TW201345546A - 幾丁聚醣-生物性高分子混摻組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種混摻組合物,其包含幾丁聚醣及生物性高分子,並具有無孔洞之特性。本發明亦提供一種該混摻組合物用於動態調控細胞的用途。本發明更進一步提供該混摻組合物做為敷料基材或組織修復貼片的用途。
Description
本發明係關於一種組織工程材料。特定而言,本發明係利用混摻幾丁聚醣及細胞外基質相關蛋白質之方式製成一種新的組織工程材料,該組織工程材料適用於培養、調控細胞,並做為敷料基材、組織修復貼片或藥物釋放載體。本發明亦關於該組織工程材料之用途及製程。
組織工程乃以合適生醫材料之基材(Matrix)搭配訊號(Signal)使特定細胞貼附、生長、分化乃至表現正常功能,也有人稱其為「再生醫學」。誠如上述,構成組織工程的三個要素為細胞、人工細胞外基質(即組織生長支架)與生長信息分子。人體的各項組織與器官,基本上是由細胞與支撐細胞的細胞外間質所構成的,細胞外間質是細胞附著的基本框架和代謝場所,其形態和功能直接影響所構成的組織形態和功能。理想的細胞外間質應具有以下特點:生物相容性好、可吸收性及可塑性、表面化學特性和表面結構利於細胞的黏附和生長、降解速率可根據不同細胞的組織再生長而進行調整。組織工程中的基材基本上即扮演著細胞外基質的功能,因此前述的種種特點亦是現今相關研究領域所追求的目標。
隨著人口結構邁向高齡化,慢性傷口的發生率亦逐年成長,此類傷口難以癒合,其照護工作不但造成醫療體系沉重的負荷,且病人易產生如感染、敗血症等併發症,嚴重時將導致截肢,甚至死亡。慢性傷口主要分為糖尿病引起之下肢潰瘍(DM ulcers)、下肢靜脈潰瘍(Venous Leg ulcers)及褥瘡(Pressure ulcers)等三種。據估計,台灣約有23萬下肢靜脈潰瘍病患,以及約13萬褥瘡病人。歐、日、美等國為降低醫療與社會成本,均使用先進敷料以取代須經常更換且更換時會破壞癒合中傷口的棉紗型傳統敷料。但是我國醫護現場的敷料仍以傳統乾燥療法的棉紗、棉墊為主,一般民眾居家創傷護理則以棉球、紗布為大宗,間接造成我國截肢率是日本的8倍。現今市面上雖有多種乾燥療創及濕潤療創的敷料,但仍面臨無法有效加快傷口修復的困境。
先前技術已揭露數種用於傷口敷料或組織工程的材料,如「凝膠與薄膜用於腹腔手術後抗沾黏的評估」(馬焜山,2007年)及「皮膚修復之奈米複合生醫材料」(曾向榮,2011年)兩篇論文中皆提及幾丁聚醣及明膠等材料以戊二醛進行交聯後,可作為術後抗沾黏或皮膚修復的敷料;然而,以戊二醛交聯處理的生物組織材料在臨床應用時會造成組織硬化、鈣化及纖維化等問題。此外,使用交聯劑易改變材料上原有的特殊官能基而導致性質改變,如機械性質、細胞調控能力及細胞毒性等。國際專利第WO 2002/102276號公開申請案教示一種以幾丁聚醣為主的創傷敷料;然而幾丁聚醣具有無法使細胞貼附及增生的缺點。美國專利第US 2009/0196901 A1號公開申請案提供一種使用脂肪幹細胞進行組織工程治療方法,該案教示以脂肪幹細胞與明膠或幾丁聚醣等生物可分解材料混合製成的膠狀物質,具有促進傷口癒合的效果;但膠狀物質一般不具有定型及透光等特性,無法作為表皮傷口的敷料或使照護者直接從敷料外觀察傷口修復情形。
發明人為改善先前技術的不足,混摻兩種生醫材料:幾丁聚醣及生物性高分子,製成一種新的混摻物,其可做為細胞培養基質。本發明之混摻物係利用細胞對幾丁聚醣及生物性高分子的貼附能力差異,以及幾丁聚醣調控細胞基因表現的能力,控制細胞的形狀、貼附情形、生長及幹細胞多能性(pluripotency)。此外,本發明之混摻物具有無孔洞、薄膜狀、具有良好透光度及生物可分解之特性,適於作為敷料基材及組織修附貼片,使傷患及醫護人員在該混摻物被完全分解、吸收之前可直接透過敷料觀察傷口癒合情況,而避免因剝離紗布等敷料而破壞傷口的情形發生。
本發明之主要優點在於:
第一、捨棄利用化學性官能基質培養細胞之方法,該方法可能造成細胞毒性的副作用,混摻的製程中並不會製造出毒害細胞的物質。
第二、混摻材料所創造出的新材料,其所改變的材料性質是材料全體性的改變,不侷限於材料表面,同時保留生物高分子的水溶性與幾丁聚醣調控細胞之特性,因此能培養細胞及做為敷料基材及/或組織修附貼片之用。
第三、混摻幾丁聚醣與生物高分子形成混摻材料的製程,不只節省時間且節省成本。
第四、利用自體細胞做為敷料的一部分進行傷口修復,相較於使用其他來源(例如:他人)的細胞,不但可避免感染來自細胞供應者的致病原,同時亦可避免引起不必要的免疫反應。
本文中,術語「混摻(blend)」代表混合兩種成分,以發展一種新穎生物材料的方法,其所得到的生物材料具有前述兩種聚合物的任一者皆無法單獨具有的性質。本文中,術語「混摻物」、「混摻材料」或「混摻組合物」代表由混摻方法所製成的產物。由幾丁聚醣及生物高分子所形成的混摻物具有幾丁聚醣的細胞調控特性,同時亦具有生物高分子的促使細胞貼復的能力。本文中,術語「細胞培養基質」或「混摻細胞培養基質」代表以本發明之混摻物用於培養細胞的狀態描述,該培養可於體內或體外,該細胞可能為任何哺乳類動物細胞,例如但不限於:人類脂肪幹細胞及纖維母細胞。
本發明混摻物的製備方法如下:將幾丁聚醣及生物性高分子(例如明膠)分別溶解在酸性溶液(例如:醋酸水溶液或冰醋酸)中,以製成幾丁聚醣溶液與生物性高分子溶液。接著,依比例將不同體積的生物性高分子溶液緩緩加入幾丁聚醣溶液中,並以上述酸性溶液補足體積,最終得到具有所需濃度之生物性高分子的混摻溶液。接著以該混摻溶液製備細胞培養基質(即混摻物薄膜)。首先將前述步驟得到的混摻溶液塗覆在組織培養皿上,在室溫靜置一段適當時間後,去除多餘溶液並將培養皿乾燥。用於細胞培養前,該細胞培養基質尚需經過以鹼性溶液(例如:氫氧化鈉)中和酸性溶液的酸性、洗淨、以及紫外線照射殺菌等步驟。
本文中,術語「生物性高分子」代表與細胞外基質(Extracellular matrix)相關的蛋白質、與細胞外基質相關的多醣類或與細胞外基質相關的蛋白多醣;或者具有生物可相容性的水溶性物質。與細胞外基質相關的蛋白質例如但不限於:膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、層黏連蛋白(laminin)、纖維醣連蛋白(fibronectin)、整合蛋白(Integrin)、RGD(Arg-Gly-Asp,SEQ ID NO: 1)或KGD(Lys-Gly-Asp,SEQ ID NO: 2);與細胞外基質相關的多醣類例如但不限於:透明質酸(hyaluronan);與細胞外基質相關的蛋白多醣例如但不限於:含有醣胺多醣的醣蛋白或含有硫酸肝素的醣蛋白。
本文中,術語「無孔洞」代表完全無孔洞或孔洞小於現今顯微技術所能觀察到之極限,而非一絕對性質之描述。同時,「無孔洞」一詞係用於描述混摻物材質的微觀結構,並非指其外觀造型而言;因此,即使將本發明之混摻物薄膜製成甜甜圈狀(Donut-shaped),或任何中間有開口之形狀,諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。然而,孔洞測量的極限可能隨技術的演進而改變,故本說明書中所述之「無孔洞」的混摻物,在未來亦有可能偵測到孔洞之存在。混摻物之無孔洞特性與其透光度之間具有密切關聯。當完全無孔洞存在或孔洞小於100 nm時,混摻物之透光度高達80~99.99%;當孔洞大小介於100~500 nm之間時,隨著孔洞越大,混摻物之透光度亦隨之下降。此外,即使將本發明之混摻物製成稍有孔洞及/或不透明之型態(例如但不限於:濕式成膜法、乾濕混合成膜法、冷凍乾燥成膜等製程所製之不透明及/或稍有孔洞之任何型態或薄膜),仍不影響混摻物中的水溶性成分隨時間逐漸溶出而達到動態調控細胞的效果,亦可用於促進傷口癒合;因此對於孔洞數量、透明度及混摻物外型之調整,仍應視為不脫離本發明之精神及範圍,因本發明之無孔洞透光性是有助於使照護者直接從表皮傷口的敷料外面來觀察傷口修復情形。
本文中,術語「C100:G0」、「C75:G25」、「C50:G50」、「C25:G75」及「C0:G100」代表幾丁聚醣(C)及明膠(G)在混摻組合物中所佔的總體比例。C75:G25代表混摻組合物中有25重量百分濃度的明膠;同理,C50:G50及C25:G75分別代表混摻組合物中有50及75重量百分濃度的明膠;C100:G0則代表純幾丁聚醣。
本文中,術語「透光度」代表光線穿透物體前後的亮度比,可做為物體透明度的指標,透光度越高代表透明度越佳。
本文中,術語「複數個」係用以描述本發明之元件或單元之數量。此用語除非明確另有所指,否則應理解為兩個以上。
本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種,且除非明顯地另有所指,表示單數時亦包括複數。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
本發明提供一種混摻組合物,其包含幾丁聚醣及生物性高分子,並具有無孔洞之特性。該無孔洞之特性可使細胞生長於其表面。在一具體實施例中,該混摻組合物進一步具有30%以上透光度,且厚度不大於2000微米。本發明之混摻組合物,可進一步包含複數個培養於其上的細胞。在一具體實施例中,該細胞係幹細胞、纖維母細胞或表皮細胞。在較佳具體實施例中,該幹細胞係間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)或皮膚幹細胞(Skin stem cells,SSCs);間葉幹細胞包括但不限於骨髓幹細胞、硬骨幹細胞、軟骨幹細胞、韌帶幹細胞、臍帶血幹細胞及脂肪幹細胞,皮膚幹細胞包括但不限於表皮幹細胞、毛囊幹細胞及黑色素幹細胞。在最佳實施例中,該間葉幹細胞係脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)。
在一具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子係與細胞外基質相關的蛋白質、與細胞外基質相關的多醣類或與細胞外基質相關的蛋白多醣。該與細胞外基質相關的蛋白質包括但不限於膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白、纖維醣連蛋白、整合蛋白、RGD(SEQ ID NO: 1)或KGD(SEQ ID NO: 2);該與細胞外基質相關的多醣類包括但不限於透明質酸;及該與細胞外基質相關的蛋白多醣包括但不限於含有醣胺多醣的醣蛋白或含有硫酸肝素的醣蛋白。
在一具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子係生物可相容水溶性物質。該生物可相容水溶性物質包括但不限於明膠、海藻膠、甲基纖維素或羧甲基纖維素。在較佳具體實施例中,該生物性高分子係明膠。
幾丁聚醣係從甲殼動物經由去乙醯化反應而獲得的天然多醣類,具有良好的生物可相容性,已被應用於許多醫學領域(例如:藥物傳輸及傷口敷料)。先前研究指出幾丁聚醣具有促進細胞分泌細胞外基質的能力(Howling et al.,Biomaterials 22(22):2959-2966,2001),此外幾丁聚醣可促進幹細胞,特別是脂肪幹細胞,形成球狀體(Spheroid)。以幾丁聚醣調控而形成球狀體的細胞有較高的幹細胞特性,除了幹細胞標記基因(例如:Oct4、Sox2、Nanog等轉錄因子)的表現量較培養在一般培養皿中的幹細胞高之外,在遇到適當的誘發性微環境時,球狀體可分化成多種相對應的細胞種類(Cheng et al.,Biomaterials 33:1748-1758,2012)。用於體外細胞培養時,幾丁聚醣會造成細胞不易貼附,導致細胞呈現圓球狀,然而加入可促使細胞貼附的生物性高分子(例如明膠)製成混摻物,即可改變此現象。從圖六可看出,當細胞培養在純幾丁聚醣薄膜上時,細胞骨架聚集且細胞外型成球形,但是當加入明膠與幾丁聚醣製成混摻物後,培養於混摻薄膜上的細胞骨架即可延展開來,且細胞貼附情況良好。相同地,若以膠原蛋白或纖維醣連蛋白與幾丁聚醣製成混摻薄膜,亦有助於使培養的細胞貼附於薄膜上(圖十一A至圖十一D)。此外,海藻膠、甲基纖維素及海藻膠-RGD混摻物亦可使培養的細胞貼附(圖十一E至圖十一G),故若將上述材料與幾丁聚醣混摻製成薄膜,可預期達到相似的效果。
在一具體實施例中,本發明之混摻組合物之透光度大於50%。在另一具體實施例中,本發明之混摻組合物之透光度係介於70%至99.99%之間。
在一具體實施例中,本發明之混摻組合物之厚度不大於1000微米。在另一具體實施例中,本發明之混摻組合物之厚度係介於5微米至250微米之間。
在一具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子占總體比例的約0.0005至99.99重量百分比。在一較佳具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子占總體比例的約25至75重量百分比,更佳為約25重量百分比。在另一較佳具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子占總體比例的約0.02至1重量百分比,更佳為約0.1重量百分比。
當組成本發明之混摻組合物的生物性高分子係與細胞外基質相關的蛋白質或與細胞外基質相關的蛋白多醣時,在一具體實施例中,其占總體比例約0.0005至5重量百分比;在較佳具體實施例中,其占總體比例約0.001至2重量百分比;在更佳具體實施例中,其占總體比例約0.002至1重量百分比;在最佳具體實施例中,其占總體比例約0.1重量百分比。由圖十三可得知,當膠原蛋白占混摻物總體比例0.0005以上時,即可促使細胞貼附於混摻物上。
當組成本發明之混摻組合物的生物性高分子係與細胞外基質相關的多醣類或明膠、海藻膠、甲基纖維素或羧甲基纖維素等生物可相容水溶性物質時,在一具體實施例中,其占總體比例約1至99重量百分比;在較佳具體實施例中,其占總體比例約10至90重量百分比;在更佳具體實施例中,其占總體比例約25至75重量百分比;在最佳具體實施例中,其占總體比例約25重量百分比。
當組成本發明之混摻組合物的生物性高分子係明膠時,在一具體實施例中,其占總體比例約15至95重量百分比。在另一具體實施例中,明膠占混摻組合物總體比例的約25至85重量百分比。在另一具體實施例中,明膠占混摻組合物總體比例的約25至75重量百分比。在較佳具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子占總體比例的約25至50重量百分比。在最佳具體實施例中,組成本發明之混摻組合物的生物性高分子占總體比例的約25重量百分比。
在一具體實施例中,當本發明之混摻組合物置於水性培養基中或與生物組織接觸時,該生物性高分子會自混摻組合物溶出。生物性高分子溶出的比例係所經時間的函數,且與該生物性高分子在混摻組合物中所佔的初始比例無關。上述生物性高分子溶出的現象使本發明之混摻組合物的成分比例隨時間而改變,置於水性培養基中或與生物組織接觸的時間越長,混摻組合物中的幾丁聚醣比例越高。基於上述混摻物組成成分的動態特性,本發明之混摻組合物可達成動態調控細胞的功效。
因此,本發明亦提供一種如上述之混摻組合物用於動態調控細胞的用途,其係將該細胞培養在具有該混摻組合物的環境中;該動態調控細胞係指該混摻組合物於培養初期促使細胞貼附至混摻組合物上及增生,並於培養後期促使細胞自混摻組合物脫附及形成球狀體(spheroid)。該動態調控係由於生物性高分子自混摻組合物溶出,混摻組合物之幾丁聚醣含量提高而造成。
在一具體實施例中,該細胞係幹細胞、纖維母細胞或表皮細胞。在較佳具體實施例中,該幹細胞係間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)或皮膚幹細胞(Skin stem cells,SSCs);間葉幹細胞包括但不限於骨髓幹細胞、硬骨幹細胞、軟骨幹細胞、韌帶幹細胞、臍帶血幹細胞及脂肪幹細胞,皮膚幹細胞包括但不限於表皮幹細胞、毛囊幹細胞及黑色素幹細胞。在最佳實施例中,該間葉幹細胞係脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)。
在一具體實施例中,該球狀體所含細胞經分散後可進一步用於促進傷口癒合。其具體的實施方式為將形成球狀體的細胞懸浮在生理等滲透壓及/或等張溶液中,將球狀體打散為單顆細胞或較小的細胞聚集後,將所得的細胞懸浮液注射至傷口周圍。上述注射可為但不限於肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射或皮下注射。
本發明另提供一種如上述之混摻組合物做為敷料基材的用途。
本發明進一步提供一種如上述之混摻組合物做為組織修復貼片的用途。
在一具體實施例中,本發明之混摻組合物做為敷料基材及/或組織修復貼片時,可直接覆蓋於傷口或創傷處,並緩緩釋出生物性高分子以促進組織修復。
在一具體實施例中,本發明之混摻組合物做為敷料基材及/或組織修復貼片時,可進一步包含複數個培養於其上的細胞。在一具體實施例中,該細胞係幹細胞或纖維母細胞。在較佳具體實施例中,該幹細胞係間葉幹細胞。在最佳實施例中,該幹細胞係脂肪幹細胞。該細胞較佳為取自欲使用本發明之混摻組合物之主體,以人類脂肪幹細胞為例,較佳為取自傷患或病患的自體脂肪幹細胞。取得脂肪幹細胞所造成的傷口小、所需手續簡便,且在脂肪組織中即有高達1%的含量。除了自體細胞較不會引起不必要的免疫反應的優點外,脂肪幹細胞具有幹細胞的多能分化特性,遭遇傷口週遭的微環境後,即可分化為修復傷口或創傷所需的細胞種類。
本發明可能以不同的形式來實施,並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
利用下列方法將幾丁聚醣-明膠混摻薄膜塗附在組織培養皿上。簡單而言,將1克的幾丁聚醣(Sigma)溶解在1%(v/v)醋酸中形成1%(w/v)的幾丁聚醣溶液,且將酸無法溶解的部分利用過濾去除。將明膠(Type A,Sigma)溶解在55℃的去礦質水中,以得到1%(w/v)的明膠溶液。將已知量的兩種溶液在55℃混合並攪拌30分鐘,接著將混合液倒入24孔細胞培養盤(TCPS)的孔槽中。將以倒入混合液的細胞培養盤至於60℃烘箱中乾燥24小時以形成薄膜,接著加入100%乙醇培養10分鐘使其穩定,再加入0.1N NaOH培養15分鐘以中和其酸性。為了消毒以用於細胞培養,將該培養盤浸泡於70%乙醇中2小時,再以此外光燈照射整夜。本發明中製備幾丁聚醣含量為5、10、15、25、50及75重量百分比的混摻物,並分別以C5:G95、C10:G90、C15:G85、C25:G75、C50:G50及C75:G25表示。純幾丁聚醣及明膠可表示為C100:G0及C0:G100。
以影像式接觸角量測儀(CAM 200,KSV Instruments)在室溫下量測幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的靜態接觸角(Static contact angles)。利用5 μL再蒸餾水注射針頭進行垂滴法(Sessile drop method)。每一個角度讀值皆為在不同表面位置測得的五個數值平均。
測量薄膜的光穿透度以估計幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的透明度。簡而言之,以UV-Visible光度計(UV-540,Unicam)測量氘(De)光源在450至800奈米波長範圍的基礎照度。接著將待測薄膜插入氘光源及光度計的偵測元件之間。透光度的定義為插入幾丁聚醣-明膠混摻薄膜後測得的照度與基礎值的比。
不同幾丁聚醣-明膠混摻薄膜測得的靜態水接觸角介於50°至96°之間(圖一)。將幾丁聚醣與明膠混合造成混摻表面的可濕性改變(p<0.05),並可能進而對不同薄膜上的細胞行為產生實質的影響。如圖三A至圖三B中所示,在可見光波長範圍內(390至750奈米)所有幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的透光度皆十分相似。由圖三A可看出,透過觀察各式薄膜可發現不論是C100:G0、C75:G25、C50:G50及C25:G75混摻薄膜,其透明度皆相當高。以定量方法表示(圖三B),可看出各式混摻薄膜的透光度差異不大。
以幾丁聚醣-明膠混摻薄膜進行拉伸試驗(Tensile testing)。將薄膜裁成啞鈴狀(厚度為60 μm,而寬度為5 mm)。拉伸試驗係在室溫下以萬能拉力試驗機進行(Dachang,QC-512),衝頭速度(cross-head speed)設定為1公分/分鐘。各樣本的斷裂伸長率(elongation-at-break ratio)係得自伸長計分離,所用的伸長計荷重為10公斤,扣夾間距為4公分,試片符合ASTM D638 IV規範。
幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的拉伸性質如圖二A至圖二B所示。幾丁聚醣及明膠薄膜的平均拉伸強度分別為65.1±3.3及52.5±4.3兆帕。強度最強的薄膜為C25:G75、C50:G50及C75:G25,皆展現出顯著高於純明膠薄膜的拉伸強度(分別為75.0±0.4、73.7±0.8及74.3±2.5 MPa,p<0:05)。幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的斷裂伸長率並不完全符合拉伸強度的測量值(Figure 2b)。純明膠薄膜具有低斷裂伸長率(3.78±0.31%)。C75:G25混摻薄膜的斷裂伸長率量測值為11.33±0.11%(p<0:05),然而,低於75%的幾丁聚醣含量比例並未顯著提高混摻薄膜的斷裂伸長率。純幾丁聚醣薄膜具有最高的斷裂伸長率(20.59±0.26%,p<0:05)。幾丁聚醣及明膠分子間可能的氫鍵及離子鍵顯示如圖二C。
將C0:G100、C10:G90、C25:G75、C50:G50及C75:G25樣本置入24孔組織培養盤的孔槽中。將各薄膜樣本在37℃下浸泡於1毫升磷酸鹽緩衝溶液(PBS,Sigma)中。第1、3及5天時將各孔槽中的PBS抽出,並重新加入新的PBS溶液。以BCA試驗(Pierce)測定上述抽出溶液中的蛋白質濃度。以薄膜中原本含有的初始明膠濃度為基準,將幾丁聚醣-明膠混摻薄膜所釋放的明膠進行常規化。結果以各時間點的累計釋放量呈現。
圖四顯示明膠自混摻薄膜溶解釋放的程度係所經時間的函數。不論混摻薄膜中初始的明膠含量比率為何,五天後各薄膜釋放至PBS中的明膠量皆為原始混摻薄膜中的40%至50%左右。明膠、C10:G90、C25:G75、C50:G50及C75:G25薄膜在各時間點所測得的明膠釋放程度之間並無顯著差異(p>0.05)。
從進行腹部抽脂手術的女性患者取得腹部的皮下脂肪組織。所有實驗步驟皆經台大醫院研究倫理委員會核可。將脂肪組織放置於生理溶液中(0.9% NaCl),以PBS清洗兩次並切碎。將刮下的脂肪組織置於限制酶切割溶液(digestion solution)中,該溶液含有1毫克/毫升的膠原蛋白酶(Gibco)以及1%的盤尼西林-鏈黴素(Biological industries),並置於at 37℃搖晃培養60分鐘。將切割產物以70微米濾網過濾(Becton & Dickinson),離心所得的細胞懸浮液以收集細胞,並將該些細胞培養在增殖用細胞培養基中(含有DMEM/F-12、10%胎牛血清(FBS)、1%盤尼西林-鏈黴素(PS)及1奈克/毫升基本母纖維細胞生長因子(bFGF))。將細胞培養在37℃、5% CO2中,每2天更換一次培養基。當細胞覆蓋面積達90%,將細胞以0.05%胰蛋白酶-EDTA自細胞培養皿分離並進行分盤。
將脂肪幹細胞(ASCs)繼代3次,並在每個分盤的時間點以胰蛋白酶處理與記數。將細胞懸浮液以培養基培養在幾丁聚醣-明膠混摻薄膜、100%幾丁聚醣薄膜或100%明膠薄膜上,該培養基係以高葡糖糖含量的DMEM(DMEM-HG,Gibco)、10% FBS及1% PS組成。每2到3天更換一次培養基。
進行細胞貼附與脫附實驗以測量細胞對不同幾丁聚醣-明膠混摻薄膜的貼附性。評估標的為細胞接種至幾丁聚醣-明膠混摻薄膜上8小時後的細胞貼附情形。將0.5毫升含有約5.0×104顆ASCs的培養基加到塗覆不同薄膜的培養盤孔槽中,並於培養箱(37℃,5% CO2)中靜置培養8小時,以使細胞貼附。接著將培養基吸除,並以PBS和緩地清洗培養盤孔槽,以去除未貼附的細胞。再利用胰蛋白酶將已貼附的細胞自孔槽底部分離,並以PicoGreen螢光dsDNA試驗(Molecular Probes)測定細胞數量(激發光波長為485奈米;放射光波長為535奈米)。貼附率為貼附細胞數量對原始接種細胞數量的百分比,可利用下列式(I)計算。
未進行細胞脫附實驗,將ASCs以每個孔槽5.0×104顆細胞的密度接種於幾丁聚醣-明膠混摻薄膜上,並將細胞置於培養箱(37℃,5% CO2)中培養以使細胞貼附到薄膜上。24小時後將培養基吸除,並以PBS潤洗孔槽兩次。然後在各孔槽中加入0.05%胰蛋白酶-EDTA培養3分鐘,再自孔槽中將溶液移除,並計算該溶液中所含有的細胞數。脫附率為脫附細胞數量對原始接種細胞數量的百分比,可利用下列式(II)計算。
圖五A顯示接種8小時之後,ASCs貼附至不同薄膜的百分比。相對於明膠薄膜的貼附率(98±2%),C50:G50、C75:G25及幾丁聚醣薄膜的細胞貼附率顯著較低,分別為79±4%、77±3%及69±3%。再者,相較於僅有16±4%的細胞自明膠薄膜脫附,C75:G25及幾丁聚醣薄膜的細胞脫附率顯著較高,分別為51±9%及67±10%(圖五B)。
將人類ASCs在4%三聚甲醛中固定20分鐘,再以溶於PBS中的0.1% TritonX-100在4℃處理10分鐘使其通透(permeabilized)。接著,以標記有玫紅的鬼筆毒環肽進行細胞染色(rhodamine-labeled phalloidin,Invitrogen)並利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Santa Cruz)染細胞核。利用螢光顯微鏡(DMI-6000,Leica)觀察染色後的細胞。
細胞骨架在細胞型態、貼附及基因表現中扮演重要的角色。為了測試幾丁聚醣-明膠混摻物對人類ASCs的細胞骨架有何影響,在培養細胞3天後檢驗纖維性肌動蛋白骨架的結構(圖六A至圖六H)。結果清楚的顯示出,培養在明膠薄膜及幾丁聚醣-明膠混摻薄膜上的細胞,其纖維性肌動蛋白纖維呈延展狀。然而,培養在純幾丁聚醣薄膜上的ASC因為形成球狀體(spheroid),肌動蛋白分佈範圍顯得較小且有聚集的情況。
細胞型態係於指定時間點利用倒立式相位差顯微鏡觀察而得。此外,利用Alamar Blue試驗估測當ASC細胞以2.50×104顆細胞/孔槽的密度培養在不同幾丁聚醣-明膠薄膜上的細胞增生情形。Alamar Blue試驗中,染劑還原的情況與存活細胞數量相關。將細胞用胰蛋白酶處理分離並從培養瓶接種到混摻薄膜上的當日定義為第0天,且剛接種完的最初4個小時製置培養以使細胞貼附。在第0、1、4、7天,將Alamar Blue溶液(AbD Serotec)直接加入培養盤孔槽中,再接著於37℃培養24小時。利用光譜儀測量實驗組及控制組在570奈米及600奈米波長的吸光值。活細胞數量與染劑還原的程度相關,並表示為Alamar Blue還原的百分比。
ASC細胞型態觀察結果如圖七A所示。第1天,ASCs開始在純幾丁聚醣薄膜上形成球狀體,但在其他薄膜上未觀察到細胞聚集的情形。第4天時,C25:G75、C50:G50及C75:G25薄膜上有一些小球狀體形成,但大多數細胞仍以紡錘狀型態貼附於薄膜上。之後在第7天時,在除了純明膠以外的所有薄膜上皆可見到ASC球狀體,且這些薄膜上僅剩下少數細胞形成的單層細胞層。若將人類纖維母細胞及小鼠纖維母細胞培養在純幾丁聚醣薄膜上,亦可觀察到球狀體的形成(圖十二A至圖十二D)。圖七B顯示在第4天或第7天時,除了純幾丁聚醣薄膜之外,所有組別的細胞數量皆明顯較第0天時多。事實上,純幾丁聚醣薄膜上沒有細胞增生的情形,與早在培養的第1天該些薄膜上即有ASC球狀體形成的發現相呼應。此外,所有混摻薄膜在第4至第7天皆無顯著細胞數量增加亦反映出這段期間ASC球狀體的形成。
將0.5毫升含有2.5×104顆ASCs的培養基加至24孔培養盤的孔槽內,該些孔槽已事先塗覆不同的幾丁聚醣-明膠薄膜,並將接種細胞後的培養盤置於培養箱(37℃,5% CO2)中培養72小時。將培養基吸除,在各孔槽中放入一小塊已裁成孔槽尺寸的膠原蛋白基質(CollaMatrix),接著加入100微升的培養基潤濕該膠原蛋白基質,然後將該細胞培養盤置於培養箱中培養。24小時之後,從孔槽中移除該膠原蛋白基質,並以10毫克/毫升的膠原蛋白酶溶液進行分解。將所得的分解溶液進行離心,並以PicoGreen螢光dsDNA試驗測定遷移至膠原蛋白基質中的細胞數量。
本實施例之目的為模擬本發明之混摻薄膜用於組織修復時,細胞自幾丁聚醣-明膠混摻薄膜遷移的情形。藉由計數膠原蛋白基質中的細胞,結果發現當混摻物組成中的幾丁聚醣比例升高時,從薄膜遷移到膠原蛋白基質的ASCs數量也隨之上升(圖八)。然而,與純明膠薄膜的的組別相較之下,只有C75:G25組別的膠原蛋白基質中有顯著較多的細胞(19,992±5,105顆細胞對9,360±2,681顆細胞,p<0.05)。
實驗數據以平均值±標準差(SD)呈現。統計上的差異係依序利用單因子變異數分析(ANOVA)及Bonferroni事後檢定(Bonferroni post-hoc test)進行分析。統計分析係利用STATA軟體(Stata Inc.)執行且p值小於0.05代表具有統計上的顯著性。
將細胞從培養瓶中接種到幾丁聚醣薄膜或TCPS上的當日定義為第0天,並於接種完成後的前4個小時靜置培養使細胞貼附。在第0、1、3、5天,將Alamar Blue溶液(AbD)直接加入培養孔槽中,並將培養盤在37°C培養24小時。以標準光譜儀(Tecan)記錄實驗組及控制組培養孔槽在570奈米與600奈米光波長的吸光值。活細胞數目與染劑還原的程度成正比,並表示為Alamar Blue染劑的還原百分比。將三次實驗結果做為活度指標(activity index),其定義為以第0天的吸光值為基準常規化之後的比率(normalized ratio)。此外,亦收集培養了7天的球狀體並將其改培養在TCPS或新的幾丁聚醣薄膜上。定義重新接種球狀體的當日定義為第0天,並在第0、1、3、5及7天進行Alamar Blue試驗。
以試劑(Invitrogen)萃取ASC球狀體及貼附細胞的總RNA,並利用光譜儀(Nanodrop ND-1000)測量260奈米波長的光密度(OD260)以測定總RNA的濃度。完成RNA分離後,利用High-Capacity cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems)合成互補DNA(cDNA)。各基因所使用的引子列於表一。簡言之,利用StepOneTM Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)以三重複進行定量聚合酶鏈鎖反應。分析各基因表現值並將各cDNA樣本對β-actin進行常規化,並以第0天細胞接種前所收集的ASC樣本為基準點計算基因表現的相對量(RQ)。
表一 即時定量聚合酶鏈鎖反應分析所用的引子序列
在細胞培養的第7天測定Sox-2、Oct-4及Nanog轉錄因子的蛋白質表現。將單層細胞及ASC球狀體重新懸浮在細胞分解緩衝液中(Thermo scientific)並用超音波擊碎。離心後,利用BCA蛋白質定量套組(Pierce Biotechnology)測定上清液中的蛋白質含量。將6毫克的球狀體蛋白質或單層細胞蛋白質加到Laemmli樣本緩衝液中並煮沸10分中。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將不同分子量的蛋白質分開並轉漬到聚二氟乙烯薄膜(PVDF)上。以抗Oct-4抗體(Genetex)、抗Sox-2抗體(R&D)、抗Nanog抗體(R&D)及抗β-actin抗體(Millipore)進行西方墨點法。將PDVF薄膜與初級抗體在4℃培養隔夜。在充分的洗滌後,將薄膜進一步與辣根過氧化酶共軛次及抗體培養1小時。接著利用ECL系統做呈色反應(enhanced chemiluminescence detection system,Millipore)。
圖九A代表受幾丁聚醣調控之細胞的生長趨勢,培養於TCPS上的細胞數量隨時間而逐漸增加,培養於幾丁聚醣上的細胞數量則相對恆定。進一步以即時定量聚合酶鏈鎖反應分析可發現,受幾丁聚醣調控之細胞的Oct4、Sox2、Nanog等胚胎幹細胞標記基因表現量無論是在第3或第7天,皆顯著高於培養在TCPS培養皿上的細胞(圖九B至圖九D)。第3天時,受幾丁聚醣調控之細胞的Oct4、Sox2、Nanog表現量分別為培養在TCPS培養皿上之細胞的7.7倍、4.9倍及2.9倍;第7天時,則分別為6.0倍、4.2倍及8.3倍。以西方墨點發分析Oct4、Sox2及Nanog蛋白質表現量亦得到相似的結果(圖九E)。
以下動物實驗經國立台灣大學動物管理及使用委員會核可,使用的小鼠為6至8週齡的母裸鼠(體重20-25克;購自國家實驗動物中心)。手術當日,使用舒泰(Zoletil,50毫克/公斤)及若朋(Rompun,0.4毫克/公斤)將小鼠麻醉,並在小鼠中軸線的兩側分別製造一個直徑為9毫米的圓形全皮層背部皮膚傷口。傷口造成後,立刻在其上施用絲裂黴素C溶液(mitomycin C,1毫克/毫升)10分鐘。以蒸餾水洗去絲裂黴素C之後,將等量(約7.5×105顆)懸浮在100微升的單層培養ASC細胞或來自微球體(經幾丁聚醣調控而形成)的ASC細胞皮下注射在傷口周圍,在對側傷口注射100微升PBS作為陰性控制組。以5-0尼龍縫線將彈性的矽O型環固定在傷口周邊以固定實驗位置。接著以透明黏性敷料覆蓋傷口(Tegaderm)。
在手術後的第0、3、5、7、10、12及14天以數位相機截取傷口的影像,並在各個時間點進行傷口癒合率分析。利用平面法(planimetric methods,Image J)測量傷口的大小,並計算開放傷口與初始傷口間的比率以定量傷口閉合情形。
由圖十A及圖十B的定量結果可得知,將經幾丁聚醣調控之ASC打散後用於小鼠傷口修復,與一般的TCPS單層培養細胞相較之下,可促進傷口癒合。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標,並獲得所提到之結果及優點,以及那些存在於其中的東西。本發明中之混摻物及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表,其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中,並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細,得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明,即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處,仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品,都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度,就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明,可能得以在缺乏任何要件,或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制,同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達,但需認清的是,在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此,應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明,但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容,諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
<110> 國立台灣大學
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<212> PRT
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圖一顯示本發明之各式幾丁聚醣/明膠混摻薄膜的水接觸角(water contact angles)。顯示數值為平均值±標準差;柱狀圖頂部標示不同字母的樣本代表彼此之間的差異具有統計上的顯著性(n=5)。
圖二顯示本發明之幾丁聚醣/明膠混摻薄膜的(A)拉伸強度及(B)斷裂伸長率。拉伸強度及伸長率兩者皆未與混摻薄膜中的幾丁聚醣含量成正比。圖二C顯示幾丁聚醣分子及明膠分子間的氫鍵及離子鍵。顯示數值為平均值±標準差;柱狀圖頂部標示不同字母的樣本代表彼此之間的差異具有統計上的顯著性(n=3)。
圖三顯示本發明之混摻薄膜的透明性(A)及其透光度定量試驗結果(B)。C代表幾丁聚醣,G代表明膠。
圖四顯示明膠自幾丁聚醣/明膠混摻薄膜中釋放的百分比與時間的關係。顯示數值為平均值±標準差(n=3)。
圖五A顯示細胞接種8小時之後,ASCs貼附在不同幾丁聚醣/明膠混摻薄膜上的百分比。圖五B顯示加入0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液3分鐘之後,ASCs自不同幾丁聚醣/明膠混摻薄膜脫附的百分比。顯示數值為平均值±標準差;*表示與明膠薄膜組別相較之下p<0.05。
圖六A至圖六H顯示在本發明之各式幾丁聚醣/明膠混摻薄膜上培養ASC細胞3天後,以玫紅鬼筆毒環肽染纖維性肌動蛋白纖維,並以DAPI染細胞核的染色結果。比例尺為50微米。
圖七A顯示本發明之各式幾丁聚醣/明膠混摻薄膜上的ASC細胞型態。培養第1天,幾丁聚醣薄膜上的ASC即開始形成球狀體;第4天時,可在C25:G75、C50:G50及C75:G25薄膜上觀察到一些球狀體;第7天,除了明膠薄膜外,其他組別的薄膜上皆有球狀體存在。比例尺代表50微米。圖七B顯示不同幾丁聚醣/明膠混摻薄膜上所培養的ASCs之Alamar Blue試驗結果。Alamar Blue染劑還原的百分比與活細胞數目相關。*代表各組內與第0天相較p<0.05;#代表指定的兩個時間點之間p<0.05。
圖八顯示將本發明之混摻薄膜與膠原蛋白基質接觸24小時之後,從不同幾丁聚醣/明膠混摻薄膜遷移到膠原蛋白基質的ASC細胞數量。在幾丁聚醣/明膠混摻薄膜上接種細胞的初始濃度為25,000細胞/孔槽,且膠原蛋白基質係在細胞培養3天後放置到各薄膜上。顯示數值為平均值±標準差;*代表與明膠薄膜組別相較p<0.05(n=3)。
圖九A顯示培養在TCPS上(實心圓)及培養在幾丁聚醣薄膜上(空心圓)的ASCs細胞之Alamar Blue試驗結果。細胞初始接種密度為2.50×104顆細胞/平方公分。活度指標(activity index)定義為相對於第0天(即細胞接種當天)的甲臢的吸光值比例。圖九B至圖九D顯示球狀體ASC細胞及單層培養ASC細胞的胚胎幹細胞標記基因(Oct4、Sox2、Nang)RNA表現情形。圖九E顯示球狀體ASC細胞及單層培養ASC細胞的胚胎幹細胞標記基因(Oct4、Sox2、Nang)蛋白質表現情形。
圖十A顯示經幾丁聚醣調控後之人類ASC細胞打散後用於小鼠傷口修復試驗的結果。圖十B顯示生理食鹽水、TCPS培養細胞及經幾丁聚醣調控後之人類ASC細胞用於小鼠傷口修復試驗的定量分析。
圖十一顯示人類ASC細胞培養在TCPS(A)、幾丁聚醣(B)、幾丁聚醣-膠原蛋白混摻物(C)、幾丁聚醣-纖維醣連蛋白混摻物(D)、海藻膠(E)、甲基纖維素(F)及海藻膠-RGD(G)上的細胞型態。幾丁聚醣-膠原蛋白混摻物及幾丁聚醣-纖維醣連蛋白混摻物中的膠原蛋白及纖維醣連蛋白皆占總體比例的0.1重量百分比。
圖十二顯示人類纖維母細胞分別培養在TCPS(A)及幾丁聚醣(B)上的細胞型態;及小鼠胚胎纖維母細胞分別培養在TCPS(C)及幾丁聚醣(D)上的細胞型態。人類纖維母細胞係取自進行包皮環切術的20至35歲亞洲男性;小鼠胚胎纖維母細胞係由食品工業研究所提供。
圖十三顯示人類脂肪幹細胞培養在幾丁聚醣-膠原蛋白混摻薄膜(A至E)、膠原蛋白薄膜(F)、幾丁聚醣薄膜(G)及TCPS培養盤(H)上1天後的細胞型態。膠原蛋白在混摻薄膜中分別占總體比例為0.0005重量百分比(A)、0.001重量百分比(B)、0.002重量百分比(C)、0.01重量百分比(D)及0.02重量百分比(E)。比例尺代表200微米。
附件一顯示本發明之各式混摻薄膜的透光度測量結果彩色圖。
附件二顯示在本發明之各式混摻薄膜上培養ASC細胞3天後,以玫紅鬼筆毒環肽染纖維性肌動蛋白纖維(紅色),並以DAPI染細胞核(藍色)的染色結果。比例尺為50微米。
附件三顯示經幾丁聚醣調控後之人類脂肪幹細胞打散後用於小鼠傷口修復試驗的結果。
Claims (26)
- 一種混摻組合物,其包含幾丁聚醣及生物性高分子,並具有無孔洞之特性;其中該生物性高分子係與細胞外基質相關的蛋白質、與細胞外基質相關的多醣類、與細胞外基質相關的蛋白多醣或生物可相容水溶性物質。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其進一步包含複數個培養於其上的細胞。
- 如申請專利範圍第2項之混摻組合物,其中該細胞係幹細胞、纖維母細胞或表皮細胞。
- 如申請專利範圍第3項之混摻組合物,其中該幹細胞係間葉幹細胞或皮膚幹細胞。
- 如申請專利範圍第4項之混摻組合物,其中該間葉幹細胞係脂肪幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其進一步具有30%以上透光度,且厚度不大於2000微米。
- 如申請專利範圍第6項之混摻組合物,其中該透光度大於50%。
- 如申請專利範圍第6項之混摻組合物,其中該透光度係介於70%至99.99%之間。
- 如申請專利範圍第6項之混摻組合物,其中該厚度不大於1000微米。
- 如申請專利範圍第6項之混摻組合物,其中該厚度係介於5微米至250微米之間。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該生物性高分子占總體比例為約0.0005至99.99重量百分比。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該生物性高分子占總體比例為約25重量百分比。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該與細胞外基質相關的蛋白質係膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、層黏連蛋白(laminin)、纖維醣連蛋白(fibronectin)、整合蛋白(integrin)、RGD或KGD。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該與細胞外基質相關的多醣類係透明質酸(hyaluronan)。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該與細胞外基質相關的蛋白多醣係含有醣胺多醣的醣蛋白或含有硫酸肝素的醣蛋白。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該生物可相容水溶性物質係明膠(gelatin)、海藻膠(alginate)、甲基纖維素(methyl cellulose)或羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,其中該生物性高分子係明膠。
- 如申請專利範圍第1項之混摻組合物,當其置於水性培養基中或與生物組織接觸時,該生物性高分子會自混摻組合物溶出。
- 一種如申請專利範圍第1項之混摻組合物用於動態調控細胞的用途,其係將該細胞培養在具有該混摻組合物的環境中;該動態調控細胞係指該混摻組合物於培養初期促使細胞貼附及增生,並於培養後期促使細胞脫附及形成球狀體(spheroid)。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該細胞係幹細胞、纖維母細胞或表皮細胞。
- 如申請專利範圍第20項之用途,其中該幹細胞係間葉幹細胞或皮膚幹細胞。
- 如申請專利範圍第21項之用途,其中該間葉幹細胞係脂肪幹細胞。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該動態調控係由於生物性高分子自混摻組合物溶出,混摻組合物之幾丁聚醣含量提高而造成。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該球狀體所含細胞經打散後可進一步用於促進傷口癒合。
- 一種如申請專利範圍第1項之混摻組合物做為敷料基材的用途。
- 一種如申請專利範圍第1項之混摻組合物做為組織修復貼片的用途。
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- 2012-05-11 TW TW101116941A patent/TWI597064B/zh active
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TWI597064B (zh) | 2017-09-01 |
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