CN113423825A

CN113423825A - 病毒生产方法

Info

Publication number: CN113423825A
Application number: CN202080014336.7A
Authority: CN
Inventors: E·维拉
Original assignee: Ology Bioservices Inc
Current assignee: Ology Bioservices Inc
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-09-21
Also published as: CA3129932A1; JP2022520401A; WO2020168230A1; EP3924469A1; EP3924469A4; US20220098555A1; AU2020221305A1; SG11202108435WA

Abstract

本发明涉及一种通过特异性修饰培养基中的溶解氧水平来增加固定床生物反应器中来自宿主细胞的病毒、病毒颗粒或病毒载体的产量的方法。

Description

病毒生产方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,277的权益，其通过引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于疫苗和病毒载体生产的病毒和病毒载体的繁殖方法。更具体地，本发明涉及增加固定床生物反应器中来自宿主细胞的病毒产量的特定方法。

背景技术

允许快速生产病毒和病毒载体以满足对疫苗和其他疗法不断增长的需求的强大的技术至关重要。此外，对于多功能宿主细胞技术平台，例如Vero细胞和其他哺乳动物细胞平台、鸟类细胞平台和昆虫细胞技术平台的开发，提高宿主细胞病毒产量的技术也在加快疫苗工艺和生产的发展中发挥着重要作用。本发明满足了改进病毒产生方法的需要。

发明内容

本发明提供了一种提高病毒产量的方法。在一个实施方案中，公开了在生物反应器中生产病毒的方法。该方法包括以下步骤:1)在生物反应器中，在参数如溶解氧(dO₂)、pH和温度可以控制的环境中，提供宿主细胞，2)在恒定的初始100％ dO₂、7.4 pH和37℃温度下生长细胞，3)将dO₂水平降低至初始dO₂水平的20-50％，同时保持pH和温度恒定，4)在降低dO₂之后8-24小时用至少一种病毒感染细胞，在20-50％的dO₂水平、7.4的pH和37℃温度下培养带有病毒的宿主细胞，和5)收获病毒。在实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞，其是贴壁依赖性的并且需要微载体和/或固定床来固定。在优选的实施方案中，将Vero细胞用作固定床生物反应器中的宿主细胞。

在本发明的优选实施方案中，在用病毒感染宿主细胞前12小时，dO₂至少降低50％。在优选的实施方案中，在宿主细胞生长到最高细胞密度后，用病毒感染宿主细胞。在本发明的另一个实施方案中，在宿主细胞达到最高细胞密度后降低dO₂。

附图说明

图1A示出了在固定床生物反应器中使用的微载体条带，在5mL培养基中显示了13条微载体条带，每条带约11.2cm²三维面积。

图1B示出了生物反应器的横截面，该生物反应器可用于容纳每床多达3,500个条带。

图1C以横截面视图示出了生物反应器的不同部分。

图2是dO₂、pH、温度和生物量参数的图示。将dO₂、pH和温度设为常数，当与生物量探针(测量细胞生长的增加)相关的电导率达到55mS/cm时发生感染。

图3是dO₂、pH、温度和生物量参数的图示。将pH和温度设为常数，而dO₂在感染前12小时降低至45-50％，并在整个感染过程中保持恒定。感染时，与生物量探针相关的电导率达到80mS/cm。

图4是dO₂、pH、温度和生物量参数的图示。将dO₂、pH和温度设为常数。感染时，与生物量探针相关的电导率达到110mS/cm。

具体实施方式

本发明提供了增加生物反应器中病毒产量的方法。

以下内容适用于本申请的具体实施方式部分。

当使用不定冠词或定冠词指代单数名词，例如“一(a)”、“一个(an)”或“该(the)”时，这包括该名词的复数形式，除非另有特别说明。在本发明的上下文中，术语“大约”或“约”表示本领域技术人员将理解的仍然确保所讨论的特征的技术效果的精确度区间。该术语通常表示与指示数值的偏差为±10％，优选为±5％。

本发明涉及在生物反应器中生产病毒的方法，其包括以下步骤:a)在恒定的初始dO₂水平、pH和温度下培养宿主细胞；c)在感染前8-24小时将dO₂降低至初始水平的20-50％；d)用至少一种病毒感染细胞；和e)收获病毒。通过这种方法产生的病毒数量明显多于常规方法中产生的病毒数量，其中包括dO₂的所有参数在整个过程中保持恒定。

如本文所用，术语“大规模”生产是指以至少200升、优选至少500升、最优选约1000升的最小培养体积的生产。

如本文所用，术语“生物反应器”是指支持生物活性环境的装置，在该环境中可以在受控条件下进行生物过程，例如病毒和载体的繁殖。生物反应器可被设计用于小规模培养，例如研究实验室中使用的那些，以及大规模生物反应器，其包括容器或大桶，以在中试装置或商业规模上生产和收获生物大分子，例如疫苗病毒、抗原和载体。生物反应器可用于繁殖悬浮细胞和贴壁细胞。生物反应器是受控环境，其中可调节氧气/dO₂、氮气、二氧化碳和pH水平。定期测量参数如dO₂、pH、温度和生物量。生物反应器的“容量”范围可以是5mL至5000mL。容量可以是约2mL至约10mL、约5mL至约50mL、约25mL至约100mL、约75mL至约500mL、约250mL至约750mL、约600mL至约1000mL。在优选的实施方案中，容量可以是50mL或80mL。在另一个优选的实施方案中，容量可以是700mL至800mL。

“固定床生物反应器”是指包括促进细胞粘附和生长的填料的固定床的一类生物反应器。由于能够以低剪切力灌注高细胞密度，固定床生物反应器已被用于以小规模和大规模生产病毒疫苗产品。固定床生物反应器可以是一次性生物反应器，例如商购可得的iCELLis系统(PallCorporation)。iCELLis系统平台提供了新的固定床技术，其在坚固、单一、封闭的系统中包括由编织的医用级聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维组成的载体，该系统无需任何无菌处理。此外，该系统使用“瀑布”技术，通过控制温度、O₂、pH、二氧化碳(CO₂)和氮气(N₂)来实现高速率气体交换，此外，使用磁力叶轮，产生低细胞剪切应力和均匀分布的培养基循环。对于大多数病毒，当与传统的贴壁细胞平底烧瓶相比时，来自iCELLis系统的生产效价显著增加。iCELLis技术可以小规模使用，如在iCELLis Nano中，其中生长面积在0.5至4m²，和以生产规模使用，如在iCELLis 500中，其中生长面积范围为66至500m²。在小规模系统中开发的方法可以按比例扩大到生产规模。

固定床生物反应器可具有测量和监测pH、温度、溶解氧和指示贴壁细胞密度的生物量的传感器。固定床生物反应器还可具有能够添加氧气或氮气的不同端口、介质交换端口、用于添加氢氧化钠(NaOH)和/或CO₂以调节pH的端口。可通过添加O₂或N₂来改变培养基的dO₂。优选地，可以通过在生物反应器的顶部空间中注入N₂，同时搅拌和监测dO₂，以受控方式消耗dO₂水平。

所公开方法的宿主细胞可以是贴壁依赖性细胞或适于成为贴壁依赖性细胞系。所公开方法的宿主细胞可以在微载体上培养，所述微载体可以悬浮在生物反应器中或微载体条带上。优选地，在固定床生物反应器的固定床中的微载体条带上培养宿主细胞。每条微载体条带可提供每条带1.25cm²的二维面积和11.2cm²的三维面积。约13条微载体条带可提供约145.6cm²的面积，这大致等于一个T-150平底烧瓶提供的生长面积。优选地，固定床生物反应器是商购可得的iCELLIS Nano(PallCorporation)、iCELLis 500生物反应器(PallCorporation)或Univercells固定床生物反应器(Univercells SA)。固定床在800mL固定床生物反应器(例如iCELLis Nano)中，可提供最大40,000cm²，在25L固定床生物反应器(例如iCELLis 500)中，可提供多达5,000,000cm²(图1A-C；表1)。固定床高度可以在20mm至10mm范围内，在800mL固定床生物反应器中提供5300cm²至40,000cm²的生长面积，至在25L固定床生物反应器中提供660000cm²至5,000,000cm²的生长面积。

表1

可以通过使用2000至20,000个细胞每cm²的接种密度来培养宿主细胞。可以根据宿主细胞的类型、生物反应器的体积、固定床生物反应器中固定床的高度等调节接种密度。在本领域技术人员的认知范围内选择用于该方法的最佳接种密度。可以通过使用生物反应器固定床内的生物量传感器测量生物量来测量细胞的生长。通过电导率指示贴壁细胞量的生物量可用于监测宿主细胞的总生长和由于感染后病毒繁殖导致的细胞量的减少。由生物量传感器监测的较高电导率指示的较高生物量表明细胞的生长速率较高。生物量的范围可以从培养开始时低生物量下的5mS/cm的低电导率到细胞可能已达到最大生长时最大生物量下的约110±50mS/cm。

如本文所用，“培养基(culture media)”或“培养基(media)”是指用于在生物反应器中培养宿主细胞的液体。本公开方法中使用的培养基可以包括支持宿主细胞生长的各种成分，包括但不限于氨基酸、维生素、有机盐和无机盐、碳水化合物。培养基可以是无血清培养基，其为不含任何动物血清的配制的培养基。当使用无血清培养基时，其选自但不限于DMEM、DMEM/F12、Medium 199、MEM、RPMI、OptiPRO SFM、VP-SFM、VP-SFM AGT、HyQ PF-Vero、MP-Vero。培养基还可以是无动物培养基；即，它没有任何动物来源的产物。培养基还可以是无蛋白质的培养基；即，配制的培养基不含蛋白质。无血清或无蛋白质的培养基可以配制成不含血清或蛋白质，但可以含有来源于宿主细胞的细胞蛋白，和任选地特异性添加到无血清或无蛋白质培养基中的蛋白质。

根据宿主细胞的pH稳定性，培养的pH可以是例如6.5-7.5。优选地，在7.4的pH下培养细胞。宿主细胞可在20-40℃，特别是30-40℃的温度下培养，哺乳动物细胞优选在37℃下培养。

在本公开的方法中用于培养病毒的宿主细胞或宿主细胞系或细胞可以是任何适于产生病毒抗原、病毒载体或病毒产物的真核细胞。优选地，宿主细胞可以是“贴壁细胞”或“贴壁依赖性细胞”。贴壁细胞是在培养条件下粘附于表面的细胞，它们的生长可能需要贴壁，它们也可称为贴壁依赖性细胞。适用于本公开方法的贴壁细胞包括但不限于Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠细胞、人细胞、鸟细胞、昆虫细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、W1-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、NTCT细胞和PerC6细胞、3T3细胞，或其组合或修饰。优选的贴壁细胞是可在载体如PET条带上生长的贴壁依赖性细胞，但也可使用可适于作为贴壁细胞生长的悬浮细胞。更优选地，本公开的贴壁依赖性细胞是Vero细胞。在本领域技术人员的认知范围内选择适用于本发明方法的贴壁宿主细胞。

本公开的病毒可以是病毒、病毒抗原或病毒载体或其组合或修饰。病毒可以是全病毒或病毒抗原，选自但不限于血管性口炎病毒(VSV)、腺病毒、流感病毒、基孔肯雅病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒和重组痘苗病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、狂犬病病毒、西尼罗病毒、黄热病毒，及其嵌合体，以及鼻病毒和呼肠孤病毒。

在本公开的实施方案中，病毒是病毒载体。病毒载体是可用于将过客(passenger)核酸序列转移到目的细胞中的病毒。病毒载体可以是可用于衍生重组蛋白的病毒表达载体。优选地，病毒载体可以是修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)、VSV、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒。更优选地，本发明的病毒载体是VSV载体。由病毒载体表达的重组蛋白可以是病毒蛋白、细菌蛋白、治疗性重组蛋白或其组合。更优选地，由病毒载体产生的重组蛋白是病毒蛋白。

优选地，本发明的病毒是VSV载体。VSV，弹状病毒科(Rhabdoviridae)的成员，是具有负链RNA基因组的包膜病毒，可引起家畜的自限性疾病。减毒VSV是理想的病毒载体，因为它们在人类中是非致病性的，在动物中几乎是无毒的，在目的连续哺乳动物细胞系中显示稳健的生长，在复制期间缺乏DNA中间体，引发强的细胞和体液免疫应答，以及允许在多个位点插入转基因的基因组结构(Humphreys andSebastian,Immunology,2018,153:1-9；Clarke et al.,Vaccine.201634:6597-6609)。

如本文所用，“感染”或“病毒感染”是指病毒进入宿主细胞并随后在细胞中复制病毒。当细胞达到特定生物量时可以进行本公开的方法中宿主细胞的感染。优选地，当细胞达到由高生物量指示的高生长速率和由生物量传感器测量的高电导率时，它们可以被感染。当电导率在50mS/cm至约120±20mS/cm的范围内时，细胞可被目的病毒感染。当细胞达到由110±10mS/cm的电导率所显示的高生长时，细胞优选被感染。用至少一种病毒颗粒感染宿主细胞。如本文所用，感染复数(MOI)是感染每个细胞的病毒颗粒的平均数。用病毒感染宿主细胞可以在约0.0001-10，优选0.001-0.5的MOI下，最优选0.05的MOI下进行。充分感染所需的病毒颗粒数量在本领域技术人员的认知范围内。

本公开的方法的宿主细胞可以在100％的初始dO₂下培养。在感染前，dO₂可降低至90％的水平到低至20％的水平。dO₂可以从约80％降低到约60％，从约70％降低到约40％，从约50％降低到约15％。优选地，在感染前，dO₂可从约50％降低到约20％。更优选地，在感染前，所述水平降低至约20％。

dO₂可在感染前2至24小时范围内的时间开始降低，并在整个感染过程中和病毒收获期间保持在该水平。dO₂在感染前从约2小时至约10小时、从约5小时至约15小时、从约10小时至约20小时以及从18小时至约24小时开始降低。优选地，dO₂在感染前8小时至约12小时范围内的时间开始降低。

当通过生物量传感器测量的电导率在约50mS/cm至约90mS/cm的范围内时，可以开始本公开的dO₂的降低。当电导率范围从约40mS/cm至约60mS/cm、从约50mS/cm至约80mS/cm、从约70mS/cm至约90mS/cm、从约80mS/cm至约100mS/cm时，可以开始本公开的dO₂的降低。优选地，当电导率在约70mS/cm至约90mS/cm的范围内时，开始本公开的dO₂的降低。

本文所用的“收获”或“病毒收获”是指通过从生物反应器中的宿主细胞收集未澄清的培养基来收集病毒。病毒的收获可在感染后2至5天，或dO₂降低后3至6天进行。优选地，病毒的收获可在感染后2天进行。一些病毒在收获前可能需要额外的宿主细胞裂解的步骤。

本公开的病毒可通过包括但不限于噬菌斑测定、终点稀释测定、血细胞凝集测定、二辛可宁酸(bicinchoninic acid)测定或电子显微镜术的方法来定量。优选地，病毒可以通过噬菌斑测定法来定量。如本文所用，噬菌斑测定法是基于其噬菌斑形成单位(pfu)的测量来测量传染性病毒颗粒的数量的方法。在噬菌斑测定中，用连续稀释的病毒原液(stocksolution)感染细胞单层，并用琼脂糖覆盖层限制病毒的流动。被感染的细胞释放子代病毒，子代病毒进而感染邻近的细胞。细胞裂解，产生被未感染的细胞包围的清晰区域，称为噬菌斑，其可使用染料可视化。更高的样本病毒效价导致更高的噬菌斑数量。

实施例

实施例1-4中使用了iCELLis Nano固定床生物反应器系统。iCELLis Nano生物反应器可容纳约800mL，这相当于固定床高度为20mm至10mm，总表面生长面积为约5,300至40,000。生长面积相当于35至267个可用于堆积生长的T-150烧瓶(见图1A、1B和表1)。使用iCELLis进行不同参数的运行。

实施例1.来自活动的VSV生产，其中参数作为病毒生产基线

Vero细胞在iCELLis生物反应器中以约100％dO₂、37℃温度、7.4pH生长。在Vero细胞培养期间，使用生物反应器的生物量传感器监测细胞生长，并用VSV以55mS/cm电导率(细胞生长的量度)感染Vero细胞。在感染后约12-24小时，系统达到约75mS/cm的最高电导率(最高细胞生长)(图2)。感染是以0.05MOI。感染后2天收获病毒。当与来自在平底烧瓶(flat-stock)中生长的相同细胞的效价相比时，病毒产量增加超过1log/mL(图2；表2)。

实施例2.来自活动的VSV生产，其中dO₂在感染前约12小时降低并从感染维持到收获。

Vero细胞在约100％dO₂，37℃温度，7.4pH下培养。在Vero细胞培养期间，使用生物量传感器监测细胞生长，并以80mS/cm电导率(约最高电导率)感染细胞，即当达到最大细胞生长时，感染Vero细胞。在感染前约12小时，dO₂水平降低至45-50％，并在整个感染过程和整个收获过程中在该降低的水平保持恒定。温度保持在37℃，pH保持在7.4。感染后约2天收获病毒。在感染前12小时降低dO₂，在Vero细胞达到最大细胞生长后用VSV感染Vero细胞，当与来自平底烧瓶的VSV效价相比时，导致VSV效价增加超过2log(表2)，并且当与实施例1中的相比时，导致病毒效价增加5.9倍(没有dO₂降低)(图3)。

实施例3.除dO₂、pH和温度保持恒定外，来自具有最大电导率的活动的VSV生产。

Vero细胞在生物反应器中以约100％dO₂，37℃温度，7.4PH培养。在Vero细胞的培养期间，使用生物量传感器监测细胞生长，并以110mS/cm电导率(约最高电导率，因此当达到最大细胞生长时)感染细胞。感染是以0.05MOI。未对dO₂水平进行调整。在整个培养和感染期间，温度保持在37℃，pH保持在7.4。感染后约2天收获病毒。来自该实验的VSV效价类似于实施例1中的效价，表明实施例2中观察到的更高产量是由于dO₂的修饰，而不是由于在最高细胞生长时感染Vero细胞，这可能推测由于更多细胞被感染而增加总效价(图4；表2)。

表2

表2比较了不同运行之间的繁殖数据。繁殖数据在以下之间进行比较：1.VSV从平底烧瓶中的Vero细胞繁殖，2.VSV从iCELLis系统中的Vero细胞繁殖(运行1)，其中感染期间dO2％为90％，3.VSV从iCELLis系统中的Vero细胞繁殖(运行2)，其中感染期间dO2％为40％，和4.VSV从iCELLis系统中的Vero细胞繁殖(运行3)，其中感染期间dO₂％为20％。表2中的数据显示，分别来自CS10平底烧瓶、运行1、运行2和运行3的VSV效价和总病毒产量逐渐显著增加。这表明当与从平底烧瓶生产的病毒相比时，使用平床生物反应器iCELLis繁殖VSV导致病毒产量增加1至2log/mL。更重要的是，感染期间dO₂逐渐降低，导致VSV效价和总病毒产量逐渐显著增加。

实施例4.感染时不同dO₂水平下的VSV生产。

VSV在Vero细胞中于约100％dO₂、37℃温度、7.4pH下生长。感染前约12小时，dO₂水平降低至90％、40％和20％，并在整个感染过程中在该降低水平保持恒定。温度保持在37℃，pH保持在7.4。感染后约2天收获病毒。如表2所示，结果表明随着感染时dO₂水平降低，病毒产量逐步增加。

Claims

1.一种在生物反应器中生产病毒的方法，其包括以下步骤:

a)在生物反应器中提供宿主细胞；

b)使宿主细胞在恒定的初始dO₂水平、pH和温度下生长；

c)将dO₂降低至初始氧水平的20-90％；

d)在步骤c)之后2-24小时用至少一种病毒或病毒颗粒感染宿主细胞；

e)培养被所述病毒或病毒颗粒感染的所述宿主细胞以繁殖所述病毒；和

e)收获病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。

3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述生物反应器是平床生物反应器。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中固定床的高度为2cm至10cm。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述生物反应器是一次性平床生物反应器。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中步骤c中的所述dO₂水平降低至20-50％。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中当电导率为60mS/cm至80mS/cm时，步骤c中的所述dO₂水平降低。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中当电导率为90mS/cm至110mS/cm时，步骤d中的宿主细胞被病毒感染。

9.根据权利要求1至8所述的方法，其中病毒感染宿主细胞的感染复数(MOI)为约0.1至0.05。

10.根据权利要求1至9所述的方法，其中病毒感染宿主细胞的MOI为0.05。

11.根据权利要求1至10所述的方法，其中步骤c中的dO₂在步骤d中感染宿主细胞前12至24小时降低。

12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述病毒选自VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒和重组痘苗病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗病毒、黄热病毒，及其嵌合体，以及鼻病毒和呼肠孤病毒。

13.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述病毒是病毒载体。

14.根据权利要求1至13所述的方法，其中所述病毒是VSV载体。

15.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠细胞、人细胞、鸟细胞、昆虫细胞、HeLa细胞、293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、W1-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞和PerC6细胞。

16.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞。

17.根据权利要求1至16所述的方法，其还包括通过噬菌斑测定法测定病毒效价的步骤。

18.根据权利要求1至17所述的方法，其还包括纯化和/或表征所述病毒的步骤。

19.根据权利要求1至18所述的方法，其还包括用所述病毒生产疫苗的步骤。

20.根据权利要求1至19所述的方法，其中所述生物反应器的容量为700至800mL。

21.根据权利要求1至20所述的方法，其中所述生物反应器的容量为50至80L。

22.根据权利要求1至21所述的方法，其中所述生物反应器包括无蛋白质培养基。

23.一种在生物反应器中生产病毒的方法，其包括以下步骤:

a)在生物反应器中提供宿主细胞；

b)使宿主细胞在恒定的初始dO₂水平、pH和温度下生长至融合；

c)将dO₂降低至初始dO₂水平的20-50％；

d)用至少一种病毒或病毒颗粒感染宿主细胞；

e)收获病毒。