KR20160110935A - 조직 재생용 조직 지지체 재료 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소정의 밀도를 갖는 미소구체가 그와 다른 밀도를 갖는 하이드로겔에 박혀 있는 조직 지지체 재료(tissue scaffold materials)에 관한 것이다. 본 발명의 재료는 상처 치유 및 조직 재생을 위한 세포 침투 및 혈관생성을 용이하게 하는 개선된 기능을 갖는다. 본 발명자들은 서로 다른 밀도를 갖는 구성성분을 갖는 재료가, 바람직한 세포, 예컨대 섬유아세포 및 내피 전구 세포를 비롯한 세포의 상기 지지체로의 침투를 촉진한다는 것을 발견하였다.
Description
[0001] 본 출원은 2013년 11월 19일 출원된 미국 가출원 번호 제61/906,131호에 대하여 우선권을 주장하며, 이 문헌 전체는 본 명세서에 통합된다.
[0002] 자가 또는 인공 조직 지지체(tissue scaffold)를 통한 세포유도(cell guidance)의 최적화는 오랜 기간 큰 관심을 받아온 주제이다. 가장 널리 적용되어 가장 성공적으로 적용된 상용(off-the-shelf) "조직-공학" 제품은 원래 모두 피부 대체 지지체의 역할을 하도록 의도되었다. 시판중인 지지체는 무세포이며(acellular), 따라서 내구성 있는 통합을 달성하기 위한 숙주세포 침투(invasion) 및 혈관생성(vascularization)의 공통 요건을 공유한다. 완성을 위하여 최소 몇 주를 필요로 하고, 의무 드레싱 교체, 상처 고정, 및 간호를 필요로 하므로 이러한 과정이 연장되기 때문에, 세포 침투 속도를 최적화할 수 있는 더 좋은 지지체를 개발하는데 상당한 관심이 있다 (Eppley, Plast Reconstr Surg. 107:757-762 (2001); Wong et al., Plast Reconstr Surg. 121:1144-1152 (2008)).
[0003] 현재 시판중인 무세포 피부 대체물은 크게 두 가지 군으로 분류될 수 있다: 탈세포 진피(decellularized dermis) 유래 제품, 및 천연 유래 하이드로겔 기반의 합성 제품 (Truong et al. J. Burns Wounds 4:e4 (2005)).
[0004] 시판중인 탈세포 피부 제품은 탈세포 사체 돼지 또는 사람의 진피로 만들어진다. 탈세포 공정의 결과, 이들 제품은 고유 피부 미세혈관계(microvasculature)의 잔재인 마이크로채널과 온전한 기저막의 내부 네트워크를 포함한다.
[0005] 또다른 일반적으로 적용되는 피부 재생 템플릿(template)인 INTEGRA (Integra LifeSciences, Plainsboro, NJ)는 "상피의" 반투과 실리콘 시트로 덮인, 가교된 I형 소 콜라겐 및 콘드로이틴-6-황산의 합성 "피부" 다공성 층으로 구성된다. 이식 후, 일단 피부층에 혈관생성이 이루어지면 실리콘 시트는 분할-두께 자가이식으로 대체된다 (Yannas et al., Science 215:174-176 (1982)). 탈세포 피부 제품과 달리, INTEGRA는 내부 혈관 구조가 없는 제품을 대표하며, 대신에 무작위 다공성(평균 기공 직경 30-120 ㎛)을 특징으로 한다 (van der Veen et al., Burns 36:305-321 (2010)).
[0006] 현재 시판중인 조직 대체 지지체의 사용은 상당한 관련 비용이 없는 것은 아니다. 예를 들어, 탈세포 피부 제품의 제조는 탈세포화 및 멸균 처리 뿐만 아니라 조직의 채취 및 수집(harvesting)을 필요로 한다 (Ng et al., Biomaterials 25:2807-2818 (2004)). 또한, 시판중의 조직 지지체는 무세포이고, 복잡한 환경, 예컨대 조사된(irradiated) 상처 또는 노출된 하드웨어 또는 뼈가 있는 상처에 사용될 경우, 실패율이 높은 경향이 있다. 이렇게 복잡한 환경에서, 기존의 조직 대체 제품을 사용할 경우 혈관신생(neovascularization)이 불충분하다.
[0007] 최적의 세포 침투 및 새로운 주변 조직의 혈관생성을 촉진하는 개선된 조직 지지체가 이 기술분야에 요구된다,
[0008] 하이드로겔과 거기에 박혀 있는 미소구체(microspheres)로 이루어진 조직 지지체 재료의 유형을 본 명세서에 개시한다. 본 명세서에 개시된 조직 지지체에서, 미소구체는 하이드로겔의 밀도과 다르거나 그에 비하여 높은 폴리머 밀도(w/v)를 갖는데, 이러한 차등한 밀도는 조직 지지체로의 세포 침투를 용이하게 한다. 일 구현예에서, 하이드로겔은 제1 폴리머를 포함하고, 미소구체는 제2 폴리머를 포함하며, 미소구체는 하이드로겔 내에 박혀 있고, 미소구체는 하이드로겔 보다 높은 밀도를 갖는다.
[0009] 제1 및 제2 폴리머는 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 셀룰로오스, 피브리노겐, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 폴리우레탄, 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산], 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 미생물 폴리에스테르, 폴리(β-히드록시알키노에이트), 및 티로신 유래 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 미소구체는 제2 폴리머를 0.2% 내지 2.0%, 0.4% 내지 1.2%, 0.6% 내지 1.0%, 또는 1.0% w/v 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 폴리머는 콜라겐이다. 미소구체는 직경이 50-250 ㎛일 수 있다. 미소구체는 조직 지지체 재료 부피의 적어도 약 50%, 60%, 또는 70%를 차지할 수 있다. 미소구체는 생리활성 인자(bioactive factors)도 포함할 수 있으나, 일부 구현예에서, 미소구체는 생리활성 인자를 포함하지 않는다. 생리활성 인자는 세포 침투, 세포 성장, 또는 혈관생성 중 하나 이상을 촉진할 수 있다.
[0010] 일 실시예에서, 하이드로겔은 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예에서, 하이드로겔은 콜라겐을 0.1% 내지 0.6%, 0.2 내지 0.4%, 또는 0.3% w/v 포함한다. 조직 지지체 재료는 0.1% 내지 0.6%, 0.2 내지 0.4%, 또는 0.3% w/v의 콜라겐을 갖는 하이드로겔 내에 박혀 있는, 0.2% 내지 2.0%, 0.4% 내지 1.2%, 0.6% 내지 1.0%, 또는 1.0% w/v의 콜라겐을 갖는 미소구체를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 조직 지지체 재료는 0.3% w/v의 콜라겐을 함유하는 하이드로겔 내에 박혀 있는, 0.6-1.0% w/v의 콜라겐을 갖는 미소구체를 갖는다.
[0011] 상기 구현예 중 어느 하나의 조직 지지체는 시트의 형태 또는 유동가능한 형태(flowable form)일 수 있다. 상기 재료는 예컨대 깊이가 0.5-3.0 mm, 또는 약 1.0-2.0 mm인 시트 형태일 수 있다. 상기 개시된 조직 지지체 재료는 대상체의 상처 치유 또는 조직 재생에 사용될 수 있다.
[0012] 또한, 전술한 조직 지지체 재료를 대상체의 상처 또는 조직에 적용함으로써, 상처 치유 또는 조직 재생을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유 또는 조직 재생을 촉진하는 방법을 여기에 개시한다. 조직 지지체 재료는 예컨대 노출된 뼈, 하드웨어, 또는 괴사 조직을 갖는 대상체의 부위에 적용될 수 있다.
[0013] 또한, 조직 지지체 재료를 제조하는 방법을 여기에 개시한다. 이 방법은 다음 단계들을 수반한다: (a) 미소구체를 갖는 제1 조성물 및 폴리머 재료를 갖는 제2 조성물을 제공하되, 제1 조성물의 밀도는 제2 조성물의 밀도와 다른 것인 제1 조성물과 제2 조성물을 제공하는 단계; (b) 제1 조성물 및 제2 조성물을 혼합하는 단계; 및 (c) 미소구체가 박힌 하이드로겔을 형성하기 위하여 상기 혼합물에서 폴리머 재료의 가교를 유도하는 단계. 제1 및 제2 조성물은 각각 폴리머로서 콜라겐, 예컨대 인간 또는 소 콜라겐을 포함할 수 있다. 콜라겐은 중화된 콜라겐일 수 있다. 미소구체는 콜라겐을 0.4% 내지 1.2%, 또는 0.6 내지 1.0% w/v 포함할 수 있다. 미소구체는 생리활성 인자를 더 포함할 수 있다. 제2 조성물은 콜라겐을 0.1% 내지 0.6%, 또는 0.3% w/v 포함할 수 있다. 가교는 예컨대 가온방법(thermal method)에 의해 이루어질 수 있다.
[0014] 또한, 상기 제공되고 여기에 더 개시된 방법에 의해 제조된 조직 지지체 재료, 및 이러한 조직 지지체 재료를 포함하는 상처 드레싱을 개시한다.
[0016] 도 1a-1c는 이식후 7일에, 세포가 MSS 지지체에 침투(infiltrate)하지만(c), 1% 벌크 단독에는 침투하지 않으며(a), 0.3% 벌크에는 저조하게 침투하는(b) 것을 도시한다.
[0017] 도 2a-2c는 이식후 14일에, MSS 지지체에서는 세포의 우수한 침투를 나타내지만(c), 1% 벌크에서는 외곽부분을 넘어서 침투하지 않으며(a), 0.3% 벌크에서는 단지 약간의(modest) 침투를 보인다(b).
[0018] 도 3a-3d는 이식후 7일에, 세포는 0.3% 벌크 중에 1% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(c), 및 0.3% 벌크 중에 0.6% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(d)에서 더 완전한 침투를 보여주고, 0.6% 벌크 중에 0.4% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(a), 및 0.2% 벌크 중에 0.4% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(b)에서 덜 침투하는 것을 보여준다.
[0019] 도 4a-4b는 이식후 7일 및 14일에, 0.3% 벌크 중의 1% 미소구체에서의 세포 침투(푸른 염색, DAPI)가 내피 전구 CD31+ 세포(붉은 염색)를 포함하고 있음을 나타낸다.
[0020] 도 5a-5d는 이식후 7일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-c), 이식후 지지체의 크기 비교(d)를 도시한다.
[0021] 도 6a-6c는 이식후 7일에, 세포가 MSS 지지체에서는 지지체의 중심까지 전체에 침투하지만(a), 1% 벌크에서는 지지체가 갈라진 부분을 제외하고는 침투하지 않으며(b), 0.3% 벌크에는 저조하게 침투하는(c) 것을 도시한다.
[0022] 도 7은 이식후 7일에, MSS 중심까지의 세포 침투를 보여주는 DAPI 핵 염색(푸른색) 및 CD31+ 내피 전구(붉은색)을 도시한다.
[0023] 도 8a-8e는 이식후 14일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-d), 이식후 지지체의 크기 비교(e)를 도시한다.
[0024] 도 9a-9d는 이식후 14일에, MSS 지지체에서의 상당한 세포 침투(a), 1% 벌크에서의 (균열 부분을 제외하고는) 최소한의 침투(b), 0.3% 벌크에서의 희박한 침투(c), 및 14일에 INTEGRA에서의 덜 강력한 침투(d)를 도시한다.
[0025] 도 10은 단위 지지체 면적당 세포 수를 나타내는데, 7일 및 14일에 1% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 5 세포) 및 0.3% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 7 세포)에 비해 훨씬 많은 세포가 MSS 지지체(단위 면적당 각각 약 7 세포 및 10 세포)를 침투하였음을 보여준다.
[0026] 도 11a-11d는 이식후 28일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-c), 이식후 지지체의 크기 비교(d)를 도시하는데, 0.3% 하이드로겔은 상당히 수축되었다.
[0027] 도 12a-12d는 이식후 28일에, MSS 지지체에서의 우수한 세포 침투(a), 1% 콜라겐에서의 (균열 부분을 제외하고는) 최소한의 침투 유지(b), 0.3% 벌크에서의 균일한 보통의(moderate) 침투(c), 및 INTEGRA에서의 적당한(reasonable) 침투(d)를 도시한다.
[0028] 도 13은 미소구체의 주사전자현미경 사진이다.
[0017] 도 2a-2c는 이식후 14일에, MSS 지지체에서는 세포의 우수한 침투를 나타내지만(c), 1% 벌크에서는 외곽부분을 넘어서 침투하지 않으며(a), 0.3% 벌크에서는 단지 약간의(modest) 침투를 보인다(b).
[0018] 도 3a-3d는 이식후 7일에, 세포는 0.3% 벌크 중에 1% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(c), 및 0.3% 벌크 중에 0.6% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(d)에서 더 완전한 침투를 보여주고, 0.6% 벌크 중에 0.4% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(a), 및 0.2% 벌크 중에 0.4% 미소구체를 갖는 MSS 지지체(b)에서 덜 침투하는 것을 보여준다.
[0019] 도 4a-4b는 이식후 7일 및 14일에, 0.3% 벌크 중의 1% 미소구체에서의 세포 침투(푸른 염색, DAPI)가 내피 전구 CD31+ 세포(붉은 염색)를 포함하고 있음을 나타낸다.
[0020] 도 5a-5d는 이식후 7일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-c), 이식후 지지체의 크기 비교(d)를 도시한다.
[0021] 도 6a-6c는 이식후 7일에, 세포가 MSS 지지체에서는 지지체의 중심까지 전체에 침투하지만(a), 1% 벌크에서는 지지체가 갈라진 부분을 제외하고는 침투하지 않으며(b), 0.3% 벌크에는 저조하게 침투하는(c) 것을 도시한다.
[0022] 도 7은 이식후 7일에, MSS 중심까지의 세포 침투를 보여주는 DAPI 핵 염색(푸른색) 및 CD31+ 내피 전구(붉은색)을 도시한다.
[0023] 도 8a-8e는 이식후 14일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-d), 이식후 지지체의 크기 비교(e)를 도시한다.
[0024] 도 9a-9d는 이식후 14일에, MSS 지지체에서의 상당한 세포 침투(a), 1% 벌크에서의 (균열 부분을 제외하고는) 최소한의 침투(b), 0.3% 벌크에서의 희박한 침투(c), 및 14일에 INTEGRA에서의 덜 강력한 침투(d)를 도시한다.
[0025] 도 10은 단위 지지체 면적당 세포 수를 나타내는데, 7일 및 14일에 1% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 5 세포) 및 0.3% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 7 세포)에 비해 훨씬 많은 세포가 MSS 지지체(단위 면적당 각각 약 7 세포 및 10 세포)를 침투하였음을 보여준다.
[0026] 도 11a-11d는 이식후 28일에, 마우스에서 MSS, 0.3% 벌크, 1% 벌크 및 INTEGRA 지지체를 구별하며(a-c), 이식후 지지체의 크기 비교(d)를 도시하는데, 0.3% 하이드로겔은 상당히 수축되었다.
[0027] 도 12a-12d는 이식후 28일에, MSS 지지체에서의 우수한 세포 침투(a), 1% 콜라겐에서의 (균열 부분을 제외하고는) 최소한의 침투 유지(b), 0.3% 벌크에서의 균일한 보통의(moderate) 침투(c), 및 INTEGRA에서의 적당한(reasonable) 침투(d)를 도시한다.
[0028] 도 13은 미소구체의 주사전자현미경 사진이다.
[0029] 상처 치유 및 조직 재성을 위한 세포 침투 및 혈관생성을 용이하게 하는 개선된 기능을 갖는 조직 지지체 재료를 여기에 개시한다. 본 발명자들은 서로 다른 밀도를 갖는 성분들을 갖는 재료가 바람직한 세포, 예컨대 섬유아세포 및 내피 전구 세포를 비롯한 세포의 상기 재료로의 침투를 촉진한다는 것을 발견하였다.
[0030] "조직 지지체(tissue scaffold)", "조직 지지체 재료", "피부 대체물", "피부 대체 재료" 및 "재료"는 생체적합성 고분자로 이루어진 세포 성장 지지 구조체를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 재료는 세포 침투 및 조직 재생을 촉진하는 생체적합성 템플릿을 제공함으로써 손상된 조직을 재생할 수 있다.
[0031] 여기에 개시된 조직 지지체 재료는 미소구체가 충전된 하이드로겔 지지체로 구성된다. 미소구체는 미소구체가 박혀 있는 하이드로겔의 밀도와 상이한 밀도(밀도는 부피에 대한 중량 또는 w/v으로 측정됨)를 갖는다. 바람직한 일 구현예에서, 미소구체는 하이드로겔 보다 높은 밀도를 갖는다. 그러나, 미소구체는 하이드로겔 보다 낮은 밀도를 가질 수도 있다.
[0032] 이 출원 전반에서, "약(about)" 및 "대략(approximately)"이라 함은, 어떤 값이 장치 또는 그 값을 결정하기 위해 채용된 방법에서 오류의 고유 편차, 또는 연구 대상체 간에 존재하는 편차를 포함한다는 것을 의미한다. 비제한적 일 구현예에서, 이 용어는 10% 이내, 좋기로는 5% 이내, 더욱 좋기로는 1% 이내, 가장 좋기로는 0.5% 이내로 정의된다.
폴리머
[0033] 여기에 개시된 미소구체, 하이드로겔, 및 조성물은 폴리머를 포함한다. 미소구체 및 하이드로겔은 동일한 폴리머를 포함할 수 있거나, 또는 서로 상이한 폴리머를 포함할 수 있다. "폴리머"는 반복하는 서브유닛으로 이루어진 거대분자이다. 조직 공학에 적합한 폴리머 재료로는 천연 폴리머, 예컨대, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 및 셀룰로오스; 피브리노겐; 및 합성 폴리머, 예를 들어 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 예컨대 HYBRANE S1200 (DSM, 네덜란드); 폴리우레탄, 예컨대 DEGRAPOL (Abmedica, 이탈리아); 폴리무수물, 예컨대 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산]; 폴리포스포에스테르, 예컨대 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드]; 폴리(오르토 에스테르); 폴리(알킬 시아노아크릴레이트); 폴리에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜); 미생물 폴리에스테르, 예컨대 폴리(β-히드록시알키노에이트); 및 폴리(아미노산), 예컨대 티로신 유래 폴리카보네이트 (Marin et al., Int . J. Nanomed. 8:3071-3091 (2013) 참조)가 있다. 일 구현예에서, 폴리머는 콜라겐, 히알루론산, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 및 폴리(락트산)(PLA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 폴리머는 I, II, III, IV, 및 V형 콜라겐을 비롯한 콜라겐 및 콜라겐계 생체재료이다. 인간 대상체 용도로 특히 바람직한 것은 인간 및 소 콜라겐, 예컨대 인간 또는 소 I형 콜라겐이다.
미소구체
[0034] "미소구체(microspheres)"는 폴리머로 이루어진 작은 입자이다. 본 명세서에서 "미소구체"라 함은 구형 또는 비구형일 수 있는 작은 입자를 포괄한다; 따라서, 여기에 개시된 미소구체가 구형 및 비구형의 작은 입자를 모두 포함하기 때문에, "미소구체"라는 용어는 본 출원에서 "미소구조체(microstructures)"라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 미소구체는 직경 1 ㎛-1 mm을 포괄할 수 있지만, 여기에 개시된 미소구체는 통상 예를 들어 10-500 ㎛의 직경, 50-250 ㎛의 직경, 50-150 ㎛의 직경, 또는 100-200 ㎛의 직경을 갖는다. 일 구현예에서, 조직 지지체 재료 내의 미소구체는 크기와 형태가 상당히 균일한데, 예를 들어 소정의 지지체에서 모든 미소구체는 대체로 구형일 수 있으며, 직경은 약 50-150 ㎛, 또는 약 100-200 ㎛일 수 있다. 다른 구현예에서, 소정의 지지체에서 미소구체는 형태가 상이할 수 있는데, 예를 들어 일부는 평평한, 구부러진, 타원, 또는 불규칙한 형태인 반면 다른 것은 구형일 수 있다. 다른 구현예에서, 소정의 지지체에서 미소구체는 크기가 상이할 수 있는데, 예를 들어 직경이 10-500 ㎛, 또는 심지어 1-1000 ㎛ 범위에서 상이할 수 있다.
[0035] 일부 실시예에서, 미소구체는 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 셀룰로오스, 피브리노겐, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 폴리우레탄, 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산], 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 미생물 폴리에스테르, 폴리(β-히드록시알키노에이트), 및 티로신 유래 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머를 0.2% 내지 2.0%, 0.4% 내지 1.2%, 0.4% 내지 0.8%, 또는 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1.0% w/v 포함하여 이루어진다. 특정 일 구현예에서, 폴리머는 콜라겐이다.
[0036] 미소구체는 폴리머에 추가하여 생리활성 인자를 더 포함할 수 있다. "생리활성 인자(bioactive factor)"는 세포 침투, 세포 성장, 혈관형성(angiogenesis), 혈관생성, 신경 재생 또는 세포 분화를 자극하거나 촉진할 수 있는 작은 유기분자, 핵산, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 생리활성 인자는 예컨대 조직 지지체 재료를 제조하기 전에 미소구체 내에 함유된 또는 미소구체의 폴리머 매트릭스와 혼합된 성장 인자일 수 있다. 일 실시예에서, 생리활성 인자는 신경 성장 인자(NGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뇌 유래 성장 인자(BDNF), 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF), 색소 상피 유래 인자(PEDF), 신경교 유래 성장 인자(GDNF), 안지오포이에틴, 및 에리스로포이에틴(EPO)으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자이다. 다른 일 실시예에서, 생리활성 인자는 핵산, 예컨대 안티센스 siRNA 분자이다. 다른 구현예에서, 미소구체는 다른 생리활성 인자를 포함하지 않는다.
하이드로겔
[0037] "하이드로겔(hydrogel)"이라 함은 물에 광범위하게 팽창하지만 물에 용해되지는 않는, 다양한 등급의 폴리머 재료를 의미한다. 일반적으로, 하이드로겔은 용액을 겔화시키기에 충분한 3차원 폴리머 네트워크를 형성하도록 폴리머가 가교될 수 있는 조건에서 친수성 모노머를 수성 용액에서 중합시킴으로써 형성된다. 하이드로겔은 Hoffman, D. S., "Polymers in Medicine and Surgery," Plenum Press, New York, pp 33-44 (1974)에서 더욱 상세하게 설명된다.
[0038] 여기에 개시된 하이드로겔은 상기 제공된 폴리머로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 셀룰로오스, 피브리노겐, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 폴리우레탄, 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산], 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 미생물 폴리에스테르, 폴리(β-히드록시알키노에이트), 및 티로신 유래 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머를 0.1% 내지 0.6%, 0.2 내지 0.4%, 또는 0.3% w/v 포함한다. 일 실시예에서, 하이드로겔은 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예에서, 하이드로겔은 콜라겐을 0.1% 내지 0.6%, 0.2 내지 0.4%, 또는 0.3% w/v 양으로 포함한다.
조직 지지체 재료의 제조방법
[0039] 조직 지지체 재료의 제조방법을 여기에 개시한다. 이 방법은 다음 단계들을 수반한다: (a) 미소구체를 갖는 제1 조성물 및 폴리머 재료를 갖는 제2 조성물을 제공하되, 제1 조성물의 밀도는 제2 조성물의 밀도와 다른 것인 제1 조성물과 제2 조성물을 제공하는 단계; (b) 제1 조성물 및 제2 조성물을 혼합하는 단계; 및 (c) 미소구체가 박힌 하이드로겔을 형성하기 위하여 상기 혼합물에서 폴리머 재료의 가교를 유도하는 단계.
[0040] 지지체를 제조하기 위하여, 적합한 폴리머를 제조를 위한 조성물에 통합시킨다. 적합한 폴리머로는 천연 폴리머, 예컨대, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 및 셀룰로오스; 피브리노겐; 및 합성 폴리머, 예를 들어 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 예컨대 HYBRANE S1200 (DSM, 네덜란드); 폴리우레탄, 예컨대 DEGRAPOL (Abmedica, 이탈리아); 폴리무수물, 예컨대 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산]; 폴리포스포에스테르, 예컨대 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드]; 폴리(오르토 에스테르); 폴리(알킬 시아노아크릴레이트); 폴리에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜); 미생물 폴리에스테르, 예컨대 폴리(β-히드록시알키노에이트); 및 폴리(아미노산), 예컨대 티로신 유래 폴리카보네이트 (Marin et al., Int . J. Nanomed. 8:3071-3091 (2013) 참조)가 있다. 일 구현예에서, 폴리머는 콜라겐, 히알루론산, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 및 폴리(락트산)(PLA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 폴리머는 I, II, III, IV, 및 V형 콜라겐을 비롯한 콜라겐 및 콜라겐계 생체재료이다. 특히 바람직한 것은 인간 및 소 콜라겐이다. 소 I형 콜라겐은 예컨대 Life Technologies, Inc에서 시판 중이다. 인간 I형 콜라겐으로는 예컨대 VITROCOL (Advanced Biomatrix, Inc., San Diego, 캘리포니아)이 동결건조 형태 또는 용액으로 이용가능하다. 재조합 인간 콜라겐으로는 예컨대 COLLAGE Collagen (CollPlant Ltd., Ness-Ziona, 이스라엘)이 이용가능하다.
[0041] 콜라겐은 다양한 원천, 예컨대 인간 또는 소 조직으로부터 유래될 수 있다. 콜라겐은 조직 지지체가 투여될 대상체의 자가 유래일 수 있고, 예컨대 대상체의 피부로부터 추출될 수 있다. 일단 적합한 생물학적 샘플(예컨대, 피부, 태반, 힘줄, 또는 배양 세포)이 조달되면, 콜라겐은 공지 기술에 의해 샘플로부터 추출되어 원액(stock solution)을 형성할 수 있다. 예를 들어, Epstein, J. Biol . Chem. 249:3225-3231 (1974)을 참조하라. 콜라겐 원액은 예컨대 0.1%의 아세트산, 또는Earle 또는 Hank 염, L-글루타민, HEPES, 및 중탄산나트륨을 함유하는 적합한 용액 내에 콜라겐을 포함할 수 있다. 적합한 배지의 예로는 Medium 199 (M199)계 배지가 있다. 이러한 배지는 예컨대 Sigma-Aldrich, Life Technologies, 및 그밖의 세포 배양 배지 판매회사에서 시판 중이다. 콜라겐은 일반적으로 최종 농도, 예컨대 하이드로겔에 있어서 0.2%-1.6%의 콜라겐 농도, 좋기로는 0.3-0.5%의 콜라겐 농도, 미소구체에 있어서 0.6-2.0%의 콜라겐 농도보다 고농도로 유지된다. 또한, 여기에 개시된 방법에 사용하기 적합한 콜라겐은 시판되는 것이 가능하다.
[0042] 일부 구현예에서, 콜라겐은 사용 전에 중화시킨다. 콜라겐은 pH 7.2-7.6, 좋기로는 pH 7.4에 이르도록 콜라겐 원액을 수산화나트륨과 혼합하여 중화시킬 수 있다. 이 혼합물은 오일, 예컨대 미네랄 오일, 좋기로는 NaOH가 혼합된 콜라겐 부피의 적어도 5배 부피의 오일로 덮이고 사용할 때까지 냉장고에 보관될 수 있다.
[0043] 미소구체를 제조하기 위하여, 오일 오버레이를 갖는 폴리머(예컨대, 콜라겐) 조성물을 고속으로 혼합하여 수중유형 에멀젼(oil-in water emulsion)을 형성한다. 이 폴리머 조성물은 적어도 1종의 전술한 생리활성 인자를 더 포함할 수 있다. 그런 다음, 에멀젼은 에탄올의 농도를 높이면서, 예컨대 첫번째 세척은 50% 에탄올로, 두번째 세척은 80% 에탄올로, 세번째부터 다섯번째 세척은 100% 에탄올로 반복 세척한다. 첫번째 세척은 콜라겐 용액 부피에 대하여 적어도 5배의 에탄올과 (예컨대 800-1500 rpm에서 20-40분 동안 교반함으로써) 혼합시키는 단계, 이 혼합물을 2500-3500 rpm에서 5-10분 동안 원심분리시키는 단계, 및 오일 및 알코올 층을 분리하는 단계를 포함한다. 후속 세척은 콜라겐 용액 부피에 대하여 적어도 5배의 에탄올과 혼합시키는 단계, 이 혼합물을 2500-3500 rpm에서 5-10분 동안 원심분리시키는 단계, 알코올 층을 분리하는 단계를 포함한다. 알코올 세척 후, 콜라겐은 적어도 5배 부피의 저온 염수, 예컨대 인산완충액(PBS)으로 3 내지 5번 씻는다. 최종 염수 세척액을 제거한 후, 세척에 의해 형성된 콜라겐 미소구체 조성물은 사용할 준비가 된다.
[0044] 하이드로겔에 사용된 폴리머는 미소구체를 제조하는데 사용된 폴리머와 동일하거나 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드로겔용 폴리머는 미소구체용 폴리머와 같다. 다른 구현예에서, 하이드로겔용 폴리머는 미소구체용 폴리머와 다르다. 바람직한 일 구현예에서, 미소구체 및 하이드로겔 모두에 사용된 폴리머는 콜라겐이다. 그러나, 미소구체 및 하이드로겔이 동일한 또는 다른 폴리머를 갖는지에 관계없이, 미소구체 내의 폴리머 밀도(w/v)는 하이드로겔 "벌크" 내의 폴리머 밀도(w/v)와는 다를 것이다.
[0045] 콜라겐 하이드로겔 "벌크" 지지체를 제조하기 위하여, pH 7.2-7.6, 좋기로는 pH 7.4에 이르도록 콜라겐 원액을 수산화나트륨과 혼합한다. 그 다음, 이 콜라겐 조성물은 사용할 준비가 된다.
[0046] 조직 지지체 재료를 제조하기 위하여, 미소구체를 함유하는 제1 조성물을 몰드 또는 성형 플랫폼에 첨가한다. 하이드로겔을 형성할, 폴리머 재료를 함유하는, 제2 조성물을 제1 조성물에 첨가한다. 균일한 혼합을 달성하기 위하여, 이들 조성물을 예컨대 교반 또는 피펫팅을 통해 혼합한다. 그런 다음, 이 혼합물을 폴리머 가교에 적합한 표준방법, 예컨대 가온(35-45℃, 좋기로는 37℃에서 20-40분 동안 배양) 또는 화학적 방법으로 가교시킨다. 가교 후, 이 조직 지지체 재료는 즉시 사용되거나 나중에 사용을 위하여 저장될 수 있다.
조직 지지체 및 드레싱
[0047] 또한, 여기에 제공된 방법에 의해 제조된 조직 지지체 재료를 개시한다. 조직 지지체를 만드는 미소구체 및 하이드로겔은 각각 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 셀룰로오스, 피브리노겐, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 폴리우레탄, 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산], 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 미생물 폴리에스테르, 폴리(β-히드록시알키노에이트), 및 티로신 유래 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머를 포함한다. 일 구현예에서, 여기에 개시된 조직 지지체 재료의 미소구체 및 하이드로겔은 폴리머로서 각각 콜라겐, 예컨대 인간 또는 소 콜라겐을 포함한다. 콜라겐은 중화된 콜라겐일 수 있다. 조직 지지체 재료는 대상체에 주사하기에 적합한 유동가능한 형태, 또는 시트 형태, 예컨대 깊이가 0.5-3.0 mm, 또는 1-2 mm인 시트일 수 있다.
[0048] 특정 실시예에서, 조직 지지체 재료는 0.1% 내지 0.6%, 0.2 내지 0.4%, 또는 0.3% w/v의 콜라겐을 갖는 하이드로겔 내에 박혀 있는, 0.2% 내지 2.0%, 0.4% 내지 1.2%, 0.6% 내지 1.0%, 또는 1.0% w/v의 콜라겐을 갖는 미소구체를 가질 수 있다. 미소구체의 밀도는 하이드로겔의 밀도와 다르고, 통상적으로 하이드로겔 밀도 보다 높다. 밀도 간 차이는 적어도 25% 이어야 한다. 일부 구현예에서, 콜라겐의 밀도에 대하여 미소구체의 밀도를 비교하면, 그 차이는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 또는 그 이상이다. 일 구현예에서, 조직 지지체 재료는 0.3% w/v의 콜라겐을 함유하는 하이드로겔 내에 박혀 있는, 0.6% 내지 1.0%의 콜라겐을 갖는 미소구체를 갖는다. 또다른 구현예에서, 미소구체는 조직 지지체 재료 부피의 적어도 약 50%, 60% 또는 70%를 차지한다. 추가적 일 구현예에서, 미소구체는 생리활성 인자, 예컨대 성장 인자를 함유한다.
[0049] 또한, 상기 개시된 조직 지지체 재료가 통합된 상처 드레싱 및 의약품을 개시한다. 조직 지지체 재료는 드레싱 내에 박히거나, 또는 드레싱의 한 면에 도포될 수 있다. 드레싱은 치유 또는 통증 경감을 용이하게 하기 위하여 실리콘, 거즈, 또는 기타 커버, 및/또는 항생제, 소염제 또는 통증 완화제 또는 기타 연고 중에서 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
[0050] 또한, 조직 지지체 제품은 상처 치유 또는 조직 재생에 사용하기 위하여 예컨대 멸균 패키지에 적합하게 포장될 수 있다.
치료 방법
[0051] 또한, 전술한 조직 지지체 재료를 대상체의 상처 또는 조직에 적용함으로써, 상처 치유 또는 조직 재생을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유 또는 조직 재생을 촉진하는 방법을 여기에 개시한다. 조직 지지체 재료는, 예컨대 개방된 상처에 적용하거나 또는 수술 과정 동안, 예컨대 조직 재생이 요구되는 대상체의 어떤 부위에 적용될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 조직 지지체 재료를 노출된 뼈, 하드웨어, 또는 괴사 조직을 갖는 대상체의 부위에 적용한다.
[0052] 여기에 개시된 조직 지지체는 제거되거나 그대로 남아있을 수 있다. 폴리머는 생분해성일 수 있으며, 이 경우 서서히 용해되어, 대상체의 세포로부터 형성된 세포와 혈관계의 새로운 네트워크를 남길 수 있다.
[0053] 본 명세서에 사용된 "대상체(subject)" 및 "환자"라는 용어는 포유류, 예컨대 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 취 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 인간)을 비롯한 동물을 지칭하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.
[0054] 본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 의하여 더욱 설명된다.
실시예
실시예 1: 미소구체/하이드로겔 지지체의 제조
[0055] 표준법을 사용하여 I형 콜라겐을 쥐 꼬리 샘플로부터 추출하였다. 날카로운 절리(dissection)를 통해 쥐 꼬리로부터 피부를 제거하고 폐기하였다. 그 다음, 힘줄의 추출은 꼬리의 원위 말단에서 시작하여, 척추뼈 내에서 관절을 파괴함으로써 및 힘줄이 부착된 원위 척추뼈가 나머지 근위 꼬리로부터 분리될 때까지 원위 척추 상에서 위쪽으로 잡아당김으로써 수행하였다. 그런 다음, 힘줄로부터 척추뼈를 섬세하게 절리하고 폐기하였다. 그 다음, 힘줄을 70% 에탄올에 두었다. 꼬리 내의 모든 관절이 파괴되고 힘줄이 추출될 때까지 이를 반복하였다. 추출된 힘줄을 수집하고, 칭량한 후 멸균 1 L 용기에 두었다. 그리고 나서, I형 콜라겐 15 mg/mL (1.5% w/v)의 고농도 콜라겐 용액이 되도록, 0.1% 아세트산을 힘줄에 첨가하여, 힘줄 g당 아세트산 75 ml의 최종 농도에 도달하였다. 콜라겐 원액을 4℃에 저장하고, 적어도 72시간 동안 매일 약 1분씩 교반하였다.
[0056] 72시간 후, 콜라겐 원액을 50 mL 원뿔 튜브에 분획하고, 4℃에서 8800 rpm에서 90분 동안 원심분리하였으며, 펠렛은 제거 및 폐기하였다. 그 다음, 최종 15 mg/mL (1.5 % w/v) 콜라겐 원액을 표준 동결건조기에 넣고 적어도 72시간 동안 동결건조시켰다. 동결건조 후, 콜라겐 원액을 사용할 때까지 -4℃에 저장하였다. 사용시, 동결건조된 콜라겐을 0.1% 아세트산에서 10 mg/mL (1% w/v)의 농도로 다시 현탁시켰다. 이렇게 재현탁된 콜라겐을 사용하기 전에 3일 동안 매일 약 1분씩 교반하였다. 1.5% (w/v)의 콜라겐 및 0.384% (w/v)의 콜라겐 원액을 각각 미소구체 및 0.3% 하이드로겔을 제조하는데 사용하였다.
[0057] 1% 미소구체의 제조를 위하여 콜라겔을 중화하기 위하여, 1.5%의 콜라겐 2 ml과 1X M199 배지(Gibco/Life Technologies, Inc.) 656 ㎕, 10X M199 배지 300 ㎕, 및 NaOH 44 ㎕ (또는 pH를 7.4로 조정하기 위해 필요한 만큼 NaOH를 추가)를 얼음에서 혼합하였다. 이 혼합물을 적어도 5배 부피(예컨대, 15 ml)의 미네랄 오일로 덮고 사용할 때까지 4℃에 저장하였다.
[0058] 미소구체를 제조하기 위하여, 오일 오버레이를 갖는 중화된 콜라겐을 약 5분 동안 고속 와류(vortexing)로 혼합하여 유중수형 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 생성하였다. 다음으로, 이 에멀젼을 플라스크에 붓고, 오일 제외 콜라겐 용액의 부피당 적어도 5배 부피의 50% 에탄올을 첨가하고, 1100 rpm에서 30분 동안 스터 바(stir bar)로 교반하였다. 그 다음, 교반한 혼합물을 50 ml 튜브에 붓고, 4℃에서 3200 rpm으로 7분 동안 원심분리하여, 오일 층 및 에탄올 층, 및 오일과 알코올 층 사이에 얇은 콜라겐 층을 형성하였다. 오일 및 알코올 층을 제거하고, 콜라겐 층을 5배 부피의 80% 에탄올로 세척하였으며, 와류시키고 상기와 같이 원심분리한 다음, 알코올 층을 제거하고, 5배 부피의 100% 에탄올로 씻었으며, 와류 및 원심분리하고, 알코올 층을 제거하였다. 그런 다음, 콜라겐을 5배 부피의 차가운 PBS으로 3번 세척하고, 와류 및 원심분리하였으며, PBS를 제거하였다. 이러한 공정 중에, 콜라겐 미소구체가 형성되었다.
[0059] 하이드로겔을 위한 콜라겐 "벌크"를 제조하기 위하여, 0.384% 콜라겐 391 ㎕를 1X M199 배지 50.8 ㎕, 10X M199 배지 50 ㎕, 및 NaOH 8.6 ㎕ (또는 pH를 7.4로 조정하기 위해 필요한 만큼 NaOH를 추가)를 얼음에서 혼합하였다. 지지체를 제조하기 위하여 이 혼합물을 다음과 같이 사용하였다.
[0060] 대략 96 mm3의 지지체를 생성하기 위하여 직경이 7 mm이고 깊이가 2.5 mm인 몰드를 사용하였다. 미소구체 지지체를 제조하기 위하여, 상기 방법으로 제조된 미소구체를 각 웰에 피펫하여 각 웰을 약 반쯤 채웠다. 콜라겐 벌크 한 액적을 각 웰에 첨가하고, 교반함으로써 미소구체와 혼합하여, 미소구체가 박힌 하이드로겔을 형성하였다. 그 다음, 이 지지체를 37℃에서 30분 동안 경화시켰다. 추가 건조를 방지하기 위하여, 경화된 지지체 위에 인산완충액(PBS)을 덮었다. "벌크" 지지체를 제조하기 위하여, 미소구체 없이 콜라겐 벌크를 미소구체를 갖는 지지체와 대략 동일한 수준으로 몰드에 추가하였다. 지지체를 전술한 바와 같이 경화시키고 PBS로 덮었다.
[0061] 조밀 구(close-packed spheres)에 대한 케플러의 추측에 따라, 지지체의 대략 74% 부피는 높은 밀도 미소구체를 구성하며, 나머지 부피는 벌크 콜라겐 하이드로겔이 차지한다.
실시예 2: 미소구체 함유 지지체는 세포 침투를 촉진한다.
[0062] 지지체를 이식 하루 전에 제조하였다. 지지체를 8주된 야생형 C57bl/6 마우스의 등에 피하 이식하였다. 3마리 마우스를 다음과 같은 총 4개의 지지체로 이식하였다: 0.3% 벌크 지지체 중의 1% 미소구체 2개; 대조군으로 1% 벌크 지지체 1개; 대조군으로서 0.3% 벌크 지지체. 7일 또는 14일 후 모든 마우스를 희생시키고 조직학적 분석을 위하여 수집하였다. 지지체로의 세포 침투를 판별하기 위하여 최적의 절삭 온도 화합물(OTC) 배지에 고정된 조직 샘플에 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 수행하였다.
[0063] 이식 7일 후, 미소구체 지지체(MSS)는 지지체의 전체 깊이에 걸쳐 실질적이고 균일한 세포 침투를 보여준다(도 1c). 이와 비교하여, 세포는 산발적이고 단지 부분적으로 0.3% 대조군 지지체에 침투하였고(도 1b), 1% 대조군 지지체에는 침투하지 못하였으며, 대신 지지체의 주변을 따라 증식하였다(도 1a).
[0064] 이식 14일 후, MSS는 지지체 깊이에 걸쳐 강력한 세포 침투를 나타냈다(도 2c). 이와 비교하여, 세포는 산발적으로 0.3% (w/v) 콜라겐 지지체에 침투하였고(도 2b), 1% (w/v) 콜라겐 지지체에는 모두 침투하지 못하고, 대신 주변에 국한되었다(도 2a).
실시예 3: 하이드로겔 밀도와 다른 미소구체의 밀도는 세포 침투를 촉진한다.
[0065] 미소구체(MS) 및 하이드로겔(H)에서 서로 다른 콜라겐 밀도(w/v)를 갖는 미소구체 지지체를 다음과 같이 제조하였다: (A) 0.3% H 중의 1% 콜라겐 MS; (B) 0.6% MS/ 0.3% H; (C) 0.4% MS/ 0.2% H; (D) 0.4% MS/ 0.6% H. 표 1(미소구체 지지체의 밀도) 참조.
| 미소구체 콜라겐 밀도 (w/v) | 벌크 콜라겐 밀도 (w/v) |
| 1% | 0.3% |
| 0.6% | 0.3% |
| 0.4% | 0.2% |
| 0.4% | 0.6% |
[0066] MSS를 성체 마우스의 등에 피하 이식하고, 면역조직화학(immunohistochemistry)을 위하여 이식 후 7일 및 14일에 수집하였다. 면역조직화학 분석은 모든 MSS에서의 세포 침투를 확인하였으며(도 3a-3d), 1% MS/ 0.3% H, 및 0.6% MS 0.3% H에서 가장 큰 침투를 나타내었다(도 3c-3d). 또한, 이식 7일 및 14일 후 모든 MSS에서 CD31 발현이 나타났는데(도 4a-4b), 이는 내피 전구체로의 침투 및 신생혈관계의 형성을 나타낸다.
실시예 4: MSS는 이식 후 28일에 걸쳐 세포 침투를 촉진하다.
[0067] 18마리의 마우스에게 다음과 같이 마우스당 4개의 피하 이식(A-D)을 하였다: (A) MSS (0.3% 콜라겐 벌크 중의 1% 콜라겐 미소구체), (B) 1% 벌크 콜라겐 하이드로겔 대조군, (C) 0.3% 콜라겐 하이드로겔 대조군, 및 (D) INTEGRA 피부 재생 템플릿(Integra LifeSciences, Plainsboro, NJ)의 7 mm 직경의 구획. 마우스는 이식후 7, 14, 28일에 희생시켰다 (시점당 마우스 6마리씩).
[0068] 이식 후 7일에(도 5a-5d), MSS, 1% 콜라겐 대조군, 및 INTEGRA 지지체를 이식전과 유사한 크기 및 형태를 유지한 반면, 0.3% 콜라겐 대조군은 명확하게 크기가 감소하였다(도 5d). 이식 후 1주에 MSS의 H&E 염색은 지지체의 중심까지 전체에 세포 침투가 일어났음을 보여준다(도 6a). 대조적으로, 1% 콜라겐 지지체에서는 재료가 갈라진 균열 부분을 제외하고는 어떠한 침투도 없었다(도 6b). 수축된 0.3% 콜라겐 지지체에는 최소한의 침투가 있었다(도 6c). CD31 항체(내피 전구 세포를 식별하기 위함) 및 DAPI(침투 세포를 식별하기 위함)를 갖는 MSS 템플릿의 형광 염색은 내피 전구 세포를 비롯한 다수의 세포 유형이 7일에 이미 MSS 지지체를 침투하고 있음을 보여준다(도 7). CD31+ 세포는 1% 및 0.3% 하이드로겔 대조군 내에서는 관찰되지 않았다 (데이터 미기재).
[0069] 14일 후(도 8a-8e), MSS, 1% 콜라겐 대조군, 및 INTEGRA 지지체는 여전히 이식전 크기에 유사한 반면, 0.3% 콜라겐 대조군은 크기가 대폭 감소하였다(도 8e). MSS 지지체는 상당한 세포 침투를 나타내고(도 9a) 1% 콜라겐은 균열 부분을 제외하고는 최소한의 침투를 나타내며(도 9b), 0.3% 콜라겐 지지체는 침투가 희박하게 나타났다(도 9c). INTEGRA 지지체는 MSS 지지체에서 보다 덜 강력한 침투를 나타내었고(도 9d); INTEGRA 지지체의 조밀한 구조는 H&E 염색을 위한 절편시 지지체의 전단(shearing)을 초래하였다.
[0070] 단위 지지체 면적당 세포 수의 비교(도 10)는 7일 및 14일에 1% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 5 세포) 및 0.3% 하이드로겔(단위 면적당 약 3 및 7 세포)에 비해 훨씬 많은 세포가 MSS 지지체(단위 면적당 각각 약 7 세포 및 10 세포)를 침투하였음을 보여준다.
[0071] 이식후 28일에(도 11a-11d), MSS, 1% 콜라겐 대조군, 및 INTEGRA 지지체는 이식전 보다 크기가 약간 작아진 반면, 0.3% 콜라겐 대조군은 7일 또는 14일 보다 더 작다(도 11d). 28일의 MSS 지지체는 우수한 세포 침투를 나타내고(도 12a), 1% 콜라겐은 본질적으로 침입이 없음을 나타내며(도 12b), 0.3% 콜라겐 지지체는 작은 크기에도 불구하고 침입을 나타낸다(도 12c). INTEGRA 지지체 또한 일부 침입을 나타내었다(도 12d).
실시예 5: 미소구체의 주사전자현미경
[0072] 실시예 1에서와 같이 미소구체를 제조하고 주사전자현미경(SEM) 분석을 준비하였다. 도 13에 도시한 바와 같이, 미소구체는 크기(50-300 ㎛ 범위) 및 형태(일부는 매우 구형인 반면, 다른 것들은 형태가 불규칙함)가 다양할 수 있다.
Claims (30)
- 제1 폴리머를 포함하는 하이드로겔 및 제2 폴리머를 포함하는 미소구체(microspheres)를 포함하는 조직 지지체 재료(tissue scaffold material)로서,
미소구체는 하이드로겔에 박혀 있으며, 하이드로겔 보다 밀도가 높은 것인 조직 지지체 재료. - 제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리머는 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 히알루로네이트, 셀룰로오스, 피브리노겐, 폴리(락트산-글리콜산) 코폴리머(PLGA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(카프로락톤), 폴리(부티렌 숙시네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(p-디옥사논), 및 폴리(부티렌 테레프탈레이트); 폴리에스테르 아미드, 폴리우레탄, 폴리[(카르복시페녹시) 프로판-세바스산], 폴리[비스(히드록시에틸) 테레프탈레이트-에틸 오르토포스포릴레이트/테레프탈로일 클로라이드], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 미생물 폴리에스테르, 폴리(β-히드록시알키노에이트), 및 티로신 유래 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 제2 폴리머는 콜라겐인 것인 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 제1 폴리머는 콜라겐인 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 제2 폴리머를 0.2% 내지 2.0% w/v 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제5항에 있어서, 미소구체는 제2 폴리머를 0.4% 내지 1.2% w/v 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제6항에 있어서, 미소구체는 제2 폴리머를 0.6% 내지 1.0% w/v 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 직경이 50-250 ㎛인 것인 조직 지지체 재료.
- 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하이드로겔은 콜라겐을 0.1% 내지 0.6% w/v의 양으로 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 조직 지지체 재료 부피의 적어도 약 70%를 구성하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 콜라겐을 0.4 내지 1.2% w/v 포함하고, 하이드로겔은 콜라겐을 0.2 내지 0.6% w/v 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제11항에 있어서, 미소구체는 콜라겐을 0.6 내지 1.0% w/v 포함하고, 하이드로겔은 콜라겐을 0.3% w/v 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 생리활성 인자를 더 포함하는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 추가적 생리활성 인자를 포함하지 않는 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조직 지지체 재료는 시트 형태 또는 유동가능한 형태인 것인 조직 지지체 재료.
- 제15항에 있어서, 상기 재료는 깊이가 0.5-3.0 mm인 시트 형태인 것인 조직 지지체 재료.
- 제16항에 있어서, 상기 재료는 깊이가 1.0-2.0 mm인 시트 형태인 것인 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 조직 지지체 재료를 대상체의 상처 치유 또는 조직 재생의 방법에 사용하는 용도.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 조직 지지체 재료를 대상체의 상처 또는 조직에 적용하는 단계를 포함하는, 상처 치유 또는 조직 재생을 이를 필요로 하는 대상체에서 촉진하는 방법.
- 제19항에 있어서, 조직 지지체 재료를 노출된 뼈, 하드웨어, 또는 괴사 조직을 갖는 대상체의 부위에 적용하는 것인 방법.
- a. 미소구체를 포함하는 제1 조성물 및 폴리머 재료를 포함하는 제2 조성물을 제공하되, 제1 조성물의 밀도는 제2 조성물의 밀도와 다른 것인 제1 조성물과 제2 조성물을 제공하는 단계;
b. 제1 조성물 및 제2 조성물을 혼합하는 단계; 및
c. 미소구체가 박힌 하이드로겔을 형성하기 위하여 상기 혼합물에서 폴리머 재료의 가교를 유도하는 단계
를 포함하는 조직 지지체 재료의 제조 방법. - 제21항에 있어서, 제1 및 제2 조성물은 각각 폴리머로서 콜라겐을 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 콜라겐은 인간 또는 소 콜라겐인 것인 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 콜라겐은 중화된 것인 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 콜라겐을 0.4% 내지 1.2% w/v 포함하는 것인 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 조성물은 콜라겐을 0.1% 내지 0.6% w/v 포함하는 것인 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구체는 콜라겐을 0.6 내지 1.0% w/v 포함하고, 제2 조성물은 콜라겐을 0.3% w/v 포함하는 것인 방법.
- 제21항 내지 제27항에 있어서, 가교는 가온방법(thermal method)에 의해 이루어지는 것인 방법.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 제조된 조직 지지체 재료.
- 제1항 내지 제17항 또는 제29항 중 어느 하나의 항에 기재된 조직 지지체 재료를 포함하는 드레싱.
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