는 포름알데하이드로 고정시켰다. 핵산 추출 및 면역침강 분석은 이전에 공지된 방법에 따랐으며(Kim et al., Plant Physiol. 159:461-478, 2012)), 소니케이션으로 크로마틴을 절단하고 GFP 및 cMyc 항체로 분석하였다.
그 결과, flm-3, svp-32 돌연변이체 및 이중 돌연변이체에서 FT, TSF 및 SOC1 유전자의 게놈부위에 결합하는 FLM-β 및 SVP 단백질 양이 감소하였다(도 3D). 이로써, FLM-β와 SVP가 결합하여 주위 온도 변화에 따른 개화를 조절한다는 것을 확인하였다.
실시예 3: FLM-β 와 SVP 의 발현 분석
야생형의 SVP, FLC 및 FLM-β 발현 측정을 위해, 각각의 온도에서 전사 수준을 RT-qPCR로 분석하였다. 또한, SVP 단백질의 안정성 분석은 pSVP:SVP:HA svp-32 식물을 23℃로 MS 배지에서 장일조건 또는 단일조건으로 성장시킨 후, 100μM CHX를 30분간 처리하여 각각의 온도(27℃, 23℃, 16℃ 및 10℃)로 옮겨 10μM MG132 프로테아좀 저해제 존재하에 배양하였다. 높은 온도에서 안정한 FT는 대조군 단백질로 사용하였다.
그 결과, FLM-β 및 FLC의 전사체는 온도가 증가함에 따라 감소하였으나, SVP는 온도가 증가하여도 전사량의 변화는 없었다(도 4A). 그러나, SVP 단백질은 고온에서는 감소함을 확인하였으며(도 4B), 고온에서 12시간 내에 분해되고, 프로테아좀 저해제인 MG132에 의해 분해가 저해되었다(도 4B). 또한, 이와 더불어 온도 변화에 의한 FLM-β 전사체 및 SVP 단백질의 감소에 따라 SVP-FLM-β 복합체도 감소한 것을 확인하였다(도 4C).
실시예 4: SVP 단백질의 개화촉진 유전자 게놈부위 결합 분석
pSVP:SVP:HA svp-32, pSVP:SVP:HA svp-32 flc-3 및 pSVP:SVP:HA svp-32 flm-3 돌연변이에서 염색질 면역침강법 분석으로 SVP 단백질과 FT, TSF 및 SOC1 유전자의 게놈부위 결합을 분석하였다(도 4D,E).
그 결과, SVP의 개화촉진 유전자 게놈에의 결합은 장일조건 저온이동(10℃)에서 높게 나타났으나, flm 변이체는 SVP 단백질이 결합하지 못하였으며, flc 변이체는 SVP 단백질과의 결합이 평균 24.7% 감소하였다. 단일조건 저온이동에서는 SVP 단백질의 결합이 3배 정도 증가한 것을 확인하였다(도 4E). 또한, FLM이 활성을 잃으면 SVP 단백질과 표적유전자와의 결합을 저해하며, 이는 SVP-FLM-β 복합체가 10℃-27℃ 온도 범위에서 주위온도 변화를 감지하여 개화를 조절하는 주요매개체임을 나타낸다.
실시예 5: Artificial miRNA 형질전환 식물체 제작
본 실시예에서는, 목적유전자인 SVP 및 FLM-β의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스로 구성되는 이중가닥 RNA를 식물체에 도입하여 목적유전자의 표적부위 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적유전자인 SVP 및 FLM-β의 발현을 억제하였다.
pRS300 벡터를 주형(template)로하여, SVP 및 FLM-β 유전자의 표적 부위 572bp를 각각의 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 572bp 증폭 산물들은 pBluescriptSKII(+) 벡터내로 클로닝하고, 시퀀싱으로 염기서열을 확인하였다. 이후, 클로닝된 인서트(inserts)는 KpnI/BamHI 제한효소로 절단한 후에, 식물 형질전환 벡터인 pCHF3에 다시 클로닝하였다.
p35S::amiR-SVP 또는 p35S::amiR-FLM-β을 발현하는 형질전환 애기장대를 제조하기 위해, 상기 제작된 각각의 벡터들을 가지는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주를 100mg/L 스펙티노마이신(Spectinomycin)이 첨가된 YEB 배지에서 3일 동안 28℃에서 배양하였다. 이 후, p35S::amiR-SVP 또는 p35S::amiR-FLM-β에 대해, floral dip 방법으로 야생형 애기장대(ecotype Columbia)를 형질전환시켰다. 모든 형질전환 식물체들은 100mg/L 카나마이신(Kanamycin)을 함유하는 MS 배지에서 선별되었고, 빛이 120μmol m-2s-1 강도로 제공되는, 장일조건(LD)[16시간(light)/8시간(dark)]의 광주기하에서 23℃ 및 16℃로 배양하여, 인공 miRNA 형질전환 식물체를 제작하였다.
Artificial miRNA 형질전환 식물체 제작에 사용된 Target region 및 프라이머
Constructs Target regions (5'-> 3') Primers (5'-> 3')

p35S::amiR-SVP-1
TTGTGTAAGTTTCTGCCTATG
(서열번호 1)		 TATAGGCAGAAACTTACACAG (서열번호 7)
CTGTGTAAGTTTCTGCCTATA (서열번호 8)
CTATGTAAGTTTCAGCCTATT (서열번호 9)
AATAGGCTGAAACTTACATAG (서열번호 10)

p35S::amiR-SVP-2
TCGTCGGAGTCTATTACTAAC
(서열번호 2)		 TTTAGTAATAGACTCCGACGA (서열번호 11)
TCGTCGGAGTCTATTACTAAA (서열번호 12)
TCATCGGAGTCTAATACTAAT (서열번호 13)
ATTAGTATTAGACTCCGATGA (서열번호 14)

p35S::amiR-SVP-3
CAGTGATCACGCCCGAATGAG
(서열번호 3)		 TTCATTCGGGCGTGATCACTT (서열번호 15)
AAGTGATCACGCCCGAATGAA (서열번호 16)
AAATGATCACGCCGGAATGAT (서열번호 17)
ATCATTCCGGCGTGATCATTT (서열번호 18)

p35S::amiR-FLM-β-1
AAGCCTGATTCATAATTAAGA
(서열번호 4)		 TCTTAATTATGAATCAGGCGT (서열번호 19)
ACGCCTGATTCATAATTAAGA (서열번호 20)
ACACCTGATTCATTATTAAGT (서열번호 21)
ACTTAATAATGAATCAGGTGT (서열번호 22)

p35S::amiR-FLM-β-2
ATGATGGAGTATATCGAGTCC
(서열번호 5)		 TGACTCGATATACTGCGTCAT (서열번호 23)
ATGACGCAGTATATCGAGTCA (서열번호 24)
ATAACGCAGTATAACGAGTCT (서열번호 25)
AGACTCGTTATACTGCGTTAT (서열번호 26)

p35S::amiR-FLM-β-3
CTGCTCTGTCCGTAAGTAGAG
(서열번호 6)		 TTCTACTTACGGATAGCGCAG (서열번호 27)
CTGCGCTATCCGTAAGTAGAA (서열번호 28)
TACGCTATCCGTTAGTAGAT (서열번호 29)
ATCTACTAACGGATAGCGTAG (서열번호 30)
실시예 6: miRNA 형질전환 식물체의 개화시기 분석
실시예 5에서 제작된 miRNA 형질전환 식물체에서 SVP 및 FLM-β유전자의 발현을 RT-qPCR로 분석하였다. RT-qPCR 분석을 위해, 트리졸 시약(Trizol reagent)을 사용하여 형질전환 식물체의 총 RNA를 추출한 후, First-Strand cDNA 합성 키트(Thermo Scientific, USA)와 oligo-dT 프라이머를 이용하여 역전사 반응을 실시하였다. 합성된 First-Strand cDNA는 하우스키핑 유전자인 PP2A A3와 SAND, 그리고 SVP 및 FLM-β에 대한 RT-qPCR 분석시, 유전자 특이적인 프라이머와 함께 사용되었다.
그 결과, 각각의 형질전환 식물체에서 SVP 및 FLM-β 유전자의 발현 감소를 확인할 수 있었다(도 5).
상기 p35S::amiR-SVP와 p35S::amiR-FLM-β 발현하는 형질전환 식물체의 개화시기를 각각 23℃ 및 16℃의 장일 조건에서 측정하였다.
그 결과, p35S::amiR-SVP-1에 해당하는 형질전환 식물체의 경우 개화시기가 야생형과 유사하였으나, 그 외에 p35S::amiR-SVP-2/-3과 p35S::amiR-FLM-β-1/-2/-3 형질전환 식물체에서는 야생형에 비해 개화시기가 빨라지고 온도에 둔감한 표현형을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 7).
또한, 본 발명의 마이크로 RNA 표적부위 외에 추가로 분석하고자 하는 SVP 및 FLM-β 유전자의 표적 부위를 확인하였다(표 2)
SVP 및 FLM의 artifical miRNA에 대해 발현감소가 예상되는 SVP와 FLM-β의 추가지역
Gene Target regions (5'-> 3') Gene Target regions (5'-> 3')
SVP CTGCATTTCTGGTTAGTAACG (서열번호 31) FLM-β GAGTATATCGAGTCCCTTAAA (서열번호 40)
ACGCTTGTCACCGATAAACTT (서열번호 32) AAGCTCGACAACTTTCGATTC (서열번호 41)
AAGAGACAATGTCTAAGTAGT (서열번호 33) GTGTCTGAATGTACGGATTGG (서열번호 42)
TAGGCTCGGCTTACCGTATGG (서열번호 34) ATGGGAAAGAATACGTTGCTG (서열번호 43)
AAGTCCTAGAGAGGCATAACT (서열번호 35) TAGGGCATAACCCTTATCGGA (서열번호 44)
GAGCGACTTGGCATGCAAATA (서열번호 36) TTGTGTCTGAATGTACGGATT (서열번호 45)
CAGCAAGGAACGCAACTAACG (서열번호 37) TTGTACCTCCTTCGGAGACAA (서열번호 46)
TCGGCTTACCGTATGGTGGTT (서열번호 38) ACGGCTGAGTTTTCACCTTAA (서열번호 47)
TCGGAGAACGCTGCTGTGTAC (서열번호 39) GAGCTAGGAAGGCAGAACTGA (서열번호 48)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Method for Controlling Flowering Time by Regulating of SVP-FLM-beta Protein Complex Formation <130> P14-B283 <150> 2014-0005283 <151> 2014-01-15 <160> 139 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-SVP-1 <400> 1 ttgtgtaagt ttctgcctat g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-SVP-2 <400> 2 tcgtcggagt ctattactaa c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-SVP-3 <400> 3 cagtgatcac gcccgaatga g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-FLM-1 <400> 4 aagcctgatt cataattaag a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-FLM-2 <400> 5 atgatggagt atatcgagtc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35S::amiR-FLM-3 <400> 6 ctgctctgtc cgtaagtaga g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-1 <400> 7 tataggcaga aacttacaca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-2 <400> 8 ctgtgtaagt ttctgcctat a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-3 <400> 9 ctatgtaagt ttcagcctat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-4 <400> 10 aataggctga aacttacata g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-5 <400> 11 tttagtaata gactccgacg a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-6 <400> 12 tcgtcggagt ctattactaa a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-7 <400> 13 tcatcggagt ctaatactaa t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-8 <400> 14 attagtatta gactccgatg a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-9 <400> 15 ttcattcggg cgtgatcact t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP-10 <400> 16 aagtgatcac 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Artificial Sequence <220> <223> SVP35 <400> 35 aagtcctaga gaggcataac t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP36 <400> 36 gagcgacttg gcatgcaaat a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP37 <400> 37 cagcaaggaa cgcaactaac g 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP38 <400> 38 tcggcttacc gtatggtggt t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP39 <400> 39 tcggagaacg ctgctgtgta c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM40 <400> 40 gagtatatcg agtcccttaa a 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM41 <400> 41 aagctcgaca actttcgatt c 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM42 <400> 42 gtgtctgaat gtacggattg g 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM43 <400> 43 atgggaaaga atacgttgct g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <223> JH5304 <400> 80 actagtatgg gaagaagaaa aatcgaga 28 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH5305 <400> 81 ctgcagattg agcagcggga gagtc 25 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8967 <400> 82 tctagaatgg gaagaagaaa aatcgag 27 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8968 <400> 83 ggatcccatt gagcagcggg agagtctc 28 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2275 <400> 84 tgacaatatt ggctgcgaag t 21 <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH3476 <400> 85 cgtcttatgc gtcttactaa ttgttca 27 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH3477 <400> 86 tgaaactctg atcatctggt gctct 25 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH7657 <400> 87 gcagtctcaa gttgttcctc ca 22 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH3778 <400> 88 gccaagaaga ccgaactcat 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA 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atagaaagag agagaga 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6854 <400> 107 caagatgata tactagcgga aataaaa 27 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6857 <400> 108 catgaaagcg aagtttggtc a 21 <210> 109 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6858 <400> 109 gacaacaaga gagaagcagc tttaga 26 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH3776 <400> 110 gaagagaacg agcgacttgg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH3777 <400> 111 gagctctcgg agtcaacagg 20 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH4601 <400> 112 gaattcatgg cgagagaaaa gatt 24 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2246 <400> 113 ctcgagtccc tttttctgaa gttcgctg 28 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH7411 <400> 114 ctcgagatgg cgagagaaaa gattcagatc 30 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH7412 <400> 115 actagtctaa ccaccatacg gtaagccgag 30 <210> 116 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2934 <400> 116 ggatcccatg gcgagagaaa agattc 26 <210> 117 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2935 <400> 117 ggatccgcac caccatacgg taagccg 27 <210> 118 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8963 <400> 118 tctagaatgg cgagagaaaa gattcag 27 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH8964 <400> 119 ggatcccacc accatacggt aagccgag 28 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2486 <400> 120 ggatcctaat ggcgagagaa aagatt 26 <210> 121 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH2487 <400> 121 ctcgagctaa ccaccatacg gtaagcc 27 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH9549 <400> 122 agcgattcaa ccgcggacaa taac 24 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH9550 <400> 123 aaggctctct gtagcagctt cg 22 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6171 <400> 124 ctcgggaatt catcgtattg 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6172 <400> 125 ccctctggca gttgaagtaa 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6444 <400> 126 cgtcccacgt atgttttcgt 20 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6833 <400> 127 ttccccaagt ttggaagaca a 21 <210> 128 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6834 <400> 128 acttctgtta ccttgtgtct atttgtt 27 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6835 <400> 129 aaggacacta cattacaccg attatg 26 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6836 <400> 130 tgatatacgt acgttgaacg agttg 25 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6837 <400> 131 gaccacaaga ggatctctac gactt 25 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH6838 <400> 132 ttggagatgt tcttgatcct 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Claims (15)

  1. 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 31 내지 39로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시켜 SVP의 발현을 억제시키는 SVP RNAi; 또는 서열번호 4 내지 6 및 서열번호 40 내지 48로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시켜 FLM-β의 발현을 억제시키는 FLM-β RNAi의 도입 또는 처리에 의해 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 촉진하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 개화시기는 10℃-27℃ 범위의 대기온도에서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 SVP RNAi는 서열번호 7/8; 9/10; 11/12; 13/14; 15/16 및 17/18로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 FLM-β RNAi는 서열번호 19/20; 21/22; 23/24; 25/26; 27/28 및 29/30으로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 31 내지 39로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시켜 SVP의 발현을 억제시키는 SVP RNAi; 또는 서열번호 4 내지 6 및 서열번호 40 내지 48로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열에 대응하는 mRNA를 분해시켜 FLM-β의 발현을 억제시키는 FLM-β RNAi가 도입되어 있는 개화시기가 촉진된 재조합 식물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 SVP RNAi는 서열번호 7/8; 9/10; 11/12; 13/14; 15/16 및 17/18로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA에 의해 SVP 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 재조합 식물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 FLM-β RNAi는 서열번호 19/20; 21/22; 23/24; 25/26; 27/28 및 29/30으로 구성되는 군에서 선택되는 miRNA에 의해 FLM-β 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 재조합 식물.
  15. 다음 단계를 포함하는, 식물의 개화시기 촉진인자를 스크리닝하는 방법:
    (a) 식물체에 개화시기 촉진인자 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 식물체에서 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성을 SVP 및 FLM-β의 발현수준으로 확인하는 단계; 및
    (c) SVP 및 FLM-β의 발현수준이 제12항의 재조합식물과 비교하여 비슷하거나 낮은 경우의 후보물질을 개화시기 촉진인자로 선택하는 단계.
KR1020140121375A 2014-01-15 2014-09-12 SVP-FLM-β 단백질 복합체의 형성 조절을 통한 식물의 개화시기 조절 방법 KR101664451B1 (ko)

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