CN110050700B - 一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蝴蝶兰种苗繁育技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，具体包括以下步骤：选取健壮、带病毒的蝴蝶兰植株，消毒后用壳聚糖溶液浸泡，再进行初代培养，挑选出初代培养获得的病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后选择继代培养后获得的长势好的小苗继续进行壮苗培养、生根培养和移栽。本发明提供的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，获得的蝴蝶兰苗株品质好、脱毒率高且长势健壮，实现蝴蝶兰的无病毒栽培。
Description
技术领域
本发明涉及蝴蝶兰种苗繁育技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法。
背景技术
蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属，原产于亚热带雨林地区，为附生性兰花。蝴蝶兰白色粗大的气根露在叶片周围，除了具有吸收空气中养分的作用外，还有生长和光合作用。新春时节，蝴蝶兰植株从叶腋中抽出长长的花梗，并且开出形如蝴蝶飞舞般的花朵，深受花迷们的青睐，素有“洋兰王后”之称。
蝴蝶兰是单茎性气生兰，侧枝发育非常少，因此很难常规进行分株繁殖，而且很少形成种子，种子发育也比较困难，基本上在自然条件下萌发的难度比较大，因此蝴蝶兰新品种的培育方法基本上都是经过杂交得来，大部分品种都带病毒，有记录显示，截至目前，至少有28种病毒曾经感染兰科植物。据调查，中国兰科植物感染的病毒以东亚兰嵌纹病毒(Cymbidiummosaicvirus,简称CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,简称ORSV)这两种病毒复合感染为多数。病毒传播严重制约了兰花产业化发展，病毒可造成植株叶斑、坏死以及花朵变色、畸形等症状，严重影响其品质，目前尚无确切的药物能有效防治病毒的危害与传播，因此繁殖蝴蝶兰无毒苗是产业化发展的必经之路，但是其他兰花品种的方法又不能直接运用到蝴蝶兰身上，因此需要独立开发一种针对蝴蝶兰培养无毒苗的方法。
发明内容
本发明提供一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，使培养后的蝴蝶兰苗株品质好、脱毒率高且长势健壮，实现蝴蝶兰的无病毒栽培。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)材料选取
选用生长健壮、经检测后携带病毒的蝴蝶兰植株，除去叶片留取茎；
(2)材料消毒
将步骤(1)中留取的蝴蝶兰茎用水冲洗后，用质量分数为70％的酒精溶液浸泡，再用质量分数为1.0％次氯酸钠溶液消毒10-30分钟后，用无菌水冲洗；最后用质量分数为0.1％升汞溶液浸泡5-15min，用无菌水冲洗；所述0.1％升汞溶液中加入吐温，使升汞溶液中吐温的质量分数为0.08％-0.12％；
(3)材料预处理
将消毒后的蝴蝶兰茎浸泡在1-2g/L壳聚糖溶液中20-30min；
(4)初代培养
将步骤(3)中处理过的蝴蝶兰茎切取茎尖，切取大小为0.2-1mm，留取1个叶原基；接种于初代培养基上培养，培养温度24-26℃，先暗培养2周，再置于光照为1500-5000LX的环境下培养2个月，光照时间为10-16h/日，待两片真叶展开形成丛生芽；所述初代培养基组分为：1/3MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.3mg/L GA3+15g/L蔗糖+100mL/L椰汁+4.5-5.5g/L琼脂+0.1g/L VC+20mg/L PVP，pH为5.4-5.8；
(5)继代培养
将步骤(4)中生长出的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽转入继代培养基继代培养1个月，培养温度24-26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx；所述继代培养基组分为：1/3MS+5mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L NAA+0.3mg/L GA3+20g/L蔗糖+50mL/L柠檬汁+0.1g/L VC+1-2g/L壳聚糖，pH为5.4-5.8；
(6)壮苗培养：
继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养10-15天，培养温度24-26℃，光照时间为13h/d，光照强度为1500-8000lx；所述壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L GA3+30-35g/L蔗糖+0.1g/L VC+100mL/L柠檬汁，pH为5.4-5.8；
(7)生根培养：
将步骤(6)获得的壮苗植株新梢基部浸入50-100mg/L的IBA中4-8h，然后转入生根培养基中进行生根培养，培养温度24-26℃，光照时间为13h/d，光照强度为5000-15000lx；所述生根培养基组分为：1/2MS+100mL/L椰汁+40g/L土豆泥+20g/L蔗糖+30mg/L活性炭，pH5.4-5.8；
(8)移栽
待步骤(7)中的壮苗生长至4-5cm高、根系3条以上、叶1-2片时，将壮苗放在自然光下炼苗5-7天；然后取出培养苗，用无菌水清洗根部，然后移栽至培养基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75-85％，温度为20-25℃，光照5000～20000lx。
优选地，步骤(2)中所述无菌水冲洗次数为5-10次。
优选地，步骤(2)中70％酒精浸泡时间为10-30s。
优选地，步骤(3)中蝴蝶兰茎用自来水冲洗时间为0.5-2h。
优选地，所述吐温为吐温-20或吐温-80。
优选地，所述茎尖的切取大小为0.2-0.4mm。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，能使培养后的蝴蝶兰苗株脱毒率高、发病率低、成苗率高，栽培后适应性强，苗株长势良好，大大提高了蝴蝶兰苗株的品质。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明各实施例中所用MS、6-BA、NAA、GA3、蔗糖、琼脂、椰汁、VC、PVP、壳聚糖、活性炭、吐温、70％酒精、0.1％升汞溶液、1.0％次氯酸钠均为市售，所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，具体包括以下步骤：
(1)材料选取
选用生长健壮、经检测后携带病毒的蝴蝶兰植株，除去叶片留取茎；
(2)材料消毒
将步骤(1)中留取的蝴蝶兰茎用自来水冲洗0.5h，用质量分数为70％的酒精溶液浸泡10s，再用质量分数为1.0％次氯酸钠消毒10分钟后，用无菌水冲洗5次；再用质量分数为0.1％升汞溶液浸泡5min，浸泡过程中不断搅拌，然后用无菌水冲洗5次；所述0.1％升汞溶液中加入吐温-20，且0.1％升汞溶液中吐温-20的质量分数为0.08％；
(3)材料预处理
将消毒后的蝴蝶兰茎浸泡在1g/L壳聚糖溶液中20min；
(4)初代培养
将步骤(3)中处理过的蝴蝶兰茎切取茎尖，切取大小为0.2mm，留取1个叶原基；接种于初代培养基上培养，培养温度24℃，先暗培养2周，再置于光照为1500LX的环境下培养2个月，光照时间为10h/日，待两片真叶展开形成丛生芽；所述初代培养基组分为：1/3MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.3mg/L GA3+15g/L蔗糖+100mL/L椰汁+4.5g/L琼脂+0.1g/LVC+20mg/L PVP，pH为5.4；
(5)继代培养
将步骤(4)中生长出的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽转入继代培养基继代培养1个月，培养温度24℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx；所述继代培养基组分为：1/3MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.3mg/L GA3+20g/L蔗糖+50mL/L柠檬汁+0.1g/L VC+1g/L壳聚糖，pH为5.4；
(6)壮苗培养：
继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养10天，培养温度24℃，光照时间为13h/d，光照强度为1500lx；所述壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L GA3+30g/L蔗糖+0.1g/L VC+100mL/L柠檬汁，pH为5.4；
(7)生根培养：
将步骤(6)获得的壮苗后植株新梢基部浸入50mg/L的IBA中4h，然后转入接于150mL生根培养基中进行生根培养；培养温度24℃，光照时间为13h/d，光照强度为5000lx；所述生根培养基组分为：1/2MS+100mL/L椰汁+40g/L土豆泥+20g/L蔗糖+30mg/L活性炭，pH5.4；
(8)移栽
当步骤(7)中的壮苗生长至4cm高，根系3条以上，叶1片时，将壮苗放在自然光下炼苗5天；然后取出培养苗，用无菌水清洗根部，然后移栽至培养基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75％，温度为20℃，光照5000lx。
实施例2
一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，具体包括以下步骤：
(1)材料选取
选用生长健壮、经检测后携带病毒的蝴蝶兰植株，除去叶片留取茎；
(2)材料消毒
将步骤(1)中留取的蝴蝶兰茎用自来水冲洗2h，用质量分数为70％的酒精溶液浸泡30s，再用质量分数1.0％次氯酸钠消毒30分钟后，用无菌水冲洗10次；再用质量分数为0.1％升汞溶液浸泡15min，浸泡过程中不断搅拌，然后用无菌水冲洗10次；所述0.1％升汞溶液中加入吐温-20，且0.1％升汞溶液中吐温-20的质量分数为0.12％；
(3)材料预处理
将消毒后的蝴蝶兰茎浸泡在2g/L壳聚糖溶液中30min；
(4)初代培养
将步骤(3)中处理过的蝴蝶兰茎切取茎尖，切取大小为0.4mm，留取1个叶原基；接种于初代培养基上培养，培养温度26℃，先暗培养2周，再置于光照为5000LX的环境下培养2个月，光照时间为16h/日，待两片真叶展开形成丛生芽；所述初代培养基组分为：1/3MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.3mg/L GA3+15g/L蔗糖+100mL/L椰汁+5.5g/L琼脂+0.1g/LVC+20mg/L PVP，pH为5.8；
(5)继代培养
将步骤(4)中生长出的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽转入继代培养基继代培养1个月，培养温度26℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx；
所述继代培养基组分为：1/3MS+5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L GA3+20g/L蔗糖+50mL/L柠檬汁+0.1g/LVC+2g/L壳聚糖，pH为5.8；
(6)壮苗培养：
继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养15天，培养温度26℃，光照时间为13h/d，光照强度为8000lx；所述壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L GA3+35g/L蔗糖+0.1g/LVC+100mL/L柠檬汁，pH为5.8；
(7)生根培养：
将步骤(6)获得的壮苗后植株新梢基部浸入100mg/L的IBA中8h，然后转入接于150mL生根培养基中进行生根培养；培养温度26℃，光照时间为13h/d，光照强度为15000lx；所述生根培养基组分为：1/2MS+100mL/L椰汁+40g/L土豆泥+20g/L蔗糖+30mg/L活性炭，pH5.8；
(8)移栽
当步骤(7)中的壮苗生长至5cm高，根系3条以上，叶2片时，将壮苗放在自然光下炼苗7天；然后取出培养苗，用无菌水清洗根部，然后移栽至培养基质中，保持湿度和通风，空气湿度为85％，温度为25℃，光照20000lx。
实施例3
一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，具体包括以下步骤：
(1)材料选取
选用生长健壮、经检测后携带病毒的蝴蝶兰植株，除去叶片留取茎；
(2)材料消毒
将步骤(1)中留取的蝴蝶兰茎用自来水冲洗1.5h，用质量分数为70％的酒精溶液浸泡20s，再用质量分数为1.0％次氯酸钠消毒20分钟后，用无菌水冲洗8次；再用质量分数为0.1％升汞溶液浸泡10min，浸泡过程中不断搅拌，然后用无菌水冲洗8次；所述0.1％升汞溶液中加入吐温-80，且0.1％升汞溶液中吐温-80的质量分数为0.10％；
(3)材料预处理
将消毒后的蝴蝶兰茎浸泡在1.5g/L壳聚糖溶液中25min；
(4)初代培养
将步骤(3)中处理过的蝴蝶兰茎切取茎尖，切取大小为1mm，留取1个叶原基；接种于初代培养基上培养，培养温度25℃，先暗培养2周，再置于光照为3000LX的环境下培养2个月，光照时间为13h/日，待两片真叶展开形成丛生芽；所述初代培养基组分为：1/3MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.3mg/L GA3+15g/L蔗糖+100mL/L椰汁+5.0g/L琼脂+0.1g/LVC+20mg/L PVP，pH为5.6；
(5)继代培养
将步骤(4)中生长出的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽转入继代培养基继代培养1个月，培养温度25℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；所述继代培养基组分为：1/3MS+5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.3mg/L GA3+20g/L蔗糖+50mL/L柠檬汁+0.1g/L VC+1.5g/L壳聚糖，pH为5.6；
(6)壮苗培养：
继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养12天，培养温度25℃，光照时间为13h/d，光照强度为5000lx；所述壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L GA3+32g/L蔗糖+0.1g/L VC+100mL/L柠檬汁，pH为5.6；
(7)生根培养：
将步骤(6)获得的壮苗后植株新梢基部浸入80mg/L的IBA中6h，然后转入150mL生根培养基中进行生根培养，培养温度25℃，光照时间为13h/d，光照强度为10000lx；所述生根培养基组分为：1/2MS+100mL/L椰汁+40g/L土豆泥+20g/L蔗糖+30mg/L活性炭，pH5.6；
(8)移栽
当步骤(7)中的壮苗生长至4cm高，根系3条以上，叶1片时，将壮苗放在自然光下炼苗6天；然后取出培养苗，用无菌水清洗根部，然后移栽至培养基质中，保持湿度和通风，空气湿度为80％，温度为22℃，光照120000lx。
下面对各实施例使用的脱毒苗培养繁殖方法对蝴蝶兰苗株的培育效果进行说明。
1、试验方法
各实施例组分别设计50组进行试验，移栽后在一个月内观察蝴蝶兰的生长状况，并在一个月后分别检测植株的病毒携带情况。
病毒检测方法
CyMV和ORSV检测用NEOGEN Phytodiagnostics公司相对应病毒的SPOT-CHECK LFTM(2min快速检测试纸条)。
2、实验结果
2.1蝴蝶兰植株的生长状况结果见表1。
表1各实施例培育的蝴蝶兰苗株生长状况
| 组别 | 成活率 | 生长状况 |
| 实施例1 | 72％ | 长势好，叶色健康，仅增殖几片小叶 |
| 实施例2 | 80.3％ | 长势好，叶色健康，仅增殖几片小叶 |
| 实施例3 | 75％ | 长势好，叶色健康，增殖生叶现象明显 |
由表1可知，各实施例使用的繁育方法培育的蝴蝶兰成活率均在70％以上，成活率较高，且各组蝴蝶兰苗株生长状况较佳。
2.2蝴蝶兰植株的病毒检测结果见表2。
表2各实施例培育的蝴蝶兰苗株病毒携带检测结果
由表2可知，各实施例使用的繁育方法培育的蝴蝶兰CyMV和ORSV病毒脱除率均较高，且本发明提供的蝴蝶兰脱毒苗的繁育方法对CyMV更易脱除。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1～3相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1. 一种蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）材料选取
选用生长健壮、经检测后携带病毒的蝴蝶兰植株，除去叶片留取茎；
（2）材料消毒
将步骤（1）中留取的蝴蝶兰茎用水冲洗后，用质量分数为70%的酒精溶液浸泡，再用质量分数为1.0%次氯酸钠溶液消毒10-30分钟后，用无菌水冲洗；最后用质量分数为0.1%的升汞溶液浸泡5-15min，用无菌水冲洗；
所述升汞溶液中加有吐温，吐温在升汞溶液中的质量分数为0.08%-0.12%；
（3）材料预处理
将消毒后的蝴蝶兰茎浸泡在1-2g/L壳聚糖溶液中20-30min；
（4）初代培养
将步骤（3）中处理过的蝴蝶兰茎切取茎尖，切取大小为0.2-1 mm，留取1个叶原基；接种于初代培养基上培养，培养温度24-26°C，先暗培养2周，再置于光照为1500-5000LX的环境下培养2个月，光照时间为10-16h/日，待两片真叶展开形成丛生芽；
所述初代培养基组分为：1/3MS+3.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3mg/LGA3+15g/L蔗糖+100mL/L椰汁+4.5-5.5g/L琼脂+0.1g/LVC+20mg/LPVP，pH为5.4-5.8；
（5）继代培养
将步骤（4）中生长出的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽转入继代培养基继代培养1个月，培养温度24-26°C，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx；
所述继代培养基组分为：1/3MS+5mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+0.3mg/LGA3+20g/L蔗糖+50mL/L柠檬汁+0.1g/LVC+1-2g/L壳聚糖，pH为5.4-5.8；
（6）壮苗培养：
继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养10-15天，培养温度24-26°C，光照时间为13h/d，光照强度为1500-8000lx；
所述壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LGA3+30-35g/L蔗糖+0.1g/LVC+100mL/L柠檬汁，pH为5.4-5.8；
（7）生根培养：
将步骤（6）获得的壮苗植株新梢基部浸入50-100mg/L的IBA中4-8h，然后转入生根培养基中进行生根培养，培养温度24-26°C，光照时间为13h/d，光照强度为5000-15000lx；
所述生根培养基组分为：1/2MS+100mL/L椰汁+40g/L土豆泥+20g/L蔗糖+30mg/L活性炭，pH5.4-5.8；
（8）移栽
待步骤（7）中的壮苗生长至4-5cm高、根系3条以上、叶1-2片时，将壮苗放在自然光下炼苗5-7天；然后取出培养苗，用无菌水清洗根部，然后移栽至培养基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75-85％，温度为20-25°C，光照5000-20000lx。
2.根据权利要求1中的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，其特征在于，步骤（2）中所述无菌水冲洗次数为5-10次。
3.根据权利要求1中的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，其特征在于，步骤（2）中酒精浸泡时间为10-30s。
4.根据权利要求1中的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，其特征在于，所述吐温为吐温-20或吐温-80。
5.根据权利要求1中的蝴蝶兰脱毒苗培养繁殖方法，其特征在于，所述茎尖的切取大小为0.2-0.4mm。
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