CN109385449A - 植物作为宿主在表达胰岛素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达胰岛素中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达胰岛素(insulin)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组胰岛素成功表达。细胞增值实验证明生菜生产的胰岛素具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组胰岛素的方法。

Description

植物作为宿主在表达胰岛素中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达胰岛素中的应用。
背景技术
人胰岛素(insulin)是一种由胰腺分泌的激素，可以将食物中的碳水化合物降解成葡萄糖用作能量，或者储存葡萄糖以备用。胰岛素有助于保持身体中的血糖水平不要太高(高血糖)或太低(低血糖)。身体中的细胞需要糖才能。然而，糖不能直接进入身体中的大多数细胞。吃完食物后，体内血糖水平升高，胰腺细胞(称为β细胞)就会发出信号，将胰岛素释放到血液中。然后胰岛素附着并发出信号从血液中吸收糖份供细胞使用。如果身体中有过多的糖份，胰岛素有助于将糖储存在于肝脏中，并在体内血糖水平较低时释放糖。因此，胰岛素有助于平衡血糖水平，并使其保持在正常范围。随着血糖水平的升高，胰腺会分泌更多的胰岛素。
由于胰腺中的β细胞受到损伤或破坏，1型糖尿病患者将不能造成胰岛素。因此，这些人将需要胰岛素注射，以使其身体能够处理葡萄糖并避免高血糖并发症。2型糖尿病患者对胰岛素反应不佳或抗拒。他们可能需要胰岛素注射，以帮助他们更好地加工糖，并防止这种疾病的长期并发症。2型糖尿病患者可以先用口服药物降糖以及合理的饮食和运动。由于2型糖尿病是一种渐进性疾病，患者的患病时间越长，他们就越需要胰岛素来维持血糖水平。
胰岛素由A、B两条肽链组成，人胰岛素的A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。20世纪80年代，人们通过基因工程(重组DNA)制造出高纯度的合成人胰岛素，其结构和人体自身份泌的胰岛素一样。对比动物胰岛素，人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗，所以皮下脂肪萎 缩的现象也随之减少；由于人胰岛素抗体少，所以注射量比动物胰岛素平均减少30％；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素，常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。
植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSOTM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。
植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人胰岛素具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供植物作为宿主在表达胰岛素中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了胰岛素，并且在温 和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组胰岛素尤其是人胰岛素。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物作为宿主在表达胰岛素中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素为人胰岛素。
本发明还提供了一种表达载体，包括胰岛素的核苷酸序列和双元植物载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述胰岛素为人胰岛素。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：
步骤1：在胰岛素的核苷酸序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl限制性酶切位点；所述人胰岛素包括insulin；
步骤2：由金斯瑞公司克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC57-INS；
步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段Insulin，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-INS。
具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人insulin(GenBank Accession号：AH002844.2)密码子优化为植物偏好的密码子，由GeneArtTM GeneOptimizerTM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的INSULIN序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人胰岛素基因片段Insulin通过Xbal/Sacl从pUC57-INS中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-Ins。将植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2) 并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO4)中至O.D.600为0.5。所述克隆Insulin基因片段(图1A，B)，并且构建两种基于双元植物表达载体p35S-INS(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。
在本发明中，Insulin cDNA 序列(GenBank:AH002844.2)如SEQ ID No.1所示；Insulin氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；密码子优化后的Insulin cDNA序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明还提供了所述表达载体在表达人胰岛素中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素为人胰岛素。
本发明还提供了一种生菜作为宿主表达胰岛素的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得人胰岛素。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述胰岛素为人胰岛素。
在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：
步骤1：抽真空25～45s；
步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；
步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；
重复上述步骤2～3次，避光处理4d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。
具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。
渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。
在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：
经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。
收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组Insulin的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hINSULIN标准品分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗INSULIN的抗体(Abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀 浆成本以及工艺。重组胰岛素经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为8kDa的条带(图3A，泳道1)，与阳性胰岛素条带一致(图3A，泳道2)。在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3A，泳道3)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为1.01mg/g。另外，Western印迹分析也检测到大约5.8kDa的条带(图3B，泳道1)，观察到的蛋白分子量(5.8kDa)与阳性对照组(图3B，泳道2)一致。
小鼠喂食高脂肪饮食20周，在禁食6小时后，使用2.0U/kg体重的人胰岛素进行IP注射，观察结果显示植物源重组胰岛素可以显著降低血浆葡萄糖水平，与商业用的胰岛素没有显著差别。(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源胰岛素具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。
用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了胰岛素，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产人胰岛素。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1(A)示胰岛素克隆载体(金斯瑞公司构建合成)；
图1(B)示胰岛素基因片段酶切(XbaI/SacI)鉴定；
图2示植物瞬时表达载体p35S-INS构建流程；利用限制性内切酶(XbaI/SacI)双酶切，从图1A，B克隆载体分别切下胰岛素片段，连接入pCam35S的XbaI/SacI位点，生成植物瞬时表达载体p35S-INS；
其中，35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；
图3(A)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的重组成纤维细胞人胰岛素；泳道1:纯化重组INSULIN(5μg)；泳道2：阳性对照 INSULIN(5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；
图3(B)示Western印记杂交检测纯化的重组人胰岛素；泳道1:纯化重组INSULIN(5μg)；泳道2：阳性对照胰岛素(5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；
图4示胰岛素耐受实验；小鼠喂食高脂肪饮食20周，在禁食6小时后，使用2.0U/kg体重的人胰岛素进行IP注射，观察结果显示植物源重组胰岛素可以显著降低血浆葡萄糖水平，与商业用的胰岛素没有显著差别。
具体实施方式
本发明公开了生菜作为宿主在表达胰岛素中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产胰岛素重组蛋白质。
本发明提供了生菜作为宿主在表达胰岛素中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1植物瞬时表达载体的构建
为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人胰岛素(GenBank Accession号：AH002844.2)密码子优化为植物偏好的密码子，由 GeneArtTM GeneOptimizerTM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的胰岛素序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人胰岛素基因片段通过Kpnl/Sacl从pUC57-INS中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-INS。将植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO4)中至O.D.600为0.5。
所述克隆胰岛素基因片段(图1A，B)，并且构建基于植物的双元表达载体p35S-INS(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。
实施例2农杆菌介导的真空渗透
本发明优化了农杆菌真空渗透的方法(图2)。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。
渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽 可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。
实施例3蛋白质提取和分离
经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)中并在4℃下储存。
实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳以及Western Blot蛋白印迹杂交
收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组胰岛素的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及胰岛素标准品(Biovision)分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗胰岛素的抗体(Abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组胰岛素经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为5.8kDa的条带(图3A)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条 带。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为1.1g/1kg。另外，Western印迹分析也检测到大约5.8kDa的条带(图3B)，观察到的蛋白分子量(5.8kDa)与阳性对照组一致。
实施例5胰岛素耐受实验
小鼠喂食高脂肪饮食20周，在禁食6小时后，使用2.0U/kg体重的人胰岛素进行IP注射，观察结果显示植物源重组胰岛素可以显著降低血浆葡萄糖水平，与商业用的胰岛素没有显著差别。
实施例6
对照组：利用烟叶生产人胰岛素；
实验组：本发明提供的生菜生产人胰岛素；
表1人胰岛素
*示与对照组相比P≤0.05；#示与对照组相比P≤0.01；
由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人胰岛素(INSULIN)显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋 白含量，显著(P≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。
综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人酸性以及碱性成纤维细胞人胰岛素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳惠升生物科技有限公司
<120> 植物作为宿主在表达胰岛素中的应用
<130> MP1716986
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> Insulin
<400> 1
atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60
ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120
ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 180
ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 240
gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 300
tccctctacc agctggagaa ctactgcaac 330
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> Insulin
<400> 2
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 密码子优化后的Insulin cDNA序列
<400> 3
atggctcttt ggatgagact tcttccactt cttgctcttc ttgctctttg gggaccagat 60
ccagctgctg cttttgttaa tcaacatctt tgtggatctc atcttgttga agctctttat 120
cttgtttgtg gagaaagagg atttttttat actccaaaga ctagaagaga agctgaagat 180
cttcaagttg gacaagttga acttggagga ggaccaggag ctggatctct tcaaccactt 240
gctcttgaag gatctcttca aaagagagga attgttgaac aatgttgtac ttctatttgt 300
tctctttatc aacttgaaaa ttattgtaat 330

Claims (10)

1.植物作为宿主在表达胰岛素中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胰岛素为人胰岛素。
3.一种表达载体，其特征在于，包括胰岛素的核苷酸序列和双元植物载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述胰岛素为人胰岛素。
5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：
步骤1：在胰岛素(insulin)的核苷酸序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl限制性酶切位点；
步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC-INSULIN；
步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段insulin，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-INS。
6.根据权利要求3至5任一项所述的表达载体在表达胰岛素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胰岛素为人胰岛素。
8.一种生菜作为宿主表达胰岛素的方法，其特征在于，将如权利要求3至5任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得胰岛素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述胰岛素为人胰岛素。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：
步骤1：抽真空25～45s；
步骤2：保持真空-95kPa压力30～60s；
步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；
重复上述步骤2～3次，避光处理4d。
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