KR101390971B1 - 천연두 생백신의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
MSP주의 함유율을 낮게 억제하였을 때 안전한 천연두 생백신 및 그의 제조방법을 제공한다. 약독화 백시니아 바이러스의 마스터 시드액을 적당 수의 군(1∼n: n은 정수)의 토끼 신장세포에 접종ㆍ배양하는 공정, 각 군의 배양액의 일부를 RK-13 세포와 Vero 세포에 접종ㆍ배양하고, RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero 세포에는 플라크를 발생시키지 않는 각 군의 배양액을 선택ㆍ회수하는 공정, 그 배양액(워킹 시드액)을 사용해서 백신 원액을 제조하는 공정으로 이루어지는 천연두 생백신의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 수득되는 천연두 생백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 배양 중에 용이하게 복귀 돌연변이주를 발생하는 약독화 백시니아 바이러스를 유효성분으로 하는 천연두 생백신의 제조방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 약독화 백시니아 바이러스의 마스터 시드액을 적당 수의 군(1∼n: n은 정수)의 토끼 신장세포에 접종ㆍ배양하는 공정, 각 군의 배양액의 일부를 RK-13 세포와 Vero E6 세포에 접종ㆍ배양하고, RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero 세포에는 플라크를 발생시키지 않는 각 군의 배양액을 선택ㆍ회수하는 공정, 그 배양액(워킹 시드액)을 사용해서 백신 원액을 조제하는 공정으로 이루어지는 천연두 생백신의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 수득되는 천연두 생백신에 관한 것이다.
천연두(smallpox)는 두창(variola)이라고도 불리고 있으며, 예전부터 가장 두려워했었던 바이러스 감염증이다. 천연두 바이러스를 포함하는 오소팍스바이러스속의 바이러스 유전자는 전장 약 180∼200kbp이고, 중앙부의 약 100kbp가 오소팍스바이러스 사이에서 매주 잘 보존되고 있다. 이 영역에 감염방어 항원이 코딩되어 있기 때문에, 오소팍스바이러스 사이에서는 감염방어 면역이 거의 완전하게 교차한다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 통상, 생바이러스 백신은 병원 바이러스의 약 독주를 사용하지만, 천연두 백신(두창 백신)의 경우에는 천연두 바이러스를 기원으로 하지 않는 백시니아 바이러스가 사용되고 있다. 대표적으로는 Lister주, New York City Board of Health주(이하, 「NYCBH주」로 언급하기도 한다), Dairen주(大蓮株), Ikeda주(池田株) 등이 사용되어 왔다.
일본에서는, Lister나 DairenㆍIkeda주를 소에 접종해서 발생한 소수포 조직을 원재료로 하는 천연두 백신이 사용되어 왔다. 이 백신은 첫 종두 유아 100 만예에서 수예의 빈도로 발생하는 종두후 뇌염 등의 치명적인 부작용이 있고(예를 들면, 비특허문헌 2 참조), 소의 피부에서 증식ㆍ계대되어 왔기 때문에, 백신액이 무균이 아니고, 바이러스도 순화된 것이 아니었다. 이 때문에, 하시즈메(Hashizume) 등은 Lister주를 친주로 하여 토끼 신장 초대세포에 저온 순화하여, 온도 감수성의 약독화 바이러스주를 제작하였다. 최종적으로는, 계란 장뇨막에서 형성되는 폭(pock)이 작은 클론을 순화한 LC16m8주가 사용되어, 임상치료 후, 1975년에 국내에서 승인되었다(예를 들면, 비특허문헌 3 참조). 약독화 백시니아 바이러스 LC16m8주는 친주인 Lister주를 비롯해서 미국에서 승인된 천연두 백신 Dryvax의 친주인 NYCBH주 등과 비교해서 신경 독력이 매우 약화되어 있지만(예를 들면, 비특허문헌 3, 4 참조), LC16m8주에 의해서 유도되는 중화 항체의 양은 Lister주에 의해 유도되는 중화 항체의 양과 거의 동등하였다(예를 들면, 비특허문헌 5 참조). 또, 세포배양에 의한 약독화 천연두 백신으로 인가되어 있는 유일한 것이다.
LC16m8주는 친주인 LC16m0주를 저온배양 3대 후에 작은 폭(pock)을 형성하는 바이러스로서 클로닝된 것으로, 그 원인이 B5R 유전자의 프레임 시프트 변이에 의 한 B5R 단백질의 결실임이 밝혀지고 있다(예를 들면, 비특허문헌 6 참조). B5R 단백질은 오소팍스바이러스의 세포외 외피 바이러스의 주요 구성 단백질이기 때문에, 이 결실에 의해 인접하는 세포로의 감염효율이 저하되어, 작은 폭(pock)을 형성하는 것으로 알려져 있다(예를 들면, 비특허문헌 7 참조).
한편, B5R 단백질의 결실은 B5R 유전자의 1염기 결실이기 때문에, 비교적 용이하게 LC16m0형의 복귀 돌연변이(revertant)주가 출현한다(예를 들면, 비특허문헌 8 참조). 이 복귀 돌연변이주의 B5R 유전자의 염기배열을 해석하면, 뉴클레오티드 274G부근의 1염기의 중복, 4염기의 중복, 2염기의 결실에 의해 0RF의 리딩프레임이 복귀한 것임을 알 수 있었다. 복귀 돌연변이주 바이러스의 생물학적 성상을 비교한 결과, RK-13 세포나 Vero E6 세포에서 LC16m0주보다 작지만 LC16m8주보다 큰 플라크를 형성하는 것이 확인되었다. 또, 부화계란 장뇨막 상에서 LC16m0과 동등한 크기의 폭(pock)을 형성하였다. 인간 피부에서의 증식성과 상관이 있다고 여겨지고 있는 토끼 피부에서의 증식성은 복귀 돌연변이주 바이러스의 함유율이 4% 정도까지는 유의차가 나오지 않았지만, 그 이상이 되면, 유의차가 나오는 것으로 추정되었다(예를 들면, 비특허문헌 9 참조).
비특허문헌 1: Moss, B. 2001. Poxviridae: the viruses and their replication, p.2849-2883. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed), Fields virology, 4th ed., vol. 2. Lippincott/The Williams & Wilkins Co., Philadelphia, Pa.
비특허문헌 2: Yoshiro Fukuda, Toshitaka Takagi: Pathology of postvaccinal encephalitis, Clinics and Virus 2:53-58, 1974
비특허문헌 3: 하시즈메 소: 새로운 약독화 두묘 LC16m8주의 기초. 임상과 바이러스 3: 13-19, 1975
비특허문헌 4: Hashizume S., Yoshizawa H., Morita M., Suzuki K.: Properties of attenuated mutant of vaccinia virus, LC16m8, derived from Lister strain. Vaccinia Virus as Vectors for Vaccine Antigens, Quinnan, Ed. Elsvier Scienced Publishing Col, Inc 87-99 1985
비특허문헌 5: 쿠보야 히로코: 건조 세포배양 두창백신 「LC16ㆍ치바」 성인접종의 평가. 치바에이켄 보고 제28호 11-14, 2004년
비특허문헌 6: Takahashi-Nishimaki, Funahashi F., Miki S. et al.: Regulation of plaque size and host range by a vaccinia virus gene related to complement system proteins. Viro1ogy 181:158-164, 1991
비특허문헌 7: Engelstad M. and Smith G.: The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. Viro1ogy 194, 627-637, 1993
비특허문헌 8: Kidokoro, M., M. Tashiro, and H. Shida. 2005. Genetically stable and fully effective smallpox vaccine strain constructed from highly attenuated vaccinia LC16m8. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:4152-4157, 2005
비특허문헌 9: 사이죠 마사유키 외 LC16m0형 복귀 돌연 변이주 바이러스가 포함되는 LC16m8주의 토끼 피부증식시험 후생노동과학연구 연구비보조금후생노동과 학 특별연구사업 세포배양 두창백신의 품질관리에 관한 연구(H15-특별-43), 2003년도.
발명이 해결하려고 하는 과제
상기한 바와 같이, 토끼 신장 초대세포에서 백시니아 바이러스 LC16m8주의 계대를 중첩하면 LC16m8주에 특징적인 작은 플라크보다 약간 더 큰 플라크(중간 크기의 플라크(middle size p1aque); 「MSP」라고 언급하는 경우도 있다)를 형성하는 복귀 돌연변이주(이하, 「MSP주」라고 언급하는 경우도 있다)가 출현한다. 계대를 거듭할 때마다 MSP주의 함유 비율은 증가(도 1 참조)하므로, 일반적으로 바이러스 클로닝에 사용되는 한계 희석법이나 플라크 분리법으로는 MSP주를 제거하는 것은 어렵다. 따라서, 본 발명의 목적은 MSP의 함유율을 낮게 억제한, 보다 안전한 천연두 생백신 및 그의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 진행한 결과, RK-13 세포 및 Vero E6 세포에 있어서의 LC16m8주의 증식성이 MSP주와 서로 다른 점에서, 이 2개의 세포를 사용하는 것에 의해 MSP주를 선택ㆍ배제할 수 있음을 발견하였다. 즉, LC16m8주는 RK-13 세포에서 소형의 플라크를 형성하여 육안으로 용이하게 식별할 수 있지만, Vero E6 세포에서는 아주 작은 바늘상의 플라크 밖에 형성하지 않기 때문에, 육안으로는 식별하기 어렵다. 한편, MSP주는 RK-13 세포 및 Vero E6 세포에서 중형의 플라크를 형성한다. 또한 바이러스를 일정한 범위의 MOI로 RK-13 세포와 Vero E6 세포에 감염시켰을 때, RK-13 세포에서 충분한 플라크를 형성하고, Vero E6 세포에서 MSP주 유래의 플라크를 형성하지 않는 바이러스액을 워킹 시드로서 사용하는 것에 의해, 백신 원액 중의 MSP주 함유율을 낮게 억제하는데 성공하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 이하의 세포배양 천연두 생백신 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
1. 복귀 돌연변이주를 발생하는 돌연변이 바이러스를 유효성분으로 함유하는 백신의 워킹 시드액의 제조방법으로서, 하기 (1)∼(3)의 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법:
(1) 돌연변이 바이러스 함유액을 1∼n군(n은 정수)의 동물세포에 접종ㆍ배양하는 공정,
(2) 각 군의 배양액의 일부를 희석하고, 그 희석액을 RK-13 세포와 Vero 세포에 접종ㆍ배양하는 공정,
(3) RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero 세포에는 플라크를 발생시키지 않는 각 군의 배양액을 선택ㆍ회수하는 공정.
2. 상기 1에서, 상기 (2)의 희석액 중의 바이러스 함량이 1×104 PFU 이상인 방법.
3. 상기 1 또는 2에서, 동물세포가 초대세포인 방법.
4. 상기 3에서, 초대세포가 토끼 신장 유래인 것인 방법.
5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에서, 돌연변이 바이러스가 약독화 백시니아 바이러스인 방법.
6. 상기 5에서, 약독화 백시니아 바이러스가 LC16m8주인 방법.
7. 상기 5 또는 6중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 워킹 시드액을 동물세포에 접종·배양하고, 배양물로부터 바이러스액을 회수하는 것을 특징으로 하는 천연두 백신의 제조방법.
8. 상기 7에서, 워킹 시드 바이러스액의 MOI가 0.001∼5, 바람직하게는 0.1∼1이고, 동물세포 수가 1×105∼1×1012개, 바람직하게는 0.5×108∼3×108개인 제조방법.
9. 상기 7 또는 8에서, 동물세포가 초대세포인 제조방법.
10. 상기 9에서, 초대세포가 토끼 신장 유래 것인 제조방법.
11. 상기 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 수득된 천연두 생백신.
12. 상기 11에서, 복귀 돌연변이주 함유율이 3% 이하인 천연두 생백신.
발명의 효과
본 발명에 따라, MSP주의 함유량을 억제할 수 있는 약독화 백시니아 바이러스를 유효성분으로 하는 천연두 생백신이 제공된다. 본 발명의 천연두 생백신은 MSP주의 함유량이 낮게 억제되어 있으므로, 그 MSP주에 의한 부작용을 배제할 수 있다. 즉 인간에 투여되었을 때, 강한 피부반응이 일어나는 것을 방지할 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 따르면 MSP주를 저감시킨 백신 원액의 제조방법이 제공된다. 이러한 제조방법은 약독화 백시니아 바이러스로 이루어지는 백신 원액뿐만 아니라, 배양 중에 복귀 돌연변이주를 발생하기 쉬운 다른 바이러스로 이루어지는 백신 원액을 제조할 때에도 사용할 수 있다.
도 1은 LC16m8주 바이러스의 계대수와 바이러스액에 포함되는 MSP 함유량의 추이를 나타내는 도면이다.
도 2는 SCID 마우스 복강내 접종실험에 있어서, 바이러스 접종후의 생존곡선을 나타내는 도면이다.
도 3은 SCID 마우스 복강내 접종실험에 있어서, 바이러스 접종후의 체중의 변화를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 방법은 약독화 백시니아 바이러스의 마스터 시드액으로부터 동물세포를 사용해서 복귀 돌연변이주 함유율이 낮은 워킹 시드를 제조하고, 그 워킹 시드로부터 백신 원액을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명에서는 주로 약독의 백시니아 바이러스에 대해서 기술하지만, 백시니아 바이러스에 한정하지 않고, 어떤 종류의 방법, 예를 들면 유전자 재조합 기술, 저온 순화법, 이종세포 계대법, 자외선 조사법, 방사선 조사법 등에 의해 돌연변이시킨 바이러스, 혹은 자연적으로 돌연변이된 바이러스(이하, 이것들을 「돌연변이 바이러스」로 언급하기도 한다)로서, 배양 중에 용이하게 복귀 돌연변이주를 발생시키는 바이러스가 본 발명의 대상이 된다. 여기에서, 복귀 돌연변이주란 돌연변이 에 의해 획득한 성질의 일부 또는 전부가 소실되고, 돌연변이전의 바이러스가 가지는 성질의 일부 또는 전부를 재획득한 바이러스로 정의된다. 이러한 성질로서 예를 들면, 플라크 형성능, 플라크 사이즈, 폭(pock) 사이즈, 병원성, 증식성, 온도 감수성, 숙주 감수성, 조직 지향성, 피부 증식성, 신경독성 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 동물세포는 대상으로 하는 돌연변이 바이러스가 증식하는 세포라면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 백신 제조에 이용되고 있는 인간 폐, 인간 양막, 원숭이 신장, 토끼 신장, 개 신장, 닭 배아 유래의 동물세포가 사용된다. 동물 초대세포를 사용하는 경우에는, 원숭이 신장, 토끼 신장, 개 신장, 닭 배아 유래의 동물 초대세포가 바람직하다. 약독화 백시니아 바이러스를 증식시키는 경우에는 토끼 신장으로부터 제조한 초대 토끼 신장세포를 사용하는 것이 더 바람직하다. 동물세포를 제조할 때는, 일반적으로 사용되는 제조방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이하의 방법에 의해, 초대 토끼 신장세포의 부유액이 제조된다. 7일령의 SPF 포유 토끼에서 신장을 적출하여, 400mg 역가/L의 황산 스트렙토마이신 및 50mg 역가/L의 에리스로마이신을 포함하는 인산완충액(이하, 「PBS(-)/2ES」로 언급하기도 한다)으로 세정 후, 가위를 사용해서 1∼2mm 정도의 크기로 잘게 자른다. 재차 PBS(-)/2ES로 세정 후, 0.3% 디스파제, 0.5% 락트알부민 및 4.5% 송아지 혈청을 포함하는 행크스(Hank's) 평형 염류용액(이하, 「디스파제액」으로 언급하기도 한다)에 넣고, 4℃에서 하룻밤, 교반하면서 소화시킨다. 소화 후, 원심분리에 의해 디스파제액을 제거하고, 세포 침전물을 적당한 배지에 부유시켜서 토끼 신장 초대세포 부유액으로 한다. 이때, 메쉬를 사용해서 여과를 실시하 면 균일한 세포 부유액을 얻을 수 있다.
세포 배양에 사용하는 배지로는, 형상을 고려한 한천배지, 액체배지, 종류를 고려한 M-199, MEM, YMM-01, DMEM, RPMI, αMEM, 평형 염류용액 등이 사용되지만 세포나 배양목적, 혹은 배양단계에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 바람직하게는, 0.5% 락트알부민, 5% 소 태아 혈청, 5% 송아지 혈청을 포함하는 행크스 평형 염류 용액을 사용할 수 있다. 세포의 확장에 사용하는 배지(이하, 「증식배지」로 언급하기도 한다)로서는 혈청, 아미노산, 비타민, 당, 항생물질, pH 조정용 완충액 등을 첨가한 것이 사용된다.
세포가 충분하게 증식한 후에 바이러스를 접종한다. 증식배지를 흡인 제거하고, 0.01%의 이염화마그네슘, 0.014%의 이염화칼슘, 200mg 역가/L의 황산 스트렙토마이신 및 25mg 역가/L의 에리스로마이신을 포함하는 인산완충액(이하, 「PBS(-)/ES」로 언급하기도 한다)을 사용해서 세포를 세정한 후, 적당한 농도로 희석한 바이러스액을 첨가한다. 바이러스가 충분하게 흡착할 때까지 1∼2시간 30℃에서 배양을 실시한다. 그 후에 바이러스의 증식에 사용하는 배지(이하, 「유지배지」로 언급하기도 한다)를 추가하고, 배양을 실시한다. 유지배지로서는 무혈청 또는 저단백 농도의 배지가 사용된다. 바람직하게는 200mg 역가/L의 황산 스트렙토마이신, 25mg 역가/L의 에리스로마이신 및, 0.2% 젤라틴을 포함하는 199 배지가 사용된다. 배지의 pH는 6∼8로, 배양온도는 30℃∼39℃의 범위로 설정된다. 배지의 양, 첨가물 및 배양시간은 배양 스케일에 맞추어서 적당하게 조절된다.
본 발명의 실시예에서는 약독화 백시니아 바이러스의 마스터 시드로서, 하시 즈메 등에 의해 제조된 LC16m8주를 사용한다(Clinics and Virus Vol.3, No3, p229-235, 1975). LC16m8주는 임상분리주(Lister주)로부터 수득된 온도 변이주로, 40.8℃ 이상에서 증식할 수 없고, 계란 장뇨막에 소형의 폭(pock)을 형성하는 성질을 갖는다. 이것을 동물세포에서 계대를 반복하면 중간 사이즈의 플라크(MSP)를 형성하는 복귀 돌연변이주(MSP주)가 출현한다. LC16m8주의 마스터 시드는 치바현 혈청연구소에서 공급된 것이다.
워킹 시드액은 LC16m8주의 마스터 시드액을 적당 수의 군(1∼n: n은 정수)의 초대 토끼 신장세포에 접종ㆍ배양하는 공정, 각 군의 배양액의 일부를 RK-13 세포와 Vero E6 세포에 접종ㆍ배양하고, 10,000 PFU 이상의 바이러스를 접종하였을 때에, RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero E6 세포에 MSP주 유래의 플라크를 발생시키지 않는 각 군의 배양액을 선택ㆍ회수하는 공정에 의해 제조된다. 마스터 시드액을 초대 토끼 신장세포에 접종할 때는, 통상, 바이러스의 증식배양에 사용할 수 있는 바이러스 감염가 MOI=0.001∼0.3이 사용된다. 바람직하게, MOI는 0.003∼0.01의 범위이다. 마스터 시드액 중에 이미 MSP주가 혼재하는 경우에는, MSP주가 혼입하지 않는 범위의 MOI를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 마스터 시드에 10-5의 비율로 MSP주가 혼재할 때는, 배양용기에 접종되는 LC16m8주의 바이러스 양이 이론상 105 PFU보다 적어지도록 조절된다. 실제로는, 혼재하는 MSP주의 함유량에 따라서 세포 수를 올리거나 또는 접종 MOI를 내리는 방법이 채택된다.
토끼 신장의 초대세포 부유액을 배양용기(플레이트, 플라스크, 롤러병 등)에 뿌릴 때는, 1×105∼1×109개, 바람직하게는, 약 3∼6×106개의 세포가 사용된다. 적당 수의 군(1∼n)은 백신 원액의 제조 스케일에 따라서 결정된다.
더 구체적으로는, 이하의 방법이 채택된다. 증식배지에 제조한 초대 토끼 신장세포 부유액을 적당 수의 배양용기에 뿌리고, 세포가 단층 시트를 형성할 때까지 배양한다. 이것에 유지배지에서 희석한 마스터 바이러스 시드를 접종하고, 세포변성 효과가 충분하게 보여질 때까지 배양을 실시한 후, 동결융해를 실시한다. 각 군의 배양용기로부터 바이러스액을 소량 채취하고, MSP주의 검출시험을 실시한다. 각 군의 배양용기는 검출시험의 결과가 나올 때까지 -80℃에서 동결 보관된다.
MSP주의 검출시험에는 아프리카 녹색원숭이 신장 유래의 주화세포(Vero 세포)와 토끼 신장 유래의 주화세포(RK-13 세포)가 사용된다. LC16m8주는 RK-13 세포에서 소형의 플라크를 형성하지만, Vero 세포에서는 아주 작은 바늘상의 플라크 밖에 형성하지 않는다. 한편, LC16m8주의 복귀 돌연변이주(MSP주)는 Vero 세포 및 RK-13 세포에서 중간 사이즈의 플라크(MSP)를 형성한다. MSP주의 검출은 이 성질을 이용해서 이루어진다. 1% 비활성화 FBS를 포함하는 MEM 배지에서 적당히 희석한 각 군의 바이러스액을 단층 시트상의 Vero 세포 및 RK-13 세포에 접종한 후, 5% 비활성화 FBS 및 0.6% 아가로오스를 포함하는 MEM배지를 중층하여 배양한다. 각 군의 배양액은 플라크 분석에 바람직한 바이러스 양이 되도록 10∼5,000배, 바람직하게는 100∼2,000배로 희석된다. RK-13 세포를 사용해서 전체 바이러스 양을 산출하는 경우에는, 1,000∼100,000배로 희석된다. 10,000 PFU 이상의 바이러스를 접종하였 을 때에, RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero 세포에서 MSP주 유래의 플라크를 형성시키지 않는 각 군의 배양액을 회수한다. 각 군의 바이러스액에 대해서, Vero 세포와 RK-13 세포에 각각에 출현한 플라크 수로부터 전체 바이러스 양에 대한 MSP주의 함유율이 산출되고, 적절한 역가를 가지며, 또한 MSP주의 함유율을 저감시킨 배양액이 선택된다. MSP주의 전체 바이러스에 대한 함유율이 0.015% 이하, 바람직하게는 0.01% 이하의 바이러스액이 워킹 시드로서 백신 원액의 제조를 위해서 사용된다. 워킹 시드로서 선택된 각 군의 바이러스액은 배양 스케일에 따라서 풀링되는 경우도 있다.
이렇게 해서 수득된 워킹 시드가 백신 원액의 제조에 사용된다. 세포를 증식시키는 방법으로서 정치 배양법, 롤러병 배양법, 부유 배양법 등이 알려져 있다. 부유 배양법에는 세포를 부착시키기 위한 마이크로 캐리어가 사용되는 경우도 있다. 마이크로 캐리어는 사이즈, 형상, 밀도, 표면 하전 및 표면 코팅재질 등 타입이 서로 다른 여러 가지의 마이크로비드가 시판되고 있으므로, 그 중에서 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 예를 들면 사이토덱스, 바이오실론(날제 눈크 인터내셔널사), CELLYARD(펜탁스사) 등의 마이크로비드를 들 수 있지만, 세포의 종류나 사용 조건에 맞추어서 사용할 수 있다. 사이토덱스(Cytodex I, 아머샴 바이오 사이언스사)의 경우 그 사용량은 배양액 1L당 1∼10g, 바람직하게는 3∼5g이다.
세포로의 바이러스 접종은 MOI=0.001∼5의 범위로 가능하지만, MOI=0.1∼1로 접종하는 것이 바람직하다. 세포 및 바이러스를 증식시킬 때의 배양온도 및 배양기간은 세포의 종류, 바이러스 접종량, 배양 스케일ㆍ방법 등의 조합에 의해 조절된 다. 예를 들면 롤러병법에 의해 토끼 신장 초대세포에서 상기의 워킹 시드를 사용하는 경우에는 이하의 방법이 채택된다.
증식배지 중에 현탁한 토끼 신장 초대세포 부유액을 1∼2×108개/롤러병으로 뿌리고, 37℃, 4∼6일간 배양한다. 세포가 단층 시트를 형성하고 있는 것을 확인한 후에 배지를 흡인 제거하고, 세포를 PBS/ES로 세정한다. 여기에 유지배지에서 적당한 농도로 희석한 바이러스액(MOI=0.1∼1)을 첨가한다. 바이러스가 충분하게 흡착할 때까지 30℃, 셀 롤러 상에 1∼2시간 방치한다. 그 후에 유지배지를 추가하고, 30℃에서 배양을 실시한다. 세포변성 효과가 충분하게 확인될 때까지 배양을 실시한다. 이어서, 롤러병을 격렬하게 진탕하는 것에 의해, 바이러스 감염세포를 롤러병으로부터 박리하고, 이것을 회수한다. 저속원심(1,000∼3,000rpm, 15∼30분간) 또는 연속원심(12,000rpm, 100∼700mL/분)에 의해 세포와 배양액을 분리한 후, 상청액의 약 90%를 흡인에 의해 제거하고, 피펫팅에 의해 세포 침전물을 부유시킨다. 이것을 초음파 파쇄기에 걸거나, 또는 동결융해에 의해 세포를 파괴한 후, 원심분리(1,000∼3,000rpm, 15∼30분간)에 의해 세포와 상청액을 분리해 상청액을 회수하여 바이러스액으로 한다. 그 바이러스액을 사용해서 상기와 동일하게 배양을 반복할 수 있다. 이렇게 해서 수득되는 바이러스액은 백신 원액으로 사용된다. 이 백신 원액에 폴리소르베이트 80, 펩톤, 아미노산 및 소르비톨, 락토오스나 수크로오스 등의 당과 같은 안정제를 적당하게 선택해서 첨가하는 것에 의해 제제화가 이루어진다. 또, 부형제로서의 효과를 가지는 소르비톨, 락토오스, 수크로오스 등의 당을 첨가하였을 경우, 동결 건조제제로 제제화하는 것도 가능하다. 본 발명의 천연두 생백신에서는 백신 원액에 안정제로서 펩톤, 소르비톨을 첨가해서 최종 벌크를 제조한다. 세정 및 건열 감균한 무색 유리병, 바람직하게는 용량 2mL의 무색 유리병에, 최종 벌크를 바람직하게는 용량 2mL의 바이알인 경우에는 0.5mL을 충전하고, 동결건조하는 것에 의해 소분제품이 만들어진다. 이렇게 하여 수득되는 본 발명의 백신은 복귀 돌연변이주(MSP주)의 함유율이 3% 이하이고, 보다 안전한 백신으로 사용할 수 있다.
MSP주의 안전성에 대한 영향은 피부 증식성 실험이나, 소형 동물, 예를 들면 마우스를 사용한 증상의 변화를 보는 것에 의해 조사할 수 있다. 피부 증식성 실험에는 감수성이 강한 토끼를 사용하는 것이 일반적이다. 생후 12∼17주된 토끼의 등 둔부를 털을 제거하고, 적당하게 단계 희석한 백신 원액의 일정량을 피내 접종하고, 접종후 2∼5일째에 발생한 발적(발진)의 직경을 측정한다. 양성 대조군으로서 LC16m8주의 친주인 LO주, LC16mO주가 사용되고, 음성 대조군으로는 바이러스를 포함하지 않는 배지나 PBS를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 발적 직경이 10mm 이상의 것을 양성으로 판정하고, 각 검체의 50% 발적량(ErD50)을 Reed-Muench 법(쿠로카와 마사미 외, 1978, Bioassay, Kindai Shuppan Co., Ltd., p. 154∼p158)을 사용해서 산출하고, 50% 발적량의 비교에 의해 안전성이 평가된다.
마우스를 사용해서 MSP주의 안전성에 대한 영향을 평가하는 경우에는, 생후 3∼5일령의 마우스를 사용할 수 있다. 더 구체적으로는, 본 발명에서 얻은 백신 원 액의 일정량이 마우스의 뇌내에 접종된다. 양성 대조군 및 음성 대조군은 상기와 같은 것이 사용된다. 접종후 21일간 생존유무를 관찰하고, 관찰 21일째의 생존율과 평균 생존일수(일)을 산출하고, 그 값을 사용해서 평가된다.
또, 생후 5∼7주령의 면역부전 마우스(이하, 「SCID 마우스」로 언급하기도 한다)를 사용할 수도 있다. 더 구체적으로는, 본 발명에서 얻은 백신 원액의 일정량이 마우스의 복강내에 접종된다. 접종 후 25∼30일간, 털 상태나 체중의 변화, 마비, 염증발생, 행동이상, 생존유무를 관찰하고, 각각의 증상을 스코어화하고, 스코어값의 합계로 MSP주의 안전성에 대한 영향이 평가된다. 양성 대조군 및 음성 대조군은 상기와 같은 것이 사용된다.
이하, 실시예에 따라서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기의 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
참고예: 계대에 의한 복귀 돌연변이주(
MSP
주) 출현의 확인
(1) 한계 희석법에 의한 분리의 시도
초대 토끼 신장세포를 T25 플라스크에 단층이 되도록 제조하고, 고도로 희석한 마스터 바이러스 시드를 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 충분한 CPE(세포변성 효과)가 확인될 때까지 배양을 실시하고, -80℃에서 동결하였다. 동결융해를 3회 반복한 후, 수득된 바이러스액의 MSP주의 함량을 측정하였다. MSP주의 함량이 검출한계를 하회한 바이러스액에 대해서, 추가로 새롭게 T25에서 제조한 초대 토끼 신 장세포에 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 3일간 배양을 실시하고, 충분한 CPE가 확인된 후에 -80℃에서 동결하였다. 동결융해를 3회 반복한 후, 수득된 바이러스액을 추가로 새롭게 T25에서 제조한 초대 토끼 신장세포에 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 상기와 동일한 작업을 추가로 3회 반복하고, 수득된 바이러스액의 MSP주의 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이 결과로부터 마스터 바이러스 시드로부터 한계 희석법에 의해 수득된 LC16m8주 바이러스는 5대 계대를 실시하는 것에 의해 MSP주가 검출한계보다도 상회하는 것이 출현하는 것임이 확인되었다.
(2) 플라크 클로닝에 의한 분리의 시도
초대 토끼 신장세포를 6웰 플레이트에 단층이 되도록 제조하고, 적절하게 희석한 마스터 바이러스 시드를 접종하고, 30℃에서 배양하였다. MSP를 볼 수 없는 클론을 회수하고, T25 플라스크에서 제조한 초대 토끼 신장세포에 접종하고, 30℃ 에서 배양하였다. 3일간 배양을 실시하고, 충분한 CPE가 확인된 후에 -80℃에서 동결하였다. 동결융해를 3회 반복한 후 수득된 바이러스액을 추가로 새롭게 T25에서 제조한 초대 토끼 신장세포에 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 상기와 동일한 작업을 추가로 4회 반복하고, 수득된 바이러스액의 MSP주 역가를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 이 결과로부터 마스터 바이러스 시드로부터 플라크 클로닝에 의해 수득된 LC16m8주 바이러스는 5대 계대를 실시하는 것에 의해 MSP가 검출한계보다도 상회하는 것이 출현하는 것임이 확인되었다.
실시예 1
1계대 워킹 시드액의 제조
(1) 6웰 플레이트에 의한 제조
7일령의 SPF 토끼에서 무균적으로 신장을 적출하고, 멸균한 PBS/2ES로 세정한 후, 세절해서 디스파제액에 넣었다. 4℃에서 교반시키면서 하룻밤 소화시킨 후에, 재차 PBS/2ES로 세정하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하고, 증식배지에 부유시킨 것을 초대 토끼 신장세포 부유액으로 하였다. 이것을 24웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 세포가 단층 시트를 형성할 때까지 배양하였다. 마스터 바이러스 시드를 유지배지로 희석하고, 각 웰에 MOI=0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001이 되도록 바이러스를 접종하였다. 30℃에서 배양을 실시하고, 세포변성 효과가 충분하게 보여질 때까지 배양을 실시하였다. 그 후에 -80℃의 냉동고에서 동결하고, 충분하게 동결하고 있는 것을 확인한 후에 유수중에서 융해하였다. 이 동결로부터 융해까지를 추가로 2회 반복하였다. 각 웰로부터 바이러스액을 소량 채취하고, MSP주의 검출시험을 수행하였다. 시험의 결과가 나올 때까지 24웰 플레이트는 재차 -80℃ 냉동고에서 동결보관하였다.
MSP주의 검출시험은 우선, 6웰 플레이트에 Vero E6 세포의 단층 시트를 형성시키고, 1×102, 3×102, 1×103으로 희석한 개별 검체의 바이러스액을 접종하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 1시간 흡착시간을 둔 후에 5% 비활성화 FBS 및 0.6% 아가로오스를 포함하는 MEM을 중층화하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 2일간 배양하였다. 또, 0.0025% 뉴트럴 레드, 1% 비활성화 FBS 및 0.6% 아가로오스를 포함하는 MEM을 중층화하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 하룻밤 배양하였다. 판정은 플라크 수의 유무에 따라서 실시하였다. 어느 쪽의 희석에서도 플라크의 출현을 볼 수 없었던 개별 검체를 저 MSP주 함유 개별 검체로 선택하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 선택된 개별 검체를 융해 후에 풀링하고, 1계대 워킹 시드액으로 하였다.
수득된 1계대 워킹 시드액의 전체 바이러스 역가를 RK-13 세포를 사용해서 산출하였다. 6웰 플레이트에 RK-13 세포의 단층 시트를 형성시키고, 1×104, 1×105, 1×106으로 희석한 1계대 워킹 시드의 바이러스액을 접종하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 1시간 흡착시간을 둔 후에 5% 비활성화 FBS 및 0.6% 아가로오스를 포함하는 MEM을 중층화하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 2일간 배양하였다. 또, 0.0025% 뉴트럴 레드, 1% 비활성화 FBS 및 0.6% 아가로오스를 포함하는 MEM을 중층화하고, 35℃의 5% 탄산가스 부화기에서 하룻밤 배양하였다. 플라크의 수를 세고, 희석배수를 고려하여, 역가의 값을 산출하였다. MSP주의 함유율은 전체 바이러스 역가에 대한 MSP주 역가의 비율(%)로 산출하였다.
(2) T25 플라스크에 의한 제조
실시예 1-(1)과 같은 수법으로 초대 토끼 신장세포 부유액을 제조하였다. 이것을 T25 플라스크에 뿌리고, 37℃에서 세포가 단층 시트를 형성할 때까지 배양하였다. 마스터 바이러스 시드를 유지배지에서 희석하고, 각 플라스크에 MOI=0.01, 0.003이 되도록 바이러스를 접종하였다. 30℃에서 배양을 실시하고, 세포변성 효과가 충분하게 보여질 때까지 배양을 실시하였다. 그 후에 -80℃의 냉동고에서 동결하고, 충분하게 동결하고 있는 것을 확인한 후에 유수중에서 융해하였다. 이 동결에서 융해까지를 추가로 2회 반복하였다. 각 플라스크로부터 바이러스액을 소량 채취하고, MSP 검출시험을 수행하였다. 시험결과가 나올 때까지 T25 플라스크는 재차 -80℃ 냉동고에서 동결보관하였다.
실시예 1-(1)과 같은 수법으로 MSP주의 검출시험을 실시하고, 어느 쪽의 희석에서도 플라크의 출현을 볼 수 없는 개별 검체를 저 MSP주 함유 개별 검체로 선택하였다. 선택된 개별 검체를 융해 후에 풀링하고, 원심분리에 의해 상청액을 회수한 것을 1계대 워킹 시드액으로 하였다. 수득된 1계대 워킹 시드액의 전체 바이러스 역가, 및 MSP주의 함유율을 실시예 1-(1) 과 동일하게 하여 산출하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 2
2계대 워킹 시드액의 제조
(1) T150 플라스크에 의한 제조
실시예 1-(1)과 같은 수법으로 얻은 초대 토끼 신장세포 부유액을 T150 플라스크에 뿌리고, 37℃에서 4일간 배양하였다. 세포가 단층 시트를 형성하고 있는 것을 확인 후에 증식배지를 흡인제거하고, PBS/ES로 세정한 후, 이것에, 실시예 1-(1)에서 수득된 1계대 워킹 시드액을 유지배지에서 MOI=0.1, 0.3, 1.0이 되도록 희석하여 첨가하였다. 바이러스가 충분하게 흡착할 때까지 1∼2시간 30℃에서 배양을 실시하였다. 그 후에 유지배지를 추가하고, 30℃에서 세포변성 효과가 충분하게 확인될 때까지 배양(3일간)을 실시하였다.
용기를 격렬하게 진탕하는 것에 의해, 바이러스에 감염된 세포를 용기로부터 박리하여 이것을 회수하였다. 원심분리(1,200rpm, 15분간)에 의해 일단 상청액을 제거하고, 약 10분의 1의 상청액을 되돌려서 세포 침전물을 재부유시켰다. 그 후에 -80℃의 냉동고에서 동결하고, 충분하게 동결하고 있는 것을 확인한 후에 유수중에서 융해하였다. 이 동결에서 융해까지를 추가로 2회 반복하였다. 융해후, 원심분리에 의해 상청액을 회수한 것을 2계대 워킹 시드액으로 하였다. 이때의 바이러스 역가 및 MSP주의 함유율을 표 5에 나타내었다.
(2) 롤러병에 의한 제조
실시예 1-(1)과 같은 수법으로 얻은 초대 토끼 신장세포 부유액을 롤러병에 뿌리고, 37℃에서 5일간 배양하였다. 세포가 단층 시트를 형성하고 있는 것을 확인후에 증식배지를 흡인제거하고, PBS/ES로 세정한 후, 이것에, 실시예 1-(2)에서 수득된 1계대 워킹 시드를 유지배지에서 MOI=0.1, 0.3, 1.0이 되도록 희석하여 첨가하였다. 바이러스가 충분하게 흡착될 때까지 1∼2시간 30℃에서 배양을 실시하였다. 그 후에 유지배지를 추가하고, 30℃에서 세포변성 효과가 충분하게 확인될 때까지 배양(3일간)을 실시하였다.
용기를 격렬하게 진탕하는 것에 의해, 바이러스에 감염한 세포를 용기로부터 박리하고, 이것을 회수하였다. 원심분리(3,000rpm, 15분간)에 의해 일단 상청액을 제거하고, 약 10분의 1의 상청액을 되돌려서 세포 침전물을 재부유시켰다. 그 후에 -80℃의 냉동고에서 동결하고, 충분하게 동결된 것을 확인한 후에 유수중에서 융해하였다. 이 동결에서 융해까지를 추가로 2회 반복하였다. 융해 후, 원심분리에 의해 상청액을 회수한 것을 2계대 워킹 시드액으로 하였다. 이 때의 바이러스 역가 및 MSP주의 함유율을 표 6에 나타내었다.
실시예
3
백신 원액의 제조
실시예 1-(1)과 같은 수법으로 얻은 초대 토끼 신장세포 부유액을 롤러병에 뿌리고 37℃에서 5일간 배양하였다. 세포가 단층 시트를 형성하고 있는 것을 확인후에 증식배지를 흡인제거하고, PBS/ES로 세정한 후, 이것에, 실시예 2-(1) 또는 실시예 2-(2)에서 수득된 2계대 워킹 시드액을 유지배지에서 MOI=0.1, 0.3, 1.0이 되도록 희석하여 첨가하였다. 바이러스가 충분하게 흡착될 때까지 1∼2시간 30℃에서 배양을 실시하였다. 그 후에 유지배지를 추가하고, 30℃에서 세포변성 효과가 충분하게 확인될 때까지 배양(3일간)을 실시하였다.
용기를 격렬하게 진탕하는 것에 의해, 바이러스에 감염한 세포를 용기로부터 박리하고 이것을 회수하였다. 원심분리(3,000rpm, 15분간)에 의해 일단 상청액을 제거하고, 약 10분의 1의 상청액을 되돌려서 세포 침전물을 재부유시켰다. 그 후에 -80℃의 냉동고에서 동결하고, 충분하게 동결된 것을 확인한 후에 유수중에서 융해하였다. 이 동결에서 융해까지를 추가로 2회 반복하였다. 융해후, 원심분리에 의해 상청액을 회수한 것을 백신 원액으로 하였다. 이 때의 바이러스 역가 및 MSP주의 함유율을 표 7에 나타내었다.
실시예
4
MSP
주의 안전성에 대한 영향
(1) 토끼 피부 증식성 실험
생후 13주(체중 2.5∼3.1kg)의 토끼(일본 백색종(JW), 수컷)의 등 둔부를 털을 제거하고, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105 PFU/mL이 되도록 유지배지에서 10배 단계 희석한 실험 검체(MSP함량: 0.001%, 0.3%, 2.1%, 3.2%, 10.8%)를 0.1mL씩 피내 접종하였다. 접종은 각 희석배율의 바이러스액에 대해서 두 부위/토끼로 3마리씩 실시하였다. 접종 후 3일째에 발생한 발적(발진)의 직경을 측정하고, 발적 직경이 10mm 이상인 것을 양성으로 판정하였다. 각 검체의 50% 발적량(ErD50)을, Reed-Muench법을 사용해서 산출하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다. ErD50 값(ErD50=1On)에 있어서 Savege 검정(순위 검정)을 사용해서 해석을 실시하였다. 그 결과, 0.001∼3.2% MSP주 함유 바이러스액 사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
(2) SCID 마우스 접종실험
생후 6주령의 SCID 마우스(암컷, C.B-17/Icr Crj-scid/scid)를 1군 5마리로 하여 유지배지에서 희석해서 107.3 PFU/mL 또는 105.6 PFU/mL로 제조한 실험 검체(MSP함량: 0.009%, 3.2%, 10.8%)를 0.5mL씩 복강내 접종하였다. 접종후 28일간 관찰하고, 관찰 28일째에 있어서의 생존률 및 평균 생존기간(일)을 산출하였다. 관찰기간 동안, 표 9에 나타내는 스코어 기준을 사용해서 각 개체의 증상을 평가하고, 각 관찰일에 있어서의 검체 접종군별로 스코어 합계를 산출하였다. 또, 관찰 6일째로부터 3일(일부는 4일) 간격으로 체중을 측정하고, 각 측정일의 검체 접종군별로 체중평균을 산출하고, 측정 개시일(관찰 6일째)의 평균값을 기준으로 하는 변화율을 산출하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
본 발명에 의해 복귀 돌연변이주 함유율을 저하시킨 보다 안전한 천연두 생백신을 제조할 수 있다.
Claims (12)
- (1) 약독화 백시니아 바이러스 LC16m8주 함유액을 1∼n군(n은 정수)의 동물세포에 접종ㆍ배양하는 단계;(2) 각 군의 배양액의 일부를 희석하고, 상기 희석액을 RK-13 세포와 Vero 세포에 접종ㆍ배양하는 단계;(3) RK-13 세포에 플라크를 발생시키고, Vero 세포에는 플라크를 발생시키지 않는 각 군의 배양액을 선택ㆍ회수하는 단계를 포함하는,약독화 백시니아 바이러스 LC16m8주를 유효성분으로 함유하는 백신의 워킹 시드액을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 동물세포가 초대세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 초대세포가 토끼 신장 유래인 것인 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (2)의 희석액 중 바이러스 함량이 1×104 PFU 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 동물세포가 초대세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 초대세포가 토끼 신장 유래인 것인 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득한 워킹 시드액을 동물세포에 접종ㆍ배양하고, 배양물로부터 바이러스액을 회수하는 것을 포함하는, 천연두 백신의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 워킹 시드액이 MOI 0.001∼5의 농도로 접종되고, 동물세포 수가 1×105∼1×1012개인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제8항에 있어서, 워킹 시드액이 MOI 0.1∼1의 농도로 접종되고, 동물세포 수가 0.5×108∼3×108개인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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