CN117866978A - 一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法及应用，涉及植物分子生物学和基因工程领域。本发明通过CRISPR‑Cas9技术对BneIF2Bβ基因外显子区域进行基因编辑，利用生物自身DBS内源修复机制的不完全保守性，造成其DNA序列移码突变，导致蛋白翻译提前终止，获得功能缺失型材料。该材料对TuMV的抗性显著增强，而其他重要园艺性状无明显改变。该新种质在植物抗TuMV分子机制的基础研究和群体改良、新种质创制的育种工作中均有极大应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体为利用基因编辑技术创制新种质和加速农作物育种进程，尤其是一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法及应用。
技术背景
芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)由美国病毒学家Schultz于1921年首次在芸薹属作物中发现，是目前发现唯一能够侵染芸薹属植物的马铃薯Y病毒属病毒。植物受TuMV侵害后叶片出现花叶、卷缩、褪绿等表型，严重时甚至导致全株枯萎，若防治不当在田间生产中易造成毁灭性损失。由于TuMV侵染范围广，危害程度大，防治难度高，探索抗病基因、选育抗病品种是目前解决这一问题的主要手段。
甘蓝型油菜(Brassica napus)是一种重要的世界范围广泛种植的油料作物，前期研究多集中在通过遗传定位鉴定TuMV显性抗病位点，但均未精细定位到具体抗病基因，研究基础较薄弱，抗病种质稀缺。eIF2Bβ是在芥菜型油菜(Brassicajuncea)中鉴定到的TuMV隐性抗病基因，编码一个翻译起始因子，可用于抗病种质的创制。但在育种工作中，隐性抗性基因的稳定导入不仅会导致育种周期延长、育种成本增加，且由于多代回交，不同材料携带的多种遗传背景相互混杂，易引起新种质重要园艺性状的改变从而影响其品质。
鉴于目前尚无利用基因编辑技术创制抗TuMV甘蓝型油菜新种质的相关研究，本发明利用基因编辑技术对BneIF2Bβ进行基因编辑，创制兼具TuMV抗性且原优良品质不改变的优质新种质，为植物抗TuMV分子机制的基础研究和群体改良、种质创制的育种工作提供研究材料和科学依据。
发明内容
本发明的第一个目的是针对上述现有甘蓝型油菜TuMV抗病种质不足，生产中抗病材料发生抗性缺失，隐性抗病基因育种周期长、成本高，育种过程难以兼顾抗病性与品质等问题，提供一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，通过基因编辑技术创制甘蓝型油菜BneIF2Bβ功能缺失型突变体，实现快速高效赋予其TuMV抗性，同时保持其原有重要品质性状不改变。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，通过对甘蓝型油菜BneIF2Bβ基因CDS区域进行基因编辑，造成其DNA序列移码突变，导致蛋白翻译提前终止，进而获得功能缺失型突变体材料，表现出芜菁花叶病毒抗性增强。
作为优选，通过CRISPR-Cas9技术，利用生物自身DBS内源修复机制，引入BneIF2Bβ基因DNA序列，引起该基因内片段的插入或缺失。
现有的基因编辑技术均可对BneIF2Bβ进行基因编辑，本发明仅列出基于CRISPR-Cas9进行基因编辑的具体操作，利用Cas9蛋白在靶点DNA上切割产生缺口，细胞自身DBS修复机制的不完全保守性来实现移码突变，造成BneIF2Bβ功能的丧失。
作为优选，具体包括如下步骤：
步骤(1)、基因编辑靶点和扩增引物设计
根据sgRNA靶点设计原则，在BneIF2Bβ基因靠近5’端外显子区域内，选取PAM序列前20bp作为靶点，第一个碱基强制变为G以提高编辑效率；设计2个靶点，将靶点序列复制到引物骨架上，原则为1个靶点序列复制替换引物F0和引物BsF中的20nt N，另1个靶点序列反向互补后替换引物R0和引物BsR中的20ntN；
靶点序列如下：
Target1:5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’
Target2:5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’
步骤(2)、重组载体构建和农杆菌转化
利用中间载体pCBC-DT1T2为模板，BsF/BsR和F0/R0进行4引物PCR扩增，克隆出靶点骨架；产物纯化后与限制性内切酶BsaI-HF、T4连接酶和基因编辑载体构建Golden Gate反应体系，获得基因编辑重组载体；将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布LB平板后过夜培养，挑取单克隆，摇菌后抽提质粒并测序，测序结果正确的质粒转化农杆菌GV3101；
步骤(3)、甘蓝型油菜遗传转化
选择TuMV感病的甘蓝型油菜品种，以播种后5天的子叶为外植体，利用农杆菌介导的叶盘法进行遗传转化，经kana抗生素筛选后获得再生芽，再生芽转移至生根培养基中获得再生植株。
作为优选，引物序列如下：
BsF:ATATATGGTCTCGATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTT
F0:TGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R0:AACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
BsR:ATTATTGGTCTCGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAA。
作为优选，还包括以下步骤：
步骤(4)、基因编辑检测
抽提再生苗叶片得到待测DNA。首先，利用基因编辑载体特异性引物扩增待测DNA，琼脂糖凝胶电泳检测条带有无和大小是否正确，从而检测载体是否成功导入植物中，初步筛选阳性再生苗。然后，在目标基因靶点附近设计特异性引物，以阳性再生苗DNA为模板进行PCR扩增，同时以野生型材料DNA扩增的PCR产物作为对照。所有产物经琼脂糖凝胶电泳检测条带大小无误后送测序，测序结果若显示无双峰，且序列对比与野生型一致，则表示未发生基因编辑；测序结果若显示有后双峰，且产生双峰的位置在所设靶点处，则表示基因编辑成功。
步骤(5)、TuMV抗性鉴定
发生基因编辑的再生苗生长至开花后自交获得T1代，T1代再自交后获得T2代，选取T1或T2代纯合编辑材料进行TuMV抗性鉴定。具体鉴定指标为接种TuMV后植株发病表型情况统计，qPCR鉴定TuMV_CP表达量和Western blotting鉴定TuMV_CP蛋白积累量。综合所有指标表征，相比野生型材料而言，基因编辑材料的TuMV抗性显著增强。
本发明的第二个目的是提供上述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法在创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质中的应用。
本发明的第三个目的是提供BneIF2Bβ基因在创制抗芜菁花叶病毒
病甘蓝型油菜新种质中的应用，所述应用为：采用CRISPR-Cas9系统对BneIF2Bβ基因进行基因编辑，进而获得抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种通过对隐性抗病基因BneIF2Bβ基因编辑从而获得抗TuMV甘蓝型油菜新种质的方法，通过后续突变体与野生型材料接种TuMV后的抗性鉴定和对比，在TuMV_CP的转录水平和翻译水平均证实了基因编辑材料对TuMV抗性的显著增强，获得了稳定可遗传的抗TuMV甘蓝型油菜新种质，且其他重要园艺性状无明显变化；
本发明创制的抗病新种质是对现有十字花科TuMV抗病材料的有力补充；
本发明创制的TuMV抗性新种质证明了除先前报道的TuMV显性抗病位点外，隐性抗病机制同样存在于甘蓝型油菜中，是对现有甘蓝型油菜TuMV抗性研究的重要参考；
本发明创制的抗TuMV新种质为十字花科TuMV抗病育种提供了新的靶基因，十字花科现有TuMV隐性抗病基因多聚焦于eIF4E/eIF(iso)4E和eIF4G/eIF(iso)4G，这些基因发生突变后能赋予植物抗病性，但在植物与病毒的“军备竞赛”中，病毒能够通过招募其他宿主因子来克服这一抗病性，因而挖掘其他隐性抗性基因并育成抗病新种质有利于作物保持长期稳定的抗病性能；
本发明所提供的基因编辑方法较常规育种方法能够更快地赋予感病材料TuMV抗性，利用这一方法创制的甘蓝型油菜抗TuMV新种质能够加速育种进程，节约育种成本，并更好地保留原材料的优异品质性状。
附图说明
图1为利用U626-IDF/U629-IDR引物对再生苗PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后胶图展示。其中，M为2000bp DNA Marker；S为以13株再生苗DNA为模板；P为阳性对照，以重组基因编辑载体为模板；N1为阴性对照1，以野生型材料DNA为模板；N2为阴性对照2，以ddH2O为模板。
图2为BneIF2Bβ基因结构图和两种基因编辑类型展示。其中灰色矩形代表外显子，白色矩形代表内含子。
图3为利用A1-F/A1-R引物对bneif2bβ-1和bneif2bβ-2进行PCR扩增后，产物测序结果。其中，箭头代表发生碱基插入的位置。
图4为野生型材料和基因编辑材料在接种TuMV/MOCK后25天的发病表型。
图5为接种TuMV/MOCK后25天，利用qPCR对野生型材料和基因编辑材料进行TuMV_CP表达量的差异分析。
图6为接种TuMV/MOCK后25天，利用Western blotting对野生型材料和基因编辑材料进行TuMV_CP蛋白积累量的差异分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：sgRNA靶点选择和引物设计
利用甘蓝型油菜泛基因组数据库(http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/index.php)中Westar品种基因组信息提取BneIF2Bβ基因(BnaC01T0437600WE)序列，具体基因序列和基因结构详见SEQ ID NO.1。提交序列至CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)筛选靶点。靶点选择原则为：位于功能性区域且尽量靠近5’端；编辑效率高，无脱靶或脱靶位于基因间区；平衡的GC含量且不易形成二级结构。选择PAM序列前20bp序列，并将第一个碱基强制变为G，此序列为sgRNA靶点，最终在BneIF2Bβ第三个外显子处选择2个靶点(SEQ ID NO.2、NO.3)。将2个靶点序列复制到PCR引物骨架上，序列详见SEQ ID NO.4、NO.5、NO.6、NO.7，引物合成后备用。
双敲靶点序列：
Target1:5’-GTGCTACAGCAGCTGTGGCG-3’；(SEQ ID NO.2)
Target2:5’-GGGAACTCCTGAGTCTGCGA-3’；(SEQ ID NO.3)
PCR所用4引物序列：
BsF:5’-ATATATGGTCTCGATTGTGCTACAGCAGCTGTGGCGGTT-3’；(SEQ ID NO.4)
F0:5’-TGTGCTACAGCAGCTGTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；(SEQ ID NO.5)
R0:5’-AACTCGCAGACTCAGGAGTTCCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；(SEQ ID NO.6)
BsR:5’-ATTATTGGTCTCGAAACTCGCAGACTCAGGAGTTCCCAA-3’；(SEQ ID NO.7)
实施例2：基因编辑重组载体构建
按表1所示配置PCR反应体系，其中模板pCBC-DT1T2中间载体需稀释200倍，反应程序为：94℃ 2min，1循环；94℃ 15sec，60℃ 30sec，68℃ 1min，30循环；68℃ 5min，1循环。PCR产物纯化后按表2所示配置Golden Gate反应体系，反应程序为：37℃ 5hours，50℃5min，80℃ 10min。反应产物吸取5μL转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布LB平板(Kana抗性)，37℃过夜培养后挑取单菌落，抽提质粒并测序，菌落PCR引物和测序引物见SEQ ID NO.8、NO.9、NO.10。热击法将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，所得菌液即可用于甘蓝型油菜遗传转化。
表1克隆PCR反应体系
表2Golden Gate反应体系
菌落PCR和测序引物：
U626-IDF:5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；(SEQ ID NO.8)
U629-IDF:5’-TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC-3’；(SEQ ID NO.9)
U629-IDR:5’-AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC-3’；(SEQ ID NO.10)实施例3：甘蓝型油菜遗传转化
以感TuMV甘蓝型油菜品种Westar的子叶为外植体，利用农杆菌介导的遗传转化法获得稳定遗传的基因编辑材料，具体步骤如下：
(1)外植体获取和农杆菌侵染
将Westar种子消毒后播种于MS培养基，5天后，尽量靠近生长点切取子叶。含有重组基因编辑载体的农杆菌摇至OD600为1.0左右，用R1培养基(MS 4.3g/L，葡萄糖30g/L)稀释至OD600为0.3。将切好的子叶浸泡在菌液中摇动10min，捞出子叶吸干菌液后，置于CC培养基(MS培养基+2mg/L6BA，0.1mg/L IAA)黑暗条件下共培养3天。
(2)外植体抗性筛选和继代
将CC培养基上的子叶转移至CS培养基(MS培养基+2mg/L 6BA，0.1mg/L IAA，2mg/LAgNO3，160mg/LTimentin，25mg/LKana)光照培养2天，再转移至SS1培养基(MS培养基+2mg/L 6BA，2mg/L AgNO3，160mg/LTimentin，25mg/L Kana)光照培养5天，完成抗性筛选。培养状态良好的外植体转移至SS2培养基(MS培养基+0.05mg/L 6BA，2mg/LAgNO3，160mg/LTimentin，25mg/L Kana)促进生芽，之后每隔14天左右继代到SS2培养基上，直至再生芽出现。
(3)再生芽收集和再生苗生根
外植体在SS2培养基培养约30天后，切除已黄化的子叶，收集所有再生芽，转移至生根培养基(MS培养基+2mg/L IBA，160mg/L Timentin，25mg/LKana)生根。当再生苗根系足够健壮后，从培养瓶中移出转至土里，于温室中生长。
实施例4：再生苗基因编辑检测
取所有再生苗叶片于离心管中，液氮速冻后利用CTAB法提取DNA。首先利用pKSE401载体引物U626-IDF/U629-IDR对所有再生苗DNA进行PCR扩增，以重组质粒为模板的PCR产物做阳性对照，以野生型材料DNA和ddH2O为模板的PCR产物做阴性对照。琼脂糖凝胶电泳图表明，13株再生苗中有10株的PCR产物条带较亮，且大小与阳性对照一致，均为726bp，两阴性对照均无条带，即获得了10株阳性再生苗(图1)。
于BneIF2Bβ基因所设靶点附近设计特异性引物A1-F/R(SEQ ID NO.11、NO.12)，以阳性再生苗DNA和野生型DNA为模板进行PCR扩增。所有产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小均为570bp。以A1-F为测序引物将所有产物送测序，其中3株再生苗的测序结果显示后双峰，表明发生了杂合编辑。将此3株再生苗的PCR产物纯化后连接至通用载体B-zero(Transgen Biotech)，转化大肠杆菌后挑取单克隆送出测序，发现在第1个靶点处发生基因编辑，共存在2种编辑类型，分别为插入一个A(bneif2bβ-1)和插入一个T(bneif2bβ-2)(图2、图3)。
基因编辑检测特异性引物：
A1-F:5’-CTGGTCGCTGCTAATCCTGT-3’；(SEQ ID NO.11)
A1-R:5’-TCCACATCCCACCAGTTACC-3’；(SEQ ID NO.12)
实施例5：突变体TuMV抗性鉴定
将3株发生基因编辑的材料于温室中培养至开花后自交，得到T1代，T1代再自交得到T2代，选取T2代中的两种纯合编辑类型材料bneif2bβ-1和bneif2bβ-2进行后续TuMV抗性鉴定，共包括以下三种鉴定方法：
(1)发病表型统计
取2g TuMV病叶于20mL 1×PBS溶液中研磨，纱布过滤后得到TuMV病原液。将野生型Westar和两种编辑材料于温室中播种，温度24℃/20℃，光照8h/16h，生长至4叶1心后，用石英砂摩擦接种TuMV病原液/MOCK(1×PBS)，于接种15天后观察发病表型。
如图4所示，与MOCK组相比，实验组的野生型和2种基因编辑材料在接种TuMV后均无明显发病表型出现，推测原因为本实验所接种的TuMV_ZJ型病毒能够侵染甘蓝型油菜Westar，但侵染后植株不会有明显发病表型，因此还需后续的分子手段继续鉴定。
(2)qPCR检测TuMV_CP表达量
取100mg接种TuMV病原液/MOCK后25天的野生型和基因编辑材料叶片，利用TRIzol法(Invitrogen)抽提RNA，反转录(Toyobo)得到cDNA。设计TuMV_CP和内参基因25S的qPCR引物(SEQ ID NO.13、NO.14、NO.15、NO.16)，以上述cDNA为模板，利用StepOne Plus system(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR实验，保证3个生物学重复和3个基础重复，利用2-ΔΔCt法计算TuMV_CP表达量。
如图5所示，在接种后第25天，野生型材料中TuMV_CP表达量极高，而2种基因编辑材料中TuMV_CP表达量极低，与MOCK组基本无差异。由此可见，在病毒转录水平上，基因编辑材料与野生型材料相比TuMV病毒积累量明显下降。
qPCR检测所用引物序列：
qPCR-TuMV_CP-F:5’-CTGATTACGAACTGACGGAGGACA-3’；(SEQ ID NO.13)
qPCR-TuMV_CP-R:5’-CACCCACATTCCGTTTATGTTCGG-3’；(SEQ ID NO.14)
qPCR-25S-F:5’-CGGTTCCTCTCGTACTAGGTTGA-3’；(SEQ ID NO.15)
qPCR-25S-R:5’-CCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTT-3’；(SEQ ID NO.16)
(3)Westernblotting检测TuMV_CP蛋白积累量
取0.3g接种TuMV病原液/MOCK后25天的野生型和基因编辑材料叶片，液氮研磨后加入600μL RIPA裂解液(Beyotime)，13,000xg 4℃离心5min，上清液即为总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime)测定所有样品蛋白浓度后，每个样品吸取10μg蛋白加入5x蛋白上样缓冲液，95℃煮10min，冷却后上样。利用10％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，条件为120V恒压电泳1.5h。完成后利用湿转法将蛋白条带转印至PVDF膜(Millipore)上，条件为恒流400mA电泳30min。完成后将膜置于TBST配置的5％脱脂奶粉中封闭2h，弃牛奶后用TBST洗膜5次，每次5min。配置1％BSA的TBST溶液，按1/3000加入TuMV单克隆抗体(Green Agriculture Safeguard)或植物内参Actin抗体(Abbkine)，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用TBST洗净膜后，与一抗稀释方法相似，按1/5000加入羊抗鼠二抗(ZENBIO)或羊抗兔二抗(Agrisera)，室温孵育1h。弃二抗，用TBST洗净膜后，通过化学发光ECL法(Bio-red)于ChemiDoc MP imaging system(Bio-red)中拍照。
如图6所示，接种TuMV后野生型材料明显可见TuMV_CP蛋白条带，而2种突变体材料无明显可见条带。由此说明，在病毒蛋白水平上，突变体材料与野生型材料相比TuMV病毒蛋白积累量明显下降。结合上述其他鉴定指标，可见通过CRISPR-Cas9创制的甘蓝型油菜Westar突变体bneif2b-1和bneif2b-2，与野生型材料相比TuMV抗性明显增强。
综上所述，本发明阐明了一种通过基因编辑技术创制抗TuMV甘蓝型油菜新种质的方法，通过对隐性抗性基因BneIF2Bβ外显子区域进行基因编辑，快速获得纯合稳定遗传的功能丧失型突变体，该材料对TuMV抗性明显增强，即抗TuMV的甘蓝型油菜新种质，在分子基础研究和群体改良育种中兼具重要的应用潜力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
SEQ ID NO.1：
BnaeIF2Bβ基因(BnaC01T0437600WE)DNA序列，标注下划线为外显子序列，标注斜体为sgRNA靶点位置，标注斜体且加粗为PAM序列。
SEQ ID NO.2：
基因编辑靶点1
GTGCTACAGCAGCTGTGGCG
SEQ ID NO.3：
基因编辑靶点2
GGGAACTCCTGAGTCTGCGA
SEQ ID NO.4：
克隆引物BsF
ATATATGGTCTCGATTGTGCTACAGCAGCTGTGGCGGTT
SEQ ID NO.5：
克隆引物F0
TGTGCTACAGCAGCTGTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
SEQ ID NO.6：
克隆引物R0
AACTCGCAGACTCAGGAGTTCCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
SEQ ID NO.7：
克隆引物BsR
ATTATTGGTCTCGAAACTCGCAGACTCAGGAGTTCCCAA
SEQ ID NO.8：
菌落PCR和测序引物U626-IDF
TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
SEQ ID NO.9：
菌落PCR和测序引物U629-IDF
TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC
SEQ ID NO.10：
菌落PCR和测序引物U629-IDR
AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC
SEQ ID NO.11：
基因编辑检测特异性引物A1-F
CTGGTCGCTGCTAATCCTGT
SEQ ID NO.12：
基因编辑检测特异性引物A1-R
TCCACATCCCACCAGTTACC
SEQ ID NO.13：
qPCR检测引物qPCR-TuMV_CP-F
CTGATTACGAACTGACGGAGGACA
SEQ ID NO.14：
qPCR检测引物qPCR-TuMV_CP-R
CACCCACATTCCGTTTATGTTCGG
SEQ ID NO.15：
qPCR检测引物qPCR-25S-F
CGGTTCCTCTCGTACTAGGTTGA
SEQ ID NO.16：
qPCR检测引物qPCR-25S-R
CCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTT
Claims (7)
1.一种通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，其特征在于：通过对甘蓝型油菜BneIF2Bβ基因CDS区域进行基因编辑，造成其DNA序列移码突变，导致蛋白翻译提前终止，进而获得功能缺失型突变体材料，表现出芜菁花叶病毒抗性增强。
2.根据权利要求1所述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，其特征在于：通过CRISPR-Cas9技术，利用生物自身DBS内源修复机制，引入BneIF2Bβ基因的DNA序列，引起该基因内片段的插入或缺失。
3.根据权利要求2所述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、sgRNA靶点选择和引物设计
根据sgRNA靶点设计原则，在BneIF2Bβ基因靠近5’端外显子区域内，选取PAM序列前20bp作为靶点，第一个碱基强制变为G；共设计2个靶点，将靶点序列复制到引物骨架上，原则为1个靶点序列复制替换引物F0和引物BsF中的20ntN，另1个靶点序列反向互补后替换引物R0和引物BsR中的20nt N；
靶点序列如下：
Target1:5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’
Target2:5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’
步骤(2)、重组载体构建和农杆菌转化
利用中间载体pCBC-DT1T2为模板，BsF/BsR和F0/R0进行4引物PCR扩增，产物纯化后与限制性内切酶BsaI-HF、T4连接酶和基因编辑载体构建Golden Gate反应体系，所得连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单克隆，摇菌，抽提质粒并测序，测序结果正确的质粒转化农杆菌GV3101；
步骤(3)、甘蓝型油菜遗传转化
选择TuMV感病的甘蓝型油菜品种，以子叶为外植体利用农杆菌介导法进行遗传转化，卡那霉素抗生素筛选后获得再生植株。
4.根据权利要求3所述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，其特征在于，引物序列如下：
BsF:ATATATGGTCTCGATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTT
F0:TGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R0:AACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
BsR:ATTATTGGTCTCGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAA。
5.根据权利要求3所述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤(4)、基因编辑检测
再生苗取样抽提得到待测DNA；首先设计基因编辑载体特异性引物扩增待测DNA，检测载体是否成功导入；后续在目标基因靶点附近设计特异性引物进行PCR扩增后送测序，检测是否发生基因编辑和具体编辑类型；
步骤(5)、TuMV抗性鉴定
发生基因编辑的再生苗自交至纯合后进行TuMV抗性鉴定；具体鉴定指标为接种TuMV后植株发病表型统计，qPCR鉴定TuMV_CP表达量和Western blotting鉴定TuMV_CP蛋白积累量；综合所有指标表征，相比野生型材料，基因编辑材料的TuMV抗性显著增强。
6.权利要求1-5任一项所述的通过基因编辑技术创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质的方法在创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质中的应用。
7.BneIF2Bβ基因在创制抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质中的应用，其特征在于，采用CRISPR-Cas9系统对BneIF2Bβ基因进行基因编辑，进而获得抗芜菁花叶病毒病甘蓝型油菜新种质。
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