CN116042913A - 通用型流感病毒全基因组扩增、富集、测序的引物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测或辅助检测流感病毒的引物组合物及其应用，属于生物技术领域。本发明提供检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组序列的组合物，所述组合物包括A型流感病毒的扩增引物对、B型流感病毒的扩增引物对、C型流感病毒的扩增引物对和D型流感病毒的扩增引物对；所述A型流感病毒的扩增引物对包括FluA‑F和FluA‑R；所述B型流感病毒扩增引物对包括FluB‑F和FluB‑R；所述C型流感病毒扩增引物对和所述D型流感病毒扩增引物对相同，包括FluC/D‑F和FluC/D‑R。全基因组引物混合扩增后，可获得流感病毒的全基因组序列，经测序可以快速获得基因组序列并鉴定未知流感病毒型别与亚型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测或辅助检测流感病毒的引物组合物及其应用。
背景技术
流行性感冒由流感病毒(Influenza virus,IV)引起，IV是一种具有高度传染性的病毒，属于正粘病毒科，基因组为单股负链分节段的RNA；当前，根据其核蛋白(Nucleoprotein,NP)和基质蛋白(Matrix 1,M1)的差异将其划分为四类：甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)，乙型流感病毒(Influenza B virus,IBV)，丙型流感病毒(Influenza C virus,ICV)，丁型流感病毒(Influenza D virus,IDV)(To J,TorresJ.Viroporins in the influenza virus[J].Cells,2019,8(7))。四种流感病毒中，A型、B型流行更广泛，C型和D型流感病毒较为少见。
流感病毒的每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性，IAV和IBV的基因组分为8个节段，而ICV和IDV的基因组分为7个节段(Cardenas-Garcia S,Caceres C J,Rajao D,et al.Reverse genetics for influenza B viruses and recentadvances in vaccine development[J].Current Opinion In Virology,2020,44:191-202.)。
IAV中第1～6基因节段分别编码RNA碱性聚合酶2(Basic polymerase 2,PB2)、碱性聚合酶1(Basic polymerase 1,PB1)、酸性聚合酶(Acidic polymerase,PA)、血凝素(Haemagglutinin,HA)、核蛋白(Nucleoprotein,NP)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)；第7基因节段编码囊膜蛋白，由于拼接可任意编码内膜基质蛋白M1和跨膜蛋白M2两种蛋白；第8节段编码非结构蛋白NS，亦通过RNA拼接可进一步分为NS1和NS2(又称NEP)两种蛋白(LiX,Liu B,Ma S,et al.High frequency of reassortment after co-infection ofchickens with the H4N6 and H9N2 influenza A viruses and the biologicalcharacteristics of the reassortants[J].Vet Microbiol,2018,222:11-7.)。
IBV与IAV不同的是，IBV第6基因节段不止编码NA蛋白，同时也编码一种NB离子通道蛋白(NB ion channel,NB)。第7基因节段编码一种BM2离子通道蛋白(BM2 ion channel,BM2)，其离子通道的功能与IAV的M2蛋白相似，主要参与调控病毒粒子的脱壳过程，促进成熟病毒粒子的释放。ICV、IDV与IAV和IBV不同的是，IAV和IBV都含有两种主要的表面糖蛋白：HA和NA，而ICV和IDV只有一种主要的表面糖蛋白，即血凝素酯酶融合蛋白(hemagglutinin-esterase-fusion,HEF)，它执行所有进入功能，包括受体结合，受体破坏和融合(Liu R,Sheng Z,Huang C,Wang D,Li F.Influenza D virus.Curr OpinVirol.2020；44:154-161)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何高效的获得流感病毒的全基因组序列以及快速准确的鉴定流感病毒。
为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组序列的组合物，所述组合物包括A型流感病毒的扩增引物对、B型流感病毒的扩增引物对、C型流感病毒的扩增引物对和D型流感病毒的扩增引物对；
所述A型流感病毒的扩增引物对包括FluA-F和FluA-R；所述B型流感病毒扩增引物对包括FluB-F和FluB-R；所述C型流感病毒扩增引物对和所述D型流感病毒扩增引物对相同，包括FluC/D-F和FluC/D-R；
所述FluA-F为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；
所述FluA-R为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；
所述FluB-F为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；
所述FluB-R为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
所述FluC/D-F为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；
所述FluC/D-R为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
进一步地，上述的组合物中，所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供上述的组合物在如下A1)-A6)中的应用：
A1)检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A2)检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A3)检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A4)扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA；
A5)制备检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A6)制备检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A7)制备检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A8)制备扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA的产品。
进一步地，本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，第三个方面本发明提供检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组序列的多重RT-PCR试剂或试剂盒，所述多重RT-PCR试剂或试剂盒包括所述A型流感病毒的扩增引物对、所述B型流感病毒的扩增引物对、所述C型流感病毒的扩增引物对和所述D型流感病毒的扩增引物对；
所述A型流感病毒扩增引物对包括FluA-F和FluA-R；所述B型流感病毒扩增引物对包括FluB-F和FluB-R；所述C型流感病毒扩增引物对和所述D型流感病毒扩增引物对相同，包括FluC/D-F和FluC/D-R；
所述FluA-F为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；
所述FluA-R为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；
所述FluB-F为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；
所述FluB-R为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
所述FluC/D-F为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；
所述FluC/D-R为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
进一步地，上述的多重RT-PCR试剂或试剂盒中，所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
所述试剂或试剂盒中还包括反转录试剂。所述反转录试剂包括2×One Step Mix(诺唯赞HiScript II One Step RT-PCR Kit，货号P611-01)和One Step Enzyme Mix(诺唯赞HiScript II One Step RT-PCR Kit，货号P611-01)。
进一步地，上述的多重RT-PCR试剂或试剂盒在如下A1)-A4)中的应用：
A1)检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A2)检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A3)检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A4)扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA。
为解决上述技术问题，第四个方面本发明提供检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组DNA的方法，所述方法包括：
S1)使用上述的多重RT-PCR试剂或试剂盒或上述的组合物对待测样品进行RT-PCR扩增，获得RT-PCR产物；
S2)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，看是否获得条带；
S3)若S2)无条带，则待测样品不是或候选不是流感病毒，或测样品不含或候选不含流感病毒；
S4)若S2)有条带，对得到的RT-PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定或辅助鉴定待测样品是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒，或，是否含有A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒或，是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒。
进一步地，上述的方法中，所述方法中S1)所述RT-PCR扩增的反应体系中所述多重RT-PCR试剂或试剂盒或组合物中所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
所述方法中S1)所述RT-PCR扩增的反应体系中所述多重RT-PCR试剂或试剂盒或组合物中所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量浓度均为10μM。
在本发明的一个实施例中，以总反应体积50μL为例，所述反应体系包括：RNaseFree ddH2O 14.5μL、2×One Step Mix 25μL、One Step Enzyme Mix 2.5μL、Flu-F(10μM)2μL、Flu-R(10μM)2μL、模板RNA 4μL、总反应体积50μL。
进一步地，上述的方法中，S1)所述RT-PCR反应中，退火温度为55-60℃。
进一步地，上述的方法中，S1)所述RT-PCR反应中，退火温度为55-58℃。
进一步地，上述的方法中，S1)所述RT-PCR反应中，退火温度为58℃。
在本发明的一个实施例中，所述RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸3min，72℃最终延伸10min。其中变性、退火和延伸步骤进行35个循环，退火温度为：55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。
上述应用或方法可为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
本发明中，所述A型流感病毒可为H3N2亚型，其全基因组序列在NationalMicrobiology Data Center Accession No.为NMDCN00011L6、NMDCN00011L7、NMDCN00011L8、NMDCN00011L4、NMDCN00011L9、NMDCN00011L5、NMDCN00011LA和NMDCN00011LB(update date2022-07-21)；所述B型流感病毒可为BV亚型，其全基因组序列在GISAID Accession No.为EPI1269610、EPI1269609、EPI1269608、EPI1056637、EPI1056633、EPI1056636、EPI1056635和EPI1056634(update date2018-08-15)；所述D型流感病毒的全基因组序列在GenBank Accession No.为NC_036616.1、NC_036615.1、NC_036619.1、NC_036618.1、NC_036617.1、NC_036620.1和NC_036621.1(update date2018-08-13)。
本发明取得的有益技术效果：
1、本发明提供的引物组合物或试剂或试剂盒可实现对四个型流感病毒的全基因富集扩增，根据RT-PCR检测结果可以快速获得基因组序列并与测序技术联用鉴定未知流感病毒型别与亚型。
2、利用本发明提供的引物组合物可通过一次PCR扩增即可获得流感病毒的全部基因组片段，不必针对流感病毒的分节段基因分别设计多组引物对进行扩增，减少了基因扩增的工作量和时间。
附图说明
图1为三对引物对分别对病毒RNA进行扩增的扩增产物电泳图谱。
图2为三对引物组成的引物组合物对对病毒RNA进行扩增的扩增产物电泳图谱。
图3为引物组合物的特异性验证结果。
图4为引物组合物的灵敏性验证结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所述A型流感病毒可为H3N2亚型，为本实验室保存，其全基因组序列在NationalMicrobiology Data Center Accession No.为NMDCN00011L6、NMDCN00011L7、NMDCN00011L8、NMDCN00011L4、NMDCN00011L9、NMDCN00011L5、NMDCN00011LA和NMDCN00011LB(update date2022-07-21)；所述B型流感病毒可为BV亚型，为本实验室从中国疾病预防控制中心申请获得；所述D型流感病毒为本实验室通过反向遗传技术制备获得，具体制备方法如下：将D型流感病毒的全基因组序列(在GenBank Accession No.为NC_036616.1、NC_036615.1、NC_036619.1、NC_036618.1、NC_036617.1、NC_036620.1和NC_036621.1(update date2018-08-13))的7个片段分别构建至pHW2000载体，获得7种重组质粒。测序结果表明：重组质粒的结构为：用目的基因替换pHW2000载体的Nhel和BglII的酶切识别位点之间的片段(Nhel和BglII的酶切识别位点之间的小片段)，保持pHW2000载体的其他核苷酸序列不变。D型流感病毒的制备方法为：先将10μL Lipofectamine 2000(Invitrogen，货号：11668)与200μL Opti-MEM培养基(Gibco，货号：31985)混合，室温放置5分钟。再将7种重组质粒各取500ng加入200μL Opti-MEM培养基中混匀，将上述两种混合液混合在一起，室温放置20分钟。期间用PBS溶液洗涤3遍铺有293T：MDCK＝1：5混合细胞的六孔板，并在每孔加入600μL Opti-MEM培养基，再将室温放置完毕的混合液均匀滴加在六孔板中。将六孔板在37℃下培养6小时，弃去转染混合物，并于每孔中加入1ml含有青链霉素(Gibco，货号：15140)各100U和1μg/mL的胰蛋白酶(SIGMA，货号：T8003)的Opti-MEM培养基。六孔板在37℃下培养，至显微镜下观察细胞病变大于50％时收获上清，该上清中即含有通过反向遗传方法制备获得的D型流感病毒。公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人处获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、用于未知流感病毒型别与亚型全基因组富集扩增、测序引物的设计
根据流感病毒RNA(包括A、B、C和D型流感的RNA)的RNA序列信息，经过分析设计了用于未知流感病毒型别与亚型全基因组富集扩增、测序引物。引物的核苷酸序列如表1，其中引物对FluA-F/FluA-R用于扩增A型流感的RNA，引物对FluB-F/FluB-R用于扩增B型流感的RNA，引物对FluC/D-F/FluC/D-R用于扩增C和D型流感的RNA。
表1.引物的核苷酸序列
本申请中核苷酸符号含义如表2：
表2.
实施例2、不同退火温度下扩增结果验证
选择实验室所具备的不同型别流感病毒RNA(包括A、B、C和D型流感病毒的RNA)，使用RT-PCR(一步法)方法，实验分为两组。第一组是三对引物对分别对病毒RNA进行扩增(简称单重RT-PCR)，具体为：分别使用引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R在不同退火温度下对相应型别流感病毒RNA(一步法RT-PCR的反应体系中直接添加RNA，实际参与PCR反应的是RNA反转录获得的cDNA)进行扩增，第二组是三对引物对的引物组合物对病毒RNA进行扩增(简称多重RT-PCR)。再使用三对引物对的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)，在不同退火温度下对不同型别流感病毒RNA进行扩增。单重RT-PCR和多重RT-PCR的扩增体系如表3。
单重RT-PCR反应体系中，Flu-F(10μM)表示如下3种溶液中的一种：1)溶剂为RNaseFree ddH2O，溶质为FluA-F，FluA-F的终浓度为10μM；2)溶剂为RNase Free ddH2O，溶质为FluB-F，FluB-F的终浓度为10μM；3)溶剂为RNase Free ddH2O，溶质为FluC/D-F，FluC/D-F的终浓度为10μM。Flu-R(10μM)表示如下3种溶液中的一种：4)溶剂为RNase Free ddH2O，溶质为FluA-R，FluA-R的浓度为10μM；5)溶剂为RNase Free ddH2O，溶质为FluB-R，FluB-R的浓度为10μM；6)溶剂为RNase Free ddH2O，溶质为FluC/D-R，FluC/D-R的浓度为10μM。
单重RT-PCR反应体系中，Flu-F(10μM)和Flu-R(10μM)靶向同一亚型的流感病毒，例如Flu-F(10μM)为FluA-F时，Flu-R(10μM)为FluA-R，Flu-F(10μM)为FluB-F时，Flu-R(10μM)为FluB-R，Flu-F(10μM)为FluC/D-F时，Flu-R(10μM)为FluC/D-R。
多重RT-PCR反应体系中，Flu-F(10μM)表示引物FluA-F、FluB-F和FluC/D-F的物质的量浓度均为10μM。Flu-R(10μM)表示引物FluA-R、FluB-R和FluC/D-R的物质的量浓度均为10μM。
第一组和第二组的引物对和反应模板如表4所示。反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，94℃变性30s，不同温度退火30s，72℃延伸3min，72℃最终延伸10min。其中变性、退火和延伸步骤进行35个循环，设置不同的退火温度分别为：55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和60℃。
表3.RT-PCR反应体系
| 试剂 | 用量 |
| <![CDATA[RNase Free ddH<sub>2</sub>O]]> | 14.5μL |
| 2×One Step Mix | 25μL |
| One Step Enzyme Mix | 2.5μL |
| Flu-F(10μM) | 2μL |
| Flu-R(10μM) | 2μL |
| 模板RNA | 4μL |
| Total | 50μL |
表4.第一组和第二组的引物对和反应模板
通过1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行初步表征，第一组的实验结果如图1所示，图1中(a)为引物对FluA-F/FluA-R扩增A型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带；图1中(b)为引物对FluB-F/FluB-R扩增B型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带(退火温度为58-60℃时条带的亮度更高)；图1中(c)为引物对FluC/D-F/FluC/D-R扩增C型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带；图1中(d)为引物对FluC/D-F/FluC/D-R扩增D型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带。
第二组的实验结果如图2所示，图2中(a)为引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)扩增A型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带；图2中(b)为引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)扩增B型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃时均可扩增出目的条带(退火温度为58-60℃时条带的亮度更高)；图2中(c)为引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)扩增C型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带；图2中(d)为引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)扩增D型流感病毒RNA的PCR产物的电泳图谱，图谱中结果显示退火温度在55-60℃均可扩增出目的条带。
最后将RT-PCR获得的目的片段进行二代测序，均可获得各个片段完整基因序列，将获得的序列进行BLAST比对，证明是相应型别的流感基因组序列，验证结果与琼脂糖凝胶电泳的检测结果一致。
实施例3、引物扩增特异性验证
选择其他呼吸道病毒RNA，包括副黏病毒PIV5(National Microbiology DataCenter Accession No.NMDCN00011LC)，冠状病毒229E(购自ATCC，Quantitative GenomicRNA from Human coronavirus 229E，货号VR-740DQ)、NL63(购自ATCC，QuantitativeSynthetic Human coronavirus NL63 RNA，货号VR-3263SD)和SARS-CoV-2(GISAIDdatabases Accession No.EPI_ISL_514256-7)的RNA，分别作为反应模板，使用如实施例2所示的RT-PCR方法，用引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的混合引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)在退火温度58℃下分别对相应病毒RNA(一步法RT-PCR的反应体系中直接添加RNA，实际参与PCR反应的是RNA反转录获得的cDNA)进行扩增。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行初步表征，结果如图3所示，图3中N为空白对照(ddH2O)，泳道1表示副黏病毒PIV5，泳道2表示冠状病毒229E，泳道3表示冠状病毒NL63，泳道4表示冠状病毒SARS-CoV-2。结果表明：对四种其他呼吸道病毒RNA扩增均未见条带。说明引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R的引物组合物具有特异性，不能扩增除A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒以外的其他病毒或者微生物。
实施例4、灵敏性验证
选择实验室所具备的不同型别的流感病毒RNA(包括A、B、C和D型流感病毒RNA)，测定RNA浓度(初始浓度)后并进行梯度稀释(从10-1到10-5梯度稀释)。所使用流感病毒RNA浓度见下表5：
表5.流感病毒RNA的浓度
| RNA来自流感类型 | RNA浓度ng/μL |
| A型(H3N2) | 176.1 |
| B型(BV) | 129.7 |
| C型 | 9.8 |
| D型 | 135.6 |
使用RT-PCR方法，用引物对FluA-F/FluA-R、FluB-F/FluB-R和FluC/D-F/FluC/D-R组成的引物组合物(引物组合物中各引物的物质的量相同)在退火温度58℃下对相应型别流感病毒梯度稀释的RNA进行扩增。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行初步表征，最后通过二代测序验证全基因组扩增富集效果。结果如图4所示。图4中(a)为上述引物组合物对梯度稀释的A型流感病毒RNA的扩增产物的电泳图谱，图4中(b)为上述引物组合物对梯度稀释的B型流感病毒RNA的扩增产物的电泳图谱，图4中(C)为上述引物组合物对梯度稀释的C型流感病毒RNA的扩增产物的电泳图谱，图4中(D)为上述引物组合物对梯度稀释的C型流感病毒RNA的扩增产物的电泳图谱。
结果表明：在C型流感病毒RNA稀释至原浓度10-1倍，D型流感病毒RNA稀释至原浓度10-2倍，A、B型流感病毒RNA稀释至原浓度10-3倍的情况下，扩增富集产物通过二代测序仍可获得完整全基因组序列。结果表明：引物组合物对A型流感病毒RNA的扩增灵敏度为0.1761ng/μL，B型流感病毒RNA的扩增灵敏度为0.1297ng/μL，C型流感病毒RNA的扩增灵敏度为0.98ng/μL，D型流感病毒RNA的扩增灵敏度为1.356ng/μL。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组序列的组合物，所述组合物包括A型流感病毒的扩增引物对、B型流感病毒的扩增引物对、C型流感病毒的扩增引物对和D型流感病毒的扩增引物对，
所述A型流感病毒的扩增引物对包括FluA-F和FluA-R，所述B型流感病毒扩增引物对包括FluB-F和FluB-R，所述C型流感病毒扩增引物对和所述D型流感病毒扩增引物对相同，包括FluC/D-F和FluC/D-R；
所述FluA-F为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；
所述FluA-R为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；
所述FluB-F为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；
所述FluB-R为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
所述FluC/D-F为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；
所述FluC/D-R为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
3.权利要求1或2所述的组合物在如下A1)-A6)中的应用：
A1)检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A2)检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A3)检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A4)扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA；
A5)制备检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A6)制备检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A7)制备检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的产品；
A8)制备扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA的产品。
4.检测或辅助检测流感病毒或扩增或辅助扩增流感病毒全基因组序列的多重RT-PCR试剂或试剂盒，所述多重RT-PCR试剂或试剂盒包括所述A型流感病毒的扩增引物对、所述B型流感病毒的扩增引物对、所述C型流感病毒的扩增引物对和所述D型流感病毒的扩增引物对，
所述A型流感病毒扩增引物对包括FluA-F和FluA-R，所述B型流感病毒扩增引物对包括FluB-F和FluB-R，所述C型流感病毒扩增引物对和所述D型流感病毒扩增引物对相同，包括FluC/D-F和FluC/D-R；
所述FluA-F为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；
所述FluA-R为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；
所述FluB-F为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；
所述FluB-R为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
所述FluC/D-F为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；
所述FluC/D-R为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的多重RT-PCR试剂或试剂盒，其特征在于：所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
6.权利要求4或5所述的多重RT-PCR试剂或试剂盒在如下A1)-A4)中的应用：
A1)检测或辅助检测A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A2)检测或辅助检测待测样本是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A3)检测或辅助检测待测病原是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒；
A4)扩增或辅助扩增流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒的全基因组DNA。
7.检测或辅助检测流感病毒或扩增流感病毒全基因组DNA的方法，其特征在于：所述方法包括：
S1)使用上述的多重RT-PCR试剂或试剂盒或上述的组合物对待测样品进行RT-PCR扩增，获得RT-PCR产物；
S2)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，看是否获得条带；
S3)若S2)无条带，则待测样品不是或候选不是流感病毒，或测样品不含或候选不含流感病毒；
S4)若S2)有条带，对得到的RT-PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定或辅助鉴定待测样品是否为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒，或，是否含有A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒或，是否感染A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中S1)所述RT-PCR扩增的反应体系中所述多重RT-PCR试剂或试剂盒或组合物中所述FluA-F、FluA-R、FluB-F、FluB-R、FluC/D-F和FluC/D-R的物质的量相同。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：S1)所述RT-PCR反应中，退火温度为55-60℃。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于：S1)所述RT-PCR反应中，退火温度为56-58℃。
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