CN107926706B - 迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本分案申请涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。本发明采用如下技术方案,迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤:选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理,从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽,在初代培养的基础上进行继代培养,将成活的丛生芽进行病毒检测,挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养,最后进行生根培养。本发明采用组织培养技术进行苗木繁育,可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高,由此提高观赏性:采用组织培养技术可以脱除迷你蝴蝶兰的主要病毒,消除了病毒的危害状,提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。
Description
本申请为申请号为2017107297756、申请日为2017年8月23日、发明名称为“迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。
背景技术
迷你蝴蝶兰又称小花蝴蝶兰,是蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodita Rchb.F.的变种,通常指的是高度在20-25cm,可放置于2寸盆器中的蝴蝶兰。由于其体型小,方便包装,在国外经常被用作精致的礼品。由于迷你蝴蝶兰的栽培周期短,自组培瓶取出至可催梗阶段只需7-9个月,资金回收快,因此成为兰花产业入门者的首选。
尽管通过有性繁殖的种子苗几乎不携带病毒,且具有植株生长速度快等优势,但是由于其植株高低不齐且花色不一,因此商品性状较差,生产数量逐年大幅度降低。而通过组织培养技术(无性繁殖)生产的分生苗,因其植株和花色高度一致,逐渐替代种子苗,目前已占据市场份额的90%以上。但长期的无性繁殖必然会导致病毒的积累,致使品种日益退化,品质下降。兰花病毒一直是严重危害蝴蝶兰品质的一类重要病害,其寄主范围广泛,易传染,防治困难。目前世界上已经报道的兰花病毒有25种,其中以建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum Ring Spot Virus,ORSV)发生最为普遍,危害也最严重。这两种病毒能使蝴蝶兰叶片形成褪绿条纹、凹陷灰白斑或坏死环斑,导致植株生长不良,花少、花期缩短,并且经常复合感染,危害加剧,使蝴蝶兰的观赏价值和经济价值大幅度下降。为避免蝴蝶兰病毒大规模发生,在亲本分生繁殖之前必须经过病毒检测,蝴蝶兰病毒也是苗木出口检疫的必检对象。为了提高蝴蝶兰瓶苗的竞争力,清除ORSV和CymMV以及更多的病毒,培育优质脱毒苗是蝴蝶兰生产发展的必然趋势。
发明内容
为弥补现有技术的不足,本发明提供一种迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法,该方法获得苗木质量高,脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒,消除了病毒的危害状,提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。
本发明采用如下技术方案,迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤:选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理,从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽,在初代培养的基础上进行继代培养,将成活的丛生芽进行病毒检测,挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养,最后进行生根培养。其中,初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L;继代培养基中,6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L;生根培养基中6-BA浓度为3.5-4.5mg/L、NAA浓度为0.7-0.9mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L。
优选的,所取迷你蝴蝶兰茎尖大小为0.5-1.0mm。
优选的,初代培养基中还加入浓度为1-5/L的碳酸氢钠和浓度为20-40mg/L的病毒唑。
优选的,所述初代培养的条件为:首先进行两周暗培养,然后于温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,培养四周。
由于植物病毒是通过输导组织在植物体内进行传播的,而植物的分生组织由于分裂很快且还没有形成输导组织,因此分生组织内不存在病毒,本发明采取抑制和钝化病毒的热处理和化学试剂处理外植体,经过不同阶段的培养,通过分子水平上的病毒检测技术,最终可以获得脱除主要病毒的迷你蝴蝶兰苗木,使迷你蝴蝶兰在无主要病毒的情况下进行快速繁殖。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:由于采用组织培养技术进行苗木繁育,可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高,由此提高观赏性:采用组织培养技术可以脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒,消除了病毒的危害状,提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。
附图说明
图1为受蝴蝶兰病毒危害叶片图;其中,左图为褪绿条纹,右图为坏死环斑;
图2为迷你蝴蝶兰CyMV RT-PCR产物电泳图;其中,泳道1,2,3,4代表检测结果为阳性,泳道5,6代表检测结果为阴性;431bp为CyMV特异扩增带;
图3为迷你蝴蝶兰ORSV RT-PCR产物电泳图,其中,泳道1,2,3,4代表检测结果为阴性,泳道5,6,7,8代表检测结果为阳性;332bp为ORSV特异扩增带。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例详述本发明,但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明,本发明所采用的实验方法均为常规方法,所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
实施例1
取带毒的迷你蝴蝶兰无菌试管苗,将其置于变温光照培养箱中。开始处理时温度为30℃,每隔一天的延续期后增加1℃继续热处理培养迷你蝴蝶兰,利用逐步升高温度的方法使迷你蝴蝶兰适应热处理的温度条件,至温度上限38℃。到达38℃之后,继续培养4周,湿度保持80%左右,光照条件为每日16h,光照强度3000Lux。将热处理4周后仍健康的迷你蝴蝶兰无菌苗,在解剖镜下剥取茎尖生长点,茎尖大小为0.5mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L上,在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠,病毒唑使用的浓度为20mg/L,碳酸氢钠的使用浓度为1.0g/L。先进行两周的暗培养后,继续按培养条件:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,培养4周,将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 8.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L)上,将成活的丛生芽进行扩大化培养,培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养,所用生根培养基为1/2MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.8mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L,生根培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d。
实施例2
迷你蝴蝶兰处理同实施例1。在解剖镜下剥取茎尖生长点,茎尖大小为0.8mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 3.5mg/L+0.4mg/L NAA琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L上,在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠,病毒唑使用的浓度为30mg/L,碳酸氢钠的使用浓度为3.0g/L。先进行两周的暗培养后,继续按培养条件:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,培养4周,将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 7.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L)上,将成活的丛生芽进行扩大化培养,培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养,所用生根培养基为1/2MS+6-BA 4.5mg/L+NAA0.9mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L,生根培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d。
实施例3
迷你蝴蝶兰处理同实施例1。在解剖镜下剥取茎尖生长点,茎尖大小为1.0mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L上,在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠,病毒唑使用的浓度为40mg/L,碳酸氢钠的使用浓度为5.0g/L。先进行两周的暗培养后,继续按培养条件:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,培养4周,将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 9.0mg/L+NAA 0.4mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L)上,将成活的丛生芽进行扩大化培养,培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d,然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养,所用生根培养基为1/2MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.7mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L,生根培养条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14h/d。
试验例
蝴蝶兰主要病毒RT-PCR检测结果:
一.迷你蝴蝶兰总RNA的提取:
(1)取500mg迷你蝴蝶兰组培苗幼嫩叶片,加液氮研磨成粉末状,迅速移入1.5mLEppendorf管中,加入600μL RNA提取缓冲液(pH8.0),1μL RNasin混匀。4℃,12000rpm,离心15min。
(2)取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)溶液,混匀,4℃,12000rpm,离心10min。重复1~2次,去除蛋白层。
(3)取水相,加2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L NaAc(pH5.3),混匀。-20℃置2h。取出后,4℃,12000rpm,离心15min。
(4)弃上清,用200μL 70%无水乙醇洗沉淀,4℃,12000rpm,5min,清洗多次,至沉淀为纯白色。
(5)室温下干燥后15min左右,溶于30μL 1‰DEPC水中,-20℃冰箱保存。
二.CyMV RT-PCR检测体系:
1.RT优化体系及程序:
(1)反应体系:
5×Buffer 2.0μl;dNTPs 0.25mmol/L;RNasin 8U;引物CyMV-RP 1μmol/L;总RNA1.0μl;Mo-MLV RTase 50U。用DEPC水补足10μl。
(2)反应程序:37℃ 2h;95℃ 5min灭活Mo-MLVRTase;反应结束后4℃保存。
2.PCR优化体系及程序:
(1)反应体系:
10×Buffer 2.5μl;dNTPs 0.2mmol/L;MgCl2 1.5mmol/L;CyMV-FP 0.8μmol/L;CyMV-RP 0.8μmol/L;TagE 1U;RT产物10μl。用DEPC水补足25μl。
(2)反应程序:94℃ 1min;55℃ 2min;72℃ 2min;循环35次,最后一轮延伸5min,4℃保存。
三.ORSVRT-PCR检测体系:
1.RT体系:5×Buffer 1.0μL;dNTPs 0.25mmol/L;RNasin 8U;引物ORSV-RP 2μmol/L;总RNA 1.0μL;Mo-MLV RTase 50U。用1‰DEPC水补足10μL。
按下列反应程序进行RT:37℃ 2h;95℃ 5min灭活MO-MLV RTase;反应结束后4℃保存。
2.PCR扩增体系如下:10×Buffer 2.0μL;dNTPs 0.2mmol/L;MgCl2 1.5mmol/L;ORSV-FP 0.8μmol/L;ORSV-RP 0.8μmol/L;TagE 0.5U;RT产物10μL。用1‰DEPC水补足25μL。
反应程序为:94℃ 1min;55℃ 2min;72℃ 2min;循环35次,最后一轮延伸5min,4℃保存。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法,其特征在于,包括如下步骤:选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理,从热处理后的无菌试管苗上取大小为0.5-1.0mm茎尖进行初代培养、继代培养,将成活的丛生芽进行病毒检测,挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养,最后进行生根培养,其中,初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4 g/L;继代培养基中,6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4 g/L;生根培养基中6-BA浓度为3.5-4.5mg/L、NAA浓度为0.7-0.9mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4 g/L;初代培养基中还加入浓度为1-5/L的碳酸氢钠和浓度为20-40mg/L的病毒唑;首先进行两周暗培养,然后于温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14 h/d,培养四周;病毒为ORSV和CymMV。
2.根据权利要求1所述的迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法,其特征在于,所述继代培养和生根培养的条件为:温度25℃,光照强度2000lx,光照周期14 h/d;所述迷你蝴蝶兰无菌试管苗热处理的具体方法为:开始处理时温度为30℃,每隔一天的延续期后增加1℃继续热处理培养迷你蝴蝶兰,利用逐步升高温度的方法使迷你蝴蝶兰适应热处理的温度条件,至温度上限38℃,到达38℃之后,继续培养4周,湿度保持80%左右,光照条件为每日16h,光照强度3000Lux。
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