CN115671367A - 含有间充质干细胞的活性因子敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医用生物敷料技术领域，且公开了一种含有间充质干细胞的活性因子敷料及其制备方法。所述含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，制得材料溶液；将磺化多糖、去离子水、生物活性因子混合制得活性因子组合物；将间充质干细胞悬液、材料溶液混合制得细胞材料混合液；将细胞材料混合液与活性因子组合物混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。本发明的含有间充质干细胞的活性因子敷料具有加速伤口愈合修复、止血、镇痛抑菌等作用。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物敷料技术领域，具体为含有间充质干细胞的活性因子敷料及其制备方法。
背景技术
敷料，是包伤的用品，用以覆盖疮、伤口或其他损害的材料。随着对创面愈合过程的病理生理的深入研究，人们对创面愈合过程的理解也越来越深刻，从而导致了医用创面敷料的不断改进与发展。由于伤口的种类繁多，且每一个伤口在其愈合的不同阶段对敷料的要求也不同。而目前现有的敷料主要具备的功能是抑菌、加快愈合等，缺乏对损伤局部创面的修复。
大量的临床前和临床试验表明，间充质干细胞治疗可以加速伤口愈合，为各种难以愈合的慢性伤口的治疗带来了希望。在组织工程与再生医学领域，除了生物材料之外，种子细胞也是极为关键的一个要素。间充质干细胞具有较强的增殖分化能力，同时不存在社会伦理争议，已成为组织工程中的首选种子细胞。
生物活性因子，是指来自生物体内的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要是生物活性多肽和细胞因子两大类。细胞因子是指由活化免疫细胞或非免疫细胞(包括骨髓、胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等)合成分泌的能调节细胞生理功能，介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应的小分子多肽，它们与免疫球蛋白和补体一样属于分泌型免疫分子。生长因子属于细胞因子，是一类刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子。
申请号为CN112891617A的中国专利“含有间充质干细胞的液体医用生物功能敷料及其制备方法”提出了负载间充质干细胞作为损伤修复的基质，制备液体医用生物功能敷料。本方法利用间充质干细胞不仅能促进损伤组织的再生与修复，还拥有良好的免疫调节能力，通过调控免疫细胞的增殖分化和功能状态，调节炎症因子水平，以应对各种炎症相关疾病。但该敷料中功能性物质单一，应用范围不广。
申请号为CN102895704B的中国专利“一种促进成骨和血管化的生物活性因子组合物”提出了利用生物活性因子、磺化多糖来作为功能性物质，充分发挥了生物活性因子诱导间质细胞分化为骨或软骨、诱导上皮发育、在体内诱导血管新生、诱导骨形成等作用。但该组合物需冻干低温保存，且功能范围较窄，应用范围不广。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各一段长度；将清洗好的脐带转移至70％医用酒精中杀菌一段时间后，及时转入到生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，培养瓶放置在细胞培养箱中静置一段时间，静置后向培养瓶内加入间充质干细胞培养液，放置细胞培养箱中，继续培养一段时间，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入间充质干细胞培养液，在细胞培养箱中培养一段时间后，吸弃培养瓶中培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，静置消化一段时间，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入磷酸盐缓冲液，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将磺化多糖溶解于去离子水中，配制成磺化多糖水溶液，再加入生物活性因子，混合均匀，即得到活性因子组合物；
步骤(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液混合制得细胞材料混合液；
步骤(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
优选地，所述步骤(1)制备间充质干细胞悬液中，取新生儿新鲜脐带，脐带组织来源为临床健康婴儿娩出后的废弃物，采集之前与产妇及其家属均签署知情同意书，方案经相关流程批准使用。
优选地，所述步骤(1)制备间充质干细胞悬液中，用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中；用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精，70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30；在30mL生理盐水中将脐带剪碎至1mm3。
优选地，所述步骤(1)制备间充质干细胞悬液中，将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75cm2的细胞培养瓶内接种40-50块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液，间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1；放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养8-12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养3-5天后，吸弃培养瓶中培养液。
优选地，所述步骤(1)制备间充质干细胞悬液中，用pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液1-3mL，静置消化1-3min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液20-40mL，得到间充质干细胞悬液；其中pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液的制备方法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50mL与0.2mol/L氢氧化钠溶液35mL，加新沸过的冷水稀释至200mL，摇匀即得pH为7.2的磷酸盐缓冲液；取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液；取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL，即得pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述步骤(1)制备材料溶液中，将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL。
优选地，所述步骤(1)制备活性因子组合物中，将磺化多糖溶解于去离子水中，配制成10μg/mL磺化多糖水溶液，按生物活性因子与磺化多糖的质量比为1:(0.1-0.2)加入生物活性因子；
优选地，磺化多糖包括硫酸肝素，10μg/mL磺化多糖水溶液即为10μg/mL硫酸肝素水溶液；
优选地，生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成。
优选地，所述步骤(2)中，间充质干细胞悬液、材料溶液间体积比为(1-3):(5-7)。
优选地，所述步骤(3)中，细胞材料混合液与活性因子组合物间体积比为20:1。
优选地，一种采用含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法制备得到的含有间充质干细胞的活性因子敷料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用的间充质干细胞具有抑制炎性因子的表达，调节多种免疫细胞的数量和比例，进而影响炎症周围细胞的生长与代谢及功能的发挥和损伤修复，并对局部微环境进行调节的作用；同时还通过诱导血管生成和组织形成来加速创面闭合、减少瘢痕形成来促进创面修复，采用的生物活性因子同样具有促进加快损伤组织修复愈合的作用，两者协同作用，其他有益物质制备敷料，制备的敷料有加速伤口愈合修复、止血、镇痛抑菌等作用。
附图说明
图1是本发明制备细胞材料混合液的流程图；
图2是本发明制备活性因子组合物的流程图；
图3是本发明制备含有间充质干细胞的活性因子敷料的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种40块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养8天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养3天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.2的磷酸盐缓冲液(取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50mL与0.2mol/L氢氧化钠溶液35mL，加新沸过的冷水稀释至200mL，摇匀即得pH为7.2的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液1mL，静置消化1min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.2的磷酸盐缓冲液20mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.1加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为1:5混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
实施例2
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种50块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.3的磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液3mL，静置消化3min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.3的磷酸盐缓冲液40mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.2加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为2:6混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
实施例3
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种45块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养10天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养4天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL，即得pH为7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液2mL，静置消化2min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液40mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.2加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为3:7混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
实施例4
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种48块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养9天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养4天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.3的磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液2mL，静置消化2min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.3的磷酸盐缓冲液30mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.15加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为3:5混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
实施例5
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种42块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养11天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养4天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.2的磷酸盐缓冲液(取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50mL与0.2mol/L氢氧化钠溶液35mL，加新沸过的冷水稀释至200mL，摇匀即得pH为7.2的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液1mL，静置消化1min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.2的磷酸盐缓冲液25mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.2加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为1:6混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
实施例6
本实施例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液及活性因子组合物；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种45块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.3的磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液3mL，静置消化3min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.3的磷酸盐缓冲液30mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.1加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为1:7混合制得细胞材料混合液；
(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
对比例1
本对比例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备材料溶液及活性因子组合物；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将硫酸肝素溶解于去离子水中，配制成10μg/mL硫酸肝素水溶液，按生物活性因子与硫酸肝素的质量比为1:0.15加入生物活性因子，其中生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成，混合均匀，即得到活性因子组合物；
(2)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的材料溶液与制得的活性因子组合物以体积比为20:1混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
对比例2
本对比例公开一种含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备间充质干细胞悬液、材料溶液；
其中，制备间充质干细胞悬液包括以下步骤：
将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精(70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30)中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎至1mm3，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75平方厘米的细胞培养瓶内接种48块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液(间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1)，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养9天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养4天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH为7.3的磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液)洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液2mL，静置消化2min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.3的磷酸盐缓冲液30mL，得到间充质干细胞悬液；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL，制得材料溶液；
(2)细胞材料混合液的制备；
将制得的间充质干细胞悬液、材料溶液以体积比为3:5混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料；
以上所有实施例、对比例中，青霉素和链霉素来自Gibco公司；RPMI-1640培养液来自Hyclone公司；0.125％-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(0.125％-0.25％是指胰蛋白酶在胰蛋白酶-EDTA消化液中体积占比为0.125％-0.25％；如0.125％胰蛋白酶-EDTA消化液即胰蛋白酶在胰蛋白酶-EDTA消化液中体积占比为0.125％)来自Gibco公司；DMEM/F12来自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)来自Hyclone公司；70％医用酒精来自河南六鹤药业集团有限公司；生理盐水来自丽尔医疗科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠来自河南欣之源化工产品有限公司，磷酸氢二钠CAS号为7558-79-4，磷酸二氢钾CAS号为7778-77-0；氢氧化钠来自陕西瑞佳优化工有限公司，CAS号为1310-73-2；羧甲基壳聚糖来自湖北泰多源生物工程有限公司；透明质酸钠来自湖北兴琰新材料科技有限公司，CAS号为9067-32-7；海藻糖来自济南允诚生物科技有限公司，CAS号为99-20-7；硫酸肝素来自上海酶联生物科技有限公司；BMP-7来自上海齐态生物科技有限公司，其中，BMP表示骨形态发生蛋白；人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子来自Gibco公司；5％二氧化碳是指二氧化碳气体体积与气体总体积比v/v为5％；新沸过的冷水为煮沸后冷却后的水，俗称凉白开水；生理盐水浓度为0.9％，每100mL生理盐水中含有氯化钠0.9g。
以上对比例是在实施例4的基础上，对比例1中未制备且未使用间充质干细胞悬液，对比例2中未制备且未使用活性因子组合物。
试验例
对实施例1-6和对比例1-2中制得的含有间充质干细胞的活性因子敷料进行促伤口愈合的试验，具体试验步骤如下：
选取160只健康小鼠，放入气体麻醉机中用异氟烷进行麻醉，再用碘伏对其背部进行剃毛消毒，然后用手术刀在背部造成直径约1cm的全皮层切除伤口，出血后，先用普通灭菌纱布吸收血液，将实施例1-6及对比例1-2制得的敷料涂抹在伤口处，并用医用胶带包裹伤口；每组20只小鼠，每只小鼠单笼饲养，每组每3天换药一次，连续一个月，观察伤口愈合情况，以伤口无炎症、伤口愈合完整为判断标准，统计小鼠愈合疗效，其中，疗效判定标准为：治愈是伤口愈合，显效是伤口愈合80％以上，有效是伤口愈合40％以上，无效，死亡。试验结果如表1所示：
表1实施例各组与对比例各组的疗效比较
由试验结果可知，治疗前后，实施例各组和对比例各组的老鼠均无死亡，说明实施例各组和对比例各组制得的敷料均无毒副作用。且实施例1-6制得的敷料对伤口愈合有较好疗效，对比例1、2效果较实施例来说较差，但对比例2的疗效优于对比例1，是因为对比例1没有使用间充质干细胞悬液，对比例2未使用活性因子组合物，但对比例2中使用的间充质干细胞悬液中间充质干细胞可分泌活性因子，故对比例2效果优于对比例1。实施例各组制得的敷料中实施例4制得的敷料效果最好，故实施例4的相关数据具有优选参考价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)制备材料溶液与活性因子组合物；
制备材料溶液包括以下步骤：
将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，制得材料溶液；
制备活性因子组合物包括以下步骤：
将磺化多糖溶解于去离子水中，配制成磺化多糖水溶液，再加入生物活性因子，混合均匀，即得到活性因子组合物；
步骤(2)细胞材料混合液的制备；
将间充质干细胞悬液、材料溶液混合制得细胞材料混合液；
步骤(3)含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备；
将制得的细胞材料混合液与制得的活性因子组合物混合制得含有间充质干细胞的活性因子敷料。
2.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备材料溶液中，将羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖、生理盐水混合，使羧甲基壳聚糖、透明质酸钠、海藻糖的含量分别为20mg/mL、1.5mg/mL、5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备活性因子组合物中，将磺化多糖溶解于去离子水中，配制成10μg/mL磺化多糖水溶液，按生物活性因子与磺化多糖的质量比为1:(0.1-0.2)加入生物活性因子；磺化多糖包括硫酸肝素，生物活性因子包括质量比为1:1:1的BMP-7、人血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子组成。
4.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的间充质干细胞悬液的制备方法是：将装有脐带的采集管用酒精喷壶喷淋并移入生物安全柜内，再用止血钳将脐带取出放入生理盐水中，润洗脐带，尽量将脐带表面附着的血块、血管里的血块以及血迹除掉，用剪刀剪掉头尾各一段长度；将清洗好的脐带转移至70％医用酒精中杀菌一段时间后，及时转入到生理盐水中，润洗除去70％医用酒精；在生理盐水中将脐带剪碎，得到脐带组织小块；将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，培养瓶放置在细胞培养箱中静置一段时间，静置后向培养瓶内加入间充质干细胞培养液，放置细胞培养箱中，继续培养一段时间，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入间充质干细胞培养液，在细胞培养箱中培养一段时间后，吸弃培养瓶中培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，静置消化一段时间，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入磷酸盐缓冲液，得到间充质干细胞悬液；制备间充质干细胞悬液中，取新生儿新鲜脐带，脐带组织来源为临床健康婴儿娩出后的废弃物，采集之前与产妇及其家属均签署知情同意书，方案经相关流程批准使用。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞悬液的制备方法，其特征在于，间充质干细胞悬液的制备中，用止血钳将脐带取出放入30mL生理盐水中；用剪刀剪掉头尾各1.5cm；将清洗好的脐带转移至30mL70％医用酒精中杀菌60s后，及时转入到30mL生理盐水中，润洗除去70％医用酒精，70％医用酒精中无水乙醇和纯化水的体积比为70:30；在30mL生理盐水中将脐带剪碎至1mm3。
6.根据权利要求4所述的间充质干细胞悬液的制备方法，其特征在于，间充质干细胞悬液的制备中，将脐带组织小块接种至细胞培养瓶中，底面积75cm2的细胞培养瓶内接种40-50块组织块，培养瓶放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中静置4小时，静置后向培养瓶内加入15mL间充质干细胞培养液，间充质干细胞培养液为DMEM/F12、胎牛血清混合液，其中DMEM/F12、胎牛血清体积比为9:1；放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中，继续培养8-12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；向细胞培养瓶中再加入15mL间充质干细胞培养液，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养3-5天后，吸弃培养瓶中培养液。
7.根据权利要求4所述的间充质干细胞悬液的制备方法，其特征在于，间充质干细胞悬液的制备中，用pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125％-0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液1-3mL，静置消化1-3min，加入与消化液等体积的胎牛血清终止细胞消化作用，再加入pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液20-40mL，得到间充质干细胞悬液；其中pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液的制备方法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50mL与0.2mol/L氢氧化钠溶液35mL，加新沸过的冷水稀释至200mL，摇匀即得pH为7.2的磷酸盐缓冲液；取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g，加水使溶解成1000mL，调节pH值至7.3，即得pH为7.3的磷酸盐缓冲液；取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL，即得pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，间充质干细胞悬液、材料溶液间体积比为(1-3):(5-7)。
9.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的活性因子敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，细胞材料混合液与活性因子组合物间体积比为20:1。
10.一种采用如权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的含有间充质干细胞的活性因子敷料。
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