JP2023547618A - ウイルスを細胞に感染させるための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バイオリアクタ内の宿主細胞からのウイルス、ウイルス粒子またはウイルスベクターの収量を増加させる方法に関する。本発明は、ウイルス収量の増加をもたらす、空気流、Ｏ２流、およびそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関を使用して、宿主細胞の感染の最適時間を決定および制御する再現性のあるロバストな方法およびシステムを提供する。本発明は、ワクチンおよびウイルスベクター製造のためにウイルスおよびウイルスベクターを増殖させる方法に関する。より詳細には、本発明は、固定床バイオリアクタ内の宿主細胞からのウイルス収量の増加をもたらす宿主細胞感染の開始のための特定の方法に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２３日に出願された米国仮出願第６３／１０４，８０３号の利益を主張し、任意の数値、表、核酸配列、アミノ酸配列または図面を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２３日に出願された米国仮出願第６３／１０４，８０３号の利益を主張し、任意の数値、表、核酸配列、アミノ酸配列または図面を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、ワクチンおよびウイルスベクター製造のためにウイルスおよびウイルスベクターを増殖させる方法に関する。より詳細には、本発明は、固定床バイオリアクタ内の宿主細胞からのウイルス収量の増加をもたらす宿主細胞感染の開始のための特定の方法に関する。
本発明は、ワクチンおよびウイルスベクター製造のためにウイルスおよびウイルスベクターを増殖させる方法に関する。より詳細には、本発明は、固定床バイオリアクタ内の宿主細胞からのウイルス収量の増加をもたらす宿主細胞感染の開始のための特定の方法に関する。
発明の背景
ワクチンおよび他の治療薬に対する絶えず増加している需要を満たすために、ウイルスおよびウイルスベクターの再現可能でロバストな生産を可能にするロバストな技術が不可欠である。さらに、ベロ細胞および他の哺乳動物細胞プラットフォーム、鳥類細胞プラットフォーム、および昆虫細胞技術プラットフォームなどの汎用性のある宿主細胞技術プラットフォームの開発のために、宿主細胞からのウイルス収量を改善する技術もまた、ワクチンプロセスおよび生産の開発を加速するのに重要な役割を果たす。本発明は、ウイルス生成の方法を改善する必要性を満たす。
ワクチンおよび他の治療薬に対する絶えず増加している需要を満たすために、ウイルスおよびウイルスベクターの再現可能でロバストな生産を可能にするロバストな技術が不可欠である。さらに、ベロ細胞および他の哺乳動物細胞プラットフォーム、鳥類細胞プラットフォーム、および昆虫細胞技術プラットフォームなどの汎用性のある宿主細胞技術プラットフォームの開発のために、宿主細胞からのウイルス収量を改善する技術もまた、ワクチンプロセスおよび生産の開発を加速するのに重要な役割を果たす。本発明は、ウイルス生成の方法を改善する必要性を満たす。
本発明の実施形態は、細胞数のサンプリングが困難、非現実的、または不可能である固定床および他のバイオリアクタシステムで拡大増殖する宿主細胞の感染の最適時間を決定するために、空気流およびＯ２流のパラメータを利用するためのシステムおよび方法を提供する。
細胞密度に関して固定床リアクタにおける感染の最適時間を決定するために代謝物データを使用する既知の方法は、サンプリングおよび広い感染ウインドウを必要とする。全空気流をリアクタ内のＯ２流と比較することを含むプロセス空気パラメータの観察を通じて、本発明者らは、固定床リアクタへの空気流の体積が減少し、リアクタへのＯ２流の体積の増加傾向と交差する傾向を含む、目的の要因、パラメータ、および傾向を特定した。本発明は、ウイルス収量の増加をもたらす、空気流、Ｏ２流、およびそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関を使用して、宿主細胞の感染の最適時間を決定および制御する再現性のあるロバストなプロセスを提供する。本明細書に開示されるデータは、リアクタ内の細胞密度に対する空気／Ｏ２の傾向および相関を裏付けている。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて特許商標局によって提供される。
発明の詳細な説明
本発明は、ウイルス収量の増加をもたらす、空気流、Ｏ２流、およびそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関を使用して、宿主細胞の感染の最適時間を決定および制御する再現性のあるロバストなプロセスのためのシステムおよび方法を提供する。
本発明は、ウイルス収量の増加をもたらす、空気流、Ｏ２流、およびそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関を使用して、宿主細胞の感染の最適時間を決定および制御する再現性のあるロバストなプロセスのためのシステムおよび方法を提供する。
或る実施形態では、本発明は、宿主細胞にウイルスを感染させる方法であって、宿主細胞を計数する工程を必要とせず、バイオリアクタ内で宿主細胞を培養する工程、バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットを観察する工程、バイオリアクタプロセス空気パラメータに基づいて第１の時間マーカを特定する工程、第１の時間マーカに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、および計算された感染ウインドウの最適時間の間に宿主細胞を感染させる工程、を含む方法を提供する。
現行適正製造規範（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＣＧＭＰ）と一致する機器は、細胞数のために装備されていなくてもよい。本発明の利点は、時間、細胞数、または細胞数の代用物（バイオマスなど）の代わりに、またはそれに加えて、空気流と酸素流との相関に基づいて、プロセス監視が感染の最適時間を開始することを可能にするプロセスを提供することである。
特定の実施形態では、宿主細胞は、接着性細胞を含み得る。特定の実施形態では、バイオリアクタは、固定床バイオリアクタであってもよい。特定の実施形態では、バイオリアクタプロセス空気パラメータを観察する工程は、バイオリアクタへの全空気流の速度を測定し、複数の時点でバイオリアクタへのＯ２流の速度を測定し、それぞれの各時点に現在の測定値セットを作成することを含む。特定の実施形態では、第１の時間マーカを特定する工程は、バイオリアクタへの全空気流の速度が減少し、バイオリアクタへのＯ２流の速度の増加傾向と交差する時間を決定することを含む。特定の実施形態では、第１の時間マーカを特定する工程は、バイオリアクタへの全空気流の速度が減少し、バイオリアクタへのＯ２流の速度の予想される増加傾向と交差すると予想される将来の時間を予測するために、１またはそれを超える現在の測定値セットから１またはそれを超える値を計算することを含む。
必要に応じて、特定の細胞株およびウイルスに対して感染ウインドウが確立されると、確立された感染ウインドウを適用し、他のウイルスと共に利用することができる。しかしながら、データを集めるための能動的な監視およびリアルタイムでのプロセス制御のために、バイオリアクタへの全空気流の速度およびバイオリアクタへのＯ２流の速度を監視することが依然として望ましい場合がある。
本発明におけるウイルスの培養に使用される宿主細胞の種類は、天然のものであり得るか遺伝子改変（例えば、組換え細胞、細胞株など）され得、ウイルス抗原の産生、ウイルスベクター、またはウイルス産生に適した任意の真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞はベロ細胞であり、ウイルスは組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）などのウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、感染ウインドウの最適時間の決定は、限定されないが、空気流、Ｏ２流、およびそれらの収束、それらの間の関係（例えば、それらの間の比）、またはそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関に基づいており、ウイルス収量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、感染ウインドウの最適時間は、空気流とＯ２流の収束である。いくつかの実施形態では、感染ウインドウは、互いに±３０％以内、または互いに±２０％以内、または互いに±１０％以内、または互いに±５％以内になるように、空気流が減少し、Ｏ２流が増加する時間間隔である。
本発明の実施形態は、バイオリアクタ内でウイルスを生産する方法であって、バイオリアクタ内に宿主細胞を提供する工程、バイオリアクタ内で宿主細胞を成長させる工程、バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットを観察する工程、バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、感染ウインドウの最適時間の間に少なくとも１つのウイルスまたはウイルス粒子を宿主細胞に感染させる工程、ウイルスまたはウイルス粒子に感染した宿主細胞をインキュベートして、ウイルスを増殖させる工程、および必要に応じて、ウイルスを回収する工程、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は接着性細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタはフラットベッド型バイオリアクタであり、宿主細胞を成長させる工程は、一定の初期溶存酸素（ｄＯ２）レベル、ｐＨ、および温度で行われる。特定の実施形態では、バイオリアクタは、使い捨てフラットベッド型バイオリアクタである。
特定の実施形態では、単独で、または任意の前述の実施形態と組み合わせて、感染ウインドウの最適時間を計算することは、バイオリアクタへの全空気流の速度が減少し、バイオリアクタへのＯ２流の速度の増加傾向と交差するまたは交わる時間を決定することを含む。代替の実施形態では、単独で、または任意の前述の実施形態と組み合わせて、感染ウインドウの最適時間を計算することは、バイオリアクタの空気－Ｏ２差が０に近づいているかまたは０である時間を決定することを含む。他の実施形態では、単独で、または任意の前述の実施形態と組み合わせて、感染ウインドウの最適時間を計算することは、バイオリアクタの空気－Ｏ２差が所定の閾値未満であるか、または所定の閾値を下回ると予想される時間を決定することを含む。いくつかの実施形態では、感染ウインドウの最適時間は、空気流とＯ２流の収束である。いくつかの実施形態では、感染ウインドウは、互いに±３０％以内、または互いに±２０％以内、または互いに±１０％以内、または互いに±５％以内になるように、空気流が減少し、Ｏ２流が増加する時間間隔である。
収束を考慮し、非限定的な例として図１の代表的な実行１を参照すると、＋／－３０単位（例えば、ｍＬ／分）の収束閾値がこの実行に対して選択され得る。空気流が８０（例えば、ｍＬ／分）であり、Ｏ２流が２０（例えば、ｍＬ／分）である場合、８０－２０＝６０であり、収束は達成されず、感染ウインドウは満たされない。空気流が６６であり、Ｏ２流が３８である場合、６５－３８＝２７であり、収束が達成され、感染ウインドウが満たされる（この例では、これは感染ウインドウの時間付近の破線のボックスの最初の点である）。空気流が６０であり、Ｏ２流が４０である場合、６０－４０＝２０であり、収束が達成され、感染ウインドウが満たされる（この例では、これは感染ウインドウの時間付近の破線のボックスの後の点である）。この実行の場合、これは感染が発生したときである。特定の実施形態では、収束の最小時間、収束のより狭いウインドウ（より低い閾値）、または感染前の別の値とともに収束を必要とするなど、追加のパラメータが適用され得ることに留意されたい。
ここで図１の代表的な実行２を参照すると、非限定的な例として、＋／－３０単位（例えば、ｍＬ／分）の収束閾値がこの実行に対して選択され得る。空気流が８０であり、Ｏ２流が２０である場合、８０－２０＝６０であり、収束は達成されず、感染ウインドウは満たされない。空気流が６０であり、Ｏ２流が３０である場合、６０－３０＝３０であり、収束が達成され、感染ウインドウが満たされる（これは感染ウインドウの時間付近の破線のボックスの最初の点である）。空気流が５０であり、Ｏ２流が５０である場合、５０－５０＝０であり、収束（この場合は交点でもある）が達成され、感染ウインドウが満たされる（これは感染ウインドウの時間付近の破線のボックスの交点である）。空気流が４０であり、Ｏ２流が６０である場合、４０－６０＝－２０であり、収束が達成され、感染ウインドウが満たされる（これは感染ウインドウの時間付近の破線のボックスの後の点である）。この実行の場合、これは感染が発生したときである。特定の実施形態では、収束の最小時間、収束のより狭いウインドウ（より低い閾値）、または別の値（空気流またはＯ２流のいずれかの特定の絶対値など）の感染と共に収束を必要とするなど、追加のパラメータを適用してもよいことに留意されたい。
有利には、空気流およびＯ２流の速度に基づいて宿主細胞を感染させるこの方法は、プロセス監視に基づいてウイルス産生を制御および再現可能にし、細胞計数を必要とせずに閉鎖系の使用を可能にする。閉鎖系として、バイオリアクタは、細胞計数の必要性または細胞計数のためのアクセスポートの必要性なしに、連続培養を可能にする、動作中に閉鎖される（例えば、気密封止される）自己完結型環境である。
あるいは、宿主細胞の感染は、本発明を使用する履歴データに由来する時間に基づいてもよいが、能動的な監視は行わない。
いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内に提供（例えば、播種）された宿主細胞は、感染工程の前に計数されない。いくつかの実施形態では、本方法は、感染後に宿主細胞または宿主細胞の生成物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の宿主細胞は、回収前に計数されない。
いくつかの実施形態では、バイオリアクタは細胞計数デバイス（例えば、計数チャンバ、自動細胞計数器、コールターカウンター、またはフローサイトメーターなどのサイトメーターなどの機器）を含まず、かつ細胞計数デバイスに接続されていない。細胞計数デバイスは、画像ベースの計数（例えば、明視野または蛍光）または非画像ベースの計数（例えば、電流排除）などの様々な技術を利用することができる。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは細胞計数のためのアクセスポートを有しない。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、閉鎖密閉（例えば、気密封止）系である。
特定の実施形態では、ウイルスによる宿主細胞の感染は、約０．１～０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）である。特定の実施形態では、ウイルスによる宿主細胞の感染は、０．０５のＭＯＩである。特定の実施形態では、ウイルスまたはウイルス粒子に感染した宿主細胞をインキュベートしてウイルスを増殖させる工程は、一定の初期のｄＯ２レベル、ｐＨ、および温度とは異なる一定の最終のｄＯ２レベル、ｐＨ、および温度で宿主細胞をインキュベートすることを含む。
ウイルスは、任意の天然に存在するウイルスまたは遺伝子改変ウイルス（例えば、組換えまたは操作されたウイルス）であり得る。特定の実施形態では、ウイルスは、天然に存在するＶＳＶもしくは遺伝子改変ＶＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、エボラ－ザイールウイルス、エボラ－スーダンウイルス、エボラ－マールブルグウイルス、ニパウイルス、または前述のいずれかのキメラからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスは、ＶＳＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスは、別の目的のウイルス由来の糖タンパク質を含有するＶＳＶなどの改変ウイルスベクターである。
本発明におけるウイルスの培養に使用される宿主細胞の種類は、天然のものであり得るか遺伝子改変（例えば、組換え細胞、細胞株など）され得、ウイルス抗原の産生、ウイルスベクター、またはウイルス産生に適した任意の真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、天然に存在するまたは遺伝子改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞およびマウス細胞）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞およびウズラ（ｑｕａｉｌ）細胞）、および昆虫細胞の中から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベロ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ １５細胞、Ｗ１－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＯＲ細胞およびＱＯＲ細胞からなる群より選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞は、ベロ細胞またはＨＥＫ ２９３細胞である。
必要に応じて、本発明の方法は、宿主細胞の拡大増殖、感染、および任意の回収を超える工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、プラークアッセイ法によってウイルス力価を決定する工程；ウイルスを精製するおよび／または特徴付ける工程；またはワクチン、遺伝子送達用のウイルスベクター、もしくは細胞を用いた免疫療法組成物、もしくはウイルスなどの細胞由来生成物、もしくはウイルスの一部を産生する工程をさらに含み得る。本発明は、任意の適切な投与経路によるヒトまたは動物の対象への投与のために製剤化され得る、本方法によって産生されたワクチンおよび免疫療法組成物などの組成物を含む。
例えば、ワクチン、ベクター、または免疫療法組成物などの組成物を生産するために、回収した細胞または細胞由来生成物（例えば、ウイルスもしくはその一部、または他の生体分子）を、１またはそれを超える賦形剤、希釈剤（水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水など）、担体、アジュバント、または前述の２つもしくはそれを超える任意に組み合わせと組み合わせてもよい。アジュバントは、ミョウバン塩および他の鉱物アジュバント、細菌生成物または細菌由来アジュバント、張力活性剤（ｔｅｎｓｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、サポニン）、水中油型（ｏ／ｗ）および油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン、リポソームアジュバント、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－γ）、およびα－ガラクトシルセラミドアナログなど、ワクチンまたは組成物の意図する使用に適した任意のクラスのものであり得る。アジュバントのいくつかの非限定的な例としては、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）エマルジョン、ＱＳ２１、フロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、およびミョウバンが挙げられる。
必要に応じて、本方法は、当技術分野で公知の方法を使用して、細胞を回収すること、および感染した宿主細胞から細胞由来生成物を回収することをさらに含み得る。本発明の方法を使用して産生された天然に存在するまたは遺伝子改変されていない細胞によって産生された様々な生体分子は、薬物または生物製剤の製造などの様々な使用のため、および薬理学的研究のために回収することができる（例えば、生体分子産生細胞から単離される）。したがって、本発明を使用して、細胞を、生体分子などの細胞の生成物を提供するための生物学的「工場」として使用することができる。「生体分子」という用語は、細胞によって産生され得る分子（複数可）（細胞由来生成物）を指す。そのような生体分子としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、ウイルス、ウイルスの一部（例えば、ウイルス粒子）、および他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。生体分子は、例えば、細胞内、膜貫通であってもよく、または細胞によって分泌されてもよく、当技術分野で公知の方法を使用して精製または単離され得る。
バイオリアクタの容量は、例えばスクリーニング、実験室の研究開発、臨床研究、および商業生産のための生産目的を満たす任意のものであり得る。適切なバイオリアクタの様々なタイプ、サイズ、およびモデルが市販されている。本発明で使用され得る市販のバイオリアクタの例としては、限定されないが、Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびｉＣＥＬＬｉｓによって生産された使い捨て固定床バイオリアクタが挙げられる。
いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、１ｍ２～６００ｍ２（表面積として）、あるいは１０ｍ２～３０ｍ２、あるいは３０ｍ２～２００ｍ２、あるいは２００ｍ２～６００ｍ２、あるいは６００ｍ２～２４００ｍ２、あるいは２．４ｍ２～２４００ｍ２の範囲の容量を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは７００～８００ｍＬ（例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ ｎａｎｏ）の体積容量（ｖｏｌｕｍｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、２５Ｌ～５０Ｌ（例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ ５００）の体積容量を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、１０ｍ２～３０ｍ２の容量、または１．５Ｌ～３．５Ｌ（例えば、ＵＮＶＣ ｃａｒｂｏ）の体積容量を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、２００ｍ２～６００ｍ２の容量、または３０Ｌ～１００Ｌ（例えば、ＵＮＶＣ ｎｉｔｒｏ）の体積容量を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、約２，４００ｍ２の容量または３５０Ｌ～４００Ｌ（例えば、ＵＮＶＣ ｏｘｏ）またはそれを超える体積容量を有する。
培地は、宿主細胞および産生目的に適した任意の培地、例えば無血清の化学的に定義された培地であり得る。
本発明の方法の実施形態は、バイオリアクタ内に宿主細胞を提供する工程、コンフルエンスまで一定の初期のｄＯ２レベル、ｐＨおよび温度で宿主細胞を成長させる工程、バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、感染ウインドウの最適時間の間に少なくとも１つのウイルスまたはウイルス粒子を宿主細胞に感染させる工程、ウイルスまたはウイルス粒子に感染した宿主細胞をインキュベートしてウイルスを増殖させる工程、および必要に応じて、ウイルスを回収する工程、を含み得る。
実施形態は、空気流およびＯ２流を含む因子とバイオリアクタ内の細胞密度との間の相関関係を有利に使用し得る。この相関する傾向は、固定床リアクタ（例えば、細胞計数サンプリングを可能にしない、または細胞計数が非実用的であるリアクタを含む）における感染の最適時間をより良好に決定するために使用され得る。
ここで図面を参照すると、図１は、本発明の実施形態による固定床バイオリアクタシステムの２つの代表的な実行について、空気流と酸素（Ｏ２）流とを比較している。
図２は、本発明の実施形態による空気－Ｏ２差 対 Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ（ＵＮＶＣ）生細胞密度を示す。実施形態は、空気流速度とＯ２流速度との間の差を評価し得る。この場合、正の差は、空気流体積がＯ２流体積よりも大きいことを示し、負の差は、その逆、すなわち空気流体積がＯ２流体積よりも小さいことを示す。空気流体積がＯ２流体積に等しい場合、差は０である。
このチャートでは、差（ｄ）が０に近づくにつれて、生細胞密度（ＶＣＤ、１平方センチメートル当たりの生細胞においてここで測定される）は１×１０５細胞／ｃｍ２に近づく。ｄ＝２０付近で、ＶＣＤは１×１０５細胞／ｃｍ２の対数の半分以内であり、これは「感染トリガーポイント」として知られている。実施形態は、空気流およびＯ２流の傾向を使用して、感染に必要な時間を推定し得る。この例では、ｄを使用すると、ＶＣＤの変動性のおよそ４２％が保持され、Ｒ２＝０．４２２４であり、差：ＶＣＤ相関係数＝－０．６４である。
図３は、本発明の実施形態による、時間をわたっての毎時の平均空気－Ｏ２差 対 生細胞密度をグラフ化したものであり、ｘ軸上の時間（接種後の時間、またはｈｐｉ）に対する右側軸上の空気－Ｏ２差 対 左側軸上のＶＣＤ（細胞／ｃｍ２）を比較する。６４ｈｐｉまでに、過去のＶＣＤは５×１０４～１×１０５細胞／ｃｍ２であることが示されている。８４～９６ｈｐｉのウインドウ内で、ＶＣＤは１×１０５細胞／ｃｍ２に最も近い傾向がある。このウインドウで、空気およびＯ２のトレンド線が収束し始める。本発明の実施形態は、有利には、感染の最適時間のより信頼性の高い推定値を提供し得る。
図４は、本発明の実施形態による代表的な実行２（図１に示す）から収集されたデータに事後に適用された空気－Ｏ２差モデルを示す。分析を代表的な実行＃２に外挿すると、感染の実際の時間が感染の最適時間よりも遅く起こったことが示唆される。この実施例では、細胞が１×１０５細胞／ｃｍ２の目標密度よりも高い細胞密度である１．３×１０５生細胞／ｃｍ２の密度であった場合に感染が起こった。
図５Ａは、固定床バイオリアクタで使用されるマイクロキャリアストリップを示し、ストリップ当たり約１１．２ｃｍ２の３次元面積の１３個のマイクロキャリアストリップが５ｍＬの培地中に示されている。
図５Ｂは、床あたり最大３，５００個のストリップを保持するために使用され得るバイオリアクタの断面を示す。
図５Ｃは、断面図でのバイオリアクタの異なる部分を示す。
本発明は、宿主細胞を計数する必要な工程を伴わずに、ウイルスを宿主細胞に感染させる方法を提供する。特に、本発明は、ウイルス収量の増加をもたらす宿主細胞の感染の最適時間を決定および制御する再現性のあるロバストなプロセスを提供する。一実施形態では、本方法は、１）全空気流、Ｏ２流、溶存酸素（ｄＯ２）、ｐＨ、および温度などのシステムパラメータを測定および制御することができる環境内のバイオリアクタに宿主細胞を提供（例えば、播種）する工程、２）感染前システムパラメータの第１のセットで宿主細胞を成長させる工程、３）システムパラメータを監視する工程、４）測定されたシステムパラメータのうちの２つまたはそれより多くにおける変化によって少なくとも部分的に決定された時間で少なくとも１つのウイルスを宿主細胞に感染させる工程、感染後システムパラメータの第２のセットでウイルスと共に宿主細胞をインキュベートする工程、ならびに必要に応じて、５）ウイルスを回収する工程を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、足場依存性であり、固定するために平らな表面、マイクロキャリア、および／または固定床を必要とする接着性細胞である。特定の実施形態では、ベロ細胞またはＨＥＫ ２９３細胞は、固定床バイオリアクタ内の宿主細胞として使用される。
いくつかの実施形態では、本方法は、１）一定の初期の８０～１００％のｄＯ２、７．２～７．４のｐＨおよび３６℃＋２℃の温度で宿主細胞をバイオリアクタに提供（例えば、播種）する工程、２）ｐＨおよび温度を一定に保ちながら、ｄＯ２レベルを初期ｄＯ２レベルの最大５０％まで低下させる工程、３）互いに±２０％以内になるように、空気流が減少し、酸素流が増加するときとして定義される感染ウインドウの間に、宿主細胞に少なくとも１つのウイルスを感染させる工程、４）宿主細胞を２０～５０％のｄＯ２レベル、７．２～７．４のｐＨおよび３６℃±２℃の温度でウイルスと共にインキュベートする工程、ならびに必要に応じて、５）ウイルスを回収する工程を含む。
本発明の具体的な実施形態では、ｄＯ２を、宿主細胞にウイルスを感染させる１２時間前に少なくとも５０％減少させる。或る実施形態では、宿主細胞を最高の細胞密度まで成長させた後、宿主細胞にウイルスを感染させる。本発明のさらに別の実施形態では、ｄＯ２を、宿主細胞が最高細胞密度に達した後に減少させる。
この方法によって産生されるウイルスの量は、ｄＯ２を含むすべてのパラメータがプロセス全体にわたって一定に保たれる従来の方法で産生されるものよりも再現性が高く、著しく多い。
以下は、本出願の詳細な説明のセクションに適用される。
単数名詞を指すときに不定冠詞または定冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」が使用される場合、特に明記されない限り、これはその名詞の複数を含む。
本発明の文脈において、「約（ａｂｏｕｔ）」または「近似（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ）」という用語は、問題の特徴の技術的効果を依然として保証するために当業者が理解する精度の区間を示す。数値と組み合わせて使用する場合、この用語は、典型的には、示された数値から±１０％、好ましくは±５％の偏差を示す。
本明細書で使用される場合、「バイオリアクタ」という用語は、制御された条件下でのウイルスおよびベクターの増殖などの生物学的プロセスが行われ得る生物学的に活性な環境を支援するデバイスを指す。バイオリアクタは、研究室で使用されるものなどの小規模培養、ならびにワクチンウイルス、抗原、およびベクターなどの生物学的高分子をパイロットプラントまたは商業規模で産生および回収するための容器またはバットを備える大規模バイオリアクタ用に設計され得る。バイオリアクタを使用して、懸濁細胞および接着性細胞の両方を増殖させ得る。バイオリアクタは、酸素／ｄＯ２、窒素、二酸化炭素、およびｐＨのレベルを調整することができる制御された環境である。
「固定床バイオリアクタ」とは、細胞の接着および成長を促進する充填材の固定床を含むバイオリアクタの一種を意味する。固定床バイオリアクタは、低い剪断力で高細胞密度を灌流する能力のために、小規模および大規模の両方でウイルスワクチン製品を生産するために使用されてきた。固定床バイオリアクタの任意の構成またはプラットフォームを本発明と共に使用することができる。
固定床バイオリアクタは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｅｒｒｉｅ ＤＭら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０２０、３８：３６３９－３６４５に記載されている市販のｉＣＥＬＬｉｓシステム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）システム（Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ）などの使い捨てバイオリアクタであってもよい。ｉＣＥＬＬｉｓシステムプラットフォームは、無菌的な取り扱いを必要としないロバストで単一の閉鎖系において、織られた医療グレードのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）繊維で構成された担体を含む新規な固定床技術を提供する。さらに、このシステムは、温度、Ｏ２、ｐＨ、二酸化炭素（ＣＯ２）、および窒素（Ｎ２）の制御による「ウォーターフォール」技術を使用して、さらに、低いセル剪断応力および均一に分布した培地循環を生成する磁気インペラの使用によって、高速のガス交換を組み込む。ほとんどのウイルスについて、ｉＣＥＬＬｉｓシステムからの産生力価は、古典的な接着性細胞フラットストックフラスコと比較した場合、有意に増加する。ｉＣＥＬＬｉｓ技術は、成長面積が０．５～４ｍ２であるｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏなどの小規模において、および成長面積が６６～５００ｍ２の範囲であるｉＣＥＬＬｉｓ ５００などの製造規模において使用され得る。小規模システムで開発されたプロセスは、製造規模のプロセスにスケールアップされ得る。
Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓのｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）バイオリアクタシステムは、一連の成長表面 ｓｃａｌｅ－Ｘ「ｈｙｄｒｏ」（＜３ｍ２）「ｃａｒｂｏ」（１０～３０ｍ２）および「ｎｉｔｒｏ」（２００～６００ｍ２）を提供する。この範囲は、スケーラブルなプロセスおよび臨床ロット生産の能力を提供する。Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ製品ライン内では、バイオリアクタの高さは増加するが、直径は一定に保たれる。例えば、ｃａｒｂｏ １０ｍ２バイオリアクタは、３０ｍ２バイオリアクタの高さの１／３である。しかしながら、異なるライン間のスケールアップは、クロマトグラフィーシステムにおけるスケールアップと同様に、固定床の高さを一定に保ち、直径を増加させることによって達成される。例えば、２００ｍ２のバイオリアクタは、１０ｍ２のバイオリアクタと同じ高さであるが、直径は異なる。ｓｃａｌｅ－Ｘ ｃａｒｂｏシステムは、ベンチスケール自動化プロセスコントローラ（ｐＨ、ＤＯ、Ｔ、撹拌、液体流量）によって動作されるインライン生成物濃縮と連結された使い捨てバイオリアクタであり、ウイルス産物の生成および同時濃縮を可能する（これは、新規であり、このタイプの固定床バイオリアクタを市場の他のものと区別する特徴である）。ｓｃａｌｅ－Ｘ ｃａｒｂｏバイオリアクタ内の固定床は、表面積に応じて、１．６～３．２Ｌの全容器体積で１０ｍ２～３０ｍ２の細胞成長のための表面積を提供する。これにより、単位体積当たりの高い細胞密度に対する容量、および標準的なバイオセーフティキャビネットへの統合を可能にするコンパクトな設置面積（footprint）が得られる。多くの市販の固定床バイオリアクタは、細胞付着のための基材としてランダムに充填されたディスクまたは布ストリップを使用するが、ｓｃａｌｅ－Ｘバイオリアクタは、細胞成長のための均一性および容器間の一貫性を提供するメッシュ層で構成された固定床を利用する。固定床バイオリアクタは、ｐＨ、温度、溶存酸素、および接着性細胞密度を示すバイオマスを測定および監視するセンサを有してもよい。固定床バイオリアクタはまた、酸素または窒素の添加を可能にする異なるポート、培地交換ポート、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および／またはＣＯ２を添加してｐＨを調整するためのポートを有し得る。培地のｄＯ２は、Ｏ２またはＮ２の添加によって改変され得る。好ましくは、ｄＯ２レベルを、バイオリアクタのヘッドスペースにＮａを注入し、同時にｄＯ２を撹拌および監視することによって制御された方法で枯渇させ得る。
本発明で使用される宿主細胞は、足場依存性細胞であってもよく、または足場依存性細胞株であるように適合され得る。開示される方法の宿主細胞はマイクロキャリア上で培養され得、バイオリアクタまたはマイクロキャリアストリップ内に懸濁され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、固定床バイオリアクタの固定床においてマイクロキャリアストリップ上で培養される。いくつかの実施形態では、固定床バイオリアクタは、市販のｉＣＥＬＬＩＳ Ｎａｎｏ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｉＣＥＬＬｉｓ ５００バイオリアクタ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、またはＵｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ固定床バイオリアクタ（Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ ＳＡ）である。いくつかの実施形態では、固定床は、ｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏなどの８００ｍＬ固定床バイオリアクタでは最大４０，０００ｃｍ２、ｉＣＥＬＬｉｓ ５００などの２５Ｌ固定床バイオリアクタ（図５Ａ～Ｃ；表１）では最大５，０００，０００ｃｍ２を提供し得る。固定床の高さは、２０ｍｍ～１０ｍｍの範囲であり得、８００ｍＬの固定床バイオリアクタにおいて５３００ｃｍ２～４０，０００ｃｍ２から２５Ｌの固定床バイオリアクタにおいて６６００００ｃｍ２～５，０００，０００ｃｍ２の成長面積を提供する。
宿主細胞は、２，０００～２０，０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度を使用することによって培養され得る。播種密度は、宿主細胞の種類、バイオリアクタの体積、固定床バイオリアクタ内の固定床の高さなどに基づいて調整され得る。プロセスに最適な播種密度を選択することは、当業者の知識の範囲内である。代謝的に活性な細胞の成長は、限定されないが、空気流、Ｏ２流、およびそれらの収束、それらの間の関係（例えば、それらの間の比）、またはそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関によって監視され得、ウイルス収量の増加をもたらす。
本発明は、バイオリアクタの固定床内のバイオマスセンサを使用してバイオマスなどのさらなるパラメータを測定することを含み得る。導電性を介して接着性細胞の質量を示すバイオマスは、宿主細胞の全体的な成長および感染後のウイルスの増殖による細胞質量の減少を監視するために利用され得る。バイオマスセンサによって監視されるように、より高い伝導度によって示されるより高いバイオマスは、細胞のより高い成長速度を示す。しかしながら、バイオマス測定への依存には欠点がある。バイオマスは、代謝活性またはピーク産生を表すものではない。例えば、宿主細胞は老化に入り、依然として高バイオマスを記録し得る。さらに、いくつかのシステムにおけるバイオマス測定は、バイオリアクタにアクセスする必要があり、このことは、ＣＧＭＰコンプライアンスを含む臨床プロセスおよび商業プロセスの課題を提示する可能性がある。
本明細書で使用される場合、「培養培地」または「培地」は、バイオリアクタ内で宿主細胞を培養するために使用される液体を指す。本開示の手順で使用される培地は、限定されないが、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、炭水化物を含む、宿主細胞の成長を支援する様々な成分を含み得る。培地は、無血清培地であってもよく、これは、いかなる動物血清も含まずに製剤化された培地である。使用される場合、無血清培地は、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ ＡＧＴ、ＨｙＱ ＰＦ－Ｖｅｒｏ、ＭＰ－Ｖｅｒｏなどの中から選択され得る。培養培地は、アニマルフリー（ａｎｉｍａｌ－ｆｒｅｅ）培地であってもよく、すなわち、動物起源の生成物を一切含まない。培養培地は無タンパク質培地であってもよく、すなわち、培地はタンパク質なしで製剤化される。無血清培地または無タンパク質培地は、血清またはタンパク質なしで製剤化され得るが、宿主細胞に由来する細胞タンパク質、および必要に応じて無血清培地または無タンパク質培地に特異的に添加されたタンパク質を含有してもよい。
培養のためのｐＨは、宿主細胞のｐＨ安定性に応じて、例えば６．５～７．５であり得る。好ましくは、細胞は７．４のｐＨで培養される。宿主細胞は、２０～４０℃の間、具体的には３０℃～４０℃の間、好ましくは哺乳動物細胞については３６℃±１℃の温度で培養され得る。
本開示の方法においてウイルスの培養に使用される宿主細胞もしくは宿主細胞株、または細胞は、ウイルス抗原の産生、ウイルスベクター、またはウイルス産生に適した任意の真核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は「接着性細胞」または「足場依存性細胞」であり得る。接着性細胞は、培養条件下で表面に接着する細胞であり、成長するために足場が必要な場合があり、足場依存性細胞と呼ばれることもある。
本発明で使用される宿主細胞は、天然のものであり得るか遺伝子改変（例えば、組換え細胞、細胞株など）され得、ウイルス抗原の産生、ウイルスベクター、またはウイルス産生に適した任意の真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、天然に存在するまたは遺伝子改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞およびマウス細胞）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞およびウズラ（ｑｕａｉｌ）細胞）、および昆虫細胞の中から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベロ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ １５細胞、Ｗ１－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＯＲ細胞およびＱＯＲ細胞の中から選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞は、ベロ細胞またはＨＥＫ ２９３細胞である。
好ましい接着性細胞は、ＰＥＴストリップなどの担体上で成長され得る足場依存性細胞であるが、接着性細胞として成長するように適合され得る懸濁細胞も使用してもよい。いくつかの実施形態では、本発明において使用される足場依存性細胞はベロ細胞である。本発明のプロセスにおける使用に適した接着性宿主細胞を選択することは、当業者の知識の範囲内である。
ウイルスは、任意の天然に存在するウイルスまたは遺伝子改変ウイルス（例えば、組換えまたは操作されたウイルス）であり得る。特定の実施形態では、ウイルスは、天然に存在するＶＳＶもしくは遺伝子改変ＶＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、エボラ－ザイールウイルス、エボラ－スーダンウイルス、エボラ－マールブルグウイルス、ニパウイルス、または前述のいずれかのキメラからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスは、ＶＳＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスは、別の目的のウイルス由来の糖タンパク質を含有するＶＳＶなどの改変ウイルスベクターである。
本発明の或る実施形態では、ウイルスはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、目的の細胞にパッセンジャー核酸配列を移入するために使用され得るウイルスである。ウイルスベクターは、組換えタンパク質を誘導するために使用され得るウイルス発現ベクターであり得る。好ましくは、ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、ＶＳＶ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスであり得る。より好ましくは、本発明のウイルスベクターはＶＳＶベクターである。ウイルスベクターによって発現される組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、治療用組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。より好ましくは、ウイルスベクターによって産生される組換えタンパク質はウイルスタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本発明のウイルスはＶＳＶベクターである。ラブドウイルス科のメンバーであるＶＳＶは、家畜において自己制限疾患を引き起こすマイナス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。弱毒化ＶＳＶは、ヒトでは非病原性であり、動物ではほとんど非毒性であり、目的の連続哺乳動物細胞株でロバストな成長を示し、複製中にＤＮＡ中間体を欠き、強い細胞性および体液性免疫応答を誘発し、複数の部位で導入遺伝子の挿入を可能にするゲノム構造を誘発することから、望ましいウイルスベクターである（ＨｕｍｐｈｒｅｙｓおよびＳｅｂａｓｔｉａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１８、１５３：１－９；Ｃｌａｒｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６ ３４：６５９７－６６０９）。
本明細書で使用される場合、「感染」または「ウイルス感染」は、宿主細胞へのウイルスの侵入およびその後の細胞内でのウイルスの複製を指す。本開示の方法における宿主細胞の感染は、例えば、空気流、Ｏ２流、およびそれらのそれぞれの傾向を含むプロセス空気パラメータの相関によって決定される感染の最適ウインドウがウイルス収量の増加をもたらすときに実行され得る。
本開示の方法の宿主細胞は、１００％の初期ｄＯ２で培養され得る。ｄＯ２を、感染前に９０％のレベルから２０％の低いレベルまで減少させてもよい。ｄＯ２を、約８０％から約６０％に、約７０％から約４０％に、約５０％から約１５％に減少させてもよい。好ましくは、感染前に、ｄＯ２を約５０％からおよそ２０％まで減少させてもよい。より好ましくは、このレベルは感染前に約２０％まで減少させる。
ｄＯ２を、感染の２～２４時間前の範囲の時間で開始して減少し得、感染過程全体およびウイルスの回収を通してこのレベルに維持され得る。ｄＯ２を、感染の約２時間～約１０時間、約５時間～約１５時間、約１０時間～約２０時間、および１８時間～約２４時間前から減少させる。好ましくは、ｄＯ２を、感染前の８時間～およそ１２時間の範囲の時間から減少させる。
本明細書で使用される場合、「回収すること」は、清澄化されていない培養培地および／または宿主細胞をバイオリアクタから収集することによる、細胞およびウイルスなどの細胞由来生成物の収集を指す。ウイルスの回収は、例えば、感染の２～５日後、またはｄＯ２の減少の３～６日後に実施され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスの回収は、感染の２日後に行われ得る。いくつかのウイルスは、回収前に宿主細胞溶解のさらなる工程を必要とし得る。
本開示のウイルスは、限定されないがプラークアッセイ、エンドポイント希釈アッセイ、赤血球凝集アッセイ、ビシンコニン酸アッセイ、または電子顕微鏡法を含む方法によって定量され得る。好ましくは、ウイルスは、プラークアッセイ法によって定量され得る。本明細書で使用される場合、プラークアッセイ法は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）の測定に基づいて、感染性ウイルス粒子の数を測定する方法である。プラークアッセイでは、細胞単層にウイルスストック溶液の段階希釈物を感染させ、アガロースオーバーレイを使用してウイルスの流れを制限する。感染細胞は子孫ウイルスを放出し、それが次に隣接細胞に感染する。細胞を溶解して、色素を用いて可視化されるプラークと呼ばれる非感染細胞に囲まれた透明領域を生成する。試料ウイルス力価が高いほど、プラークの数が多くなる。
本発明の実施形態は、宿主細胞を計数する必要な工程なしに、宿主細胞にウイルスを感染させるための新規かつ有利なシステムおよび方法を提供する。一実施形態では、システムは、細胞培養、ウイルスによる細胞の感染、ウイルスの増殖、およびウイルスの回収のために構成および適合されたバイオリアクタと、バイオリアクタ内の細胞培養培地と、バイオリアクタ内の細胞培養培地の上方の空気空間と、バイオリアクタへの空気流入口と、バイオリアクタへの空気流を測定する空気流センサと、バイオリアクタへのＯ２流入口と、バイオリアクタへのＯ２流を測定するＯ２流センサと、データ収集モジュールであって、以下の値：バイオリアクタへの現在の空気流、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向、バイオリアクタへの現在のＯ２流、およびバイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向、を収集するように構成および適合された、データ収集モジュールと、指示ユニットであって、バイオリアクタへの空気流の減少傾向、バイオリアクタへのＯ２流の増加傾向、およびバイオリアクタへの空気流とバイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間の収束が発生するときを示すように構成および適合された、指示ユニット、とを備える。
或る実施形態では、データ収集ユニットは、空気流センサおよびＯ２流センサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１のプロセッサと、少なくとも１つの第１のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１の機械可読媒体であって、少なくとも１つの第１のプロセッサによって実行された場合に、バイオリアクタへの現在の空気流の値を生成するために空気流センサからの読み取り値を記録する工程、現在の空気流の値を以前の空気流の少なくとも１つの値と比較して、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向を生成する工程、バイオリアクタへの現在のＯ２流の値を生成するためにＯ２流センサからの読み取り値を記録する工程、および現在のＯ２流の値を以前のＯ２流の少なくとも１つの値と比較して、バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向を生成する工程、を実施する、そこに記憶された命令を有する、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と、を備える。
或る実施形態では、指示ユニットは、データ収集ユニットおよびバイオリアクタと動作可能に通信している少なくとも１つの第２のプロセッサと、少なくとも１つの第２のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第２の機械可読媒体であって、少なくとも１つの第２のプロセッサによって実行された場合に、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向が減少している、バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向が増加している、およびバイオリアクタへの空気流とバイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間に収束が存在する場合かつその場合に限り、ウイルスによる細胞の感染のための時間ウインドウを示す工程を実施する、そこに記憶された命令を有する、少なくとも１つの第２の機械可読媒体と、を備える。
増加または減少の傾向は、単一の対のデータ点の比較（例えば、時間Ｔ０におけるフロー（ｆｌｏｗ）対時間Ｔ１におけるフロー）、複数のデータ点の比較（例えば、第１の期間にわたって収集、観察、または記録されたすべてのフロー値の平均対第２の期間にわたって収集、観察、または記録されたすべてのフロー値の平均）、または他の方法（例えば、統計分析、機械学習、または人工知能の方法）によって定義され得る。１またはそれを超えるパラメータにおける増加または減少の傾向を決定するための基準、方法、または閾値は、同じであってもよく、異なっていてもよい。
収束は、時間をわたって２つの値（例えば、空気流量およびＯ２流量）が有意に一緒になると定義される。収束は、１つの流量の測定値を別の流量の測定値と比較することによって、単一の時点または２つの近傍であるが別々の時点で計算され得る。流量は、比較前に平均化、サンプリング、または他の方法で処理され得る。収束を決定または発見するために、収束閾値を設定してもよい。収束閾値は、フローの単位（例えば、ｍＬ／分）またはパーセンテージベース（例えば、小さい方の値は大きい方の値の３０％以内である）で確立され得る。あるいは、フロー値を相対的なパーセンテージに変換し、パーセンテージ値で比較してもよい（例えば、６２％の空気および３８％のＯ２であるフローに適用される＋／－３０％のフロー閾値は収束を有し得る）。あるいは、２つの値を総フローの絶対パーセンテージに変換し、パーセンテージ値（例えば、４２％の空気、１２％のＮ２、および４６％のＯ２であるフローに適用される＋／－１０％のフロー閾値は、空気流とＯ２流との間の収束を有する）で比較することができる。
実施形態は、ウイルスによる細胞の感染のための時間ウインドウが示された場合に、ウイルスによる細胞の感染を開始するように構成および適合された意思決定ユニットをさらに備え得る。データ収集ユニット、指示ユニット、および意思決定ユニット（個別にまたは任意に組み合わせて採用される）の各々は、デジタルコンピュータ、コントローラ（例えば、市販または製造されたバイオリアクタ制御ユニット内のモジュールまたはアプリケーション）の埋め込み部品、機械システム、空気圧または油圧システム、アナログ電気または電子システム、標準的な操作手順、人、または前述のいずれかの組み合わせのいずれかであってもよく、それらのいずれかを構成してもよく、それらのいずれかを備えてもよく、またはそれらのいずれかに接続されてもよい。
或る実施形態では、少なくとも１つの第１プロセッサと少なくとも１つの第２のプロセッサは、同じプロセッサである。
或る実施形態では、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と少なくとも１つの第２の機械可読媒体は、同じ機械可読媒体である。
或る実施形態では、バイオリアクタは密閉型バイオリアクタである。
或る実施形態では、収束閾値は＋／－２０％として選択され、収束は、バイオリアクタへのＯ２流パーセントの値がバイオリアクタへの空気流パーセントの値の＋／－２０％以内にあるときに見出される。
或る実施形態では、データ収集モジュールは、機械センサまたはアナログ電気センサを備える。
或る実施形態では、指示ユニットは、１またはそれを超える可聴インジケータ、視覚インジケータ、または触覚インジケータを備える。
或る実施形態は、宿主細胞を計数する必要な工程を伴わずに、ウイルスを宿主細胞に感染させるための方法を提供する。本方法は、細胞培養、ウイルスによる細胞の感染、ウイルスの増殖、およびウイルスの回収のために構成および適合されたバイオリアクタを提供することと、バイオリアクタ内に細胞培養培地を提供することと、バイオリアクタ内の細胞培養培地の上方に空気空間を提供することと、バイオリアクタへの空気流入口を提供することと、バイオリアクタへの空気流を測定する空気流センサを提供することと、バイオリアクタへのＯ２流入口を提供することと、バイオリアクタへのＯ２流を測定するＯ２流センサを提供することと、データ収集モジュールによって、バイオリアクタへの現在の空気流、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向、バイオリアクタへの現在のＯ２流、およびバイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向を収集することと、指示ユニットによって、バイオリアクタへの空気流の減少傾向、バイオリアクタへのＯ２流の増加傾向、およびバイオリアクタへの空気流とバイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間の収束が発生するときを示すことと、を含み得る。
或る実施形態では、データ収集ユニットは、空気流センサおよびＯ２流センサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１のプロセッサと、少なくとも１つの第１のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１の機械可読媒体であって、少なくとも１つの第１のプロセッサによって実行された場合に、バイオリアクタへの現在の空気流の値を生成するために空気流センサからの読み取り値を記録する工程、現在の空気流の値を以前の空気流の少なくとも１つの値と比較して、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向を生成する工程、バイオリアクタへの現在のＯ２流の値を生成するためにＯ２流センサからの読み取り値を記録する工程、および現在のＯ２流の値を以前のＯ２流の少なくとも１つの値と比較して、バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向を生成する工程、を実施する、そこに記憶された命令を有する、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と、を備える。
或る実施形態では、指示ユニットは、データ収集ユニットおよびバイオリアクタと動作可能に通信している少なくとも１つの第２のプロセッサと、少なくとも１つの第２のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第２の機械可読媒体であって、少なくとも１つの第２のプロセッサによって実行された場合に、バイオリアクタへの空気流の現在の傾向が減少している、バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向が増加している、およびバイオリアクタへの空気流とバイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間に収束が存在する場合かつその場合に限り、ウイルスによる細胞の感染のための時間ウインドウを示す工程を実施する、そこに記憶された命令を有する、少なくとも１つの第２の機械可読媒体と、を備える。
或る実施形態では、本方法は、ウイルスによる細胞の感染のための時間ウインドウが示された場合に、ウイルスによる細胞の感染を開始することをさらに含み得る。
或る実施形態では、少なくとも１つの第１プロセッサと少なくとも１つの第２のプロセッサは、同じプロセッサである。
或る実施形態では、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と少なくとも１つの第２の機械可読媒体は、同じ機械可読媒体である。
或る実施形態では、バイオリアクタは密閉型バイオリアクタである。
或る実施形態では、バイオリアクタへのＯ２流の値は、バイオリアクタへの空気流の値の＋／－２０％以内である。
或る実施形態では、データ収集モジュールは、機械センサまたはアナログ電気センサを備える。
或る実施形態では、指示ユニットは、１またはそれを超える可聴インジケータ、視覚インジケータ、または触覚インジケータを備える。
本明細書に記載の方法およびプロセスを、コードおよび／またはデータとして具現化することができる。本明細書に記載のソフトウェアコードおよびデータを、コンピュータシステムによる使用のためのコードおよび／またはデータを記憶することができる任意のデバイスまたは媒体を含むことができる１またはそれを超える機械可読媒体（例えば、コンピュータ可読媒体）に記憶することができる。コンピュータシステムおよび／またはプロセッサがコンピュータ可読媒体に記憶されたコードおよび／またはデータを読み出して実行すると、コンピュータシステムおよび／またはプロセッサは、コンピュータ可読記憶媒体内に記憶されたデータ構造およびコードとして具現化された方法およびプロセスを実施する。
コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、およびコンピューティングシステム／環境によって使用される他のデータなどの情報の記憶に使用することができる取り外し可能および取り外し不可能な構造／デバイスを含むことを当業者は理解されたい。コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ）などの揮発性メモリ；フラッシュメモリ、各種リードオンリーメモリ（ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ）、磁気メモリおよび強磁性／強誘電体メモリ（ＭＲＡＭ、ＦｅＲＡＭ）、ならびに磁気記憶デバイスおよび光記憶デバイス（ハードドライブ、磁気テープ、ＣＤ、ＤＶＤ）などの不揮発性メモリ；ネットワークデバイス；またはコンピュータ可読情報／データを記憶することができる、現在知られている、または今後開発される他の媒体を含むが、これに限定されない。コンピュータ可読媒体は、いかなる伝播信号も含むとみなされるべきでも解釈されるべきでもない。本発明のコンピュータ可読媒体は、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、フラッシュメモリデバイス、揮発性メモリ、または外部ＨＤＤもしくはコンピューティングデバイスのＨＤＤなどのハードディスクドライブ（ＨＤＤ）とすることができるが、実施形態はそれらに限定されない。コンピューティングデバイスは、例えば、ラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、サーバ、携帯電話、またはタブレットとすることができるが、実施形態はこれらに限定されない。
本明細書で言及または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、すべての図および表を含むそれらの全体が参照により組み込まれる。
材料および方法
実施例１～４では、ｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏ固定床バイオリアクタシステムを使用した。ｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏバイオリアクタは約８００ｍＬを保持することができ、これは２０ｍｍ～１０ｍｍの固定床高さを有する約５，３００～４０，０００の全表面成長面積に相当する。成長面積は、積層成長（図５Ａ、図５Ｂ、および表１を参照）に使用することができる３５～２６７ Ｔ－１５０フラスコに相当した。異なるパラメータを伴う実行を、ｉＣＥＬＬｉｓを用いて実施した。
実施例１～４では、ｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏ固定床バイオリアクタシステムを使用した。ｉＣＥＬＬｉｓ Ｎａｎｏバイオリアクタは約８００ｍＬを保持することができ、これは２０ｍｍ～１０ｍｍの固定床高さを有する約５，３００～４０，０００の全表面成長面積に相当する。成長面積は、積層成長（図５Ａ、図５Ｂ、および表１を参照）に使用することができる３５～２６７ Ｔ－１５０フラスコに相当した。異なるパラメータを伴う実行を、ｉＣＥＬＬｉｓを用いて実施した。
Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓのｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏ固定床バイオリアクタシステムは、予測実施例５～７（Ｂｅｒｒｉｅ ＤＭら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０２０、３８：３６３９－３６４５）で使用され得る。ｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏバイオリアクタは、表面積に応じて、１．６～３．２Ｌの総容器体積において１０ｍ２～３０ｍ２の範囲の細胞成長のための表面積を有する。ｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏバイオリアクタを用いて、異なるパラメータを伴う実行を実施することができる。
以下は、本発明を実施するための手順を説明する例である。これらの例は、限定として解釈されるべきではない。特に明記されていない限り、すべてのパーセンテージは重量によるものであり、すべての溶媒混合物の割合は体積によるものである。
実施例１．パラメータがウイルス産生のベースラインとして機能したキャンペーンからのＶＳＶ産生。
ベロ細胞を、ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクタにおいておよそ１００％のｄＯｉ、３７℃の温度、７．４のｐＨで成長させた。ベロ細胞の培養期間にわたって、バイオリアクタのバイオマスセンサを使用して細胞成長を監視し、ベロ細胞を５５ｍＳ／ｃｍの伝導度（細胞成長の尺度）でＶＳＶに感染させた。ｒＶＳＶ－ＬＡＳＶは、物質移動合意書ＬＡＢ－１８－Ｐ＿ＬＶ－２２に基づきＮＩＡＩＤによって提供された。
システムは、感染の約１２～２４時間後に約７５ｍＳ／ｃｍの最高伝導度（最高細胞成長）に達した。感染は０．０５ ＭＯＩであった。感染の２日後にウイルスを回収した。ウイルス産生は、フラットストックで成長している同じ細胞からの力価と比較した場合、１ｌｏｇ／ｍＬを超えて増加した（表２）。
実施例２．ｄＯ２を感染前におよそ１２時間にわたり減少させ、感染を通して維持して回収するキャンペーンからのＶＳＶ産生
ベロ細胞をおよそ１００％ｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨで培養した。ベロ細胞の培養期間にわたって、バイオマスセンサを使用して細胞成長を監視し、細胞を８０ｍＳ／ｃｍの伝導度（ほぼ最高の伝導度）で感染させた（すなわち、細胞成長が最大に達したときにベロ細胞を感染させた）。感染のおよそ１２時間前に、ｄＯ２レベルを４５～５０％に低下させ、感染の間を通しておよび回収の間を通して、この低下したレベルで一定に保った。温度を３７℃に維持し、ｐＨを７．４に維持した。感染のおよそ２日後にウイルスを回収した。感染の１２時間前にｄＯ２を減少させ、ベロ細胞が最大細胞成長を達成した後にベロ細胞にＶＳＶを感染させると、フラットストックからのＶＳＶ力価と比較した場合、ＶＳＶ力価は２ｌｏｇを超えて増加し（表２）、実施例１（ｄＯ２減少なし）のものと比較した場合、ウイルス力価は５．９倍増加した。ｒＶＳＶ－ＬＡＳＶは、物質移動合意書ＬＡＢ－１８－Ｐ＿ＬＶ－２２に基づきＮＩＡＩＤによって提供された。
実施例３．ｄＯ２、ｐＨ、および温度が一定のままであることに加えて、最大伝導度を伴うキャンペーンからのＶＳＶ産生。
ベロ細胞をバイオリアクタ内でおよそ１００％のｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨで培養した。ベロ細胞の培養期間にわたってバイオマスセンサを使用して細胞成長を監視し、細胞を１１０ｍＳ／ｃｍの伝導度（ほぼ最高の伝導度、したがって最大の細胞増殖に達したとき）で感染させた。感染は０．０５ ＭＯＩであった。ｄＯ２レベルの調整は行わなかった。温度を３７℃に維持し、培養および感染期間を通してｐＨを７．４に維持した。感染からおよそ２日後にウイルスを回収した。この実験からのＶＳＶ力価は実施例１のＶＳＶ力価と同様であり、実施例２で観察されたより高い収量は、ｄＯ２の改変によるものであり、最高の細胞成長でのベロ細胞の感染によるものではなく、これはおそらくより多くの細胞が感染することに起因して全体的な力価を増加させる可能性があることを示した（表２）。
表２は、異なる実行間の増殖データを比較する。増殖データを以下の間で比較した：１．フラットストックフラスコ内でベロ細胞から増殖させたＶＳＶ、２．感染中のｄＯ２％が９０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム（実行１）においてベロ細胞から増殖させたＶＳＶ、３．感染中のｄＯ２％が４０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム（実行２）においてベロ細胞から増殖させたＶＳＶ、および４．感染中のｄＯ２％が２０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム（実行３）においてベロ細胞から増殖させたＶＳＶ。表２のデータは、ＣＳ１０フラスコストック、実行１、実行２および実行３からのＶＳＶ力価および総ウイルス産生の有意な漸進的な増加をそれぞれ示す。これは、ＶＳＶを増殖させるためにフラットベッド型バイオリアクタｉＣＥＬＬｉｓを使用すると、フラットストックから産生されたウイルスと比較した場合、１ｍＬ当たりのウイルス産生が１～２ｌｏｇ増加したことを示す。より顕著には、感染中のｄＯ２の漸進的な減少は、ＶＳＶ力価および総ウイルス産生の漸進的に有意な増加をもたらした。ｒＶＳＶ－ＬＡＳＶは、物質移動合意書ＬＡＢ－１８－Ｐ＿ＬＶ－２２に基づきＮＩＡＩＤによって提供された。
実施例４．感染時の異なるｄＯ２レベルでのＶＳＶ産生。
ＶＳＶを、およそ１００％のｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨでベロ細胞において成長させた。感染のおよそ１２時間前に、ｄＯ２レベルを９０％、４０％、および２０％に低下させ、感染全体を通してこの低下したレベルで一定に維持した。温度を３７℃に維持し、ｐＨを７．４に維持した。感染のおよそ２日後にウイルスを回収した。結果は、表２に示すように、感染時のｄＯ２減少のレベルを伴ってウイルス収量の漸進的増加を示す。ｒＶＳＶ－ＬＡＳＶは、物質移動合意書ＬＡＢ－１８－Ｐ＿ＬＶ－２２に基づきＮＩＡＩＤによって提供された。
予測実施例５－パラメータが将来のウイルス産生のベースラインとして機能し得るキャンペーンからのＶＳＶ産生。
ベロ細胞を、適切な化学的に定義された無血清培地を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ ｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏバイオリアクタ内で、およそ１００％のｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨで成長させ得る。ベロ細胞の培養期間にわたって、Ｏ２および空気流センサを使用してプロセス空気パラメータを監視し得、バイオリアクタへの全空気流の減少傾向、バイオリアクタへの全Ｏ２流の増加傾向、ならびにバイオリアクタへの全空気流およびバイオリアクタへの全Ｏ２流の現在のそれぞれの値の収束（例えば、＋／－２０％）（代謝的に活性な細胞密度の指標）を観察した際に、ベロ細胞をＶＳＶに感染させ得る。次いで、感染の２～５日後にウイルスが回収され得る。ウイルス産生は、フラットストックで成長する同じ細胞からの力価と比較した場合、１ｌｏｇ／ｍＬを超えて増加すると予想され得る（表２に示す実際の結果と同様）。
予測実施例６－パラメータが将来のウイルス産生のベースラインとして機能し得るキャンペーンからのインフルエンザ産生。
ウズラ（Ｑｕａｉｌ）細胞を、適切な化学的に定義された無血清培地を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ ｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏバイオリアクタ内で、およそ１００％のｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨで成長させ得る。ウズラ細胞の培養期間にわたって、Ｏ２および空気流センサを使用してプロセス空気パラメータを監視し得、バイオリアクタへの全空気流の減少傾向、バイオリアクタへの全Ｏ２流の増加傾向、および（例えば、バイオリアクタへの全空気流およびバイオリアクタへの全Ｏ２流の現在のそれぞれの値の）収束（代謝的に活性な細胞密度の指標）を観察した際に、ウズラ細胞をＶＳＶに感染させ得る。次いで、感染の２～５日後にウイルスが回収され得る。ウイルス産生は、フラットストックで成長する同じ細胞からの力価と比較した場合、１ｌｏｇ／ｍＬを超えて増加すると予想され得る（表２に示す実際の結果と同様）。
予測実施例７－パラメータが将来のウイルス産生のベースラインとして機能し得るキャンペーンからのＬＶＶ産生。
ＨＥＫ ２９３細胞を、適切な化学的に定義された無血清培地を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ Ｓｃａｌｅ－Ｘ（商標）Ｃａｒｂｏバイオリアクタ内で、およそ１００％のｄＯ２、３７℃の温度、７．４のｐＨで成長させ得る。ＨＥＫ ２９３細胞の培養期間にわたって、Ｏ２および空気流センサを使用してプロセス空気パラメータを監視し得、バイオリアクタへの全空気流の減少傾向、バイオリアクタへの全Ｏ２流の増加傾向、および（例えば、バイオリアクタへの全空気流およびバイオリアクタへの全Ｏ２流の現在のそれぞれの値の）収束（代謝的に活性な細胞密度の指標）を観察した際に、ＨＥＫ ２９３細胞をＶＳＶに感染させ得る。次いで、感染の２～５日後にウイルスが回収され得る。ウイルス産生は、フラットストックで成長する同じ細胞からの力価と比較した場合、１ｌｏｇ／ｍＬを超えて増加すると予想され得る（表２に示す実際の結果と同様）。
本明細書に記載された例および実施形態は例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、これらは本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。さらに、本明細書に開示される任意の発明もしくはその実施形態の任意の要素もしくは限定は、（個別にまたは任意に組み合わせて）任意のおよび／またはすべての他の要素もしくは限定と組み合わせることができ、または本明細書に開示された任意の他の発明もしくはその実施形態と組み合わせることができ、すべてのそのような組み合わせは、それに限定されることなく本発明の範囲と企図される。
Claims (85)
- 宿主細胞を計数する工程を必要とせずに、前記宿主細胞にウイルスを感染させる方法であって、
バイオリアクタ内で宿主細胞を培養する工程、
バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットを観察する工程、
前記バイオリアクタプロセス空気パラメータに基づいて第１の時間マーカを特定する工程、
前記第１の時間マーカに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、および
計算された前記感染ウインドウの最適時間の間に前記宿主細胞を感染させる工程
を含む、方法。 - 前記宿主細胞が接着性細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが固定床バイオリアクタである、請求項２に記載の方法。
- 前記バイオリアクタプロセス空気パラメータを観察する工程が、前記バイオリアクタへの空気流の速度を測定し、複数の時点で前記バイオリアクタへのＯ２流の速度を測定し、それぞれの各時点にそれぞれの現在の測定値セットを作成することを含む、請求項３に記載の方法。
- 第１の時間マーカを特定する工程が、前記バイオリアクタへの前記空気流の速度が減少し、前記バイオリアクタへの前記Ｏ２流の速度の増加傾向と交差する時間を決定することを含む、請求項４に記載の方法。
- 第１の時間マーカを特定する工程が、前記バイオリアクタへの前記空気流の速度が減少し、前記バイオリアクタへの前記Ｏ２流の速度の予想される増加傾向と交差すると予想される将来の時間を予測するために、１またはそれを超える現在の測定値セットから１またはそれを超える値を計算することを含む、請求項５に記載の方法。
- 前記宿主細胞が天然に存在する細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞が遺伝子改変細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、天然に存在するかまたは遺伝子改変された哺乳動物細胞、鳥類細胞または昆虫細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ベロ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ １５細胞、Ｗ１－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＯＲ細胞およびＱＯＲ細胞の中から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞がベロ細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスが天然に存在するウイルスである、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスが遺伝子改変ウイルスである、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスが、天然に存在するＶＳＶもしくは遺伝子改変ＶＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、エボラ－ザイールウイルス、エボラ－スーダンウイルス、エボラ－マールブルグウイルス、ニパウイルス、または前述のいずれかのキメラの中から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスがウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスが、別の目的のウイルス由来の糖タンパク質を含有する改変ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ）である、請求項１５に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間が、前記宿主細胞の最適な生細胞密度に達した時間を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間を計算する工程が、前記バイオリアクタへの前記空気流の速度が減少し、前記バイオリアクタへの前記Ｏ２流の速度の増加傾向と交差する時間を決定することを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間を計算する工程が、前記バイオリアクタの空気－Ｏ２差が所定の閾値未満であるか、または前記所定の閾値を下回ると予想される時間を決定することを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間が、前記バイオリアクタへの前記空気流の速度の減少傾向と、前記バイオリアクタへの前記Ｏ２流の速度の増加傾向とが、互いの±３０％以内、または互いの±２０％以内、または互いの±１０％以内、または互いの±５％以内になるように収束する時間間隔である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、（表面積として）１ｍ２～６００ｍ２の範囲の容量を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、（表面積として）６００ｍ２～２４００ｍ２の範囲の容量を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタ内の前記宿主細胞が、前記感染させる工程の前に計数されない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記感染させる工程の後に前記宿主細胞または前記宿主細胞の生成物を回収する工程をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタ内の前記宿主細胞が、前記回収する工程の前に計数されない、請求項２５に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが細胞計数デバイスを含まず、かつ細胞計数デバイスに接続されていない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが細胞計数のためのアクセスポートを有しない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが閉鎖密閉（例えば、気密封止）系である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法から産生された細胞または細胞由来生成物を含む、組成物。
- バイオリアクタ内でウイルスを生産する方法であって、
ａ）前記バイオリアクタ内に宿主細胞を提供する工程、
ｂ）前記バイオリアクタ内で前記宿主細胞を成長させる工程、
ｃ）バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットを観察する工程、
ｄ）前記バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、
ｅ）前記感染ウインドウの最適時間の間に少なくとも１つのウイルスまたはウイルス粒子を前記宿主細胞に感染させる工程、
ｆ）前記ウイルスまたはウイルス粒子に感染した前記宿主細胞をインキュベートして、前記ウイルスを増殖させる工程、および必要に応じて、
ｇ）前記ウイルスを回収する工程、を含む、方法。 - 前記宿主細胞が接着性細胞である、請求項３１に記載の方法。
- 前記バイオリアクタがフラットベッド型バイオリアクタであり、一定の初期のｄＯ２レベル、ｐＨおよび温度で前記宿主細胞を成長させる工程である、請求項３２に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、使い捨てフラットベッド型バイオリアクタである、請求項３１に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間を計算する工程が、前記バイオリアクタへの空気流の速度が減少し、前記バイオリアクタへのＯ２流の速度の増加傾向と交差する時間を決定することを含む、請求項３１～３４に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間を計算する工程が、前記バイオリアクタの空気－Ｏ２差が所定の閾値未満であるか、または前記所定の閾値を下回ると予想される時間を決定することを含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記感染ウインドウの最適時間が、前記バイオリアクタへの空気流の速度の減少傾向と、前記バイオリアクタへのＯ２流の速度の増加傾向とが、互いの±３０％以内、または互いの±２０％以内、または互いの±１０％以内、または互いの±５％以内になるように収束する時間間隔である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスによる前記宿主細胞の前記感染が、約０．１～０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）である、請求項３１に記載の方法。
- 前記ウイルスによる前記宿主細胞の前記感染が０．０５のＭＯＩである、請求項３３８に記載の方法。
- 前記ウイルスまたはウイルス粒子に感染した前記宿主細胞をインキュベートして前記ウイルスを増殖させる工程が、前記一定の初期のｄＯ２レベル、ｐＨ、および温度とは異なる一定の最終のｄＯ２レベル、ｐＨ、および温度で前記宿主細胞をインキュベートすることを含む、請求項３９に記載の方法。
- 前記宿主細胞が天然に存在する細胞である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が遺伝子改変細胞である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、天然に存在するかまたは遺伝子改変された哺乳動物細胞、鳥類細胞または昆虫細胞である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ベロ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ １５細胞、Ｗ１－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＯＲ細胞およびＱＯＲ細胞の中から選択される、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記宿主細胞がベロ細胞である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが天然に存在するウイルスである、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが遺伝子改変ウイルスである、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、天然に存在するＶＳＶもしくは遺伝子改変ＶＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、エボラ－ザイールウイルス、エボラ－スーダンウイルス、エボラ－マールブルグウイルス、ニパウイルス、または前述のいずれかのキメラの中から選択される、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスがウイルスベクターである、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、別の目的のウイルス由来の糖タンパク質を含有する改変ウイルスベクターである、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ）である、請求項４９に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、（表面積として）１ｍ２～６００ｍ２の範囲の容量を有する、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、（表面積として）６００ｍ２～２４００ｍ２の範囲の容量を有する、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタ内の前記宿主細胞が、前記感染させる工程の前に計数されない、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記感染させる工程の後に前記宿主細胞または前記宿主細胞の生成物を回収する工程をさらに含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタ内の前記宿主細胞が、前記回収する工程の前に計数されない、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが細胞計数デバイスを含まず、かつ細胞計数デバイスに接続されていない、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが細胞計数のためのアクセスポートを有しない、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが閉鎖密閉（例えば、気密封止）系である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- プラークアッセイ法によりウイルス力価を決定する工程をさらに含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスを精製するおよびまたは特徴付ける工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
- 前記ウイルスを用いてワクチンを製造する工程をさらに含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが、化学的に定義された培地を含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項３１に記載の方法から産生された細胞または細胞由来生成物を含む、組成物。
- バイオリアクタ内でウイルスを生産する方法であって、
ａ）前記バイオリアクタ内に宿主細胞を提供する工程、
ｂ）コンフルエンスまで一定の初期のｄＯ２レベル、ｐＨおよび温度で宿主細胞を成長させる工程、
ｃ）バイオリアクタプロセス空気パラメータのセットに基づいて、感染ウインドウの最適時間を計算する工程、
ｄ）前記感染ウインドウの最適時間の間に少なくとも１つのウイルスまたはウイルス粒子を前記宿主細胞に感染させる工程、
ｅ）前記ウイルスまたはウイルス粒子に感染した前記宿主細胞をインキュベートして前記ウイルスを増殖させる工程、および必要に応じて、
ｆ）前記ウイルスを回収する工程
を含む、方法。 - 宿主細胞を計数する工程を必要とせずに、ウイルスを前記宿主細胞に感染させるためのシステムであって、
細胞培養、ウイルスによる細胞の感染、前記ウイルスの増殖、および前記ウイルスの回収のために構成および適合されたバイオリアクタと、
前記バイオリアクタ内の細胞培養培地と、
前記バイオリアクタ内の前記細胞培養培地の上方の空気空間と、
前記バイオリアクタへの空気流入口と、
前記バイオリアクタへの空気流を測定する空気流センサと、
前記バイオリアクタへのＯ２流入口と、
前記バイオリアクタへのＯ２流を測定するＯ２流センサと、
データ収集モジュールであって、
前記バイオリアクタへの現在の空気流、
前記バイオリアクタへの空気流の現在の傾向、
前記バイオリアクタへの現在のＯ２流、および
前記バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向
を表す値を収集するように構成および適合された、データ収集モジュールと、
指示ユニットであって、
前記バイオリアクタへの空気流の減少傾向、
前記バイオリアクタへのＯ２流の増加傾向、および
前記バイオリアクタへの空気流と前記バイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間の収束
が発生するときを示すように構成および適合された、指示ユニット
とを備える、システム。 - 前記データ収集ユニットが、
前記空気流センサおよび前記Ｏ２流センサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１のプロセッサと、
前記少なくとも１つの第１のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１の機械可読媒体であって、前記少なくとも１つの第１のプロセッサによって実行された場合に、
前記バイオリアクタへの現在の空気流の値を生成するために前記空気流センサからの読み取り値を記録する工程、
前記現在の空気流の値を以前の空気流の少なくとも１つの値と比較して、前記バイオリアクタへの空気流の現在の傾向を生成する工程、
前記バイオリアクタへの現在のＯ２流の値を生成するために前記Ｏ２流センサからの読み取り値を記録する工程、および
前記現在のＯ２流の値を以前のＯ２流の少なくとも１つの値と比較して、前記バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向を生成する工程、を実施する、前記少なくとも１つの第１の機械可読媒体に記憶された命令を有する、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と、
を備える、請求項６６に記載のシステム。 - 前記指示ユニットが、
前記データ収集ユニットと動作可能に通信している少なくとも１つの第２のプロセッサと、
前記少なくとも１つの第２のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第２の機械可読媒体であって、前記少なくとも１つの第２のプロセッサによって実行された場合に、
指示条件のセットであって
前記バイオリアクタへの空気流の前記現在の傾向が減少している、
前記バイオリアクタへのＯ２流の前記現在の傾向が増加している、および
前記バイオリアクタへの空気流と前記バイオリアクタへのＯ２流の前記現在のそれぞれの値の間に収束が存在することを含む、前記指示条件のセットが満たされる場合に、
前記ウイルスによる前記細胞の感染のための時間ウインドウを示す工程を実施する、前記少なくとも１つの第２の機械可読媒体に記憶された命令を有する、少なくとも１つの第２の機械可読媒体と、
を備える、請求項６７に記載のシステム。 - 前記ウイルスによる前記細胞の感染のための前記時間ウインドウが示された場合に、前記ウイルスによる前記細胞の感染を開始するように構成および適合された意思決定ユニットをさらに備える、請求項６８に記載のシステム。
- 前記少なくとも１つの第１プロセッサと前記少なくとも１つの第２のプロセッサが、同じプロセッサである、請求項６９に記載のシステム。
- 前記少なくとも１つの第１の機械可読媒体と前記少なくとも１つの第２の機械可読媒体が、同じ機械可読媒体である、請求項７０に記載のシステム。
- 前記バイオリアクタが密閉型バイオリアクタである、請求項７１に記載のシステム。
- 前記バイオリアクタへのＯ２流の値が、前記バイオリアクタへの空気流の値の＋／－２０％以内である、請求項７２に記載のシステム。
- 前記データ収集モジュールが、機械センサまたはアナログ電気センサを備える、請求項６６に記載のシステム。
- 前記指示ユニットが、１またはそれを超える可聴インジケータ、視覚インジケータ、または触覚インジケータを備える、請求項６６に記載のシステム。
- 宿主細胞を計数する工程を必要とせずに、ウイルスを前記宿主細胞に感染させるための方法であって、
細胞培養、ウイルスによる細胞の感染、前記ウイルスの増殖、および前記ウイルスの回収のために構成および適合されたバイオリアクタを提供することと、
前記バイオリアクタ内に細胞培養培地を提供することと、
前記バイオリアクタ内の前記細胞培養培地の上方に空気空間を提供することと、
前記バイオリアクタへの空気流入口を提供することと、
前記バイオリアクタへの空気流を測定する空気流センサを提供することと、
前記バイオリアクタへのＯ２流入口を提供することと、
前記バイオリアクタへのＯ２流を測定するＯ２流センサを提供することと、
データ収集モジュールによって、
前記バイオリアクタへの現在の空気流、
前記バイオリアクタへの空気流の現在の傾向、
前記バイオリアクタへの現在のＯ２流、および
前記バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向
を収集することと、
指示ユニットによって、
前記バイオリアクタへの空気流の減少傾向、
前記バイオリアクタへのＯ２流の増加傾向、および
前記バイオリアクタへの空気流と前記バイオリアクタへのＯ２流の現在のそれぞれの値の間の収束
が発生するときを示すことと、を含む、方法。 - 前記データ収集ユニットが、
前記空気流センサおよび前記Ｏ２流センサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１のプロセッサと、
前記少なくとも１つの第１のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第１の機械可読媒体であって、前記少なくとも１つの第１のプロセッサによって実行された場合に、
前記バイオリアクタへの現在の空気流の値を生成するために前記空気流センサからの読み取り値を記録する工程、
前記現在の空気流の値を以前の空気流の少なくとも１つの値と比較して、前記バイオリアクタへの空気流の現在の傾向を生成する工程、
前記バイオリアクタへの現在のＯ２流の値を生成するために前記Ｏ２流センサからの読み取り値を記録する工程、および
前記現在のＯ２流の値を以前のＯ２流の少なくとも１つの値と比較して、前記バイオリアクタへのＯ２流の現在の傾向を生成する工程、を実施する、前記少なくとも１つの第１の機械可読媒体に記憶された命令を有する、少なくとも１つの第１の機械可読媒体と、
を備える、請求項７６に記載の方法。 - 前記指示ユニットが、
前記データ収集ユニットおよび前記バイオリアクタと動作可能に通信している少なくとも１つの第２のプロセッサと、
前記少なくとも１つの第２のプロセッサと動作可能に通信している少なくとも１つの第２の機械可読媒体であって、前記少なくとも１つの第２のプロセッサによって実行された場合に、
前記バイオリアクタへの空気流の前記現在の傾向が減少している、
前記バイオリアクタへのＯ２流の前記現在の傾向が増加している、および
前記バイオリアクタへの空気流と前記バイオリアクタへのＯ２流の前記現在のそれぞれの値の間に収束が存在する場合かつその場合に限り、
前記ウイルスによる前記細胞の感染のための時間ウインドウを示す工程を実施する、前記少なくとも１つの第２の機械可読媒体に記憶された命令を有する、少なくとも１つの第２の機械可読媒体と、
を備える、請求項７７に記載の方法。 - 前記ウイルスによる前記細胞の感染のための前記時間ウインドウが示された場合に、前記ウイルスによる前記細胞の感染を開始することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの第１プロセッサと前記少なくとも１つの第２のプロセッサが、同じプロセッサである、請求項７８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの第１の機械可読媒体および前記少なくとも１つの第２の機械可読媒体が、同じ機械可読媒体である、請求項８０に記載の方法。
- 前記バイオリアクタが密閉型バイオリアクタである、請求項８１に記載の方法。
- 前記バイオリアクタへのＯ２流の値が、前記バイオリアクタへの空気流の値の＋／－２０％以内である、請求項８２に記載の方法。
- 前記データ収集モジュールが、機械センサまたはアナログ電気センサを備える、請求項７６に記載の方法。
- 前記指示ユニットが、１またはそれを超える可聴インジケータ、視覚インジケータ、または触覚インジケータを備える、請求項７６に記載の方法。
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