CN116829180A - 用于用病毒感染细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高生物反应器中来自宿主细胞的病毒、病毒颗粒或病毒载体的产量的方法。本发明提供了一种确定和控制宿主细胞感染的最佳时间的可重复且稳健的方法和系统，该方法和系统使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。

Description

用于用病毒感染细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月23日提交的美国临时申请序列号63/104,803的权益，其据此通过引用以其整体并入本文，包括任何图、表格、核酸序列、氨基酸序列或附图。
技术领域
本发明涉及一种用于疫苗和病毒载体制造的病毒和病毒载体的繁殖方法。更具体地，本发明涉及一种用于引发导致在固定床(fixed-bed)生物反应器中宿主细胞病毒产量增加的宿主细胞感染的特定方法。
背景技术
允许病毒和病毒载体可重复和稳健生产以满足对疫苗和其他疗法不断增长的需求的稳健技术是必不可少的。此外，对于多功能宿主细胞技术平台(诸如Vero细胞和其他哺乳动物细胞平台、禽细胞平台和昆虫细胞技术平台)的开发，提高来自宿主细胞的病毒产量的技术在加速疫苗过程和生产的开发中也发挥重要作用。本发明满足了改进病毒生成方法的需求。
发明内容
本发明的实施方案提供了利用空气流和O2流参数来确定在固定床和其他生物反应器系统中扩增的宿主细胞的最佳感染时间的系统和方法，在固定床和其他生物反应器系统中细胞计数采样是困难的、不切实际的或不可能的。
使用代谢物数据来确定固定床反应器中相对于细胞密度的最佳感染时间的已知方法需要采样和宽泛的感染窗口。通过观察过程空气参数，包括将反应器内的总空气流与O2流进行比较，本发明人已经确定了感兴趣的因素、参数和趋势，包括进入固定床反应器的空气流的体积减少并与进入反应器的O2流体积的增加趋势交叉的趋势。本发明提供了一种确定和控制宿主细胞最佳感染时间的可重复且稳健的过程，该过程使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。本文公开的数据支持空气/O2趋势以及与反应器内细胞密度的相关性。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本在请求并支付必要的费用后将由专利商标局提供。
图1比较了根据本发明实施方案的两次代表性运行的空气流和氧气(O2)流。
图2绘制了根据本发明实施方案的空气-O2差与UNVC活细胞密度的图表。
图3绘制了根据本发明实施方案的平均每小时空气-O2差与活细胞密度随时间的变化。
图4图示了根据本发明实施方案应用于图1中的代表性运行2的空气-O2差模型。
图5A图示了固定床生物反应器中使用的微载体条，13个微载体条(每条3维面积为约11.2cm2)显示在5mL培养基中。
图5B图示了可以用于每个床容纳最多3,500条的生物反应器的横截面。
图5C以横截面图图示了生物反应器的不同部分。
具体实施方式
本发明提供了用于确定和控制宿主细胞最佳感染时间的可重复且稳健过程的系统和方法，该系统和方法使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染宿主细胞的方法，其包括以下步骤：在生物反应器中培养宿主细胞；观察一组生物反应器过程空气参数；基于生物反应器过程空气参数识别第一时间标记；基于第一时间标记计算感染窗口的最佳时间；以及在所计算的感染窗口的最佳时间期间感染宿主细胞。
符合现行良好生产规范(CGMP)的设备可能没有配备细胞计数。本发明的优点是，它提供了一种过程，其允许过程基于空气流和氧气流的相关性进行监测以开始最佳感染时间，而不是基于或附加地基于时间、细胞计数或细胞计数的替代物(诸如生物量)。
在某些实施方案中，宿主细胞可以包括贴壁细胞。在某些实施方案中，生物反应器可以是固定床生物反应器。在某些实施方案中，观察生物反应器过程空气参数的步骤包括在多个时间点，测量进入生物反应器的总空气流的速率和测量进入生物反应器的O2流的速率，以在每个相应的时间点创建当前测量组。在某些实施方案中，识别第一时间标记的步骤包括确定进入生物反应器的总空气流的速率降低并与进入生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉的时间。在某些实施方案中，识别第一时间标记的步骤包括计算来自一个或多个当前测量组的一个或多个值，以预测进入生物反应器的总空气流的速率预期降低并与进入生物反应器的O2流的速率的预期增加趋势交叉的未来时间。
任选地，一旦为特定细胞系和病毒建立了感染窗口，就可以将建立的感染窗口应用于其他病毒并与其他病毒一起使用。然而，可能仍然需要监测进入生物反应器的总空气流和进入生物反应器的O2流的速率，以便进行主动监测以收集数据和进行实时过程控制。
本发明中用于培养病毒的宿主细胞的类型可以是天然的或基因修饰的(例如，重组细胞、细胞系等)，并且可以是适于生产病毒抗原、病毒载体或病毒产品的任何真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞，并且病毒是病毒载体诸如重组水疱性口炎病毒(rVSV)。
在一些实施方案中，感染窗口的最佳时间的确定基于过程空气参数的相关性，包括但不限于空气流、O2流及其收敛、它们之间的关系(例如，两者之间的比率)或其各自的趋势，从而提高病毒产量。在一些实施方案中，感染窗口的最佳时间是空气流和O2流的收敛。在一些实施方案中，感染窗口是空气流减少和O2流增加使得它们在彼此的±30％以内、或在彼此的±20％以内、或在彼此的±10％以内、或在彼此的±5％以内的时间区间。
本发明的实施方案包括在生物反应器中生产病毒的方法，其包括以下步骤：在生物反应器中提供宿主细胞；使宿主细胞在生物反应器中生长；观察一组生物反应器过程空气参数；基于生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；在感染窗口的最佳时间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染宿主细胞；温育感染病毒或病毒颗粒的宿主细胞以繁殖病毒；以及任选地，收获病毒。
在一些实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞。在一些实施方案中，生物反应器是平床式(flat-bed)生物反应器，并且使宿主细胞生长的步骤在恒定的初始溶解氧(dO2)水平、pH和温度下进行。在某些实施方案中，生物反应器是一次性平床式生物反应器。
在某些实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感染窗口的最佳时间包括确定进入生物反应器的总空气流的速率降低并与进入生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉或相交的时间。在备选的实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感染窗口的最佳时间包括确定生物反应器的空气-O2差接近零或为零的时间。在其他实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感染窗口的最佳时间包括确定生物反应器的空气-O2差小于预定阈值或预期穿过预定阈值以下的时间。在一些实施方案中，感染窗口的最佳时间是空气流和O2流的收敛。在一些实施方案中，感染窗口是空气流降低且O2流增加使得它们在彼此的±30％以内、或在彼此的±20％以内、或在彼此的±10％以内、或在彼此的±5％以内的时间区间。
考虑收敛并参考图1中的代表性运行1作为非限制性示例：可以为本次运行选择+/-30单位(例如mL/min)的收敛阈值。当空气流为80(例如mL/min)且O2流为20(例如mL/min)时，则80-20＝60，未达到收敛，并且不满足感染窗口。当空气流为65且O2流为38时，则65-38＝27，达到收敛并满足感染窗口(在该示例中，这是感染窗口时间周围虚线框中的第一个点)。当空气流为60且O2流为40时，则60-40＝20，达到收敛并满足感染窗口(在该示例中，这是感染窗口时间周围虚线框中的后一点)。对于该运行，这是发生感染的时间。注意，在某些实施方案中，可以应用附加参数，诸如要求收敛的最短时间、收敛的更窄窗口(更低阈值)或感染前与另一个值一起收敛。
现在参考图1中的代表性运行2，作为非限制性示例：可以为本次运行选择+/-30单位(例如mL/min)的收敛阈值。当空气流为80且O2流为20时，则80-20＝60，未达到收敛，并且不满足感染窗口。当空气流为60且O2流为30时，则60-30＝30，达到收敛并满足感染窗口(这是感染窗口时间周围虚线框中的第一点)。当空气流为50且O2流为50时，则50-50＝0，达到收敛(在该例中也是交点)并满足感染窗口(这是感染窗口时间周围虚线框中的交点)。当空气流为40且O2流为60时，则40-60＝-20，达到收敛并满足感染窗口(这是感染窗口时间周围虚线框中的后一点)。对于该运行，这是发生感染的时间。注意，在某些实施方案中可以应用附加参数，诸如要求收敛的最短时间、收敛的更窄窗口(更低阈值)或与另一个感染值(诸如空气流或O2流的特定绝对值)一起收敛。
有利的是，这种基于空气流和O2流速率感染宿主细胞的方法使病毒生产基于过程监测而可控且可重复，并且允许使用封闭系统而无需细胞计数。作为封闭的系统，生物反应器是自给自足的环境，在操作过程中是封闭的(例如，气密的)，允许连续培养，而无需细胞计数或接入端口进行细胞计数。
备选地，宿主细胞的感染可以基于来源于使用本发明的历史数据的时间，而不进行主动监测。
在一些实施方案中，在感染步骤之前不对提供(例如，接种)到生物反应器中的宿主细胞进行计数。在一些实施方案中，该方法进一步包括在感染后收获宿主细胞或宿主细胞的产物。在一些实施方案中，在收获之前不对生物反应器中的宿主细胞进行计数。
在一些实施方案中，生物反应器不包括细胞计数设备(例如，诸如计数室、自动细胞计数器、库尔特计数器的仪器或诸如流式细胞仪的细胞仪)，并且不连接到细胞计数设备。细胞计数设备可以利用一系列技术，诸如基于图像的计数(例如，明场或荧光)或非基于图像的计数(例如，电流排除)。在一些实施方案中，生物反应器不具有用于细胞计数的接入端口。在一些实施方案中，生物反应器是封闭的、密封的(例如，气密的)系统。
在某些实施方案中，宿主细胞感染病毒的感染复数(MOI)为约0.1至0.05。在某些实施方案中，宿主细胞感染病毒的MOI为0.05。在某些实施方案中，温育感染病毒或病毒颗粒的宿主细胞以繁殖病毒的步骤包括将宿主细胞在不同于恒定的初始dO2水平、pH和温度的恒定的最终dO2水平、pH和温度下温育。
病毒可以是任何天然存在的或基因修饰的病毒(例如，重组或工程化病毒)。在某些实施方案中，病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉-扎伊尔病毒、埃博拉-苏丹病毒、埃博拉-马尔堡病毒、尼帕病毒或前述中的任何一种的嵌合体。在一些实施方案中，病毒是病毒载体。在某些实施方案中，病毒是VSV载体。在某些实施方案中，病毒是经修饰的病毒载体，诸如VSV，其含有来自另一种感兴趣病毒的糖蛋白。
本发明中用于培养病毒的宿主细胞的类型可以是天然的或基因修饰的(例如，重组细胞、细胞系等)，并且可以是适于生产病毒抗原、病毒载体或病毒产品的任何真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自天然存在或基因修饰的哺乳动物细胞(例如，人细胞和鼠细胞)、禽细胞(例如，鸡细胞和鹌鹑细胞)和昆虫细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、WI-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞或HEK 293细胞。
任选地，本发明的方法包括宿主细胞扩增、感染和任选的收获之外的步骤。例如，在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：通过空斑测定法测定病毒滴度的步骤；纯化和/或表征病毒的步骤；或用细胞或细胞衍生产物(诸如病毒或病毒的一部分)生产疫苗、用于基因递送的病毒载体或免疫治疗组合物的步骤。本发明包括由该方法生产的组合物(诸如疫苗和免疫治疗组合物)，其可以配制成用于通过任何合适的施用途径施用于人或动物对象。
例如，为了生产组合物(诸如疫苗、载体或免疫治疗组合物)，可以将收获的细胞或细胞衍生产物(诸如病毒或其一部分，或其他生物分子)与一种或多种赋形剂、稀释剂(诸如水、磷酸盐缓冲盐水或盐水)、载体、佐剂或前述两种或更多种的任意组合进行组合。佐剂可以是适合疫苗或组合物预期用途的任何类别，诸如明矾盐和其他矿物佐剂、细菌产物或细菌衍生佐剂、张力活性剂(例如皂苷)、水包油(o/w)和油包水(w/o)乳液、脂质体佐剂、细胞因子(例如IL-2、GM-CSF、IL-12和IFN-γ)和α-半乳糖神经酰胺类似物。佐剂的一些非限制性示例包括Montanide乳液、QS21、弗氏完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、卡介苗(BCG)和明矾。
任选地，该方法可以进一步包括使用本领域已知的方法从受感染的宿主细胞中收获细胞，以及收获细胞衍生产物。可以收获(例如，从生物分子产生细胞中分离)使用本发明方法产生的由天然存在或非基因修饰细胞产生的各种生物分子以用于各种用途，诸如生产药物或生物制剂，以及用于药理学研究。因此，使用本发明，细胞可以用作生物“工厂”来提供细胞的产物，诸如生物分子。术语“生物分子”是指可以由细胞产生的一个或多个分子(细胞衍生产物)。这样的生物分子包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质、碳水化合物、核酸、核苷酸、病毒、病毒部分(例如病毒颗粒)和其他物质。生物分子可以是细胞内的、跨膜的或由细胞分泌的，例如，并且可以使用本领域已知的方法进行纯化或分离。
生物反应器的容量可以是符合生产目的(例如，用于筛选、实验室研发、临床研究和商业化生产)的任何容量。各种类型、大小和型号的合适的生物反应器是可商购的。可以用于本发明的市售生物反应器的示例包括但不限于由Univercells Technologies和iCELLis生产的一次性固定床生物反应器。
在一些实施方案中，生物反应器具有在以下范围内的容量：1m2-600m2(作为表面积)、备选地10m2-30 m2、备选地30m2-200 m2、备选地200m2-600 m2、备选地600m2-2400 m2、备选地2.4m2-2400m2。在一些实施方案中，生物反应器具有700-800mL的体积容量(例如，iCELLis nano)。在一些实施方案中，生物反应器具有25L-50L的体积容量(例如，iCELLis500)。在一些实施方案中，生物反应器具有10m2-30 m2的容量或1.5L-3.5L的体积容量(例如，UNVC carbo)。在一些实施方案中，生物反应器具有200m2-600 m2的容量或30L-100L的体积容量(例如，UNVC nitro)。在一些实施方案中，生物反应器具有约2,400m2的容量或350L-400L的体积容量(例如，UNVC oxo)，或更大。
培养基可以是适合宿主细胞和生产目的的任何培养基，诸如无血清化学成分限定培养基。
本发明方法的实施方案可以包括以下步骤：在生物反应器中提供宿主细胞；在恒定的初始dO2水平、pH和温度下使宿主细胞生长至汇合；基于生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；在感染窗口的最佳时间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染宿主细胞；温育感染病毒或病毒颗粒的宿主细胞以繁殖病毒；以及任选地，收获病毒。
实施方案可以有利地采用包括空气流和O2流在内的因素与生物反应器中的细胞密度之间的相关性。这种相关趋势可以用于更好地确定固定床反应器(例如，包括不允许细胞计数采样或细胞计数不切实际的反应器)中的最佳感染时间。
现在转到附图，图1比较了根据本发明实施方案的固定床生物反应器系统的两次代表性运行的空气流和氧气(O2)流。
图2绘制了根据本发明实施方案的空气-O2差与Univercells(UNVC)活细胞密度的图表。实施方案可以评估空气流速率和O2流速率之间的差。在这种情况下，正差表示空气流体积大于O2流体积，而负差表示相反，或者空气流体积小于O2流体积。当空气流体积等于O2流体积时，差为零。
在该图表中，当差(d)接近零时，活细胞密度(VCD，本文以活细胞/cm2为单位测量)接近1×105个细胞/cm2。在d＝20左右，VCD在1×105个细胞/cm2的log的一半内，其被称为“感染触发点”。实施方案可以使用空气流和O2流的趋势来估计感染所需的时间。在该示例中，使用d保留大约42％的VCD变异性，R2＝0.4224，并且差:VCD相关系数＝-0.64。
图3绘制了根据本发明实施方案的平均每小时空气-O2差与活细胞密度随时间的变化，比较了右侧轴上的空气-O2差与左侧轴上的VCD(细胞/cm2)关于x轴上的时间(接种后小时数或hpi)的变化。到64hpi，历史VCD显示在5×104和1×105个细胞/cm2之间。在84-96hpi的窗口内，VCD倾向于最接近1×105个细胞/cm2。在该窗口，空气和O2趋势线开始收敛。本发明的实施方案可以有利地提供更可靠的最佳感染时间估计。
图4图示了根据本发明实施方案在事后应用于从代表性运行2(如图1所示)收集的数据的空气-O2差模型。将分析外推到代表性运行#2表明，实际感染时间发生晚于最佳感染时间。在该示例中，当细胞密度为1.3×105个活细胞/cm2时发生感染，这比目标密度1×105个细胞/cm2的细胞密度更高。
图5A图示了固定床生物反应器中使用的微载体条，13个微载体条(每条3维面积为约11.2cm2)显示在5mL培养基中。
图5B图示了可以用于每张床容纳最多3,500条的生物反应器的横截面。
图5C以横截面图图示了生物反应器的不同部分。
本发明提供了一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染宿主细胞的方法。具体地，本发明提供了一种确定和控制宿主细胞最佳感染时间从而提高病毒产量的可重复且稳健的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：1)将宿主细胞提供(例如，接种)到生物反应器中，该生物反应器处于系统参数(诸如总空气流、O2流、溶解氧(dO2)、pH和温度)可以测量和控制的环境中，2)使宿主细胞在第一组感染前系统参数下生长，3)监测系统参数，4)在至少部分地由测量的系统参数中的两个或更多个的变化确定的时间，用至少一种病毒感染宿主细胞，在第二组感染后系统参数下将宿主细胞与病毒一起温育，以及任选地，5)收获病毒。在一些实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞，其是锚定依赖性的并且需要平坦的表面、微载体和/或固定床来锚定。在具体实施方案中，Vero细胞或HEK 293细胞用作固定床生物反应器中的宿主细胞。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：1)将宿主细胞提供(例如接种)到生物反应器中，该生物反应器处于恒定的初始80％-100％dO2、7.2-7.4pH和36℃+2℃温度下，2)将dO2水平降低至初始dO2水平的50％，同时保持pH和温度恒定，3)在感染窗口期间用至少一种病毒感染宿主细胞，该感染窗口定义为当空气流降低且氧气流增加使得它们在彼此的±20％以内的时间，4)将宿主细胞与病毒在20％-50％dO2水平、7.2-7.4pH和36℃+2℃温度下温育，以及任选地5)收获病毒。
在本发明的具体实施方案中，在用病毒感染宿主细胞之前12小时，dO2降低至少50％。在一个实施方案中，在宿主细胞生长到最高细胞密度后，用病毒感染宿主细胞。在本发明的又一个实施方案中，dO2在宿主细胞达到最高细胞密度后降低。
通过该方法产生的病毒量比常规方法产生的病毒量更具可重复性并且明显更多，在常规方法中包括dO2在内的所有参数在整个过程中保持恒定。
以下内容适用于本申请的具体实施方式部分。
如果在指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”、“一种”或“该”，则包括该名词的复数形式，除非另有具体说明。
在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解的仍然确保所讨论特征的技术效果的精度区间。当与数值结合使用时，该术语通常表示与指示数值的偏差为±10％，优选为±5％。
如本文所用，术语“生物反应器”是指支持生物活性环境的设备，在该环境中可以进行生物过程，诸如在受控条件下的病毒和载体繁殖。生物反应器可以设计用于小规模培养物，诸如在研究实验室中使用的培养物，以及用于在试验工厂或商业规模上生产和收获生物大分子(诸如疫苗病毒、抗原和载体)的包括容器或大桶的大型生物反应器。生物反应器可以用于繁殖悬浮细胞和贴壁细胞。生物反应器是受控环境，其中可以调节氧气/dO2、氮气、二氧化碳和pH水平。
“固定床生物反应器”是指一种生物反应器，其包括促进细胞贴壁和生长的固定床填充材料。由于用低剪切力灌注高细胞密度的能力，固定床生物反应器已被用于生产小规模和大规模的病毒疫苗产品。固定床生物反应器的任何配置或平台都可以与本发明一起使用。
固定床生物反应器可以是一次性生物反应器，诸如市售的iCELLis系统(PallCorporation)或scale-XTM系统(Univercells)，它们描述于Berrie DM等人，Vaccine,2020,38:3639-3645，其通过引用以其整体并入本文。iCELLis系统平台提供了一种新颖的固定床技术，包括由在不需要任何无菌处理的坚固、单一、封闭的系统中的编织医用级聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维组成的载体。此外，该系统通过控制温度、O2、pH、二氧化碳(CO2)和氮气(N2)来使用“瀑布(waterfall)”技术引入高气体交换率，此外，还使用磁力叶轮，其产生低细胞剪切应力以及均匀分布的培养基循环。对于大多数病毒，与传统的贴壁细胞平板(flat-stock)烧瓶相比，iCELLis系统的生产滴度显著增加。iCELLis技术可以用于小规模，诸如iCELLis Nano，其生长面积在0.5至4m2之间，以及制造规模，诸如iCELLis 500，其生长面积范围为66至500m2。在小规模系统中开发的过程可以扩展到制造规模。
Univercells的scale-XTM生物反应器系统提供了一系列生长表面：scale-X“hydro”(<3m2)“carbo”(10-30m2)和“nitro”(200-600m2)。该系列提供了可扩展的过程和临床批量生产的能力。在Univercells产品线内，生物反应器高度增加，而直径保持不变。例如，carbo 10m2生物反应器的高度是30m2生物反应器高度的1/3。然而，不同生产线之间的放大是通过保持固定床的高度恒定并增加直径来实现的，类似于色谱系统中的放大。例如，200m2生物反应器与10m2生物反应器的高度相同，但直径不同。scale-X carbo系统是一次性生物反应器，其与由实验室规模的自动化过程控制器(pH、DO、T、搅拌、液体流速率)操作的在线产品浓缩相结合，能够实现病毒产品的生产和同步浓缩；这是新颖的特征并且将这种类型的固定床生物反应器与市场上的其他生物反应器区分开来。取决于表面积，scale-Xcarbo生物反应器中的固定床为细胞生长提供了10m2至30m2之间的表面积，总容器体积为1.6-3.2L。这导致每单位体积高细胞密度的容量和紧凑的占用面积，允许集成到标准生物安全柜中。许多市售的固定床生物反应器使用随机包装的盘或织物条作为细胞附着的基质；然而，scale-X生物反应器使用由网状层组织的固定床，其为细胞生长提供均匀性和容器间一致性。固定床生物反应器可以具有测量和监测pH、温度、溶解氧和生物量(其指示贴壁细胞密度)的传感器。固定床生物反应器还可以具有能够添加氧气或氮气的不同端口、培养基交换端口、用于添加氢氧化钠(NaOH)和/或CO2以调节pH的端口。可以通过添加O2或N2来改变培养基的dO2。优选地，通过在生物反应器的顶部空间中注入N2，同时搅拌并监测dO2，可以以受控方式消耗dO2水平。
用于本发明的宿主细胞可以是锚定依赖性细胞或适于成为锚定依赖性细胞系。所公开方法的宿主细胞可以在微载体上培养，微载体可以在生物反应器中或在微载体条上悬浮。在一些实施方案中，宿主细胞在固定床生物反应器的固定床中的微载体条上培养。在一些实施方案中，固定床生物反应器是市售的iCELLIS Nano(Pall Corporation)、iCELLis500生物反应器(Pall Corporation)或Univercells固定床生物反应器(Univercells SA)。在一些实施方案中，固定床可以在800mL固定床生物反应器(诸如iCELLis Nano)中提供最多40,000cm2，并且在25L固定床生物反应器(诸如iCELLis 500)中提供高达5,000,000cm2(图5A-图5C；表1)。固定床高度可以在20mm和10mm的范围内，在800mL固定床生物反应器中提供5300cm2至40,000cm2的生长面积，在25L固定床生物反应器中提供660000cm2至5,000,000cm2的生长面积。
表1.
可以通过使用2,000至20,000个细胞/cm2的接种密度培养宿主细胞。接种密度可以基于宿主细胞的类型、生物反应器的体积、固定床生物反应器中固定床的高度等进行调整。为本过程选择最佳的接种密度在本领域技术人员的知识范围内。代谢活性细胞的生长可以通过过程空气参数(包括但不限于空气流、O2流及其收敛、它们之间的关系(例如，两者之间的比率)或其各自的趋势)的相关性进行监测，从而提高病毒产量。
本发明可以包括使用生物反应器固定床内的生物量传感器测量进一步的参数，诸如生物量。生物量通过电导率指示贴壁细胞的质量，可以用于监测宿主细胞的整体生长和感染后由于病毒繁殖而导致的细胞质量减少。生物量传感器监测的越高的电导率指示的生物量越高，指示细胞的生长速率越高。然而，依赖生物量测量存在缺点。生物量不代表代谢活动或峰值产量。例如，宿主细胞可能陷入衰老，但仍具有高生物量。此外，一些系统中的生物量测量需要接入生物反应器，这可能会给临床和商业过程带来挑战，包括CGMP合规性。
如本文所用，“培养基”是指用于在生物反应器中培养宿主细胞的液体。用于本公开内容的规程的培养基可以包括支持宿主细胞生长的各种成分，包括但不限于氨基酸、维生素、有机和无机盐、碳水化合物。培养基可以是无血清培养基，其是不用任何动物血清配制的培养基。使用时，无血清培养基可以选自DMEM、DMEM/F12、Medium199、MEM、RPMI、OptiPRO SFM、VP-SFM、VP-SFM AGT、HyQ PF-Vero、MP-Vero或其他。培养基也可以是无动物培养基；即，它没有任何动物源性产品。培养基也可以是无蛋白培养基；即，培养基不用蛋白质配制。无血清或无蛋白培养基可以不用血清或蛋白质配制，但可以含有源于宿主细胞的细胞蛋白，以及任选地特异性地添加到无血清或无蛋白培养基中的蛋白质。
例如，用于培养的pH可以在6.5-7.5之间，具体取决于宿主细胞的pH稳定性。优选地，细胞在pH 7.4下培养。宿主细胞可以在20-40℃的温度下培养，特别是在30℃和40℃之间，并且对于哺乳动物细胞优选地在36℃±1℃下培养。
在本公开内容的方法中用于培养病毒的宿主细胞或宿主细胞系或细胞可以是任何适于生产病毒抗原、病毒载体或病毒产品的真核细胞。优选地，宿主细胞可以是“贴壁细胞”或“锚定依赖性细胞”。贴壁细胞是在培养条件下黏附在表面上的细胞，它们的生长可能需要锚定，并且它们也可以称为锚定依赖性细胞。
本发明中使用的宿主细胞可以是天然的或基因修饰的(例如，重组细胞、细胞系等)，并且可以是适于生产病毒抗原、病毒载体或病毒产品的任何真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自天然存在或基因修饰的哺乳动物细胞(例如，人细胞和鼠细胞)、禽细胞(例如，鸡细胞和鹌鹑细胞)和昆虫细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、WI-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞或HEK 293细胞。
优选的贴壁细胞是可以在诸如PET条的载体上生长的锚定依赖性细胞，但也可以使用可能适于作为贴壁细胞生长的悬浮细胞。在一些实施方案中，用于本发明的锚定依赖性细胞是Vero细胞。选择适于在本发明过程中使用的贴壁宿主细胞在本领域技术人员的知识范围内。
病毒可以是任何天然存在的或基因修饰的病毒(例如，重组或工程化病毒)。在某些实施方案中，病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉-扎伊尔病毒、埃博拉-苏丹病毒、埃博拉-马尔堡病毒、尼帕病毒或前述中的任何一种的嵌合体。在一些实施方案中，病毒是病毒载体。在某些实施方案中，病毒是VSV载体。在某些实施方案中，病毒是经修饰的病毒载体，诸如VSV，其含有来自另一种感兴趣病毒的糖蛋白。
在本发明的一个实施方案中，病毒是病毒载体。病毒载体是可以用于将过客核酸序列转移到感兴趣细胞中的病毒。病毒载体可以是可以用于衍生重组蛋白的病毒表达载体。优选地，病毒载体可以是经修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)、VSV、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒。更优选地，本发明的病毒载体是VSV载体。由病毒载体表达的重组蛋白可以是病毒蛋白、细菌蛋白、治疗性重组蛋白或其组合。更优选地，由病毒载体产生的重组蛋白是病毒蛋白。
在一些实施方案中，本发明的病毒是VSV载体。VSV是弹状病毒(Rhabdoviridae)科的成员，是一种具有负链RNA基因组的包膜病毒，在牲畜中引起自限性疾病。减毒VSV是理想的病毒载体，因为它们在人类中是非致病性的，在动物中几乎无毒力，在感兴趣连续哺乳动物细胞系中显示出稳健的生长，在复制过程中缺乏DNA中间体，引发强烈的细胞和体液免疫应答，以及允许在多个位点插入转基因的基因组结构(Humphreys和Sebastian，Immunology,2018,153:1-9；Clarke等人，Vaccine.2016 34:6597-6609)。
如本文所用，“感染”或“病毒感染”是指病毒进入宿主细胞并随后病毒在细胞中的复制。在本公开内容的方法中，宿主细胞的感染可以在由如过程空气参数(例如，包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性确定的最佳感染窗口时进行，从而提高病毒产量。
本公开内容的方法的宿主细胞可以在100％的初始dO2下培养。在感染之前，dO2可以降低到90％的水平至低至20％的水平。dO2可以从约80％降低到约60％、从约70％降低到约40％、从约50％降低到约15％。优选地，在感染前，dO2可以从约50％降低到约20％。更优选地，在感染前，水平降低到约20％。
dO2可以在感染前2至24小时的时间范围开始降低，并在整个感染过程和病毒收获期间保持在该水平。dO2从感染前约2小时至约10小时、约5小时至约15小时、约10小时至约20小时、18小时至约24小时开始降低。优选地，dO2在感染前8小时至约12小时的时间范围开始降低。
如本文所用，“收获”是指通过从生物反应器中收集未澄清的培养基和/或宿主细胞来收集细胞和细胞衍生产物诸如病毒。例如，病毒的收获可以在感染后2至5天或dO2降低后3至6天进行。在一些实施方案中，病毒的收获可以在感染后2天进行。一些病毒可能需要在收获前进行宿主细胞裂解的附加步骤。
本公开内容的病毒可以通过包括但不限于空斑测定、终点稀释测定、血凝测定、二辛可宁酸测定或电子显微镜等方法进行定量。优选地，病毒可以通过空斑测定法进行定量。如本文所用，空斑测定法是测量感染性病毒颗粒的数量的方法，基于对空斑形成单位(pfu)的测量。在空斑测定中，用连续稀释的病毒原液感染细胞单层，并且使用琼脂糖覆盖层来限制病毒的流动。受感染的细胞释放后代病毒，后代病毒又感染邻近细胞。细胞被裂解以产生被未感染细胞包围的透明区域，称为空斑，使用染料进行可视化。更高的样品病毒滴度导致更高数量的空斑。
本发明的实施方案提供了用于在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染宿主细胞的新颖且有利的系统和方法。在一个实施方案中，该系统包括被配置为且适合于细胞培养、用病毒感染细胞、繁殖病毒和收获病毒的生物反应器；在生物反应器内的细胞培养基；在生物反应器内细胞培养基上方的空气空间；进入生物反应器的空气流入口；测量进入生物反应器的空气流的空气流传感器；进入生物反应器的O2流入口；测量进入生物反应器的O2流的O2流传感器；被配置为且适合于收集以下值的数据收集模块：进入生物反应器的当前空气流、进入生物反应器的空气流的当前趋势、进入生物反应器的当前O2流以及进入生物反应器的O2流的当前趋势；被配置为且适合于指示以下何时发生的指示单元：进入生物反应器的空气流的降低趋势、进入生物反应器的O2流的增加趋势以及进入生物反应器的空气流和进入生物反应器的O2流的当前各自值之间的收敛。
在一个实施方案中，数据收集单元包括：与空气流传感器和O2流传感器可操作通信的至少一个第一处理器；以及与至少一个第一处理器可操作通信的至少一个第一机器可读介质，该至少一个第一机器可读介质具有存储在其上的指令，当由至少一个第一处理器执行时，执行以下步骤：记录来自空气流传感器的读数以产生进入生物反应器的当前空气流的值，将当前空气流的值与至少一个先前空气流的值进行比较，以产生进入生物反应器的空气流的当前趋势，记录来自O2流传感器的读数以产生进入生物反应器的当前O2流的值，以及将当前O2流的值与至少一个先前O2流的值进行比较，以产生进入生物反应器的O2流的当前趋势。
在一个实施方案中，指示单元包括：与数据收集单元和生物反应器可操作通信的至少一个第二处理器；以及与至少一个第二处理器可操作通信的至少一个第二机器可读介质，该至少一个第二机器可读介质具有存储在其上的指令，当由至少一个第二处理器执行时，执行以下步骤：指示用病毒感染细胞的时间窗口，当且仅当：进入生物反应器的空气流的当前趋势正在降低，进入生物反应器的O2流的当前趋势正在增加，并且在进入生物反应器的空气流和进入生物反应器的O2流的当前各自值之间存在收敛。
增加或降低趋势可以通过以下来界定：通过比较单对数据点(例如，时间T0的流相对于时间T1的流)、通过比较多个数据点(例如，在第一时间段收集、观察或记录的所有流值的平均值相对于在第二时间段收集、观察或记录的所有流值的平均值)，或通过其他方法(例如，统计分析、机器学习或人工智能方法)。用于确定一个或多个参数的增加或降低趋势的标准、方法或阈值可以相同或不同。
收敛被定义为两个值(例如，空气流速率和O2流速率)随时间显著聚集在一起。收敛可以通过将一个流速率的测量值与另一个流速率的测量值进行比较在单个时间点或者在两个相邻但离散的时间点进行计算。在比较之前，可以对流速率进行平均、采样或以其他方式处理。为了确定或找到收敛，可以设置收敛阈值。收敛阈值可以以流单位(例如，mL/min)或以百分比为基础(例如，较小值在较大值的30％以内)建立。备选地，可以将流值转换为相对百分比并以百分比值进行比较(例如，应用于62％空气和38％ O2的流的+/-30％的流阈值将具有收敛)。备选地，可以将两个值转换为总流的绝对百分比，并以百分比值进行比较(例如，应用于42％空气、12％ N2和46％ O2的流的+/-10％的流阈值将在空气流和O2流之间具有收敛)。
实施方案可以进一步包括决策单元，该决策单元被配置为且适合于当指示用病毒感染细胞的时间窗口时，开始用病毒感染细胞。数据收集单元、指示单元和决策单元(单独或以任何组合方式)中的每一个可以是、包含、包括或连接到数字计算机、控制器的嵌入部件(例如，商用或制造的生物反应器控制单元内的模块或应用程序)、机械系统、气动或液压系统、模拟电或电子系统、标准操作程序、人员中的任何一种，或前述任何一种的组合。
在一个实施方案中，至少一个第一处理器和至少一个第二处理器是相同的处理器。
在一个实施方案中，至少一个第一机器可读介质和至少一个第二机器可读介质是相同的机器可读介质。
在一个实施方案中，生物反应器是密封的生物反应器。
在一个实施方案中，收敛阈值选择为+/-20％，当进入生物反应器的O2流百分比值在进入生物反应器的空气流百分比值的+/-20％以内时，发现收敛。
在一个实施方案中，数据收集模块包括机械或模拟电传感器。
在一个实施方案中，指示单元包括一个或多个听觉、视觉或触觉指示器。
一个实施方案提供了一种用于在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染宿主细胞的方法。该方法可以包括：提供生物反应器，该生物反应器被配置为且适合于细胞培养、用病毒感染细胞、繁殖病毒和收获病毒；提供在生物反应器内的细胞培养基；提供在生物反应器内的细胞培养基上方的空气空间；提供进入生物反应器的空气流入口；提供测量进入生物反应器的空气流的空气流传感器；提供进入生物反应器的O2流入口；提供测量进入生物反应器的O2流的O2流传感器；通过数据收集模块收集以下：进入生物反应器的当前空气流、进入生物反应器的空气流的当前趋势、进入生物反应器的当前O2流以及进入生物反应器的O2流的当前趋势；通过指示单元指示以下何时发生：进入生物反应器的空气流的降低趋势、进入生物反应器的O2流的增加趋势以及进入生物反应器的空气流和进入生物反应器的O2流的当前各自值之间的收敛。
在一个实施方案中，数据收集单元包括：与空气流传感器和O2流传感器可操作通信的至少一个第一处理器；以及与至少一个第一处理器可操作通信的至少一个第一机器可读介质，该至少一个第一机器可读介质具有存储在其上的指令，当由至少一个第一处理器执行时，执行以下步骤：记录来自空气流传感器的读数以产生进入生物反应器的当前空气流的值，将当前空气流的值与至少一个先前空气流的值进行比较，以产生进入生物反应器的空气流的当前趋势，记录来自O2流传感器的读数以产生进入生物反应器的当前O2流的值，以及将当前O2流的值与至少一个先前O2流的值进行比较，以产生进入生物反应器的O2流的当前趋势。
在一个实施方案中，指示单元包括：与数据收集单元和生物反应器可操作通信的至少一个第二处理器；以及与至少一个第二处理器可操作通信的至少一个第二机器可读介质，该至少一个第二机器可读介质具有存储在其上的指令，当由至少一个第二处理器执行时，执行以下步骤：指示用病毒感染细胞的时间窗口，当且仅当：进入生物反应器的空气流的当前趋势正在降低，进入生物反应器的O2流的当前趋势正在增加，并且在进入生物反应器的空气流和进入生物反应器的O2流的当前各自值之间存在收敛。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括当指示用病毒感染细胞的时间窗口时，开始用病毒感染细胞。
在一个实施方案中，至少一个第一处理器和至少一个第二处理器是相同的处理器。
在一个实施方案中，至少一个第一机器可读介质和至少一个第二机器可读介质是相同的机器可读介质。
在一个实施方案中，生物反应器是密封的生物反应器。
在一个实施方案中，进入生物反应器的O2流的值在进入生物反应器的空气流的值的+/-20％以内。
在一个实施方案中，数据收集模块包括机械或模拟电传感器。
在一个实施方案中，指示单元包括一个或多个听觉、视觉或触觉指示器。
本文描述的方法和过程可以体现为代码和/或数据。本文描述的软件代码和数据可以存储在一个或多个机器可读介质(例如，计算机可读介质)上，其可以包括能够存储代码和/或数据以供计算机系统使用的任何设备或介质。当计算机系统和/或处理器读取和执行存储在计算机可读介质上的代码和/或数据时，计算机系统和/或处理器执行体现为存储在计算机可读存储介质中的数据结构和代码的方法和过程。
本领域技术人员应当理解，计算机可读介质包括可以用于存储信息的可移动和不可移动结构/设备，诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块和由计算系统/环境使用的其他数据。计算机可读介质包括但不限于易失性存储器，诸如随机存取存储器(RAM、DRAM、SRAM)；和非易失性存储器，诸如闪存存储器、各种只读存储器(ROM、PROM、EPROM、EEPROM)、磁性和铁磁/铁电存储器(MRAM、FeRAM)以及磁性和光学存储设备(硬盘驱动器、磁带、CD、DVD)；网络设备；或现在已知或以后开发的能够存储计算机可读信息/数据的其他介质。计算机可读介质不应被理解或解释为包括任何传播信号。本发明的计算机可读介质可以是例如光盘(CD)、数字视频光盘(DVD)、闪存存储器设备、易失性存储器或硬盘驱动器(HDD)，诸如外部HDD或计算设备的HDD，尽管实施方案不限于此。计算设备可以是例如膝上型计算机、台式计算机、服务器、移动电话或平板电脑，尽管实施方案不限于此。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用以其整体并入，包括所有附图和表格，在它们与本说明书的明确教导不相矛盾的范围内。
材料和方法
iCELLis Nano固定床生物反应器系统用于实施例1-4。iCELLis Nano生物反应器可以容纳约800mL，相当于约5,300至40,000的总表面生长面积，其中固定床高度为20mm至10mm。生长面积相当于35至267个可以用于堆叠生长的T-150烧瓶(参见图5A、图5B和表1)。使用iCELLis执行具有不同参数的运行。
Univercells的scale-XTM Carbo固定床生物反应器系统可以用于预测性实施例5-7(Berrie DM等人，Vaccine,2020,38:3639-3645)。scale-XTM Carbo生物反应器具有在10m2-30 m2范围内的细胞生长表面积，总容器体积为1.6-3.2L，具体取决于表面积。可以使用scale-XTM Carbo生物反应器进行具有不同参数的运行。
以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释为限制。除非另有说明，否则所有百分比均为重量百分比，并且所有溶剂混合物比例均按体积计。
实施例1.来自专项活动(campaign)的VSV产量，其中将参数用作病毒产生的基线。
使Vero细胞在iCELLis生物反应器中在大约100％dOi、37℃温度、7.4pH下生长。在Vero细胞的培养期间，使用生物反应器的生物量传感器监测细胞生长，并用VSV在55mS/cm电导率(细胞生长的量度)时感染Vero细胞。rVSV-LASV由NIAID根据材料转让协议LAB-18-P_LV-22提供。
该系统在感染后约12-24小时达到约75mS/cm的最高电导率(最高细胞生长)。感染率为0.05MOI。在感染后2天收获该病毒。与在平板中生长的相同细胞的滴度(表2)相比，病毒产量提高超过1log/mL。
实施例2.来自专项活动的VSV产量，其中在感染前大约12小时，将dO2降低并在整个感染至收获期间保持。
在大约100％dO2、37℃温度、7.4pH下培养Vero细胞。在Vero细胞的培养过程中，使用生物量传感器监测细胞生长，并在80mS/cm电导率(大约最高电导率)时感染细胞，即当达到最大细胞生长时感染Vero细胞。在感染前大约12小时，将dO2水平降低到45-50％，并在整个感染和收获期间保持恒定在该降低的水平。将温度保持在37℃，并且将pH保持在7.4。在感染后大约2天收获该病毒。在感染前12小时降低dO2，在Vero细胞达到最大细胞生长后感染Vero细胞VSV，导致与平板VSV滴度相比，VSV滴度增加2log以上(表2)，与实施例1相比，病毒滴度增加5.9x(dO2没有降低)。rVSV-LASV由NIAID根据材料转让协议LAB-18-P_LV-22提供。
实施例3.来自专项活动的VSV产量，其中除了dO2、pH和温度保持恒定外，具有最大电导率。
在大约100％dO2、37℃温度、7.4pH下培养Vero细胞。在Vero细胞的培养过程中，使用生物量传感器监测细胞生长，并在110mS/cm电导率(大约最高电导率，因此当达到最大细胞生长时)时感染细胞。感染率为0.05MOI。dO2水平没有调整。在整个培养和感染期间，将温度保持在37℃，并且将pH保持在7.4。在感染后大约2天收获病毒。该实验的VSV滴度与实施例1的相似，表明实施例2中观察到的较高产量是由于dO2的改变，而不是由于在最高细胞生长下感染Vero细胞，这可能由于更多的细胞被感染而增加总滴度(表2)。
表2
表2比较了不同运行之间的繁殖数据。比较以下之间的繁殖数据：1.来自平板烧瓶中Vero细胞繁殖的VSV，2.来自iCELLis系统(运行1)中的Vero细胞繁殖的VSV，其中感染期间的dO2％为90％，3.来自iCELLis系统(运行2)中的Vero细胞繁殖的VSV，其中感染期间的dO2％为40％，以及4.来自iCELLis系统(运行3)中的Vero细胞繁殖的VSV，其中感染期间的dO2％为20％。表2中的数据显示，分别来自CS10烧瓶平板、运行1、运行2和运行3的VSV滴度和总病毒产量逐渐显著增加。这表明，与平板产生的病毒相比，使用平床式生物反应器iCELLis繁殖VSV导致每mL病毒产量增加1至2log。更重要的是，感染期间dO2的逐渐降低导致VSV滴度和总病毒产量逐渐显著增加。rVSV-LASV由NIAID根据材料转让协议LAB-18-P_LV-22提供。
实施例4.感染时不同dO2水平的VSV产量。
使VSV在处于大约100％dO2、37℃温度、7.4pH的Vero细胞中生长。在感染前大约12小时，将dO2水平降低到90％、40％和20％，并在整个感染期间保持恒定在该降低的水平。将温度保持在37℃，并且将pH保持在7.4。在感染后大约2天收获病毒。如表2所示，结果显示随着感染时dO2水平降低，病毒产量逐渐增加。rVSV-LASV由NIAID根据材料转让协议LAB-18-P_LV-22提供。
预测性实施例5—来自专项活动的VSV产量，其中可以将参数用作未来病毒产生的基线。
可以使Vero细胞在Univercells scale-XTM Carbo生物反应器中，使用合适的化学成分限定无血清培养基，在大约100％dO2、37℃温度、7.4pH下生长。在Vero细胞的培养期间，O2和空气流传感器可以用于监测过程空气参数，并且在观察到以下情况时，可以用VSV感染Vero细胞：进入生物反应器的总空气流的降低趋势、进入生物反应器的总O2流的增加趋势以及进入生物反应器的总空气流和进入生物反应器的总O2流的当前各自值的收敛(例如，+/-20％)(代谢活性细胞密度的指标)。然后可以在感染后2至5天收获病毒。与在平板中生长的相同细胞的滴度(与表2中所示的实际结果相似)相比，病毒产量有望增加超过1log/mL。
预测性实施例6—来自专项活动的流感病毒产量，其中可以将参数用作未来病毒产生的基线。
可以使Quail细胞在Univercells scale-XTM Carbo生物反应器中，使用合适的化学成分限定无血清培养基，在大约100％dO2、37℃温度、7.4pH下生长。在Quail细胞的培养期间，O2和空气流传感器可以用于监测过程空气参数，并且在观察到以下情况时，可以用VSV感染Quail细胞：进入生物反应器的总空气流的降低趋势、进入生物反应器的总O2流的增加趋势以及收敛(例如，进入生物反应器的总空气流和进入生物反应器的总O2流的当前各自值的收敛)(代谢活性细胞密度的指标)。然后可以在感染后2至5天收获病毒。与在平板中生长的相同细胞的滴度(与表2中所示的实际结果相似)相比，病毒产量有望增加超过1log/mL。
预测性实施例7—来自专项活动的LVV产量，其中可以将参数用作未来病毒产生的基线。
可以使HEK 293细胞在Univercells scale-XTM Carbo生物反应器中，使用合适的化学成分限定无血清培养基，在大约100％dO2、37℃温度、7.4pH下生长。在HEK 293细胞的培养期间，O2和空气流传感器可以用于监测过程空气参数，并且在观察到以下情况时，可以用VSV感染HEK 293细胞：进入生物反应器的总空气流的降低趋势、进入生物反应器的总O2流的增加趋势以及收敛(例如，进入生物反应器的总空气流和进入生物反应器的总O2流的当前各自值的收敛)(代谢活性细胞密度的指标)。然后可以在感染后2至5天收获病毒。与在平板中生长的相同细胞的滴度(与表2中所示的实际结果相似)相比，病毒产量有望增加超过1log/mL。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将建议于本领域技术人员，并且应包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合，并且所有这样的组合都被认为在本发明的范围内，而不是对其的限制。

Claims (85)

1.一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染所述宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
在生物反应器中培养宿主细胞；
观察一组生物反应器过程空气参数；
基于所述生物反应器过程空气参数识别第一时间标记；
基于所述第一时间标记计算感染窗口的最佳时间；以及
在所计算的感染窗口的最佳时间期间感染所述宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物反应器是固定床生物反应器。
4.根据权利要求3所述的方法，其中观察所述生物反应器过程空气参数的步骤包括在多个时间点，测量进入所述生物反应器的空气流的速率以及测量进入所述生物反应器的O2流的速率，以在每个相应的时间点创建相应的当前测量组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中识别第一时间标记的步骤包括确定进入所述生物反应器的所述空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势交叉的时间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中识别第一时间标记的步骤包括计算来自一个或多个当前测量组的一个或多个值，以预测进入所述生物反应器的所述空气流的速率预期降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的预期增加趋势交叉的未来时间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是基因修饰的细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的或基因修饰的哺乳动物细胞、禽细胞或昆虫细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、WI-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是天然存在的病毒。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是基因修饰的病毒。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉-扎伊尔病毒、埃博拉-苏丹病毒、埃博拉-马尔堡病毒、尼帕病毒或前述中的任何一种的嵌合体。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是病毒载体。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是经修饰的病毒载体，其含有来自另一种感兴趣病毒的糖蛋白。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体是重组VSV(rVSV)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间包括达到所述宿主细胞的最佳活细胞密度的时间。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定进入所述生物反应器的所述空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势交叉的时间。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定所述生物反应器的空气-O2差小于预定阈值或预期穿过所述预定阈值以下的时间。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间是进入所述生物反应器的所述空气流的速率的降低趋势和进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势收敛使得它们在彼此的±30％以内、或在彼此的±20％以内、或在彼此的±10％以内、或在彼此的±5％以内的时间区间。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述生物反应器具有在1m2-600 m2(作为表面积)的范围内的容量。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器具有在600m2-2400m2(作为表面积)的范围内的容量。
24.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在所述感染之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。
25.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其进一步包括在所述感染之后收获所述宿主细胞或所述宿主细胞的产物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述收获之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。
27.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不包括细胞计数设备，并且不与细胞计数设备连接。
28.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不具有用于细胞计数的接入端口。
29.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器是封闭的、密封的(例如，气密的)系统。
30.一种组合物，其包含由根据权利要求1所述的方法生产的细胞或细胞衍生产物。
31.一种在生物反应器中生产病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述生物反应器中提供宿主细胞；
b)使所述宿主细胞在所述生物反应器中生长；
c)观察一组生物反应器过程空气参数；
d)基于所述生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；
e)在所述感染窗口的最佳时间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染所述宿主细胞；
f)温育感染所述病毒或病毒颗粒的所述宿主细胞以繁殖所述病毒；以及任选地，
g)收获所述病毒。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物反应器是平床式生物反应器，并且使所述宿主细胞生长的步骤在恒定的初始dO2水平、pH和温度下进行。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物反应器是一次性平床式生物反应器。
35.根据权利要求31至34所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定进入所述生物反应器的空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉的时间。
36.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定所述生物反应器的空气-O2差小于预定阈值或预期穿过所述预定阈值以下的时间。
37.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间是进入所述生物反应器的所述空气流的速率的降低趋势和进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势收敛使得它们在彼此的±30％以内、或在彼此的±20％以内、或在彼此的±10％以内、或在彼此的±5％以内的时间区间。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞感染所述病毒的感染复数(MOI)为约0.1至0.05。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述宿主细胞感染所述病毒的MOI为0.05。
40.根据权利要求39所述的方法，其中温育感染所述病毒或病毒颗粒的所述宿主细胞以繁殖所述病毒的步骤包括将所述宿主细胞在不同于恒定的初始dO2水平、pH和温度的恒定的最终dO2水平、pH和温度下温育。
41.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的细胞。
42.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是基因修饰的细胞。
43.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的或基因修饰的哺乳动物细胞、禽细胞或昆虫细胞。
44.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC-5细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK 15细胞、WI-38细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。
45.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞。
46.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是天然存在的病毒。
47.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是基因修饰的病毒。
48.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉-扎伊尔病毒、埃博拉-苏丹病毒、埃博拉-马尔堡病毒、尼帕病毒或前述中的任何一种的嵌合体。
49.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是病毒载体。
50.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是经修饰的病毒载体，其含有来自另一种感兴趣病毒的糖蛋白。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述病毒载体是重组VSV(rVSV)。
52.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，所述生物反应器具有在1m2-600 m2(作为表面积)的范围内的容量。
53.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述生物反应器具有在600m2-2400m2(作为表面积)的范围内的容量。
54.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中在所述感染之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。
55.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其进一步包括在所述感染之后收获所述宿主细胞或所述宿主细胞的产物。
56.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中在所述收获之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。
57.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不包括细胞计数设备，并且不与细胞计数设备连接。
58.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不具有用于细胞计数的接入端口。
59.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述生物反应器是封闭的、密封的(例如，气密的)系统。
60.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其进一步包括通过空斑测定法确定病毒滴度的步骤。
61.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括纯化和/或表征所述病毒的步骤。
62.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其进一步包括用所述病毒生产疫苗的步骤。
63.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述生物反应器包括化学成分限定培养基。
64.一种组合物，其包含由根据权利要求31所述的方法生产的细胞或细胞衍生产物。
65.一种在生物反应器中生产病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述生物反应器中提供宿主细胞；
b)在恒定的初始dO2水平、pH和温度下使宿主细胞生长至汇合；
c)基于生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；
d)在所述感染窗口的最佳时间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染所述宿主细胞；
e)温育感染所述病毒或病毒颗粒的所述宿主细胞以繁殖所述病毒；以及任选地，
f)收获所述病毒。
66.一种用于在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染所述宿主细胞的系统，所述系统包括：
生物反应器，所述生物反应器被配置为且适合于细胞培养、用病毒感染细胞、繁殖所述病毒和收获所述病毒；
细胞培养基，所述细胞培养基在所述生物反应器内；
空气空间，所述空气空间在所述生物反应器内的所述细胞培养基上方；
空气流入口，所述空气流入口进入所述生物反应器；
空气流传感器，所述空气流传感器测量进入所述生物反应器的空气流；
O2流入口，所述O2流入口进入所述生物反应器；
O2流传感器，所述O2流传感器测量进入所述生物反应器的O2流；
数据收集模块，所述数据收集模块被配置为且适合于收集表示以下的值：
进入所述生物反应器的当前空气流，
进入所述生物反应器的空气流的当前趋势，
进入所述生物反应器的当前O2流，以及
进入所述生物反应器的O2流的当前趋势；
指示单元，所述指示单元被配置为且适合于指示以下何时发生：
进入所述生物反应器的空气流的降低趋势，
进入所述生物反应器的O2流的增加趋势，以及
进入所述生物反应器的空气流和进入所述生物反应器的O2流的当前各自值之间的收敛。
67.根据权利要求66所述的系统，其中所述数据收集单元包括：
与所述空气流传感器和所述O2流传感器可操作通信的至少一个第一处理器；以及
与所述至少一个第一处理器可操作通信的至少一个第一机器可读介质，所述至少一个第一机器可读介质具有存储在其上的指令，当由所述至少一个第一处理器执行时，执行以下步骤：
记录来自所述空气流传感器的读数，以产生进入所述生物反应器的当前空气流的值，
将所述当前空气流的值与至少一个先前空气流的值进行比较，以产生进入所述生物反应器的空气流的当前趋势，
记录来自所述O2流传感器的读数，以产生进入所述生物反应器的当前O2流的值，以及
将所述当前O2流的值与至少一个先前O2流的值进行比较，以产生进入所述生物反应器的O2流的当前趋势。
68.根据权利要求67所述的系统，其中所述指示单元包括：
与所述数据收集单元可操作通信的至少一个第二处理器；以及
与所述至少一个第二处理器可操作通信的至少一个第二机器可读介质，所述至少一个第二机器可读介质具有存储在其上的指令，当由所述至少一个第二处理器执行时，执行以下步骤：
如果满足一组指示条件，则指示用所述病毒感染所述细胞的时间窗口，所述一组指示条件包括：
进入所述生物反应器的所述空气流的当前趋势正在降低，进入所述生物反应器的所述O2流的当前趋势正在增加，以及
在进入所述生物反应器的空气流和进入所述生物反应器的O2流的当前各自值之间存在收敛。
69.根据权利要求68所述的系统，其进一步包括决策单元，所述决策单元被配置为且适合于当指示用所述病毒感染所述细胞的时间窗口时，开始用所述病毒感染所述细胞。
70.根据权利要求69所述的系统，其中所述至少一个第一处理器和所述至少一个第二处理器是相同的处理器。
71.根据权利要求70所述的系统，其中所述至少一个第一机器可读介质和所述至少一个第二机器可读介质是相同的机器可读介质。
72.根据权利要求71所述的系统，其中所述生物反应器是密封的生物反应器。
73.根据权利要求72所述的系统，其中进入所述生物反应器的O2流的值在进入所述生物反应器的空气流的值的+/-20％以内。
74.根据权利要求66所述的系统，其中所述数据收集模块包括机械或模拟电传感器。
75.根据权利要求66所述的系统，其中所述指示单元包括一个或多个听觉、视觉或触觉指示器。
76.一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染所述宿主细胞的方法，所述方法包括：
提供生物反应器，所述生物反应器被配置为且适合于细胞培养、用病毒感染细胞、繁殖所述病毒和收获所述病毒；
提供在所述生物反应器内的细胞培养基；
提供在所述生物反应器内的所述细胞培养基上方的空气空间；
提供进入所述生物反应器的空气流入口；
提供测量进入所述生物反应器的空气流的空气流传感器；
提供进入所述生物反应器的O2流入口；
提供测量进入所述生物反应器的O2流的O2流传感器；
通过数据收集模块收集以下：
进入所述生物反应器的当前空气流，
进入所述生物反应器的空气流的当前趋势，
进入所述生物反应器的当前O2流，以及
进入所述生物反应器的O2流的当前趋势；
通过指示单元指示以下何时发生：
进入所述生物反应器的空气流的降低趋势，
进入所述生物反应器的O2流的增加趋势，以及
进入所述生物反应器的空气流和进入所述生物反应器的O2流的当前各自值之间的收敛。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述数据收集单元包括：
与所述空气流传感器和所述O2流传感器可操作通信的至少一个第一处理器；以及
与所述至少一个第一处理器可操作通信的至少一个第一机器可读介质，所述至少一个第一机器可读介质具有存储在其上的指令，当由所述至少一个第一处理器执行时，执行以下步骤：
记录来自所述空气流传感器的读数，以产生进入所述生物反应器的当前空气流的值，
将所述当前空气流的值与至少一个先前空气流的值进行比较，以产生进入所述生物反应器的空气流的当前趋势，
记录来自所述O2流传感器的读数，以产生进入所述生物反应器的当前O2流的值，以及
将所述当前O2流的值与至少一个先前O2流的值进行比较，以产生进入所述生物反应器的O2流的当前趋势。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述指示单元包括：
与所述数据收集单元和所述生物反应器可操作通信的至少一个第二处理器；以及
与所述至少一个第二处理器可操作通信的至少一个第二机器可读介质，所述至少一个第二机器可读介质具有存储在其上的指令，当由所述至少一个第二处理器执行时，执行以下步骤：
指示用所述病毒感染所述细胞的时间窗口，当且仅当：
进入所述生物反应器的所述空气流的当前趋势正在降低，进入所述生物反应器的所述O2流的当前趋势正在增加，并且
在进入所述生物反应器的空气流和进入所述生物反应器的O2流的当前各自值之间存在收敛。
79.根据权利要求78所述的方法，其进一步包括当指示用所述病毒感染所述细胞的时间窗口时，开始用所述病毒感染所述细胞。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述至少一个第一处理器和所述至少一个第二处理器是相同的处理器。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一个第一机器可读介质和所述至少一个第二机器可读介质是相同的机器可读介质。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述生物反应器是密封的生物反应器。
83.根据权利要求82所述的方法，其中进入所述生物反应器的O2流的值在进入所述生物反应器的空气流的值的+/-20％以内。
84.根据权利要求76所述的方法，其中所述数据收集模块包括机械或模拟电传感器。
85.根据权利要求76所述的方法，其中所述指示单元包括一个或多个听觉、视觉或触觉指示器。
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