JP2022520401A - ウイルスの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、具体的には、培地中の溶存酸素レベルを変えることにより、固定床バイオリアクターにおける宿主細胞からのウイルス、ウイルス粒子又はウイルスベクターの収率を増加させる方法に関する。【選択図】図３

Description

関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年２月１５日出願の米国仮出願第６２／８０６，２７７号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。

本発明は、ワクチン及びウイルスベクターの製造のためにウイルス及びウイルスベクターを増殖させる方法に関する。特に、本発明は、固定床バイオリアクターにおける宿主細胞からのウイルス収率を増加させるための具体的な方法に関する。

ワクチン及び他の治療薬に対する増え続ける需要を満たすために、ウイルス及びウイルスベクターの迅速な製造を可能にする堅牢な技術が不可欠である。また、Ｖｅｒｏ細胞や他の哺乳動物細胞プラットフォーム、鳥類細胞プラットフォーム、昆虫細胞技術プラットフォーム等の多用途宿主細胞技術プラットフォームの開発には、宿主細胞からのウイルス収量を向上させる技術もワクチンプロセスや製造の開発を加速させる上で重要な役割を果たしている。本発明は、ウイルス製造の方法を改善するニーズを満たすものである。

本発明は、ウイルス収量を増加させるプロセスを提供する。一実施形態において、バイオリアクターにおいてウイルスを製造する方法が開示されている。本方法は、１）溶存酸素（ｄＯ_２）、ｐＨ、及び温度等のパラメータが制御可能な環境において、バイオリアクター中に宿主細胞を提供する工程、２）一定の初期１００%ｄＯ_２、ｐＨ７．４、及び３７℃の温度で細胞を増殖させる工程、３）ｐＨ及び温度を一定に保ちながら、ｄＯ_２レベルを初期ｄＯ_２レベルの２０～５０％に減少させる工程、４）ｄＯ_２を減少させた後、少なくとも１つのウイルスで細胞を８～２４時間感染させ、宿主細胞を２０～５０％のｄＯ_２レベル、ｐＨ７．４及び３７℃の温度でウイルスと共にインキュベートする工程、及び５）ウイルスを回収する工程、を含む。一実施形態において、宿主細胞は固定依存性であり、固定するためにマイクロキャリア及び／又は固定床を必要とする接着細胞である。好ましい実施形態において、Ｖｅｒｏ細胞は、固定床バイオリアクターにおいて、宿主細胞として用いられる。

本発明の好ましい実施形態において、ｄＯ_２は、宿主細胞をウイルスで感染させる前、１２時間で少なくとも５０％減少する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞が最大細胞密度まで増殖された後にウイルスに感染される。本発明のさらに別の実施形態において、ｄＯ_２は、宿主細胞が最大細胞密度に達した後に減少する。

図１Ａは、固定床バイオリアクターにおいて使用されるマイクロキャリアストリップを示しており、ストリップ当たり約１１．２ｃｍ^２の３次元領域の１３個のマイクロキャリアストリップが、５ｍＬの培地中に示される。 図１Ｂは、床当たり３，５００個までのストリップを保持するために使用することができるバイオリアクターの断面図を示す。 図１Ｃは、バイオリアクターの異なる部分を断面図で示す。 図２は、ｄＯ_２、ｐＨ、温度、及びバイオマスパラメータのグラフである。ｄＯ_２、ｐＨ、及び温度を一定として設定し、バイオマスプローブ（細胞増殖の増加を測定する）に関連する導電率が５５ｍＳ／ｃｍに達したときに感染が起こった。 図３は、ｄＯ_２、ｐＨ、温度、及びバイオマスパラメータのグラフである。ｐＨ及び温度を定数として設定したが、ｄＯ_２は、感染の前１２時間で４５～５０％に減少し、感染の間一定のままであった。感染時に、バイオマスプローブに関連する導電率は、８０ｍＳ／ｃｍに達した。 図４は、ｄＯ_２、ｐＨ、温度、及びバイオマスパラメータのグラフである。ｄＯ_２、ｐＨ及び温度を一定として設定した。感染時に、バイオマスプローブに関連する導電率は、１１０ｍＳ／ｃｍに達した。

本発明は、バイオリアクターにおけるウイルスの製造を増加させるための方法を提供する。

以下は、本出願の詳細な説明に適用される。

単数名詞、例えば「１つ」又は「その」というとき、不定冠詞又は定冠詞が使用される場合、他の何かが具体的に述べられていない限り、その名詞の複数形を含む。本発明の文脈において、「約」又は「おおよそ」という用語は、当業者が当該特徴の技術的効果が確実に理解される正確度を示す。この用語は、典型的には、示された数値から±１０％、好ましくは、±５％の偏差を示す。

本発明は、ａ）一定の初期ｄＯ_２レベル、ｐＨ、及び温度で宿主細胞を増殖させる工程、ｃ）感染前の８～２４時間に、ｄＯ_２を初期レベルの２０～５０％に減少させる工程、ｄ）細胞を少なくとも１つのウイルスで感染させる工程、及びｅ）ウイルスを回収する工程を含む、バイオリアクターにおいて、ウイルスを製造する方法に関する。この方法によって製造されるウイルスの量は、ｄＯ_２を含む全てのパラメータがプロセス全体を通して一定に保たれる従来の方法で製造される量よりも大幅に多い。

本明細書で使用される「大規模」製造という用語は、少なくとも２００リットル、好ましくは少なくとも５００リットル、最も好ましくは約１０００リットルの最小培養容積での製造を意味する。

本明細書中で使用される「バイオリアクター」という用語は、制御された条件下でのウイルス及びベクターの増殖のような生物学的プロセスが実施される、生物学的に活性な環境を支持するデバイスをいう。バイオリアクターは、研究室で使用されるような小規模培養物、パイロット植物又は商業規模でワクチンウイルス、抗原、及びベクターのような生物学的高分子を製造及び回収するための容器又はバットを含む大規模バイオリアクターのために設計することができる。バイオリアクターは、懸濁細胞及び接着細胞の両方を繁殖させるのに使用される。バイオリアクターは、酸素／ｄＯ_２、窒素、二酸化炭素、及びｐＨレベルを調節することができる制御された環境である。ｄＯ_２、ｐＨ、温度、及びバイオマス等のパラメータを定期的な間隔で測定する。バイオリアクターの「容量」は、５ｍＬ～５０００ｍＬの範囲である。容量は、約２ｍＬ～約１０ｍＬ、約５ｍＬ～約５０ｍＬ、約２５ｍＬ～約１００ｍＬ、約７５ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約６００ｍＬ～約１０００ｍＬである。好ましい実施形態において、容量は５０ｍＬ又は８０ｍＬであってよい。別の好ましい実施形態において、容量は７００ｍＬ～８００ｍＬであってよい。

「固定床バイオリアクター」は、細胞接着及び増殖を促進する充填材料の固定床を含むタイプのバイオリアクターを意味する。固定床バイオリアクターは、低い剪断力で高い細胞密度を潅流する能力のために、小規模と大規模の両方でウイルスワクチン製品を製造するのに使用されてきた。固定床バイオリアクターは、市販のｉＣＥＬＬｉｓシステム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等の使い捨てバイオリアクターであってもよい。ｉＣＥＬＬｉｓシステムプラットフォームは、無菌操作を必要としない、堅牢な単一の閉鎖システムにおいて、医療グレードのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）織繊維から構成されるキャリアを含む、新規な固定床技術を提供する。さらに、このシステムは、温度、Ｏ_２、ｐＨ、二酸化炭素（ＣＯ_２）、及び窒素（Ｎ_２）の制御による「ウォーターフォール」技術を使用する高速のガス交換を組み込み、さらに、低い細胞剪断応力及び均一に分布した培地循環を生じる磁性インペラの使用を組み込む。ほとんどのウイルスについて、ｉＣＥＬＬｉｓシステムからの製造力価は、従来の接着細胞フラットストックフラスコと比較して大幅に増加する。ｉＣＥＬＬｉｓ技術は、増殖面積が６６～５００ｍ²のｉＣＥＬＬｉｓ５００等の製造規模や、増殖面積が０．５ｍ～４ｍ²と製造規模の間であるｉＣＥＬＬｉｓナノ等の小規模で使用される。小規模システムで開発されたプロセスは、製造規模のものまでスケールアップすることができる。

固定床バイオリアクターは、ｐＨ、温度、溶存酸素、及び接着細胞密度を示すバイオマスを測定及びモニターするセンサーを有する。固定床バイオリアクターはまた、酸素又は窒素の添加を可能にする異なるポート、培地交換ポート、ｐＨを調節するための水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び／又はＣＯ_２の添加のためのポートを有する。培地のｄＯ_２は、Ｏ_２又はＮ_２の添加によって変更することができる。好ましくは、ｄＯ_２レベルは、バイオリアクターのヘッドスペースにＮ_２を注入し、同時に撹拌し、ｄＯ_２をモニターすることによって、制御された方法で減少させることができる。

開示された方法の宿主細胞は、固定依存性細胞であってもよく、又は固定依存性細胞株となるように適合されてもよい。開示された方法の宿主細胞は、バイオリアクター中で懸濁されていてもよいマイクロキャリア上、又はマイクロキャリアストリップ上で培養される。好ましくは、宿主細胞は、固定床バイオリアクターの固定床においてマイクロキャリアストリップ上で培養される。各マイクロキャリアストリップは、１ストリップ当たり１．２５ｃｍ²の２次元領域及び１１．２ｃｍ²の３次元領域を提供することができる。約１３のマイクロキャリアストリップは、１つのＴ-１５０フラットストックフラスコによって提供される増殖面積にほぼ等しい１４５．６ｃｍ²の凡その面積を提供する。好ましくは、固定床バイオリアクターは、市販のｉＣＥＬＬＩＳナノ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｉＣＥＬＬｉｓ５００バイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、又はＵｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ固定床バイオリアクター（Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ ＳＡ）である。固定床は、ｉＣＥＬＬｉｓナノ等の８００ｍＬ固定床バイオリアクター中で最大４０，０００ｃｍ²、及びｉＣＥＬＬｉｓ５００等の２５Ｌ固定床バイオリアクター中で５，０００，０００ｃｍ²までを提供することができる（図１Ａ～Ｃ、表１）。固定床の高さは、２０ｍｍから１０ｍｍの範囲であり、８００ｍＬ固定床バイオリアクターにおいて５３００ｃｍ²から４０，０００ｃｍ²、２５Ｌ固定床バイオリアクターにおいて６６００００ｃｍ²から５，０００，０００ｃｍ²の増殖面積を与える。

宿主細胞は、２０００～２０，０００細胞／ｃｍ²の範囲の播種密度を用いて培養することができる。播種密度は、宿主細胞のタイプ、バイオリアクターの体積、固定床バイオリアクターにおける固定床の高さ等に基づいて調節される。プロセスに最適な播種密度を選択することは、当業者の知識の範囲内である。細胞の増殖は、バイオリアクターの固定床内のバイオマスセンサーを使用して、バイオマスを測定することによって測定することができる。導電率により接着細胞の質量を示すバイオマスを利用して、宿主細胞の全体的な増殖及び感染後のウイルスの繁殖による細胞質量の低下をモニターする。バイオマスセンサーによってモニターされる、より高い導電率によって示される、より高いバイオマスは、細胞のより速い増殖速度を示す。バイオマスは、培養開始時の低バイオマスでの５ｍＳ／ｃｍの低導電率から、細胞が最大増殖に達した場合の最大バイオマスでの約１１０±５０ｍＳ／ｃｍまでの範囲となる。

本明細書中で使用される「培養培地」又は「培地」は、バイオリアクター中で宿主細胞を培養するために使用される液体をいう。本開示の手順において使用される培地は、宿主細胞の増殖を支持する様々な成分、これらに限られるものではないが、アミノ酸、ビタミン、有機及び無機塩、炭水化物を含む。培地は、無血清培地であってもよく、これは動物血清を含まないように調製された培地である。使用される場合、無血清培地は、これらに限られるものではないが、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ、ＶＰ-ＳＦＭ、ＶＰ-ＳＦＭ ＡＧＴ、ＨｙＱ ＰＦ-Ｖｅｒｏ、ＭＰ-Ｖｅｒｏから選択される。培養培地はまた、動物質を含まない培地であってもよく、すなわち、動物起源の生成物を全く有さない。培養培地はまた、タンパク質を含まない培地であってもよく、すなわち、培地は、タンパク質を含まないように調製される。無血清培地又は無タンパク質培地は、血清又はタンパク質なしで調製されてもよいが、宿主細胞に由来する細胞タンパク質、及び任意で無血清培地又は無タンパク質培地に特異的に添加されるタンパク質を含んでいてもよい。

培養のためのｐＨは、宿主細胞のｐＨ安定性に依存して、例えば、６．５～７．５の間である。好ましくは、細胞は、ｐＨ７．４で培養される。宿主細胞は、哺乳動物細胞については２０～４０℃、特に３０～４０℃、好ましくは３７℃の温度で培養することができる。

本開示の方法において、ウイルスの培養に使用される宿主細胞又は宿主細胞株又は細胞は、ウイルス抗原、ウイルスベクター、又はウイルス製造の製造に適した任意の真核細胞である。好ましくは、宿主細胞は、「接着細胞」又は「固定依存性細胞」である。接着細胞は、培養条件下で表面に接着する細胞であり、増殖のために固定が必要であり、それらは固定依存性細胞とも呼ばれる。開示の手順に適した接着細胞としては、これらに限られるものではないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ネズミ細胞、ヒト細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、Ｗｌ－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＮＴＣＴ細胞、及びＰｅｒＣ６細胞、３Ｔ３細胞、又はこれらの組み合わせ、又は改変が挙げられるが。好ましい接着細胞は、ＰＥＴストリップ等のキャリア上で増殖させることができる固定依存性細胞であるが、接着細胞として増殖するように適合させることができる懸濁細胞も使用することができる。より好ましくは、本開示の固定依存性細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。本開示のプロセスにおける使用に適切な接着性宿主細胞を選択することは、当業者の知識の範囲内である。

本開示のウイルスは、ウイルス、ウイルス抗原、又はウイルスベクター、又はそれらの組み合わせもしくは改変である。ウイルスは、これらに限られるものではないが、血管性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス及び組換えワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、及びこれらのキメラ、同様に、ライノウイルス及びレオウイルスの群から選択される、全ウイルス、又はウイルス抗原である。

本開示の一実施形態において、ウイルスは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、目的の細胞にパッセンジャー核酸配列を移入するために使用されるウイルスである。ウイルスベクターは、組換えタンパク質を誘導するために使用されるウイルス発現ベクターであってもよい。好ましくは、ウイルスベクターは、改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＶＳＶ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスであってもよい。より好ましくは、本発明のウイルスベクターは、ＶＳＶベクターである。ウイルスベクターによって発現される組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、治療用組換えタンパク質、又はそれらの組み合わせである。より好ましくは、ウイルスベクターによって製造される組換えタンパク質はウイルスタンパク質である。

好ましくは、本発明のウイルスは、ＶＳＶベクターである。ラブドウイルス系列の一員であるＶＳＶは、マイナス鎖ＲＮＡゲノムをもつエンベロープウイルスであり、生きている家畜に自己制限疾患を引き起こす。弱毒化されたＶＳＶは、ヒトにおいて非病原性であり、動物においてほとんど非毒性であり、目的の連続的な哺乳動物細胞株において強い増殖を示し、複製の間にＤＮＡ中間体を欠き、強い細胞性及び体液性免疫応答を誘発し、複数部位における導入遺伝子の挿入を可能にするゲノム構造を示すので、望ましいウイルスベクターである（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ及びＳｅｂａｓｔｉａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１８、１５３：１-９、Ｃｌａｒｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６、３４：６５９７-６６０９）。

本明細書中で使用される「感染」又は「ウイルス感染」とは、宿主細胞内へのウイルスの侵入及びその後の細胞内でのウイルスの複製を意味する。本開示の方法における宿主細胞の感染は、細胞が特定のバイオマスに到達したときに行うことができる。好ましくは、細胞が高いバイオマスによって示される高い増殖速度、及びバイオマスセンサーによって測定される高い導電率に到達したときに感染される。細胞は、導電率が５０ｍＳ／ｃｍ～約１２０±２０ｍＳ／ｃｍの範囲である場合、目的のウイルスに感染される。細胞は、細胞が１１０±１０ｍＳ／ｃｍの導電率によって示される高い増殖に達したときに感染するのが好ましい。宿主細胞は、少なくとも１つのウイルス粒子に感染する。本明細書中で使用される場合、感染多重度（ＭＯＩ）は、各細胞に感染するウイルス粒子の平均数である。ウイルスによる宿主細胞の感染は、約０．０００１～１０、好ましくは０．００１～０．５、最も好ましくは０．０５のＭＯＩで行うことができる。十分な感染に必要なウイルス粒子の数は、当業者の知識の範囲内である。

本開示の方法の宿主細胞は、１００％の初期ｄＯ_２で培養される。ｄＯ_２は、感染前に９０％のレベルまで、２０％のレベルまで減少させてもよい。ｄＯ_２は、約８０％～約６０％、約７０％～約４０％、約５０％～約１５％減少させることができる。好ましくは、ｄＯ_２は、感染前に約５０％から約２０％まで減少される。より好ましくは、レベルは、感染前に約２０％まで減少する。

ｄＯ_２は、感染の２～２４時間前の範囲で一度に減少し始め、感染プロセス全体を通して、かつウイルスの回収を通して、このレベルに保たれる。ｄＯ_２は、感染前、約２時間～約１０時間、約５時間～約１５時間、約１０時間～約２０時間、及び１８時間～約２４時間に減少し始める。好ましくは、ｄＯ_２は、感染前、８時間～約１２時間の範囲の時間で減少し始める。

本開示のｄＯ_２の減少は、バイオマスセンサによって測定される導電率が、約５０ｍＳ／ｃｍ～約９０ｍＳ／ｃｍの範囲である場合に始まる。本開示のｄＯ_２の減少は、導電率が、約４０ｍＳ／ｃｍ～約６０ｍＳ／ｃｍ、約５０ｍＳ／ｃｍ～約８０ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ～約９０ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ～約１００ｍＳ／ｃｍの範囲である場合に始まる。好ましくは、本開示のｄＯ_２の減少は、導電率が約７０ｍＳ／ｃｍ～約９０ｍＳ／ｃｍの範囲である場合に始まる。

本明細書で使用される「回収」又は「ウイルス回収」は、バイオリアクター中の宿主細胞から未浄化培養培地を集めることによるウイルスの収集を指す。ウイルスの回収は、感染後２～５日、又はｄＯ_２の減少後３～６日に行うことができる。好ましくは、ウイルスの回収は、感染の２日後に行われる。ウイルスによっては、回収前に宿主細胞溶解の追加工程が必要となる。

本開示のウイルスは、これらに限られるものではないが、プラークアッセイ、終点希釈アッセイ、赤血球凝集アッセイ、ビシンコニン酸アッセイ、又は電子顕微鏡を含む方法によって定量される。好ましくは、ウイルスは、プラークアッセイ法によって定量される。本明細書中で使用される場合、プラークアッセイ法は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）の測定に基づいて、感染性ウイルス粒子の数を測定する方法である。プラークアッセイでは、細胞単層をウイルスストック溶液の連続希釈液で感染させ、アガロースオーバーレイを用いてウイルスの流れを制限する。感染した細胞は、子孫ウイルスを放出し、それが次に隣接する細胞に感染する。細胞を溶解して、プラークと呼ばれる非感染細胞によって囲まれた透明な領域を生成し、これを色素を用いて可視化する。サンプルのウイルス力価が高くなると、プラークの数が多くなる。

実施例
ｉＣＥＬＬｉｓナノサイズ固定床バイオリアクターシステムを実施例１～４で使用した。ｉＣＥＬＬｉｓナノバイオリアクターは、約８００ｍＬを保持することができ、これは、２０ｍｍ～１０ｍｍの固定床高さを有する約５，３００～４０，０００の総表面増殖面積に相当する。増殖面積は、３５～２６７ Ｔ－１５０フラスコに相当し、積層増殖に使用することができた（図１Ａ、１Ｂ、及び表１参照）。ｉＣＥＬＬｉｓを用いて、異なるパラメータを用いた実験を行った。

実施例１ パラメータをウイルス製造のベースラインとした実験によるＶＳＶ製造
Ｖｅｒｏ細胞を、ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクター中、約１００％ｄＯ_２、３７℃、７．４ｐＨで増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞の培養期間にわたって、バイオリアクターのバイオマスセンサーを使用して細胞増殖をモニターし、Ｖｅｒｏ細胞を５５ｍＳ／ｃｍ導電率（細胞増殖の尺度）でＶＳＶに感染させた。このシステムは、感染後、約１２～２４時間で約７５ｍＳ／ｃｍの最大導電率（最大細胞増殖）に達した（図２）。感染は、０．０５ＭＯＩでなされた。感染後２日目にウイルスを回収した。ウイルス製造は、フラットストック中で増殖する同じ細胞からの力価と比較した場合、１ｍＬあたり１ｌｏｇを超えて増加した（図２、表２）。

実施例２ 感染前約１２時間でｄＯ_２が減少し、感染中維持され回収される実験によるＶＳＶ製造
Ｖｅｒｏ細胞を、ｄＯ_２約１００％、温度３７℃温度、ｐＨ７．４で培養した。Ｖｅｒｏ細胞の培養期間にわたって、バイオマスセンサーを使用して細胞増殖をモニターし、細胞を８０ｍＳ／ｃｍの導電率（ほぼ最大の導電率）で感染させた。すなわち、Ｖｅｒｏ細胞を、最大細胞増殖に到達したときに感染させた。感染前、約１２時間、ｄＯ_２レベルは４５～５０％に減少し、感染期間中及び回収を通して、この減少したレベルで一定に保たれた。温度を３７℃に維持し、ｐＨを７．４に維持した。感染後、約２日目にウイルスを回収した。感染前、１２時間ｄＯ_２を減少し、Ｖｅｒｏ細胞が最大細胞増殖を達成した後、Ｖｅｒｏ細胞にＶＳＶを感染させると、フラットストックからのＶＳＶ力価と比較してＶＳＶ力価が２ｌｏｇを超えて上昇し（表２）、実施例１と比較してウイルス力価が５．９倍上昇した（ｄＯ_２の減少なし）（図３）。

実施例３ ｄＯ_２、ｐＨ、及び温度が一定であることに加えて、最大導電率での実験によるＶＳＶ製造
Ｖｅｒｏ細胞を、バイオリアクター中、ｄＯ_２約１００%、温度３７℃、ｐＨ７．４で培養した。Ｖｅｒｏ細胞の培養期間にわたって、バイオマスセンサーを用いて細胞増殖をモニターし、細胞を１１０ｍＳ／ｃｍの導電率（ほぼ最大の導電率、すなわち、最大細胞増殖に到達したとき）で感染させた。感染は０．０５ＭＯＩでなされた。ｄＯ_２レベルに調整は行わなかった。温度を３７℃に維持し、培養及び感染期間を通してｐＨを７．４に維持した。感染後約２日目にウイルスを回収した。この実験からのＶＳＶ力価は、実施例１のものと同様であり、実施例２で観察されたより高い収率はｄＯ_２の変形例によるものであり、最大の細胞増殖でＶｅｒｏ細胞を感染させることによるものではなく、これは、おそらく、より多くの細胞が感染するために、全体の力価を増加させることができるものと考えられる（図４、表２）。

表２は、異なる実験での繁殖データを比較する。繁殖データを比較した。
１．フラットストックフラスコ中でＶｅｒｏ細胞から増殖させたＶＳＶ、
２．感染中のｄＯ_２％が９０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム中でＶｅｒｏ細胞から増殖させたＶＳＶ（実験１）、
３．感染中のｄＯ_２％が４０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム中でＶｅｒｏ細胞から増殖させたＶＳＶ（実験２）、及び
４．感染中のｄＯ_２％が２０％である、ｉＣＥＬＬｉｓシステム中でＶｅｒｏ細胞から増殖させたＶＳＶ（実験３）。
表２のデータは、ＣＳ１０フラスコストック、実験１、実験２、及び実験３それぞれのＶＳＶ力価の大幅な増加、及び総ウイルス製造の漸増を示す。これは、平床バイオリアクターｉＣＥＬＬｉｓを用いてＶＳＶを増殖させると、フラットストックから製造されたウイルスと比較した場合、１ｍＬ当たりのウイルス製造が１～２ｌｏｇ増加したことを示している。より重要なのは、感染中のｄＯ_２の漸減は、ＶＳＶ力価及び総ウイルス製造の有意な漸増となったことである。

実施例４ 感染時の異なるｄＯ_２レベルでのＶＳＶ製造
ＶＳＶを、ｄＯ_２約１００%、温度３７℃、ｐＨ７．４でＶｅｒｏ細胞中で増殖させた。感染前、約１２時間で、ｄＯ_２レベルは９０％、４０％、２０％に減少し、感染期間を通じてこの減少レベルが一定に保たれた。温度を３７℃に維持し、ｐＨを７．４に維持した。感染後、約２日目にウイルスを回収した。表２に示すように、これらの結果は、感染時のｄＯ_２減少のレベルに伴い、ウイルス収量の漸増を示している。

Claims (23)

1. ａ）バイオリアクター中に宿主細胞を提供する工程と、
   ｂ）一定の初期ｄＯ_２レベル、ｐＨ及び温度で前記宿主細胞を増殖させる工程と、
   ｃ）前記ｄＯ_２を初期酸素レベルの２０～９０％まで減少させる工程と、
   ｄ）工程ｃ）の後、少なくとも１つのウイルス又はウイルス粒子で前記宿主細胞を２～２４時間感染させる工程と、
   ｅ）前記ウイルス又はウイルス粒子で感染させた前記宿主細胞をインキュベートして、前記ウイルスを繁殖させる工程と、
   ｆ）前記ウイルスを回収する工程と
   を含む、バイオリアクターにおいてウイルスを製造する方法。
2. 前記宿主細胞は、接着細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記バイオリアクターは、固定床バイオリアクターである、請求項１～２に記載の方法。
4. 前記固定床の高さは、２ｃｍ～１０ｃｍである、請求項１～３に記載の方法。
5. 前記バイオリアクターは、使い捨て固定床バイオリアクターである、請求項１～４に記載の方法。
6. 工程ｃ）における前記ｄＯ_２レベルは、２０～５０％まで減少する、請求項１～５に記載の方法。
7. 導電率が６０ｍＳ／ｃｍ～８０ｍＳ／ｃｍのとき、工程ｃ）における前記ｄＯ_２レベルが減少する、請求項１～６に記載の方法。
8. 前記導電率が９０ｍＳ／ｃｍ～１１０ｍＳ／ｃｍのとき、工程ｄ）における前記宿主細胞がウイルスに感染する、請求項１～７に記載の方法。
9. 前記宿主細胞の前記ウイルスでの感染は、約０．１～０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）でなされる、請求項１～８に記載の方法。
10. 前記宿主細胞の前記ウイルスでの感染は、約０．０５のＭＯＩでなされる、請求項１～９に記載の方法。
11. 工程ｃ）における前記ｄＯ_２は、工程ｄ）における前記宿主細胞の感染の前、１２～２４時間に減少する、請求項１～１０に記載の方法。
12. 前記ウイルスは、ＶＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ロスリバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス及び組換えワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、及びこれらのキメラ、並びにライノウイルス及びレオウイルスからなる群から選択される、請求項１～１１に記載の方法。
13. 前記ウイルスは、ウイルスベクターである、請求項１～１２に記載の方法。
14. 前記ウイルスは、前記ＶＳＶベクターである、請求項１～１３に記載の方法。
15. 前記宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ネズミ細胞、ヒト細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ細胞、ＰＫ １５細胞、Ｗｌ－３８細胞、Ｔ－ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、及びＰｅｒＣ６細胞からなる群から選択される、請求項１～１４に記載の方法。
16. 前記宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である、請求項１～１５に記載の方法。
17. プラークアッセイ法によって、ウイルス力価を判断する工程をさらに含む、請求項１～１６に記載の方法。
18. 前記ウイルスを純化する、及び／又は特定する工程をさらに含む、請求項１～１７に記載の方法。
19. 前記ウイルスによりワクチンを製造する工程をさらに含む、請求項１～１８に記載の方法。
20. 前記バイオリアクターは、７００～８００ｍＬの容量を有する、請求項１～１９に記載の方法。
21. 前記バイオリアクターは、５０～８０ｍＬの容量を有する、請求項１～２０に記載の方法。
22. 前記バイオリアクターは、無タンパク質培地を含む、請求項１～２１に記載の方法。
23. ａ）バイオリアクター中に宿主細胞を提供する工程と、
    ｂ）一定の初期ｄＯ_２レベル、ｐＨ及び温度で宿主細胞をコンフルエントまで増殖させる工程と、
    ｃ）前記ｄＯ_２を初期ｄＯ_２レベルの２０～５０％まで減少させる工程と、
    ｄ）少なくとも１つのウイルス又はウイルス粒子で前記宿主細胞を感染させる工程と、
    ｅ）前記ウイルス又はウイルス粒子で感染させた前記宿主細胞をインキュベートして、前記ウイルスを繁殖させる工程と、
    ｆ）前記ウイルスを回収する工程と
    を含む、バイオリアクターにおいてウイルスを製造する方法。

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