CN114522220A - 一种碱性成纤维细胞生长因子微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碱性成纤维细胞生长因子微球及其制备方法。本发明提供了一种制备微球的方法，包括以下步骤：提供有机相，所述有机相包含溶解于有机溶剂中的聚己内酯和任选的有机相表面活性剂；提供外水相，所述外水相包含溶解于水中的外水相表面活性剂；提供内水相，所述内水相包含溶解于水中的碱性成纤维细胞生长因子和任选的内水相表面活性剂；由内水相和有机相得到油包水初乳；由油包水初乳和外水相得到水包油包水复乳；使复乳中的有机溶剂挥发，得到微球；以及收集微球。本发明还提供了一种微球，包括外壳和内核，所述外壳包含聚己内酯，所述内核包含碱性成纤维细胞生长因子。
Description
技术领域
本发明涉及一种碱性成纤维细胞生长因子微球及其制备方法。
背景技术
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为一种生理功能非常广泛的细胞生长因子，它对成纤维细胞、血管内皮细胞等均有明显的促细胞分裂作用；能刺激血管生长，加速创伤愈合。因此以bFGF作为原料药的药物被广泛应用于烧伤创面(包括浅II度、深II度、肉芽创面)、慢性创面(包括体表慢性溃疡等)和新鲜创面(包括外伤、供皮区创面、手术伤等)。此外，在包括牙骨、软骨和骨骼等骨的再生过程中，bFGF对相关细胞如软骨细胞和成骨细胞的增殖和迁移以及相关组织如牙骨质和结缔组织的再生同样具有重要影响。同时，bFGF可以通过维持或增加骨缺损部位的间充质干细胞的分化、增值能力，来预防骨质流失并促进骨再生，上述特点使得bFGF具有极大的潜在价值。然而，目前国内上市的bFGF药物多局限于外用创伤领域，且剂型多为如冻干粉、外用溶液以及凝胶等的外用制剂。这些制剂的共同点是它们均需要多次给药，而且疗效持续时间短，而频繁用药也容易降低患者的依从性，大大限制bFGF的成药性和应用前景。
近年来，基于生物材料的控释策略也被广泛研究并应用于创伤修复和骨再生等领域。国内公开的有关bFGF载体制备的专利技术中，大多数生物载体为纳米膜或水凝胶，它们虽然能够起到一定的缓释效果，但实际使用过程仍有一定的缺陷。由于纳米膜装载药物的方式为静电吸附，不能控制bFGF释放过程中的参数，导致批间差异明显、重复性差。同时bFGF暴露于材料表面，不仅增加了储存的难度，还无法保证治疗期间bFGF的生物学活性。同样对于水凝胶，虽然提高了载体的生物相容性并能局部持续释放bFGF，但缓释效率和bFGF稳定性同样无法保证，这将限制治疗的总体功效。因此常规缓释载体的缺陷强调了对新一代缓释载体的需求。
为应对这一需求，国内外许多研究人员着手于微球递送系统的开发，由于其具有稳定、良好的缓释能力，微球被广泛用于控制药物输送以治疗各种疾病。同时，微球在治疗期间可以对药物提供一定程度的酶保护作用，大大增加了其作为载体的适用范围。常用的微球材料是人工合成高分子材料包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚丙交酯以及PLA和PGA的共聚物(PLGA)等。由于PLGA是FDA最早认证的可用于人体的合成可降解的生物高分子材料之一，目前研制的bFGF微球大多为PLGA微球。虽然PLGA微球有较高的机械强度、对装载的bFGF有一定的保护作用、能够完全降解且降解时间可调控，但PLGA降解后会增加伤口部位的酸度进而影响组织的修复和bFGF的稳定性。不仅如此，部分bFGF在PLGA微球中以吸附作用和PLGA结合，并没有被完全包裹，这就造成了实际释放过程中，PLGA微球有着较大的突释率和较短的释放周期等问题。更为重要的是，PLGA微球的载药量大部分为ng/mg级别，无法长期维持bFGF在缓释过程中的有效浓度，因而多数技术仅仅停留在实验阶段，限制了PLGA微球作为bFGF释放载体在临床中的应用。
仍然需要一种新的碱性成纤维细胞生长因子微球及其制备方法，该微球具有良好的形态、质地、粒径分布，能够缓慢持续释放bFGF，且具有良好的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的碱性成纤维细胞生长因子微球及其制备方法，该微球具有良好的形态、质地、粒径分布，能够缓慢持续释放bFGF，且具有良好的稳定性。
本发明涉及一种制备微球的方法，包括以下步骤：
提供有机相，所述有机相包含溶解于有机溶剂中的聚己内酯(PCL)和任选的有机相表面活性剂；
提供外水相，所述外水相包含溶解于水中的外水相表面活性剂；
提供内水相，所述内水相包含溶解于水中的碱性成纤维细胞生长因子和任选的内水相表面活性剂；
由内水相和有机相得到油包水初乳；
由油包水初乳和外水相得到水包油包水复乳；
使复乳中的有机溶剂挥发，得到微球；以及
收集微球。
本发明还涉及一种微球，包括外壳和内核，所述外壳包含聚己内酯，所述内核包含碱性成纤维细胞生长因子。
所述微球具有良好的形态、质地、粒径分布，能够缓慢持续释放具有生物学活性的bFGF，具有良好的稳定性。
附图说明
图1是bFGF-PCL微球的1,500X的扫描电子显微镜图；
图2是bFGF-PCL微球的30,000X的扫描电子显微镜图；
图3是bFGF-PCL微球的37℃下体外释放曲线图；
图4是bFGF-PCL微球的部分取样点的体外释放上清液的生物学活性统计结果图；
图5是bFGF-PCL微球的第49天的体外释放上清液的生物学活性实验结果图。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本文件为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
对于本公开内容涉及的所有数值范围，应理解为公开了该范围内所有具体数值，以及该范围内任意两个数值限定的子范围。例如，对于1％-10％，应理解为公开了1％、2％、3％、3.5％、4.5％、10％等具体数值，以及1％-5％，2％-6％，3.5％-7.5％等子范围。
在一个方面，本发明涉及一种制备微球的方法，包括以下步骤：
提供有机相，所述有机相包含溶解于有机溶剂中的聚己内酯和任选的有机相表面活性剂；
提供外水相，所述外水相包含溶解于水中的外水相表面活性剂；
提供内水相，所述内水相包含溶解于水中的碱性成纤维细胞生长因子和任选的内水相表面活性剂；
由内水相和有机相得到油包水初乳；
由油包水初乳和外水相得到水包油包水复乳；
使复乳中的有机溶剂挥发，得到微球；以及
收集微球。
在一个方面，聚己内酯的相对分子量为50,000～70,000，例如55,000。
在一个方面，内水相中bFGF的质量百分比为0.0000005％～0.50％，例如0.05％-0.50％。
在一个方面，有机相中聚己内酯的质量百分比为2％～10％。
在一个方面，有机相中的有机相表面活性剂的体积百分比为0.2％～4.0％。
在一个方面，通过将聚己内酯和任选的有机相表面活性剂加入有机溶剂中，静置溶解过夜，得到有机相。
在一个方面，由内水相和有机相得到油包水初乳，且所述内水相和有机相的体积比为1∶5～1∶20。
在一个方面，由油包水初乳和外水相得到水包油包水复乳，且所述有机相和外水相的体积比为1∶5～1∶20。
在一个方面，所述有机相表面活性剂选自司盘-80、聚甘油油酸酯或硬脂酸甘油酯。
在一个方面，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃。
在一个方面，所述外水相表面活性剂选自吐温-80、PVA、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素钠。
在一个方面，所述外水相中的所述外水相表面活性剂是质量百分比为0.5％～5.0％的PVA和/或体积百分比为0.0001％～1％的吐温-80。
在一个方面，所述外水相还包含渗透压调节剂或pH缓冲剂。
在一个方面，渗透压调节剂为NaCl；或pH缓冲剂为磷酸盐或碳酸盐。
在一个方面，外水相中渗透压调节剂的质量百分比为0～7％。
在一个方面，外水相的pH值为6.0～8.0。
在一个方面，所述外水相通过在60～80℃持续搅拌15～90分钟后，静置冷却至室温后得到。
在一个方面，所述外水相在缓冲体系中制备。
在一个方面，缓冲体系为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和磷酸缓冲盐溶液中的一种。
在一个方面，所述内水相表面活性剂选自PVA、吐温-80或司盘-80。
在一个方面，内水相中的所述内水相表面活性剂是质量百分比为0～4％的PVA。
在一个方面，通过将PVA加至碱性成纤维细胞生长因子水溶液中，静置溶解后得到内水相。
在一个方面，通过在搅拌下将内水相在有机相液面上方以一定速率滴加至有机相中，任选地在滴加结束后继续搅拌，得到油包水初乳。
在一个方面，通过在搅拌下将内水相在有机相液面上方以0.5～2.0ml/min的速率滴加至有机相中，任选地在滴加结束后以相同转速1000-3000rpm，例如2,500rpm继续搅拌0～1.5min，得到油包水初乳。
在一个方面，通过在搅拌下将油包水初乳在外水相液面下方以一定速率加至外水相中，任选地在滴加结束后继续搅拌，得到水包油包水复乳，任选调节转速，继续搅拌使有机溶剂挥发，得到微球。
在一个方面，通过在搅拌下将油包水初乳在外水相液面下方以0.5～2.0ml/min的速率加至外水相中，任选地在滴加结束后以相同转速1000-3000rpm，例如2,500rpm继续搅拌0～1.5min，得到水包油包水复乳，任选调节转速至600～1,200rpm，继续搅拌6～24h使有机溶剂挥发，得到微球。
在一个方面，通过离心后弃去上清液收集微球，任选清洗微球，任选将微球用水分散后冻干。
在一个方面，离心转速为3000-10000rpm，例如6500rpm。
在一个方面，用注射用水清洗微球。
在一个方面，所述冻干过程包括：以-0.25～-1.00℃/min的降温速率将微球分散液从室温冷冻至-30℃，并在-30℃维持120min；待所述冷冻结束后，调整真空度至200～300μB，将温度从-30℃阶段式升温至-25℃、-20℃、-15℃，其中各阶段升温速率为+0.08～0.17℃/min、维持时间为60～180min；待一次升华结束后，调整真空度至150μB、温度至-15℃，持续120～180min；待二次升华结束后，得到干燥的微球
在一个方面，本发明涉及一种微球，包括外壳和内核，所述外壳包含聚己内酯，所述内核包含碱性成纤维细胞生长因子。
以上各个方面的特征可以相互组合。
本发明所用的材料可购买得到，或用本领域技术人员公知的方法得到。
质量百分比单位为g/100ml，例如质量百分比2％表示2g/100ml。
实施例
实施例1
将2％(w/v)浓度的PCL加入10ml三氯甲烷中，静置溶解过夜，作为有机相；将2％(w/v)浓度的PVA加入100ml PBS(pH＝7.4)中，加热溶解后冷却至室温，作为外水相。将0.5％(w/v)浓度的PVA加入1ml 0.14％(w/v)浓度bFGF原液中溶解，作为内水相。使用注射器在10ml有机相液面上方以1ml/min的速度逐滴加入1ml内水相，并以2,500rpm的转速边加边搅拌。滴加结束后以2,500rpm的转速继续搅拌，持续0.5min，得到油包水初乳。使用注射器吸取油包水初乳，并在100ml外水相液面下方以1.2ml/min的速率加入，并以2,500rpm的转速边加边搅拌。滴加结束后以2,500rpm的转速继续搅拌，持续1min，得到水包油包水复乳。然后调节转速至1000rpm，持续搅拌6h，直至体系中三氯甲烷完全挥发后得到固化微球。将反应溶液于6500rpm离心8min后弃去上清液并收集微球。微球用25ml注射用水清洗两次，并于7000rpm离心2min后弃去上清液。得到的微球用1ml注射用水分散并转移至5ml西林瓶中，前去冻干(包括以-0.25℃/min的降温速率将微球溶液从室温冷冻至-30℃，并在-30℃维持120min；待上述冷冻结束后，调整真空度至300μB，将温度从-30℃阶段式升温至-25℃、-20℃、-15℃，其中各阶段升温速率为+0.08～0.17℃/min、维持时间为60～180min；待上述一次升华结束后，调整真空度至150μB、温度至-15℃，持续150min。)。冻干结束后得到bFGF-PCL微球。
实施例2
将6％(w/v)浓度的PCL和2％(v/v)浓度的聚甘油油酸酯加入25ml三氯甲烷中，静置溶解过夜，作为有机相；将1.0％(w/v)浓度的PVA、1％(w/v)浓度的NaCl以及0.5％(v/v)浓度的Tween-80加入500ml PBS(pH＝7.4)中，加热溶解后冷却至室温，作为外水相。内水相为重组碱性成纤维细胞生长因子原液。使用注射器在25ml有机相液面上方以1ml/min的速度逐滴加入5ml 0.20％(w/v)浓度的bFGF水溶液，并以2,500rpm的转速边加边搅拌。滴加结束后以2,500rpm的转速继续搅拌，持续1.5min，得到油包水初乳。使用注射器吸取油包水初乳，并在500ml外水相液面下方以0.5ml/min的速率加入，并以2,500rpm的转速边加边搅拌。滴加结束后以2,500rpm的转速继续搅拌，持续1.5min，得到水包油包水复乳。然后调节转速至1000rpm，持续搅拌24h，直至体系中三氯甲烷完全挥发后得到固化微球。将反应溶液于6500rpm离心8min后弃去上清液并收集微球。微球用25ml注射用水清洗两次，并于7000rpm离心2min后弃去上清液。得到的微球用5ml注射用水分散并转移至多个5ml西林瓶中，前去冻干(包括以-1.00℃/min的降温速率将微球溶液从室温冷冻至-30℃，并在-30℃维持120min；待上述冷冻结束后，调整真空度至300μB，将温度从-30℃阶段式升温至-25℃、-20℃、-15℃，其中各阶段升温速率为+0.08～0.17℃/min、维持时间为60～180min；待上述一次升华结束后，调整真空度至150μB、温度至-15℃，持续180min。)。冻干结束后得到bFGF-PCL微球。
实施例3
扫描电子显微镜(SEM)下观察bFGF-PCL微球形态
对实施例1获得的bFGF-PCL微球进行扫描电镜检测，检测结果如图1和图2所示，分别为1,500X和30,000X倍数下的bFGF-PCL微球SEM图。
从图1和图2可以看出微球形态饱满，质地均匀，粒径分布较为均匀。
实施例4
bFGF-PCL微球的释放特性及其释放出的bFGF的生物活性测定
对于体外释放实验：取部分实施例2获得的bFGF-PCL微球，浸入释放介质(pH＝7.4的PBS缓冲液)，放置于37℃恒温摇床。在设置的时间点取上清液，并加入同体积的释放介质。使用ELISA法测定bFGF的含量，绘制成体外释放曲线，如图3所示。图3为37℃下本发明实施例2所获得的bFGF-PCL微球的累计释放效率(n＝4)。
对于生物学活性的测定：将Balb/c 3T3细胞接种到96孔板上，培养并饥饿后，向其中加入实施例2获得的部分取样点的微球体外释放上清液(用饥饿培养基不同倍数稀释处理后上样)。继续培养48h，加入MTT显色，之后加入DMSO溶解并于570nm和630nm进行检测，如图4、5所示。图4为部分取样点的微球体外释放上清液的生物学活性统计结果(n＝4，其中Cell Viability(IU/mg)＝样品生物学活性(IU/mg)/样品浓度(mg/ml))，图5为第49天的微球体外释放上清液的生物学活性实验结果(STD为标准品，其余四组为第49天平行的四组体外释放上清液)。样品生物学活性按下式计算：
样品生物学活性(IU/ml)＝Pr x(Ds x Es)/(Dr x Er)
式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为样品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为样品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。
从图3可以看出，整个释放过程分为两个部分。第一部分，37℃下本发明实施例2所获得的bFGF-PCL微球在第一天有着较快的释放速率，一共释放了约6000ng，可以使得微球在给药部位迅速获得较高治疗浓度。第二部分，微球在剩余的49天里持续缓慢的释放，释放速率约为50-100ng/d，这使得微球在给药部位可以持续给予有效的治疗浓度。解决了本发明所要解决的常规微球缓释效率低的问题，使bFGF微球更具备应用潜力和临床价值。
从图4、5可以看出，本发明实施例2所获得的bFGF-PCL微球在体外37℃释放49天后所释放的上清液，能明显的促进细胞生长，且仍具有较高的生物学活性。这也表明本发明所制备的bFGF-PCL微球能够对包裹的bFGF起到良好的稳定和保护作用。
虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。
Claims (10)
1.一种制备微球的方法，包括以下步骤：
提供有机相，所述有机相包含溶解于有机溶剂中的聚己内酯和任选的有机相表面活性剂；优选地，聚己内酯的相对分子量为50,000～70,000，例如55,000；优选地，聚己内酯的质量百分比为2％～10％；优选地，有机相表面活性剂的体积百分比为0.2％～4.0％；优选地，通过将聚己内酯和任选的有机相表面活性剂加入有机溶剂中，静置溶解过夜，得到有机相；
提供外水相，所述外水相包含溶解于水中的外水相表面活性剂；
提供内水相，所述内水相包含溶解于水中的碱性成纤维细胞生长因子和任选的内水相表面活性剂；优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的质量百分比为0.0000005％～0.50％，例如0.05％-0.50％；
由内水相和有机相得到油包水初乳；优选地，所述内水相和有机相的体积比为1∶5～1∶20；
由油包水初乳和外水相得到水包油包水复乳；优选地，所述有机相和外水相的体积比为1∶5～1∶20；
使复乳中的有机溶剂挥发，得到微球；以及
收集微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机相表面活性剂选自司盘-80、聚甘油油酸酯、硬脂酸甘油酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述外水相表面活性剂选自吐温-80、PVA、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素钠；优选地，所述外水相表面活性剂是质量百分比为0.5％～5.0％的PVA和/或体积百分比为0.0001％～1％的吐温-80。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述外水相还包含渗透压调节剂(例如NaCl)或pH缓冲剂(例如磷酸盐或碳酸盐)；优选地，渗透压调节剂的质量百分比为0～7％；优选地，pH值为6.0～8.0；优选地，所述外水相通过在60～90℃持续搅拌15～90分钟后，静置冷却至室温后得到；优选地，所述外水相在缓冲体系(例如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和磷酸缓冲盐溶液中的一种)中制备。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述内水相表面活性剂选自PVA、吐温、司盘；优选地，所述内水相表面活性剂是质量百分比为0～4％的PVA；优选地，通过将PVA加至碱性成纤维细胞生长因子水溶液中，静置溶解后得到内水相。
7.根据权利要求1所述的方法，其中通过在搅拌下将内水相在有机相液面上方以一定速率(例如0.5～2.0ml/min)滴加至有机相中，任选地在滴加结束后优选以相同转速(例如1000-3000rpm，例如2500rpm)继续搅拌例如0～1.5min，得到油包水初乳。
8.根据权利要求1所述的方法，其中通过在搅拌下将油包水初乳在外水相液面下方以一定速率(例如0.5～2.0ml/min)加至外水相中，任选地在滴加结束后优选以相同转速(例如1000-3000rpm，例如2,500rpm)继续搅拌例如0～1.5min，得到水包油包水复乳，任选调节转速(例如600～1200rpm)，继续搅拌(例如6～24h)使有机溶剂挥发，得到微球。
9.根据权利要求1所述的方法，其中通过离心后(例如3000-10000rpm，例如6500rpm)弃去上清液收集微球，任选清洗微球(例如用注射用水清洗)，任选将微球用水分散后冻干；优选地，所述冻干过程包括：以-0.25～-1.00℃/min的降温速率将微球分散液从室温冷冻至-30℃，并在-30℃维持120min；待所述冷冻结束后，调整真空度至200～300μBar，将温度从-30℃阶段式升温至-25℃、-20℃、-15℃，其中各阶段升温速率为+0.08～0.17℃/min、维持时间为60～180min；待一次升华结束后，调整真空度至150μB、温度至-15℃，持续120～180min；待二次升华结束后，得到干燥的微球。
10.一种微球，包括外壳和内核，所述外壳包含聚己内酯，所述内核包含碱性成纤维细胞生长因子。
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