CN108350418A - 病毒感染模型、其制作方法及其利用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种克服以往的肝炎病毒感染模型的缺点的病毒感染模型。本发明提供一种能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型的构建方法，该方法包括使在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。所述病毒感染模型是包含感染了病毒的细胞集合体的、能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型，所述细胞集合体是在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体。本发明提供一种方法，该方法使用所述病毒感染模型，筛选具有抗病毒活性的物质。

Description

病毒感染模型、其制作方法及其利用
技术领域
本发明涉及病毒感染模型、其制作方法及其利用。
背景技术
近年来，利用具有向各种各样的功能细胞分化的能力的iPS细胞等多能性干细胞、通过分化诱导来创出有益于创制新药筛选、再生医疗的人功能细胞的方法受到关注。目前为止，本发明人等的研究小组已经确立了由在成体组织中可以观察到的血管内皮细胞、间充质细胞构成的具有有秩序的立体结构的人组织/内脏器官的再构建法(非专利文献1：Takebe T.et.al.，Nature(2013)VOL.499，p.481-485；专利文献1：人组织/内脏器官的制作方法WO2013/047639)。
另一方面，此前人所罹患的肝炎病毒的感染模型是使用经过初代培养的人肝细胞或各种肿瘤细胞进行(非专利文献2：Gripon P等人Virol 1995；213：292-299；非专利文献3：Watashi K等人，JBC.2013 288：31725-31727；非专利文献4：Yang D等人PNAS2014E1264-E1273.)。然而，此前使体外再构建的立体组织中感染肝炎病毒的系统只报告过使用了肿瘤细胞的系统(非专利文献5：Molina-Jimenez F等人Virology 2012425；31-9.)。
使经过初代培养的人肝细胞感染肝炎病毒(HBV：乙型肝炎病毒)的模型存在有如下所示的优点、缺点。
·可以没有作为HBV受体已知的NTCP等的过量表达地感染HBV。
·在可以供给的细胞方面有限制。
·细胞不会增殖。
·重现性低(批次的差别大)。
另外，使肝癌细胞株感染肝炎病毒的模型存在有如下所示的优点、缺点。
·没有批次差，有增殖性。
·感染达成需要大量的病毒(2000～6000Geq/cell)。
·属于肿瘤细胞，没有肝细胞特异的标记的表达。
病毒感染试验的问题是，就目前的培养系统而言，病毒的生命周期的重现困难。以往的初代培养肝细胞不可能再感染，作为使之能够再感染的感染模型，仅报告过从具有人源化肝脏的嵌合体小鼠中分离出的人肝细胞(非专利文献6：Ishida Y，Am J Patho，Vol.185，No.5，May 2015，pp.1275-1285)，其他的感染模型是使肿瘤细胞感染病毒的模型(非专利文献7：Yang D.，PNAS E1264-E1273 published online March 10，2014；非专利文献8：Sai LT，JMII(2014)xx，1-6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nature(2013)VOL.499，p.481-485
非专利文献2：Gripon P等人Virol 1995；213：292-299；
非专利文献3：Watashi K等人，JBC.2013 288：31725-31727
非专利文献4：Yang D等人PNAS 2014 E1264-E1273.
非专利文献5：Molina-Jimenez F等人Virology 2012 425；31-9.
非专利文献6：Ishida Y，Am J Patho，Vol.185，No.5，May 2015，pp.1275-1285
非专利文献7：Yang D，PNAS E1264-E1273 published online March 10，2014
非专利文献8：Sai LT，JMII(2014)xx，1-6
专利文献
专利文献1：WO2013/047639
发明内容
发明所要解决的问题
以往的肝炎病毒感染模型存在有如下所示的缺点。
·无法重现在对人的肝炎病毒感染中观察到的病毒生命周期、特别是多轮的感染动态。
·无法从感染细胞向培养上清液中释放出高浓度的病毒。
·由于使用了肿瘤细胞，因此不可能调查肝脏的功能性障碍。
本发明以解决这些问题为目标。
用于解决问题的方法
本发明人等深入努力，结果找出了使用从多能性干细胞等创出的人组织/内脏器官实现全新的病毒感染模型的方法。即，通过将人iPS细胞等多能性干细胞与间充质干细胞及血管内皮细胞组合，由此重建立体的人肝芽(liver bud)，而使具有内脏器官亲和性的各种病毒的感染效率飞跃性地增大，成功地构建出近似于对人肝脏的感染的感染模型。利用本发明，可以推进对创制新药筛选、病毒感染机理的阐明，可以期待带来对各种肝炎病毒感染症的新药的开发、新的发病机理的阐明。
本发明的主旨如下所示。
(1)一种能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型的构建方法，该方法包括使在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
(2)根据(1)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体为器官芽。
(3)根据(1)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，包括使与血管内皮细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
(4)根据(1)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，包括使与间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
(5)根据(2)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，包括使与血管内皮细胞及间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的器官芽感染病毒。
(6)根据(5)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，组织或内脏器官细胞为来自于人iPS细胞的细胞。
(7)根据(5)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，血管内皮细胞为人脐带静脉血管内皮细胞。
(8)根据(5)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，间充质细胞为来自于人骨髄的间充质细胞。
(9)根据(5)记载的病毒感染模型的构建方法，其中，所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
(10)一种病毒感染模型，是包含感染了病毒的细胞集合体的、能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型，所述细胞集合体是在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体。
(11)根据(10)记载的病毒感染模型，其中，所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
(12)一种筛选方法，该方法使用(10)记载的病毒感染模型来筛选具有抗病毒活性的物质。
(13)一种筛选方法，该方法使用所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒的(11)记载的病毒感染模型来筛选具有抗病毒活性的物质。
此前，本发明人等的研究小组成功地构建了利用以往的技术完全没有达成的、用于制成恰当地配置了血管系统的人组织/内脏器官的基础技术(人组织/内脏器官的制作方法WO2013/047639)。
本发明通过使使用了该基础技术的人肝芽感染肝炎病毒，能够实现以下的情况。
·重现仅在对人的肝炎病毒感染中观察到的病毒生命周期、特别是多轮(multiround)的感染动态。
·实现从感染细胞向培养上清液中的高浓度的病毒释放。
·调查肝脏的功能性障碍。
本发明有望应用于比以往更简便有效的体外的创制新药筛选。
发明效果
由于器官芽可以均一且大量地生产，因此利用本发明可以消除以往的初代培养肝细胞那样的批次间的波动，能够大量地制造创制新药开发中所必需的病毒感染人肝组织。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、特愿2015‐249520的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1的上段为对三维培养人iPS细胞、血管内皮细胞、未分化间充质细胞而制作出的人肝芽在制作后第1、7、15天利用倒置光学显微镜进行观察得到的照片。下段为使人肝芽感染HBV后第10、20、30天利用倒置光学显微镜观察得到的照片。
图2是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的培养上清液中的HBV DNA复制数的图。
图3是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的细胞内的HBV3.5k RNA的图。
图4表示人肝芽内的HBV感染。是将感染10、20、30天后的人肝芽用HBc抗体进行免疫染色的图。
图5是比较了使初代培养人肝细胞(PXB细胞)感染上感染20天后的人肝芽的培养上清液时的PXB细胞的培养上清液中的HBV DNA复制数的图。
图6是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的细胞内的HBV闭环状DNA的复制数的图。与来自于人iPS细胞的肝细胞相比在人肝芽中观察到明显更多的HBV闭环状DNA。
图7是将感染10天后的人肝芽的电子显微镜像与未感染的人肝芽进行比较的图。发生了HBV感染的人肝芽观察到以箭头表示的肝细胞的微绒毛减少。
图8表示对人肝芽的HBV感染被各种药剂阻碍。Con：对照组、IFN-α：干扰素α1000U/ml、IFN-γ：干扰素γ1000U/ml、PreS1：HBV表面抗原PreS1肽100nM、ETV：恩替卡韦(エンテカビル)1.8μM。*p<0.05，**p<0.01，***p<.0001vs Con。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型的构建方法，该方法包括使在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
本发明中所谓“细胞集合体”，是在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的集合体，例如记载于WO2015/129822(自组织化用细胞集合体的制作方法)中，该细胞集合体由于紧密地进行细胞间的相互作用，因此可以重现在胎内产生的生物学环境。可以认为，由此会有效地产生向内脏器官的前体细胞的初期分化诱导，因此其存在频率、个数提高。细胞集合体适合为细胞之间发生了粘附、能够非破坏性地回收的集合体。
细胞集合体是包括器官芽或类器官(器官芽(WO2013/047639)、肝芽、肝憩室、肝类器官、胰腺(背侧或腹侧)芽、胰腺憩室(pancreatic diverticula)、胰腺类器官、肠芽、肠憩室、肠类器官(K.Matsumoto，等人Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等的概念，无论构成细胞集合体的细胞的种类或种类的个数如何均可，器官芽相当于在器官发生初期形成的物质，参与构成的细胞的种类在原则上是构成内脏器官或组织的功能细胞(或向功能细胞分化的未分化细胞)、血管细胞及间充质细胞这三种，类器官仅由构成上皮性组织的细胞构成，基本上为小型(1mm以下)。
细胞集合体通过自组织化而形成附加了高次结构的三维组织结构，由此能够实现前体细胞的终末分化诱导。自组织化无论是在体内还是在体外的哪种条件下进行都可以。例如，通过将细胞集合体移植到生物体内，形成血管网，诱导血液灌流，引起向具有复杂结构的高次组织的自组织化，就能够以与成体组织同等的高度制作具有有秩序的组织结构的组织、内脏器官。除了血管网以外，还有可能可以形成输尿管结构、胆管结构、气管结构等附加了更加高次结构的高次组织。此外，为了像肝脏等那样表达其功能，不仅是肝脏，还存在多个需要重建与胆管、胰腺管的合流、向十二指肠的连结等与其他内脏器官的关联的内脏器官。
可以与血管内皮细胞或间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成细胞集合体。细胞集合体的制作方法记载于WO2015/129822(自组织化用细胞集合体的制作方法)中，然而当然并不限定于此。
在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体可以是器官芽。
本发明中所谓“器官芽”，是可以通过成熟而分化为器官的结构体，是指包括组织或内脏器官细胞、血管内皮细胞及间充质细胞(未分化间充质细胞或由其分化出的细胞)的结构体。对于某个结构体是否为器官芽，例如可以通过如下操作来确认，即，将该结构体移植到生物体中，调查是否可以分化为目的器官(如果分化为目的器官则可以判断为器官芽。)，以及/或者调查该结构体是否包含全部的上述三种细胞(即组织或内脏器官细胞、血管内皮细胞及间充质细胞)(如果包含全部三种细胞则可以判断为器官芽。)。器官芽例如可以是分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髄等器官的器官芽等，优选分化为肝脏的器官芽(肝芽)、分化为胰脏的器官芽(胰芽)、分化为肠道的器官芽等分化为内胚层性器官的器官芽。对于某个结构体是否分化为内胚层性器官的器官芽，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出后述的标记蛋白质的任意一个或多个，则可以判断为器官芽。)。例如，就肝芽而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就胰芽而言，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，就分化为肠道的器官芽而言，CDX2、SOX9等成为标记。在本领域技术人员间所使用的术语中，肝芽、肝憩室、肝类器官、胰腺(背侧或腹侧)芽、胰腺憩室、胰腺类器官、肠芽、肠憩室、肠类器官(K.Matsumoto，等人Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等包含于本发明的器官芽中。
可以与血管内皮细胞及间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成器官芽。器官芽的制作方法记载于WO2013/047639(人组织/内脏器官的制作方法)中，然而当然并不限定于此。
本发明中所谓“组织或内脏器官细胞”，是指构成组织或内脏器官的功能细胞、或向功能细胞分化的未分化细胞。作为“未分化的组织或内脏器官细胞”，例如可以是能够分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髄等器官的细胞等，可以举出能够分化为脑、脊髄、肾上腺髄质、表皮、毛发/爪/皮肤腺、感觉器、末梢神经、水晶体等外胚层性器官的细胞、能够分化为肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨骼、真皮、结缔组织、中皮等中胚层性器官的细胞、能够分化为肝脏、胰脏、肠道、肺、甲状腺、副甲状腺、尿道等内胚层性器官的细胞等。对于某个细胞是否能够分化为外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为能够分化为内胚层性器官的细胞。)。例如，就能够分化为肝脏的细胞而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就能够分化为胰脏的细胞而言，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，就能够分化为肠道的细胞而言，CDX2、SOX9等成为标记，就能够分化为肾脏的细胞而言，SIX2、SALL1成为标记，就能够分化为心脏的细胞而言，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA成为标记，就能够分化为血液的细胞而言，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4成为标记，就能够分化为脑或脊髄的细胞而言，HNK1、AP2、NESTIN等成为标记。在本领域技术人员间所使用的术语当中，成肝细胞、肝祖细胞、成胰腺细胞、肝前体细胞、成胰腺细胞、胰腺祖细胞、胰祖细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、肠祖细胞、肠前体细胞、中胚层、后肾间充质前体细胞、多能性肾单位祖细胞、肾祖细胞、心脏中胚层、心血管祖细胞、心脏祖细胞(JR.Spence，等人Nature.；470(7332)：105-9.(2011)、Self，等人EMBO J.；25(21)：5214-5228.(2006)、J.Zhang，等人Circulation Research.；104：e30-e41(2009)、G.Lee，等人Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007))等包含于本发明的未分化的组织或内脏器官细胞中。未分化的组织或内脏器官细胞可以从组织或内脏器官采集、或从人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞依照公知的方法制作。另外，未分化的组织或内脏器官细胞也可以是从iPS细胞等多能性干细胞向组织或内脏器官的分化处于中途阶段的细胞，例如可以是原始肠内胚层细胞(PrimitiveGut Endoderm Cells：PGECs)(日本专利第5777127号)等。PGECs能够向肝细胞、胰细胞及肠细胞分化(分化功能高)，不表达与癌的恶性度相关的标记(安全性高)，可以从iPS细胞在非饲养环境下分化诱导而制备，因此具有还可以临床应用的优点。而且，PGECs能够大量制备。PGECs可以利用日本专利第5777127号中记载的方法制备。或者也可以使用在向无血清培养基中添加了激活素、Wnt 3a、NaB的培养基中培养iPS细胞等多能性干细胞并诱导为内胚层系细胞而得的PGECs。除此以外，例如，能够分化为肝脏的内脏器官细胞可以依照K.Si-Taiyeb，等人Hepatology，51(1)：297-305(2010)、T.Touboul，等人Hepatology.51(5)：1754-65.(2010)来制作，能够分化为胰脏的内脏器官细胞可以依照D.Zhang，等人CellRes.；19(4)：429-38.(2009)来制作，能够分化为肠道的内脏器官细胞可以依照J.Cai，等人J Mol Cell Biol.；2(1)：50-60(2010)、R.Spence，等人Nature.；470(7332)：105-9.(2011)来制作，能够分化为心脏的内脏器官细胞可以依照J.Zhang，等人Circulation Research.；104：e30-e41(2009)来制作，能够分化为脑或脊髄的细胞可以依照G.Lee，等人NatureBiotechnology 25，1468-1475(2007)来制作。作为“分化了的组织或内脏器官细胞”，可以例示出胰脏的内分泌细胞、胰脏的胰腺管上皮细胞、肝脏的肝细胞、肠道的上皮细胞、肾脏的尿细管上皮细胞、肾脏的肾小球上皮细胞、心脏的心肌细胞、血液的淋巴细胞或粒细胞、红细胞、脑的神经细胞或神经胶质细胞、脊髄的神经细胞或许旺细胞等。组织或内脏器官细胞主要使用来自于人的细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的组织或内脏器官细胞。
本发明中所谓“血管内皮细胞”，是指构成血管内皮的细胞、或可以分化为此种细胞的细胞。对于某个细胞是否为血管内皮细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为血管内皮细胞。)。本发明中所用的血管内皮细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于血管内皮细胞是否为分化了的细胞，可以利用CD31、CD144来确认。在本领域技术人员间所使用的术语当中，内皮细胞、脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞、成血管细胞(HJ.joo，等人Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含于本发明的血管内皮细胞中。优选的血管内皮细胞是来自于脐带静脉的血管内皮细胞。血管内皮细胞主要使用来自于人的血管内皮细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的血管内皮细胞。
本发明中所谓“间充质细胞”的概念是指，主要存在于来自于中胚层的结缔组织中、形成以组织发挥作用的细胞的支撑结构的结缔组织细胞，也包括虽然确定了向间充质细胞分化的命运、然而还没有分化为间充质细胞的细胞。本发明中所用的间充质细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于某个细胞是否为未分化间充质细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为未分化间充质细胞。)。另外，对于没有表达出前项的标记的任意一种的间充质细胞可以判断为分化间充质细胞。在本领域技术人员间所使用的术语当中，间充质干细胞、间充质祖细胞、间充质细胞(R.Peters，等人PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包含于本发明的间充质细胞中。优选的间充质细胞是来自于骨髄的间充质细胞(特别是间充质系干细胞)。间充质细胞主要使用来自于人的间充质细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的未分化间充质细胞。
共培养中的两种细胞的培养比只要是可以形成细胞集合体的范围内，就没有特别限定，合适的细胞的个数比为组织或内脏器官细胞：血管内皮细胞＝10：10～5、组织或内脏器官细胞：间充质细胞＝10：0.1～3。
共培养中的三种细胞的培养比只要是可以形成器官芽的范围内，就没有特别限定，合适的细胞的个数比为组织或内脏器官细胞：血管内皮细胞：间充质细胞＝10：10～5：0.1～3。可以对组织或内脏器官细胞40万个左右、血管内皮细胞20～40万个左右、间充质细胞2～12万个左右进行共培养，形成大小为50μm～3mm左右的器官芽。
培养时使用的培养基只要是可以形成细胞集合体(优选为器官芽)的培养基，则无论是何种都可以，然而优选使用血管内皮细胞培养用的培养基、组织或内脏器官细胞培养用的培养基、混合了所述2个培养基的培养基等。血管内皮细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，然而优选使用包含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素(例如庆大霉素、两性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚红、BBE的至少1种的培养基。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可以使用EGM-2 BulletKit(Lonza公司制)、EGM BulletKit(Lonza公司制)、VascuLife EnGS CompKit(LCT公司制)、人内皮-SFM基础生长培养基(Invitrogen公司制)、人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制)等。组织或内脏器官细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，然而在内脏器官细胞为肝细胞的情况下，优选使用包含抗坏血酸、BSA-FAF、胰岛素、氢化可的松、GA-1000的至少1种的培养基。作为肝细胞培养用的培养基，可以使用从HCMBulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基、向RPMI1640(Sigma-Aldrich公司制)中加入了1％B27 Supplements(GIBCO公司制)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich公司制)等。关于人肝芽的形成，当将GM BulletKit(Lonza公司制)与从HCMBulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1：1混合，向所得的培养基中添加地塞米松、抑瘤素M、HGF时，即判明对于肝芽的成熟有效果。
虽然在细胞的培养时，无需使用支架材料，然而最好在间充质细胞能够收缩的凝胶状支撑体上培养细胞的混合物。
间充质细胞的收缩可以通过(利用显微镜、或肉眼)在形态学上观察立体组织形成、或伴随着利用药勺等的回收显示出具有保持组织的形状的强度等(Takebe等人Nature499(7459)，481-484、2013))来确认。
支撑体可以是具有合适的硬度(例如杨氏模量为200kPa以下(涂布上Matrigel胶(マトリゲル)的形状为平坦的凝胶的情况等)，支撑体的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。)的凝胶状基材，作为此种基材，可以例示出水凝胶(例如丙烯酰胺凝胶、明胶、Matrigel胶等)等，然而并不限定于它们。需要说明的是，根据作为目的的集合体的形状、尺寸、量，支撑体的硬度未必均匀，可以在硬度上设定空间的、时间的梯度或进行图案化。在支撑体的硬度均匀的情况下，支撑体的硬度优选为100kPa以下，更优选为1～50kPa。凝胶状支撑体可以为平面，或者凝胶状支撑体的进行培养的一侧的截面可以是U或V字的形状。通过使凝胶状支撑体的进行培养的一侧的截面为U或V字的形状，细胞就会集聚在支撑体的培养面，能够以更少数量的细胞和/或组织形成细胞集合体，因此有利。另外，也可以对支撑体实施化学的、物理的修饰。作为修饰物质，可以例示出Matrigel胶、层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白等。
在凝胶状培养支撑体的硬度中设定空间的梯度的一例是中心部的硬度大于周边部的硬度的凝胶状培养支撑体。中心部的硬度适合为200kPa以下，周边部的硬度只要小于中心部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。在凝胶状培养支撑体的硬度中设定空间的梯度的另一例是周边部的硬度大于中心部的硬度的凝胶状培养支撑体。
图案化了的凝胶状培养支撑体的一例是具有1个以上的中心部的硬度大于周边部的硬度的图案的凝胶状培养支撑体。中心部的硬度适合为200kPa以下，周边部的硬度只要小于中心部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。图案化了的凝胶状培养支撑体的另一例是具有1个以上的周边部的硬度大于中心部的硬度的图案的凝胶状培养支撑体。周边部的硬度适合为200kPa以下，中心部的硬度只要小于周边部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。
培养时的温度没有特别限定，优选设为30～40℃，更优选设为37℃。
培养期间没有特别限定，优选设为3～10天，更优选设为6天。
通过使利用上述的方法形成的细胞集合体(优选为器官芽)感染病毒，可以构建病毒感染模型。该模型能够重现病毒的生命周期，特别是能够重现多轮的感染动态。另外，实现从感染细胞向培养上清液中的高浓度的病毒释放。后述的实施例中，本发明的病毒感染模型(感染了HBV的肝芽)中，直至感染后30天的期间，细胞内的HBV RNA量增加，并且在培养上清液中观察到HBV DNA。此外，向本发明的病毒感染模型(感染了HBV的肝芽)的培养上清液中释放出的病毒能够感染其他的细胞。即，可以重现病毒的生命周期。另外，本发明的病毒感染模型(感染了HBV的肝芽)中，观察到明显多的HBV闭环状DNA。此外，本发明的病毒感染模型(感染了HBV的肝芽)中，肝细胞的微绒毛减少。
作为病毒的种类，可以例示出乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等，然而当然并不限定于它们。
感染病毒的细胞集合体(优选为器官芽)例如可以是将组织或内脏器官细胞、血管内皮细胞及间充质细胞的细胞混合后，在包含DMSO的培养基中共培养7天，继而在包含HGF、OSM、DEX的培养基中培养7天而得。为了使之感染HBV，例如使每1个组织或内脏器官细胞感染约500个HBV、培养约30天即可。在培养时，使用包含PEG8000的培养基即可。
另外，本发明提供一种病毒感染模型，是包含感染了病毒的细胞集合体的、能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型，所述细胞集合体是在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体。
对于细胞集合体、病毒、感染了病毒的细胞集合体如上所述。作为病毒的种类，可以例示出乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等，然而当然并不限定于它们。
另外，本发明提供使用上述的病毒感染模型来筛选具有抗病毒活性的物质的方法。作为病毒的种类，可以例示出乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等，然而当然并不限定于它们。
以下对筛选具有抗病毒活性的物质的方法的一例进行说明。使上述说明过的肝芽感染病毒，供给被测物质。或者在肝芽制作时混合被测物质。在被测物质供给组与被测物质未供给组之间比较肝芽的培养上清液中或肝芽中的病毒量。或者鉴定因被测物质的供给而使培养上清液中或肝芽中的病毒量减少50％以上的物质。被测物质没有特别限定，可以举出低分子化合物、肽、核酸、来自于天然物的提取物、无机化合物等。将供给被测物质后第1～30天后的肝芽的培养上清液或细胞内的病毒量与没有供给被测物质的肝芽的培养上清液或细胞内的病毒量进行比较。最好选择因被测物质的供给而使病毒量变为未供给组的30％以下的被测物质。利用该方法，能够实现病毒治疗剂或预防剂的筛选。
作为成为筛选的对象的物质，可以有蛋白质、多肽、寡肽、核酸(包括天然型核酸、人工核酸)、低分子有机化合物、无机化合物、细胞提取物、来自于动植物或土壤等的提取物等。物质可以是天然物，也可以是合成物。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明。
〔实施例1〕
实验方法
人肝芽的制作方法基于“组织及内脏器官的制作方法”(WO2013/047639)。
(1)人肝脏内胚层细胞的制作
向无血清培养基中添加Activin、Wnt 3a、NaB而培养人iPS细胞(作为一例是来自于人皮肤的TkDA3hiPSC克隆(由东京大学提供))，得到内胚层系细胞(定形内胚层：DE)。
(2)人肝芽的制作
将所得的内胚层系细胞、与血管内皮细胞(来自于人脐带静脉的内皮细胞)(Lonza，Basel，Switzerland)及未分化间充质细胞(来自于人骨髄的间充质系干细胞)(Lonza，Basel，Switzerland)分别以10：7：1(每1个器官芽中为400个：280个：40个)的比例混合，制作出人肝芽(大小120-150μm)。
(3)对人肝芽的HBV感染
将(2)中制作出的人肝芽在包含DMSO的培养基中培养7天，再在包含HGF、OSM、DEX的培养基中培养7天，使之感染HBV。HBV是从向人肝癌细胞株HepG2中利用脂质体转染法导入了基因的HepG2.2.15细胞的培养上清液中回收完全的HBV基因组(D基因型)。使用包含4％的PEG8000的培养基使每1个内胚层系细胞感染约500个HBV，培养约30天。
(4)来自于人iPS细胞的肝细胞的制作及HBV感染
将(1)中得到的内胚层系细胞在包含KO-DMEM、KSR、DMSO的培养基中培养7天，得到未成熟肝细胞(immature hepatocyte：IH)。在这些包含HGF、OSM、DEX的培养基中再培养7天，得到来自于人iPS细胞的肝细胞(mature hepatocyte：MH)。使来自于人iPS细胞的肝细胞感染与(3)相同的HBV。使用包含4％的PEG8000的培养基使每1个细胞感染约500个HBV。
(5)回收HBV感染后10、20、30天后的人肝芽、以及来自于人iPS细胞的肝芽的培养上清液，测定HBV DNA。
(6)回收HBV感染后10、20、30天后的人肝芽、以及来自于人iPS细胞的肝芽而测定HBV 3.5k RNA。
(7)将HBV感染后10、20、30天后的人肝芽内用HBc抗体进行免疫染色。
(8)使人初代培养肝细胞(PXB细胞(株式会社Phoenixbio))感染上HBV感染后20天后的人肝芽的培养上清液。
(9)回收HBV感染后20天后的人肝芽、以及来自于人iPS细胞的肝芽而测定闭环状DNA(cccDNA)。
(10)将HBV感染10天后的人肝芽及同时期的HBV未感染人肝芽用多聚甲醛及戊二醛固定并利用电子显微镜拍摄。
(11)使人肝芽每1个细胞感染5000个HBV，向培养基中添加干扰素α1000U/ml、干扰素γ1000U/ml、PreS1肽100nM、恩替卡韦1.8μM而培养10天。测定细胞内的HBV 3.5k RNA及培养上清液的HBV DNA。
结果
将结果表示于图1～8中。
图1上段是在对三维培养人iPS细胞、血管内皮细胞、未分化间充质细胞而制作的人肝芽在制作后第1、7、15天利用倒置光学显微镜观察得到的照片。即使在肝芽制作后经过15天也维持了球形的立体结构。
图1下段是在使人肝芽感染HBV后第10、20、30天利用倒置光学显微镜观察得到的照片。直到感染后30天以前肝芽的形态都得到维持。
图2是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的、培养上清液中的HBV DNA复制数的图。与来自于人iPS细胞的肝细胞相比人肝芽中观察到明显更多的HBV的释放。
图3是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的、细胞内的HBV 3.5k RNA的图。与来自于人iPS细胞的肝细胞相比人肝芽的细胞内观察到明显更多的HBV 3.5k RNA。
图4是将感染10、20、30天后的人肝芽内用HBc抗体进行了免疫染色的图。在感染10、20、30天后继续观察到HBV感染。
图5是比较了使初代培养人肝细胞(PXB细胞)感染上感染20天后的人肝芽的培养上清液时的、PXB细胞的培养上清液中的HBV DNA复制数的图。显而易见可以产生能够感染已经发生HBV感染的人肝芽的HBV。
图6是比较了来自于人iPS细胞的肝细胞、以及使人肝芽感染HBV时的、细胞内的HBV闭环状DNA的复制数的图。与来自于人iPS细胞的肝细胞相比在人肝芽中观察到明显更多的HBV闭环状DNA。
图7是将感染10天后的人肝芽的电子显微镜像与未感染的人肝芽进行比较的图。发生了HBV感染的人肝芽可以观察到以箭头表示的肝细胞的微绒毛减少。
图8表示对人肝芽的HBV感染被各种药剂阻碍。Con：对照组、IFN-α：干扰素α1000U/ml、IFN-γ：干扰素γ 1000U/ml、PreS1：HBV表面抗原PreS1肽100nM、ETV：恩替卡韦1.8μM。*p<0.05，**p<0.01，***p<.0001vs Con。
将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明可以应用于体外的创制新药筛选。

Claims (13)

1.一种能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型的构建方法，该方法包括使在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
2.根据权利要求1所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体为器官芽。
3.根据权利要求1所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
包括使与血管内皮细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
4.根据权利要求1所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
包括使与间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体感染病毒。
5.根据权利要求2所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
包括使与血管内皮细胞及间充质细胞一起在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的器官芽感染病毒。
6.根据权利要求5所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
组织或内脏器官细胞为来自于人iPS细胞的细胞。
7.根据权利要求5所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
血管内皮细胞为人脐带静脉血管内皮细胞。
8.根据权利要求5所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
间充质细胞为来自于人骨髄的间充质细胞。
9.根据权利要求5所述的病毒感染模型的构建方法，其中，
所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
10.一种病毒感染模型，是包含感染了病毒的细胞集合体的、能够重现病毒的生命周期的病毒感染模型，所述细胞集合体是在体外培养组织或内脏器官细胞而形成的细胞集合体。
11.根据权利要求10所述的病毒感染模型，其中，
所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
12.一种筛选方法，该方法使用权利要求10所述的病毒感染模型来筛选具有抗病毒活性的物质。
13.一种筛选方法，该方法使用所感染的病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒的权利要求11所述的病毒感染模型来筛选具有抗病毒活性的物质。
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