ES2909875T3

ES2909875T3 - Métodos y composiciones para modular el crecimiento de pelo

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Publication number: ES2909875T3
Application number: ES15818144T
Authority: ES
Inventors: Alexey V Terskikh
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2035-07-07
Also published as: BR112017000085A2; CN106661547B; CA2954282C; MX2017000374A; JP2017525672A; US10716808B2; AU2015287978A1; AU2015287978B2; SG10202111888XA; AU2021209278A1; AU2021209278B2; SG11201700095SA; WO2016007522A1; JP6941052B2; CN106661547A; EP3167047B1; EP4052714A1; EP3167047A4; KR20170020724A; EP3167047A1

Abstract

Un método para preparar una población de células de papilas dérmicas inducidas, comprendiendo dicho método: obtener una población de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC); diferenciar la población de hIPSC para generar una población intermedia de células de la cresta neural derivadas de células madre pluripotentes inducidas (hIPSC-NC) que comprende (i) cultivar las hIPSC en condiciones para formar agrupamientos; (ii) cultivar los agrupamientos en suspensión para formar esferas; (iii) sembrar en placas las esferas en la superficie de un sustrato seleccionado de plástico o un sustrato recubierto con fibronectina o poliornitina seleccionar células adherentes de la población de hIPSC-NC inducidas; y pasar dichas hIPSC-NC adherentes en un medio que contenga suero para generar una población de células de papilas dérmicas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC-DP); en donde la población de hIPSC-NC inducidas comprende los marcadores Sox10, Foxd3 y CD47, y carece de los marcadores OCT4 y SSEA4; en donde la población de hIPSC-DP inducidas comprende los marcadores P-75 y nestina.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para modular el crecimiento de pelo

Campo de la invención

Las realizaciones de los métodos y composiciones proporcionadas en el presente documento se refieren a la inducción del crecimiento de pelo en un sujeto.

Antecedentes de la invención

Se ha sugerido que en la embriogénesis los folículos pilosos se forman por interacciones recíprocas entre la epidermis y el mesodermo subyacente [1,2,3,4]. Las papilas dérmicas (DP, por sus siglas en inglés) primero se generan como condensados celulares en la dermis en respuesta a la formación de la placoda epidérmica. A medida que los folículos pilosos continúan su desarrollo, las células epidérmicas en las placodas proliferan activamente y envuelven los condensados dérmicos, ahora las llamadas papilas dérmicas, que las separan de la dermis circundante [5]. Expuestas a estas nuevas condiciones de nicho, las células de DP adquieren la expresión de BMP-4, su inhibidor nogina y los marcadores de superficie N-CAM y p-75. Adicionalmente, secretan proteínas específicas de matriz extracelular (por ejemplo, versican (VCAN)) y muestran un nivel alto de actividad de fosfatasa alcalina (AP) [6]. Utilizando ratones con doble indicador Lef1-RFP/K14-H2BGFP, los estudios han identificado la firma detallada genética de las células de DP de ratón prospectivamente aisladas [7] y la vía identificada de señalización Wnt, BMP y FGF como un requerimiento para el mantenimiento y la función de DP murina [8,9,10]. Las células de DP desempeñan un papel en el crecimiento y el ciclo de pelo [6] y determinan el tamaño de pelo y el tipo de pelo [11 ,12 ]. Es un hecho reconocido desde hace tiempo que las células de DP son capaces de inducir la formación del folículo piloso no solo en la embriogénesis sino también en el periodo posnatal. Las células de DP de las vibrisas indujeron la formación de pelo de novo cuando se trasplantaron en la almohadilla de la rata adulta, que es normalmente un área de piel sin pelo [13]. Las células de DP humanas aisladas de la piel del cuero cabelludo contribuyen a la formación de pelo cuando se trasplantan en roedores [14,15] e inducen la morfogénesis de queratinocitos en los cultivos [16].

Las células de DP han sido propuestas como un tratamiento a base de células para enfermedades de caída de pelo. Higgins et al (PNAS, vol. 110, N.° 49; 2013, páginas 19679-19688) divulga que las células de DP del cuero cabelludo humano pueden inducir el pelo del prepucio. Yang et al., (Nature Communications, vol. 5; 2014, páginas 1 a 11) describe células CD200+/ITGA6+ derivadas de iPSC humanas (células epiteliales humanas foliculogénicas) que son capaces de generar todos los linajes del folículo piloso en ensayos de reconstitución de la piel.

Sin embargo, las células de DP humanas no son adecuadas para este fin debido a que no pueden ser obtenidas en cantidades necesarias y pierden con rapidez su capacidad para inducir la formación del folículo piloso cuando se cultivan [7,8,17,18]. Por consiguiente, existe la necesidad no satisfecha de desarrollar células de DP funcionales que tengan la capacidad de inducir un crecimiento robusto de pelo.

Sumario de la invención

Se proporciona un método para preparar una población de células de papilas dérmicas inducidas, comprendiendo dicho método:

obtener una población de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC, por sus siglas en inglés); diferenciar la población de hIPSC para generar una población intermedia de células de la cresta neural derivadas de células madre pluripotentes inducidas (hIPSC-NC, por sus siglas en inglés) que comprende

(i) cultivar las hIPSC en condiciones para formar agrupamientos;

(ii) cultivar los agrupamientos en suspensión para formar esferas;

(iii) sembrar en placas las esferas en la superficie de un sustrato seleccionado de plástico o un sustrato recubierto con fibronectina o poliornitina

seleccionar células adherentes de la población de hIPSC-NC inducidas; y

pasar dichas hIPSC-NC adherentes en un medio que contenga suero para generar una población de células de papilas dérmicas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hIPSC-DP);

en donde la población de hIPSC-NC inducidas comprende los marcadores Sox10, Foxd3 y CD47, y carece de los marcadores OCT4 y SSEA4;

en donde la población de hIPSC-DP inducidas comprende los marcadores P-75 y nestina.

Además, se proporciona una población de células de papilas dérmicas inducidas preparada por dicho método. Aún además, se proporciona una población de células de papilas dérmicas inducidas (hIPSC-DP) para su uso en un método para inducir el crecimiento de pelo en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar dicha población de células de papilas dérmicas inducidas al sujeto, en donde dichas hIPSC-DP han sido preparadas por el método de la invención.

En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes inducidas se generan a partir de una fuente seleccionada del grupo que consiste en fibroblasto, célula epitelial renal y célula sanguínea. En algunas realizaciones, la población de células madre pluripotentes inducidas humanas se genera a partir de fibroblastos BJ humanos.

En algunas realizaciones, la población de células de papilas dérmicas inducidas se obtiene a partir de un sujeto donante. En algunas realizaciones, el sujeto donante y el sujeto son los mismos. En algunas realizaciones, el sujeto donante y el sujeto son diferentes.

Se proporciona una población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso en un método terapéutico para inducir el crecimiento de pelo en un sujeto que padece una enfermedad de caída de pelo, comprendiendo dicho método administrar dicha población de células de papilas dérmicas inducidas a dicho sujeto, en donde dichas hIPSC-DP han sido preparadas por el método de la invención. En algunas realizaciones, la administración comprende un trasplante subcutáneo. En algunas realizaciones, la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende pelo en la ubicación en una población de sujetos. En algunas realizaciones, la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto seleccionada del grupo que consiste en cuero cabelludo, cara, labio superior, barbilla, ceja, pestaña, brazo, pierna, espalda, torso y abdomen. En algunas realizaciones, la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende un tejido cicatricial. En algunas realizaciones, el sujeto tiene alopecia.

En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

En algunas realizaciones, la población de células de papilas dérmicas inducidas comprende un marcador seleccionado del grupo que consiste en P-75, nestina, veriscan, actina de músculo liso, fosfatasa alcalina y vimentina.

La población de células de papilas dérmicas inducidas se genera a partir de una población de células de la cresta neural inducidas. En algunas realizaciones, la población de células de la cresta neural inducidas comprende además un marcador seleccionado del grupo que consiste en integrina alfa 4, receptor cognado para la fibronectina, CD184, CD44, P-75 y nestina. En algunas realizaciones, la población de células de la cresta neural inducidas carece además de un marcador seleccionado del grupo que consiste en veriscan, actina de músculo liso y fosfatasa alcalina.

En algunas realizaciones, la población de células madre comprende células seleccionadas del grupo que consiste en células madre embrionarias, y células madre pluripotentes inducidas. En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes inducidas se generan a partir de una fuente seleccionada del grupo que consiste en fibroblasto, célula epitelial renal y célula sanguínea. En algunas realizaciones, la población de células madre comprende células madre pluripotentes inducidas humanas generadas a partir de fibroblastos BJ humanos.

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1A-1E representan la diferenciación de hESCs en células de tipo DP a través de la NC intermedia. La FIG.

1A es una representación esquemática de la estrategia de diferenciación. La FIG. 1B son dos fotomicrografías que representan la expresión de los marcadores migratorios de NC Sox 10 y Foxd3, en cultivos de hESC-NC. Tinción de inmunofluorescencia, DAPI de color azul. La FIG. 1C es una serie de tres gráficas que representan el análisis de citometría de flujo del marcador de NC integrina alfa-4 (ITGA4) y los marcadores de hESC OCT4 y SSEA4 en cultivos de hESC-NC. La FIG. ID es una serie de fotomicrografías que representan la expresión de p-75, Nestina, Versican, SMA y Fosfatasa alcalina (AP) en cultivos de hESC-NC, hDP (de la piel normal) y hESC-DP. Tinción de inmunofluorescencia, DAPI de color azul. La FIG. 1E es una serie de gráficas que representan el análisis de Q-PCR de los marcadores de hDP p-75, Nexina-1, Versican, SMA y Vimentina en los cultivos de hESC-DP durante la formación de patrones de DP. Día 0 = células hESC-NC. Los niveles de la expresión génica, mostrados como logaritmo de cambio múltiplo con respecto a los niveles de hESC-NC, se normalizaron en 18S. Para cada gen, la línea discontinua representa los niveles de la expresión génica en los cultivos de células hDP. Barras de escala 100 |jm.

Las FIG. 2A-2C representan los efectos de los trasplantes celulares subcutáneos en ratones desnudos. La FIG. 2A es una serie de fotomicrografías que muestra las imágenes en estéreo de los montajes completos de queratinocitos trasplantados solos o en combinación con las células dérmicas neonatales (mDC, por sus siglas en inglés) de ratón, hDP, hESC-DP, hESC diferenciadas en suero durante 14 días (hESC-suero), células de la cresta neural derivadas de hESC humanas (hESC-NC) y hESC-NC diferenciadas con DP durante 7 días (hESC-DP 7 días). La FIG. 2B es una gráfica que representa la cuantificación de los pelos inducidos por queratinocitos trasplantados solos o en combinación con mDC, hDP o hESC-DP. La FIG. 2C es una gráfica que representa la dinámica de capacidad inductiva del pelo de las células ESC-DP con tiempo de diferenciación de hESC-NC (día 0) mostrado como el número de pelos formados por trasplante (tendencia visualizada por la línea roja) o hESC diferenciadas en presencia de suero (diamante azul) en comparación con los queratinocitos solos (visualizados por la línea discontinua). Todos los datos son representados como media ± EEM y fueron analizados con ANOVA unidireccional (prueba de Kruskal-Wallis, prueba posterior de comparaciones múltiples de Dunn). *, P < 0,05; **, P < 0,001. Barras de escala 1 mm. Las FIG. 3A-3F representan trasplantes subcutáneos de las hESC-DP y hIPSC-DP marcadas con GFP en una serie de fotomicrografías. La FIG. 3A muestra la observación estereoscópica de los trasplantes de montaje completo de las células identificadas hESC-DP positivas a GFP en posiciones de DP (cabezas de flechas) y la cápsula dérmica (flechas) en los pelos recientemente formados; los recuadros muestran aumentos 2x de las regiones de DP. La FIG.

3B representa las hiPSC-DP marcadas con GFP que pueden ser encontradas en DP y la cápsula dérmica de los pelos: los trasplantes de montaje completo (GFP/campo brillante) y las secciones de 8 pm (campo brillante). Recuadro, imagen de fluorescencia de las células positivas a GFP en el área de DP del folículo piloso (aumento 2x del cuadro blanco del área de DP en la imagen de campo brillante). Las FIG. 3C y 3D representan que las DP positivas a GFP de los pelos recientemente formados (GFP/campo brillante, microscopía confocal) son positivas a Versican (Versican, microscopía confocal) y Fosfatasa alcalina (Ap , campo brillante), respectivamente. La FIG. 3E muestra raramente que las células positivas a GFP derivadas de NC (~1 % de los pelos recientemente formados) fueron detectadas en el área de vaina radicular exterior (flechas) así como DP positiva a GFP (delineada), con la imagen confocal en el panel de GFP. La FIG. 3F representa que las células positivas a GFP derivadas de NC fueron encontradas en la matriz de pelo en trasplantes (microscopía confocal). El recuadro muestra un aumento 2x de las células positivas a GFP; GFP en blanco. Se observan múltiples gránulos de melanina (en color negro) presentes a través de las células positivas a GFP. Barras de escala 250 pm para la FIG. 3A; 50 pm para las FIG. 3B-3F.

Las FIG. 4A-4B representan una función de la señalización de BMP en la adquisición de destino celular de DP. La FIG. 4A muestra fotomicrografías que representan los resultados de la morfología y trasplante de las células hESC-DP derivadas en ausencia o en presencia del inhibidor de BMP selectivo dorsomorfina. Barras de escala 50 pm para cultivos celulares y 0,5 mm para trasplantes celulares. La FIG. 4B es una gráfica que representa el análisis de Q-PCR de la expresión de Versican, Corina, Nexina-1, p-75, Vimentina y SMA en células hESC-DP en ausencia o en presencia del inhibidor de BMP selectivo dorsomorfina. Todos los datos son presentados como media ± EEM y fueron analizados con la prueba de la t de Student. *, P < 0,05; **, P < 0,001.

La FIG. 5 es una serie de gráficas que representan la expresión de los marcadores mesenquimales en hESC-NC con un análisis de citometría de flujo de la expresión de los marcadores mesenquimales (CD47, CD184, CD44) en cultivos de hESC-NC.

La FIG. 6 es una serie de fotomicrografías que representan la expresión de los marcadores de DP en las células de DP de folículos pilares humanas in situ. Tinción de inmunofluorescencia para las secciones congeladas de SMA, Fosfatasa alcalina (AP), Nestina y Versican; DAPI de color azul. Barras de escala 100 pm.

La FIG. 7 es una serie de fotomicrografías que representan el trasplante de las células de DP humanas por debajo de la piel de ratones desnudos en los que las células hDP positivas a GFP pueden ser encontradas en la dermis aunque no se incorporan en las áreas de DP de los pelos recientemente formados; trasplante de montaje completo (los recuadros muestran aumentos 2x de las áreas de DP). Barra de escala 250 pm.

Las FIG. 8A-8C representan la diferenciación de las hIPSC en células de tipo DP a través de la NC intermedia. La FIG. 8A es una serie de fotomicrografías que representan la expresión de los marcadores neuroepiteliales Sox 2, Sox 9 y nestina en los cultivos de hIPSC-NC. Tinción de inmunofluorescencia, DAPI de color azul. La FIG. 8B es una serie de fotomicrografías que representan la expresión de los marcadores de DP Actina de músculo liso (SMA), P-75 y Nestina en cultivos celulares de IPSC-DP humanas. Tinción de inmunofluorescencia, DAPI de color azul. La FIG.

8C es una gráfica que representa el análisis de Q-PCR de la expresión de Versican, Nexina-1, p-75, Vimentina y SMA. Los niveles de la expresión génica son normalizados en 18S y mostrados como logaritmo de cambio múltiple con respecto al nivel de hESC-NC de la expresión. Barras de escala 100 pm.

Descripción detallada

Los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento se refieren a la inducción del crecimiento de pelo en un sujeto. Una población de células de papilas dérmicas inducidas puede generarse a partir de una población de células de la cresta neural inducidas, que a su vez puede generarse a partir de una población de células madre. La población de células de papilas dérmicas inducidas puede ser trasplantada subcutáneamente en un sujeto y puede generar pelo. Ventajosamente, cada población de células puede ser aumentada para proporcionar una amplia población de células de papilas dérmicas inducidas disponibles para su uso, tal como su uso en un trasplante. Las células de papilas dérmicas inducidas pueden utilizarse para tratar sujetos que tengan trastornos de la piel, tales como quemaduras, cicatrices y caída de pelo.

Las papilas dérmicas (DP) son una población única de células mesenquimales que regulan la formación y el ciclo del crecimiento del folículo piloso. Durante el desarrollo, la mayoría de las células de DP se derivan del mesodermo, sin embargo, las células de DP con funcionalidad equivalente de los pelos cefálicos se originan en la cresta neural (NC, por sus siglas en inglés). La NC es una población de células que se genera transitoriamente a partir del tubo neural dorsal en desarrollo y origina múltiples tejidos que incluyen sistema neural periférico, médula suprarrenal, melanocitos y varios tejidos mesenquimales craneofaciales [19]. El rastreo de linaje (Wnt1-Cre) específico de NC que utiliza ratones con indicador Lox-STOP-Rosa26 o Z/EG proporcionó la evidencia genética de la contribución de la NC a una gran proporción de células de DP cefálicas [20,21,22].

El solicitante ha desarrollado métodos y composiciones que incluyen la derivación de las células de tipo DP funcionales de las células madre embrionarias humanas (hESCs). Véase Gnedeva K., et al., "Derivation of Hair-Inducing Cell from Human Pluripotent Stem Cells" (2015) Derivation of Hair-Inducing Cell from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 10(1): e0116892. doi:10.1371/journal.pone.0116892. En algunas realizaciones, las hESC pueden ser utilizadas para generar células de NC y después células de tipo DP de inducción de pelo en el cultivo. Las células de tipo DP derivadas de hESC (hESC-DPs) expresaron marcadores que se expresan normalmente en células de DP de humano adulto (por ejemplo, p-75, nestina, versican, SMA, fosfatasa alcalina) y fueron capaces de inducir la formación del folículo piloso cuando se trasplantaron debajo de la piel de ratones desnudos inmunodeficientes. Las células de tipo DP derivadas de hESC se modificaron por ingeniería genética para expresar GFP incorporada en la DP de los folículos pilosos recientemente formados y los marcadores adecuados expresados. La señalización de BMP es un factor en la derivación de hESC-DP debido a que el inhibidor de BMP dorsomorfina eliminó la actividad de inducción de pelo de los cultivos de hESC-DP.

Métodos para inducir el crecimiento de pelo

La población de células de papilas dérmicas inducidas realizada por el método de la invención puede ser utilizada para inducir el crecimiento de pelo en un sujeto. En algunas de estas realizaciones, una población de células de papilas dérmicas inducidas se administra al sujeto. Los métodos de administración pueden incluir el trasplante de las células de papilas dérmicas inducidas en la piel del sujeto, por ejemplo la administración puede incluir un trasplante subcutáneo de las células de papilas dérmicas inducidas. Las células de papilas dérmicas inducidas pueden ser administradas en cualquier ubicación de la piel del sujeto, por ejemplo, una ubicación de la piel del sujeto, tal como cuero cabelludo, cara, labio superior, barbilla, ceja, pestaña, brazo, pierna, espalda, torso, mano, pie y abdomen. En algunas realizaciones, la ubicación de la piel del sujeto incluye un tejido cicatricial. En algunas realizaciones, el sujeto tiene alopecia. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano.

Las características de las células de papilas dérmicas inducidas pueden incluir marcadores asociados con las células de papilas dérmicas, tales como proteínas, expresadas como ácidos nucleicos, actividad para inducir la formación del folículo piloso, actividad para inducir la morfogénesis de queratinocitos y actividad para inducir el crecimiento del tallo del pelo. Los marcadores de ejemplo incluyen BMP-4, nogina, N-CAM y p-75, proteínas de matriz extracelular tales como versican (VCAN), actividad de fosfatasa alcalina (AP), nestina, actina de músculo liso y vimentina.

Las características de las células de la cresta neural inducidas pueden incluir marcadores asociados con las células de la cresta neural, tales como proteínas, expresadas como ácidos nucleicos, actividad capaz de generar células tales como melanocitos, cartílago y hueso craneofacial, músculo liso, neuronas periféricas y entéricas y glía. Los marcadores de ejemplo incluyen Sox10, Foxd3, integrina alfa 4, receptor cognado para la fibronectina, CD47, CD184, CD44, P-75 y nestina. En algunas realizaciones, la población de células de la cresta neural inducidas carece además de un marcador seleccionado del grupo que consiste en OCT4, SSEA4, veriscan, actina de músculo liso y fosfatasa alcalina.

Las células de la cresta neural inducidas pueden ser generadas a partir de una población de células madre. Los métodos de ejemplo para generar células de la cresta neural inducidas de las células madre se describen en Bajpai R., et al. Cell Death and Differentiation (2009) 16, 807-825, y Curchoe CL, et al. (2010) Early acquisition of neural crest competence during hESCs neuralization. PLoS One 5: e13890.

Las células madre pluripotentes inducidas pueden ser generadas a partir de varias fuentes, tales como fibroblasto, célula epitelial renal y célula sanguínea. Los métodos de ejemplo para generar células madre pluripotentes inducidas incluyen los descritos en Takahashi, K. y Yamanaka, S (2006) Cell 126 (4): 663-76; Zhou H, et al. (2009) Cell Stem Cell 4 (5): 381-4; Zhou, et al., (2012) Nature Protocols 7 (12): 2080-2089; y Moad, M., et al. (2013) European Urology 64 (5): 753-761. En algunas realizaciones, la población de células madre comprende células madre pluripotentes inducidas humanas generadas a partir de fibroblastos BJ humanos. En algunas realizaciones, la población de células de papilas dérmicas inducidas se obtiene a partir de un sujeto donante. Por ejemplo, una muestra de células puede ser tomada de un sujeto donante y una población de células madre pluripotentes inducidas es generada a partir de la muestra de células. En algunas realizaciones, el sujeto donante y el sujeto son los mismos. En algunas realizaciones, el sujeto donante y el sujeto son diferentes.

Ejemplos

Derivación de hESC-DP utilizando productos células de NC intermedia

Las células de tipo DP humanas fueron obtenidas a partir de las hESC por medio de NC intermedia (FIG.1A). Las hESC fueron inducidas para diferenciarse en células de la cresta neural (hESC-NC) derivadas de hESC como se ha descrito anteriormente [24,25]. Los cultivos de hESC-NC mostraron la expresión robusta de los marcadores de la cresta neural Sox10 y Foxd3 (FIG. 1B). El análisis de citometría de flujo confirmó que casi el 80 % de las células hESC-NC cultivadas expresa el marcador de NC Integrina alfa 4 (ITGA4), el receptor cognado para la fibronectina [26] y la carencia de expresión de OCTA4 y SSEA4, lo que sugiere la ausencia de las hESC no diferenciadas (FIG.

1C).

La cresta neural es una población multipotente de células que originan precursores para varios tejidos mesenquimales [19]. El análisis de FACS mostró que las células hESC-NC en 14 días de diferenciación expresaron marcadores de células madre mesenquimales CD47 (99,95 %), CD184 (20%), y CD44 (52,58%) (FIG. 5). Para generar las células de tipo DP, las hESC-NC fueron inducidas además para diferenciarlas en el medio DMEM-F12 que contenía 10% de FBS durante dos semanas adicionales (FIG. 1A). Las células de DP son células madre dérmicas somáticas [27] y expresan los marcadores de células madre mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés) [28]. Por consiguiente, las células mesenquimales fueron enriquecidas a partir de la diferenciación de los cultivos de hESC-NC utilizando la adherencia preferencial con el plástico de cultivo tisular [29]. De forma rutinaria, aproximadamente un 20 % de los cultivos de hESC-NC se adhirió al plástico y se pasó en un medio que contenía suero que origina las células de tipo DP derivadas de hESC (hESC-DP). Estos resultados sugieren que las células de NC derivadas de hESC contienen la población progenitora mesenquimal de células que pueden ser enriquecidas utilizando un protocolo de aislamiento y condiciones de cultivo para las células MSC y DP.

Caracterización de las células hESC-DP

Se han recopilado los genes característicos de las células de DP de la piel dorsal de ratón [7], sin embargo, se conoce poco acerca de la expresión génica en las células de papilas dérmicas cefálicas humanas. Los marcadores para ambas células de DP humanas y de ratón se utilizaron para caracterizar las hESC-DP mesenquimales. Los marcadores comunes para la DP y la cresta neural, P-75 y Nestina, se detectaron en las células hESC-NC, las células de DP humanas (hDP, por sus siglas en inglés) cultivadas (aisladas de la piel humana normal) y las células hESC-DP (FIG. 1D) [21]. Otros marcadores de DP humanas: Versican, Actina de músculo liso (SMA) y Fosfatasa alcalina (AP) no fueron detectados en las células hESC-NC, aunque estaban presentes en los cultivos de hDP y hESC-DP (FIG. 1D). La especificidad de la tinción para Nestina, Versican, SMA y AP en hDP fue confirmada utilizando las secciones de la piel del cuero cabelludo humano (FIG. 6). La expresión de los marcadores de NC P-75 (~30 %) y Nestina (~90 %) en hESC-NC fue similar a la expresión en los cultivos de hESC-DP (p-75 ~40 %, Nestina ~90 %) y mostró un patrón cercano de la expresión en las células hDP (P-75 ~20 %, Nestina -90 %). En contraposición, las células hESC-NC fueron negativas para Versican (<1 %), SMA (< 3 %) y carecen por completo de la actividad de AP, mientras la mayoría de las hESC-DP expresó Versican (~70 %), SMA (~70 %) y mostró un nivel alto de actividad de AP similar al encontrado en las células de DP humanas, que eran casi 100 % positivas para Versican, SMA y AP. La morfología total de la célula y la ubicación subcelular de los marcadores fueron similares entre los cultivos de las células de DP humanas y las hESC-DP. Para evaluar cuantitativamente la dinámica de expresión de los marcadores de DP durante la diferenciación de las hESC-NC en las hESC-DP, se utilizó el análisis de Q-PCR. Los niveles de expresión de todos los marcadores humanos de DP analizados (p-75, Nexina-1, Versican, SMA y Vimentina) aumentaron progresivamente durante la diferenciación de hESC-NC y después de dos semanas fueron comparables o superiores a los encontrados en los cultivos de células de DP humanas (FIG. 1E). Considerados en conjunto, estos resultados sugieren la presencia de células de tipo DP humanas dentro de los cultivos de hESC-DP.

Propiedades de inducción de pelo de hESC-DP tras el trasplante

Se investigó si las células hESC-DP son competentes para inducir la formación de folículos pilosos tras el trasplante en ratones atímicos nu/nu (Desnudos). Se utilizó el método de parche de trasplante de células previamente utilizado para demostrar el potencial de inducción de pelo de los precursores dérmicos derivados de la piel de ratón [27]. Brevemente, las células de interés se combinaron con las células epidérmicas de ratón (queratinocitos) aisladas de animales recién nacidos y trasplantadas subcutáneamente en los ratones desnudos como una suspensión celular espesa. Debido a que los ratones desnudos tienen el antecedente genético BALB/c (albino), los pelos recientemente formados y preexistentes pudieron ser distinguidos al utilizar las células epidérmicas de los ratones C57BL/6 con pelo oscuro para el trasplante. La capacidad de inducción de pelo se midió como el número de pelos formados por trasplante. El método de parche no permite que los pelos recientemente formados entren en la superficie de la piel de manera que alteren la morfología del folículo piloso en fases avanzadas de morfogénesis. Por lo tanto, el análisis se llevó a cabo a los 14 posteriores al trasplante cuando se formaron los folículos pilosos, aunque no estaban completamente desarrollados. El trasplante de las células epidérmicas solas dio lugar a una inducción mínima de pelo, probablemente debido a la presencia de las células de DP endógenas (FIG. 2A, 2B). Las células epidérmicas de ratón (mDC, por sus siglas en inglés), utilizadas como control positivo, indujeron un crecimiento robusto de pelo (P=0,0282) con una eficiencia similar a la que se informa previamente para el mismo modelo de trasplante [27] (FIG.

2A, 2B). Como se esperaba, las células humanas de DP cultivadas aisladas de la piel del cuero cabelludo de adulto no indujeron un número significante de pelos si se compara con el control negativo (solo queratinocitos) (FIG. 2A, 2B). De hecho, se ha demostrado que las células de DP humanas contribuyen a la nueva formación de las transespecies de pelos únicos [14] aunque la capacidad robusta de inducción de pelo de las células de DP humanas en el modelo de ratón no se ha informado [18]. En contraposición, se observó una inducción significativa de pelo (P=0,0002) mediante las hESC-DP similar a la de mDC (FIG. 2A, 2B).

Para controlar la dinámica de las propiedades de inducción de pelo durante la diferenciación de las hESC hacia las células de tipo DP, se trasplantaron hESC-DPs y varias poblaciones relacionadas con la célula, concretamente, las hESC diferenciadas durante dos semanas en un medio de DP omitiendo la etapa intermedia de inducción de la NC (hESC), hESC-NC y las hESC-DP parcialmente diferenciadas (7 días de diferenciación) (FIG. 2C). Sorprendentemente, el trasplante de las hESC diferenciadas en las condiciones de suero así como las hESC-NC dio como resultado la inhibición significativa del crecimiento de pelo en comparación con el control negativo (FIG. 2C). Por consiguiente, la diferenciación de las células hESC-NC a hESC-DP dio como resultado un aumento de casi 100 veces en la capacidad de inducción de pelo (FIG. 2C). El número de pelos formados en los trasplantes parcialmente diferenciados de las hESC-NC no fue significativamente diferente al del control negativo (FIG. 2C).

Estos resultados sugieren que las células hESC-DP descritas en este caso tienen una capacidad robusta de inducción de pelo similar a la capacidad de las células dérmicas de ratón neonatal y que las hESC-NC adquieren esta capacidad a lo largo del procedimiento de diferenciación.

Las hESC-DP se incorporan en DP de los folículos pilosos formados de novo

Las hESC-DP trasplantadas pueden incorporar/activar las células de DP de ratón endógenas, o mediar directamente la inducción observada de la formación del folículo piloso. Para abordar esta cuestión, las hESC-DP fueron modificadas por ingeniería genética para expresar la GFP y se analizaron los folículos pilosos recientemente formados in situ (FIG. 3). Catorce días después del trasplante bajo la piel de los ratones desnudos utilizando el método de parche, se observó la formación de cabello de novo que puede ser determinada por la pigmentación negra de los tallos del pelo. La observación estereoscópica de los trasplantes de hESC-DP, sugirió que la mayoría de las DP y las cápsulas dérmicas de los pelos recientemente formados estaban compuestas por células positivas a GFP (FIG. 3A). La microscopía confocal de los pelos de montaje completo aislados de los trasplantes de hESC-DP mostró la presencia de células de DP positivas a GFP dentro de los pelos recientemente inducidos (FIG. 3C, 3D, 3E). Las DP positivas a GFP de estos pelos se tiñeron positivamente para los marcadores específicos, concretamente, Versican (FIG. 3C) y AP (FIG. 3D). Además de las DP positivas a GFP, se observó la presencia de células positivas a GFP en el área de las vainas radiculares exterior e interior (FIG. 3E). También se observó la presencia de gránulos de melanina en el citoplasma de las células positivas a GFP en la matriz de pelo (FIG. 3F). Estos datos sugieren que las hESC-DP trasplantadas pueden adquirir la función de inducción de pelo de las células de DP.

Derivación y caracterización de hIPSC-DP

Además de la línea H9 de ESC humana (ejemplo de referencia solo), se utilizaron tres líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) previamente caracterizadas generadas a partir de los fibroblastos BJ humanos normales [30]. Las células hIPSC-NC se generaron después del protocolo descrito anteriormente y se analizaron en busca de la presencia de los marcadores neuroepiteliales Sox2, Sox9 y nestina. Las hIPSC-NC obtenidas de las tres líneas mostró un patrón similar de expresión. Solo aproximadamente el 50 % de las células hIPSC-NC expresó Sox2 y Sox9, la tinción adicional de nestina reveló diferencias morfológicas cuando se comparó con las células hESC-NC (FIG. 8A, FIG. 1D).

Las células hIPSC-NC se diferenciaron para obtener hIPSC-DP utilizando el protocolo descrito anteriormente. La inmunotinción para los marcadores de DP SMA, p-75 y nestina así como el análisis de Q-PCR de Versican, Nexina-1, p-75, Vimentina y SMA mostró que solo una línea de hIPSC (BJ16) originó células con alguna expresión de los marcadores de DP en comparación con las células hESC-DP (FIG. 8B). La FIG. 8C muestra los niveles de expresión génica en las hIPSC-DP en relación con las células hESC-NC.

Las células BJ16 IPSC-DP se caracterizaron además por el trasplante de parche. Esta población de células no indujo un número significativo de pelos en comparación con el control negativo. Sin embargo, el trasplante de células BJ16 IPSC-DP positivas a GFP dio como resultado la formación de pelos con papilas dérmicas positivas a GFP y cápsulas dérmicas aunque con frecuencias mucho más bajas (1 pelo de 50) que en el caso de las células hESC-DP. La presencia de las células positivas a GFP dentro de DP de estos pelos fue confirmada en secciones (FIG. 3B). Cabe señalar que, la integración de las células trasplantadas en el área de las papilas y cápsula de los pelos recientemente formados se observó solo en el caso de las células hESC-DP y hIPSC-DP. Aunque las células de DP humanas trasplantadas modificadas por ingeniería genética para expresar la GFP estaban presentes en la dermis, estas células no fueron encontradas en la DP de los folículos pilosos vecinos (FIG. 7). Estos resultados sugieren que aunque las células de tipo DP derivadas de células pluripotentes humanas comparten la expresión de algunos marcadores específicos con las células de DP aisladas de la piel humana adulta, su capacidad de inducción de pelo es más alta y pueden aplicarse al tratamiento a base de células de las enfermedades de caída de pelo.

Papel de la señalización de BMP en la derivación de hESC-DP

Los mecanismos que participan en la generación de DP de la NC migratoria durante el desarrollo son desconocidos. Sin embargo, el suero bovino fetal utilizado para inducir la diferenciación de las células de DP y NC es conocido por contener proteínas morfogenéticas óseas (BMPs, por sus siglas en inglés) [31], que son esenciales en la especificación mesodérmica durante el desarrollo del embrión [32,33] y la inducción mesodérmica de hESC in vitro [34]. Se descubrió que la señalización de BMP es un mecanismo que mantiene el potencial de inducción del folículo piloso en la piel del lomo del ratón DP [9]. Se investigó si la señalización de BMP desempeña un papel en la derivación de las células hESC-DP de las células hESC-NC que utilizan un inhibidor de BMP selectivo dorsomorfina bien estudiado [35]. La adición de dorsomorfina durante la conversión de NC a DP dio como resultado cambios obvios en la morfología de la célula en comparación con el control positivo, en particular, las células hESC-DP tenían una morfología característica alargada de tipo fibroblastos mientras que las células tratadas con dorsomorfina eran hexagonales y demostraron la presencia en múltiples gránulos en su citoplasma (FIG. 4A). Es más, las células tratadas con dorsomorfina trasplantadas debajo de la piel de los ratones desnudos fueron incapaces de inducir la formación de pelo, lo que sugiere la pérdida de las propiedades de DP (FIG. 4A). El análisis de Q-PCR de las células tratadas con dorsomorfina reveló que la inhibición de la señalización de BMP dio como resultado la disminución significativa en los niveles de los ARNm que codifican los marcadores específicos de DP Versican (P=0,0002), Corina (P=0,0022), Nexina-1 (P=0,0008) y Vimentina (P=0,0001) pero no el marcador de NC pan p-75 (no cambiado) o el marcador de músculo liso SMA (aumentado significativamente) (FIG. 4B). Sin embargo, las células de DP no se derivaron de los cultivos de hESC-NC utilizando BMPs ya que solo los agentes de diferenciación sugieren que otras vías de señalización estarán involucradas en la adquisición de destino de células de DP cefálicas. Estos resultados indican que la señalización de BMP es necesaria pero no suficiente para la generación y/o mantenimiento de las hESC-DP de inducción de pelo de las células hESC-NC.

Los resultados sugieren que las células de NC derivadas de hESC cultivadas en un medio que contenía suero adquieren progresivamente los marcadores de las células de DP humanas y originan la población de células adherentes con el potencial de inducción de pelo. La capacidad robusta de inducción de pelo de las hESC-DP en comparación con las células de DP humanas podría reflejar un gran parecido de la población anterior con la población embriónica o neonatal de las células precursoras de papilas dérmicas, que se sabe que inducen la formación de folículos pilosos a través de diferentes mecanismos [36].

Es probable que los cultivos de hESC-DP sean heterogéneos. La capacidad de inducción de pelo promedio mostrada por estos cultivos fue similar a la capacidad de las células dérmicas de ratón neonatal. Se demostró que las células de DP de ratón primarias purificadas prospectivamente son aproximadamente cinco veces más eficientes en la inducción de pelo que los preparados dérmicos de ratón [27]. Por consiguiente, es posible que los cultivos de hESC-DP comprendan una subpoblación de células de tipo DP de inducción de pelo, con una capacidad de inducción de pelo aún mayor que el promedio informado anteriormente. Adicionalmente, cuando las hESC-DP positivas a GFP se trasplantaron, se observó la presencia de células positivas a GFP en otros compartimientos de los folículos pilosos (es decir, la vaina radicular exterior, la vaina radicular interior y la matriz de pelo). Dado que se sabe que los melanocitos se originan a partir de CN migratoria durante el desarrollo, es probable que algunas células hESC-NC originen los precursores de melanocitos dentro de los cultivos de hESC-DP. De manera similar, es posible que algunas hESC-NC sean capaces de originar los queratinocitos de los pelos recientemente formados debido a que las células de NC de roedores pueden originar las células madre epidérmicas en la protuberancia de los bigotes [37]. Estos datos sugieren que las hESC-DP son una población mezclada de células derivadas de NC que contienen células de tipo DP con propiedades de inducción de pelo, pero también podrían contener células de formación de melanocitos y queratinocitos.

Los resultados sugieren que la etapa intermedia de la diferenciación de hESC en el linaje de NC parece que es crítica, si se omite la inducción de Cn, se pierde por completo la actividad de inducción de pelo. Dirigir las hESC a las células de NC podría limitar la variedad de tipos de células mesenquimales al subconjunto que se especifica en el desarrollo aguas abajo de las células de NC en la piel (por ejemplo, DP cefálica durante el desarrollo, melanocitos, protuberancia cefálica). Por consiguiente, las células de tipo hESC-DP son enriquecidas prominentemente en las células de tipo DP de inducción de pelo que utilizan condiciones relativamente comunes de enriquecimiento mesenquimal tales como la diferenciación en el medio que contiene suero y la selección para los tipos de células adherentes.

Las líneas de iPSC diferentes pueden tener una propensión variable para diferenciarse hacia las células de tipo DP. Las células de hiPSC-DP no fueron capaces de inducir la formación del folículo capilar cuando se trasplantaron utilizando el método de parche y tuvieron una frecuencia baja de incorporación en la DP de los folículos pilosos recientemente formados. Esto podría ser el resultado del fenómeno de memoria epigenética, que se conoce por influir en la diferenciación de IPSC [38,39,40]. Las líneas de IPSC utilizadas para estos experimentos se derivaron de los fibroblastos BJ [30]. Su origen mesodérmico provocaría dificultades en la primera etapa de diferenciación, inducción de las células de la cresta neural ectodérmica. De hecho, solo algunas de las células hIPSC-NC expresaron los marcadores neuroepiteliales Sox2 y Sox9 (FIG. 8A, 8B). Sin embargo, una comparación general de las múltiples líneas de hiPCS y hESC sugirió que cuando se compararon números suficientemente grandes de líneas de hIPSC con las líneas de hESC, se observó una superposición mayor en su potencial de diferenciación [41]. Por lo tanto, aunque la eficiencia absoluta puede variar entre líneas diferentes de hESC y hiPSC, debe ser posible derivar las células con propiedades de inducción de pelo de las muchas hiPSC [42].

Recientemente, se demostró que las SKP son muy potentes en la inducción de pelo [27], pero la pérdida progresiva de las SKP en un proceso de envejecimiento podría dificultar el aislamiento de las SKP autólogas para las terapias de regeneración capilar para personas de edad avanzada [43]. La derivación de las células de tipo DP de inducción de pelo de las hESC representa la primera etapa hacia el desarrollo de un tratamiento a base de células para personas con caída de pelo.

Materiales y métodos

Cultivo de hESCs: la línea de hESC H9 (ejemplo de referencia únicamente) se mantuvo en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados como se ha descrito anteriormente [24]. Generación de las células de NC a partir de hESC: el protocolo de diferenciación se ha descrito anteriormente [24,25]. Generación de ESC-DP: las células de NC en un pase se cultivaron durante 3 días con Medio de DP de la siguiente composición: DMEM/F-12 Glutamax (Gibco 10829-018), 10 % de FBS (Gibco n.° 10437), L-glutamina 1 mM (Gibco 25030-081), 1 X antibiótico/antimicótico (Omega Scientific AA-40). Después de eso, se disociaron en una suspensión de célula única con 0,25% de solución de Tripsina-EDTA (Gibco 25200) y se cultivaron en placas en placas de cultivo no recubiertas en una densidad de 100 mil células/mirr2 Las células flotantes que no se unieron después de 24 horas se eliminaron con el cambio de medio en el siguiente día. Las células unidas crecieron en placas de plástico no recubiertas con el cambio de Medio cada día; el cultivo se pasó cada 4-5 días.

Análisis de inmunohistoquímica y FACS: los cultivos de células se fijaron con el 4% de PFA en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente; las muestras de tejido se fijaron a 4 °C durante la noche. Después de la fijación, las células se lavaron en PBS 3 veces durante 5 minutos y las muestras de tejido fueron embebidas en OCT para las secciones congeladas o fueron utilizadas para las disecciones de pelo y las preparaciones de montaje completo. Las células y las secciones se bloquearon en 4 % de BSA o 10 % de suero de cabra con 0,05 %-0,3 % de Triton X 100 (Sigma T8787) en PBS durante una hora antes de la tinción. Los anticuerpos primarios se aplicaron durante la noche a 4 °C. A continuación, las células o secciones se lavaron en PBS durante 3 veces 15 minutos cada una. Los anticuerpos secundarios (diluidos 1:500 en PBS) se aplicaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron en PBS durante 3 veces 10 minutos cada una. Los núcleos se marcaron con Hoechst o Dapi. Para el análisis FACS, las células de interés se separaron con Accutase y se volvieron a suspender en 3 % de BSA/PBS durante 20 minutos para bloquear la unión no específica. Después, las células se incubaron con los anticuerpos primarios durante 30 minutos en hielo. Después, las células se lavaron en 3 ml de PBS y se volvieron a suspender en 3% de BSA/PBS con los anticuerpos secundarios adecuados (1:1000) durante 30 minutos y se lavaron con 3 ml de PBS antes de volver a suspenderse en 1 % de BSA/PBS y se incubaron con yoduro de propidio (PI). Las células se clasificaron de acuerdo con la fluorescencia (FACSVantageSE DiVa, BD Biosciences, San Jose) y los datos se analizaron con el software FlowJo. Se usaron los anticuerpos siguientes: monoclonal de ratón CD47 (R&D), monoclonal de ratón CD184 (eBioscience), monoclonal de ratón CD44 (Novus), policlonal de cabra Foxd3 (Santa Cruz), policlonal de conejo GFP (Invitrogen), monoclonal de ratón ITGA4 (R&D), monoclonal de ratón Nestina (Chemicon), monoclonal de ratón OCT3/4 (Santa Cruz), policlonal de conejo P-75 (Chemicon), monoclonal de ratón SMA (Chemicon), policlonal de conejo Sox2 (Abcam), policlonal de conejo Sox9 (Millipore), policlonal de conejo Sox10 (Abcam), monoclonal de ratón SSEA4 (R&D), monoclonal de ratón Versican (Seikagaku Corporation).

Q-PCR: el ARN total se extrajo utilizando el kit RNeasy y 1 |jg de ARN total que se transcribió inversamente utilizando el kit Quantitect (Qiagen) de acuerdo con las sugerencias del fabricante para realizar el ADNc. El análisis Q-PCR se realizó con la mezcla maestra SyberGreen (Invitrogen) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Para Q-PCR, se utilizó el nivel de expresión 18S para la normalización y los datos se analizaron utilizando el método de curva estándar. El análisis Q-PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización inicial: 10 min a 95 °C; 40 ciclos de desnaturalización: 30 s a 95 °C, hibridación: 1 min a 56 °C, extensión: 30 s a 72 °C; y un ciclo final de desnaturalización durante 1 min a 95 °C, hibridación durante 30 s a 65 °C y desnaturalización final durante 30 s a 95 °C. Los cebadores de Q-PCR en tiempo real se resumen en la TABLA 1.

TABLA 1

continuación

Células: se obtuvieron células de ESC-DP en pases diferentes. Las células se disociaron con la suspensión de célula única con 0,1 % de Tripsina-EDTA (Gibco 25200) y se lavaron 3 veces con PBS mediante centrifugado en serie (1200 RPM durante 5 minutos). Finalmente, las células se volvieron a suspender en medio de DP a una concentración de 5 millones por 100 pl y se mantuvieron en hielo hasta su trasplante.

Las células dérmicas y epidérmicas de ratón se obtuvieron a partir de la piel de ratones p0-p2 BL6. Las pieles del lomo se aislaron y colocaron en hielo, se lavaron en PBS con antibiótico/antimicótico (1X final; Omega Scientific AA-40) 5 veces durante 5 minutos de agitación y se incubaron en 0,01 % de Dispasa (Sigma) en PBS durante la noche a 40 °C. Las capas epidérmicas de las pieles fueron aisladas con fórceps, se lavaron en PBS durante 5 min y se incubaron en 0,1 % de una solución de Tripsina-EDTA a 370 °C durante 8 minutos. Las capas dérmicas de la piel se homogeneizaron con tijeras y se digirieron con 0,1 % de la solución de Tripsina-EDTA a 370 °C durante 45 minutos. La actividad enzimática se bloqueó con la adición del medio de DP y las epidermis o dermis se pipetearon vigorosamente durante 10 minutos. La suspensión celular se aisló con un tamizador celular (BD Falcon 9261365) y se lavó en PBS mediante centrifugado 3 veces (1200 RPM durante 5 minutos). Las células se volvieron a suspender en medio de DP a 5 millones de células por 100 pl y se mantuvieron en hielo hasta su trasplante.

Células de papilas dérmicas humanas: el uso de las muestras derivadas de tejido humano en este estudio se limitó al uso de tejido de resto de piel de 2 procedimientos médicos cosméticos. Las pieles se lavaron en PBS con antibiótico/antimicótico (1X final; Omega Scientific AA-40) 15 veces durante 5 minutos de agitación. Luego, se aisló la grasa que contenía los folículos pilares con un escalpelo y se incubó en 0,2 % de Dispasa (Sigma) en DMEM/F12 durante la noche a 40 °C. Los folículos pilosos se aislaron de la grasa con los fórceps y se incubaron en 0,1 % de Colagenasa de tipo I (Sigma) en DMEM/F12 durante 5-7 horas. Luego, las DP se separaron del resto de los folículos mediante el pipeteo vigoroso durante 10 minutos. Después de que los folículos pilosos se asentaran en el fondo, las DP se mantuvieron en el sobrenadante y se aislaron centrifugando a 1000 RPM durante 5 minutos.

Trasplante de célula: el método de trasplante de células fue descrito anteriormente en detalle [27]. Brevemente, se combinaron 100 pl de suspensión (5x105 células) de células de interés (ESC-NC, ESC-DP temprana, ESC-DP, rDP p2) con 100 pl de suspensión de células epidérmicas (5x105 células) y se trasplantaron con inyecciones subcutáneas a ratones inmunodeficientes (cepa Atímica Nu/Nu). Después de 14-21 días, los ratones se sacrificaron y se analizaron los trasplantes. Para el control negativo se trasplantaron solo células epidérmicas.

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La expresión "que comprende/n" tal como se usa en el presente documento es sinónimo de "que incluye/n", "que contiene/n", o "caracterizado/a por" y es inclusiva o abierta y no excluye elementos o etapas de métodos adicionales que no se hayan mencionado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una población de células de papilas dérmicas inducidas, comprendiendo dicho método: obtener una población de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC);

diferenciar la población de hIPSC para generar una población intermedia de células de la cresta neural derivadas de células madre pluripotentes inducidas (hIPSC-NC) que comprende

(i) cultivar las hIPSC en condiciones para formar agolpamientos;

(ii) cultivar los agrupamientos en suspensión para formar esferas;

seleccionar células adherentes de la población de hIPSC-NC inducidas; y

pasar dichas hIPSC-NC adherentes en un medio que contenga suero para generar una población de células de papilas dérmicas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC-DP);

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las hIPSC se generan a partir de una fuente seleccionada del grupo que consiste en fibroblastos, células epiteliales renales y células sanguíneas.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las hIPSC se generan partir de fibroblastos BJ humanos.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población de hIPSC-NC inducidas comprende además un marcador seleccionado del grupo que consiste en integrina alfa 4, receptor cognado para la fibronectina, CD184, CD44, P-75 y nestina.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población de células de la cresta neural inducidas carece además de un marcador seleccionado del grupo que consiste en veriscan, actina de músculo liso y fosfatasa alcalina.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población de células de papilas dérmicas inducidas comprende además un marcador seleccionado del grupo que consiste en veriscan, actina de músculo liso, fosfatasa alcalina y vimentina.

7. Una población de células de papilas dérmicas inducidas preparada por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una población de células de papilas dérmicas inducidas (hIPSC-DP) para su uso en un método para inducir el crecimiento de pelo en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar dicha población de células de papilas dérmicas inducidas al sujeto, en donde dichas hIPSC-DP se han preparado por un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la población de hIPSC-DP inducidas se ha preparado por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las hIPSC se han obtenido a partir de un sujeto donante.

10. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con 9, en donde el sujeto donante y el sujeto son los mismos.

11. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el sujeto donante y el sujeto son diferentes.

12. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende pelo; y/o en donde la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto seleccionada del grupo que consiste en cuero cabelludo, cara, labio superior, barbilla, ceja, pestaña, brazo, pierna, espalda, torso y abdomen; y/o en donde la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende un tejido cicatricial.

13. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde el sujeto tiene alopecia.

14. Una población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso en un método terapéutico para inducir el crecimiento de pelo en un sujeto que padece una enfermedad de caída de pelo, comprendiendo dicho método administrar dicha población de células de papilas dérmicas inducidas a dicho sujeto, en donde dichas hIPSC-DP se han preparado por un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la administración comprende un trasplante subcutáneo.

16. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende pelo en la ubicación en una población de sujetos; seleccionada opcionalmente del grupo que consiste en cuero cabelludo, cara, labio superior, barbilla, ceja, pestaña, brazo, pierna, espalda, torso y abdomen; y/o en donde la administración se realiza en una ubicación de la piel del sujeto que comprende un tejido cicatricial.

17. La población de células de papilas dérmicas inducidas para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el sujeto tiene alopecia.