KR20110138765A - 인간지방 조직으로부터 분리한 세포와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합필러 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 충전용 복합 필러에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러에 대한 것이다.

Description

인간지방　조직으로부터　분리한　세포와　히알루론산　유도체를　포함하는　복합필러{COMPOSITE FILLER COMPRISING CELLS ISOLATED FROM HUMAN ADIPOSE TISSUE AND HYALURONIC ACID DERIVATIVE}

본 발명은 피부 충전용 복합 필러에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러에 대한 것이다.

인체의 연부조직(soft tissue)은 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질과 글리코스아미노글리칸을 포함하는 세포외기질에 의해 그 구조를 유지하고 있다. 그런데 선천성 요인, 외부의 충격 또는 병적요인 등에 의한 연부조직의 결손이 발생하는 경우 해당 부위에 생체 조직이나 합성 고분자 화학물질을 삽입하여 연부조직을 확장함으로써 그 형태를 복원, 교정하여 왔다.

한편, 피부조직과 유사한 성분으로 특정부위에 삽입되어 연부조직을 확장시킴으로써 주름개선이나 윤곽교정 등에 사용되는 물질을 일반적으로 피부 충전제(dermal filler) 또는 필러(filler)라고 하는데, 이러한 필러는 작용기전에 따라 다음과 같이 두 가지 형태로 분류될 수 있다.

첫째, 직접 부피를 키워서 확대효과를 내는 필러인데, 이러한 피부 충전제의 주요성분은 콜라겐(collagen)이나 히알루론산(hyaluronic acid) 등과 같은 물질로 이루어져 있다.

둘째, 가교된 덱스트란과 같이 직접 부피를 키우는 작용을 일부 함과 동시에 일정기간 이상 동안 이물반응을 일으켜 장기간 또는 영구적으로 자가 콜라겐 형성을 유도하여 확대효과를 내는 필러도 있다.

한편, 두 가지 형태의 작용기전을 모두 갖고 있는 물질로는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, polymethylmethacrylate)가 알려져 있다.

현재 사용되고 있는 필러로서, 콜라겐이나 히알루론산 각각을 주성분으로 하는 제품들이 많다. 먼저 콜라겐을 주성분으로 하는 피부 충전제로는, 돼지 콜라겐(porcine collagen)을 주성분으로 하는 EVOLENCE 30(ColBar LifeScience사), 소 콜라겐(bovine collagen)을 주성분으로 하는 Zyderm이나 Zyplast(Inamed사), 인간 콜라겐을 주성분으로 하는 CosmoDerm이나 CosmoPlast(Inamed사) 등이 알려져 있다.

히알루론산을 주성분으로 하는 것으로는 Rofilan(Rofil/Philoderm사), Perlane, Restylane(이상 Medicis/Q-Med AB사), Teosyal(Teoxane SA사), Surgiderm(Corneal Laboratoire사) 등이 있다.

하지만, 콜라겐이나 히알루론산을 주성분으로 하는 피부 충전제들은 값이 고가인데 비해 효과의 지속기간이 너무 짧다는 것이 임상에서 실제 사용을 제한하는 요인이 되고 있다.

그 밖에, 히알루론산과 가교된 덱스트란(DEAE sephadex)을 주성분으로 한 MATRIDEX(BioPolymer GmbH & Co.KG사)가 있다. 주성분이 히알루론산과 가교된 덱스트란 입자로 이루어진 피부 충전제의 경우는 주입 즉시 부피확대효과가 나타나며, 히알루론산이 6 내지 12개월에 걸쳐 분해·흡수되고 그 공간을 가교된 덱스트란의 자극으로 인해 새롭게 형성된 자가 콜라겐이 채우게 된다.

그러나, 히알루론산도 결국은 1년 이내에 분해되어 없어지고 1년 내지 2년 이내에 가교된 덱스트란까지 모두 분해되어 없어지므로 피부 충전제에 의해 부피확대효과를 유지하는 기간이 짧다는 문제점이 있다.

가교된 덱스트란을 주성분으로 하는 제품으로는 인체 안에서 분해 및 흡수되지 않으면서 장기적으로 자가 콜라겐 생산을 유도해 내는 폴리메틸메타크릴레이트를 주성분으로 하는 제품이 있다. 예를 들면, 폴리메틸메타크릴레이트와 콜라겐을 주성분으로 한 Artefill(Artes Medical사)이 그것이다.

그러나 사용되는 콜라겐이 소의 추출물로 동물에서 유래한 것이기 때문에 사용 전에 반드시 피부 반응 검사(allergic skin test) 등의 전처치가 필요한데, 이점이 임상 적용에 있어서 큰 장애가 된다. 또한 콜라겐 성분은 상당히 고가인 관계로 시술시 환자의 경제적 부담이 크고, 주입시 인체 내에서 지나치게 빨리 분해, 흡수되어(3 내지 6주 만에 전부 흡수됨) 새로운 콜라겐 형성에 의한 부피유지를 장담하기 어려운 단점이 있다.

한승규 등은 Restylane^®에 진피섬유아세포를 혼합한 필러를 개시하고 있다(윤을식, 고한웅, 한승규, 김우경, "연부 조직 증대를 위한 Restylane^®과 진피섬유아세포의 혼합", 대한성형외과학회지, 제30권, 제1호, pp39-44).

그러나 한승규 등에 따르면, 상기 진피섬유아세포를 얻기 위하여, 환자로부터 진피를 채취한 후 이를 두 단계에 걸쳐 배양을 하고, 이로부터 세포를 유리하여 세척 및 여과 과정을 거쳐 계대배양을 해야만 한다는 문제점이 있다. 즉, 한승규 등에 따른 필러를 제조하기 위해서는 복잡하고 많은 시간과 비용이 소요되는 과정을 거쳐야 한다.

본 발명자들은 전술한 종래 기술의 단점을 극복하고자 인간지방유래 스트로마 혈관 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러를 개발하였다.

본 발명의 복합 필러는 지방유래 줄기세포 만을 별도로 분리하지 아니한 채로 제조되기 때문에, 예를 들어 전술한 한승규 등의 필러와 비교하여, 줄기세포를 분리해 내기 위한 복잡하고 비용이 소모되는 과정 없이 간단하고 저렴하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 필러는 그 효과의 지속시간 면에서도 종래 기술의 단점을 극복하였다.

또한, 상기 스트로마 혈관 세포(SVF cell)를 배양하지 아니한 채로 사용하기 때문에, 상기 배양 과정에서 수반될 수 있는 세포의 변형의 우려가 전혀 없다.

본 발명의 목적은 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포는 T 조절 세포(T regulatory cell), 내피전구세포(endothelial precursor cell), 지방전구세포(preadipocyte), 항염증 M2 대식세포(antiinflammatory M2 macrophage), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 등을 포함한다.

본 발명의 복합 필러는 상기 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포는 10⁶개/ml 내지 10⁸개/ml로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 복합 필러에 포함되는 상기 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포가 배양되지 아니한 것일 수 있다. 이로써, 세포 배양에 따른 시간과 비용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 복합 필러에 포함되는 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 본 발명에서 히알루론산 유도체는 산의 형태와 그의 양이온염을 포함한다. 즉, 본 발명에서 히알루론산의 양이온염은 예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등의 무기 염기의 염과 테트라부틸암모늄염 등의 유기염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 히알루론산은, 히알루론산을 가교하여 제조된 물질들을 포함하고, 히알루론산 및 카르복시메칠셀룰로즈 복합체 유도체, 히알루론산의 에스테르화된 유도체 또는 히알루론산의 자기-가교된 유도체(WO 1997/07833) 및 히알루론산 에폭사이드 유도체(히알루론산을 2개 이상의 에폭사이드기를 갖는 에폭사이드 가교제를 사용하여 가교화시킨 것) 등, 종래의 히알루론산 유도체를 모두 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 히알루론산 유도체는 1,4-부탄디올디글라이시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하여 가교된 히알루론산 유도체일 수 있다.

본 발명의 복합 필러는 종래의 필러와 비교하여 장시간 동안 피부 조직 내에서 분해되지 아니하고 유지된다. 또한, 인간지방조직 유래 SVF 세포에 의하여 상기 복합 필러가 충진된 부위에서 인간유래 콜라겐 조직이 생성된다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 사용된 SVF 세포와 히알루론산 유도체가 혼합된 복합 필러 및 히알루론산 만으로 이루어진 필러를 보여 준다.
도 2는 실시예 2에서 본 발명의 복합 필러와 히알루론산 만으로 이루어진 필러로 충진된 무흉선 무모 백서 및 3개월 후의 충진 부위를 보여 주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 실험군과 대조군의 충진 부위에 대한 사진 및 이들의 면역조직학적 검사 결과를 보여 주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 실험군과 대조군의 충진 부위에서 형성된 콜라겐 조직을 비교한 사진이다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 지방유래 SVF 세포( adipose tissue - derived stromal vascular fraction cell )의 분리

환자의 하복부에서 통상적인 방법인 지방세포흡입법으로 지방조직세포를 얻은 후, 상기 지방조직을 생리식염수로 세척하였다. 세척된 지방조직을 교원질 분해효소인 콜라게나제(collagenase)와 PBS (phosphate buffered saline)가 혼합된 용액으로(3.5 mg/10 ml) 30분간　CO₂　항온기에서 반응시킨 후 지방 유래 SVF 세포를 분리하였다. 지방조직 세포가 포함된 용액을 100 μm 필터를 통해 여과하여 부유물을 제거하고 원심분리하였다. 분리된 세포 중 적혈구만을 용혈시켜 제거한 후, 최종적으로 1 ml 지방조직당 1.0×10⁵개 내지 1.6×10⁵개의 세포를 획득하였다.

실시예 2. 인간 지방 유래 SVF 세포와 히알루론산 유도체 복합필러의 제조 및 이식시험

복합필러의 이식시험을 위해 무흉선 무모 백서(anthymic nude mouse; SLC Inc. Japan)의 등 부위의 좌우 2곳에서 주사부를 선택하여, 우측에는 대조군으로서 100 μl의 히알루론산 유도체 (HyaFillia)만(도 1 우측 사진)을, 좌측에는 실험군으로서 100 μl의 히알루론산 유도체(HyaFillia)와 지방 유래 SVF 세포 1.0×10⁵개를 혼합(도 1 좌측 사진)하여 주사하였다(도 2 참조).

삽입물 주사 3개월 후에 5 mm 펀치를 사용하여 상기 주사부위에 형성된 결절을 피부를 포함하여 표재근 상층까지, 결절 부위가 모두 포함되도록 충분히 절제하였다(도 3 참조).　대조군과 실험군에 형성된 조직에서 인간 콜라겐의 형성 유무를 확인하기 위하여 조직을 포르말린으로 고정 후 면역조직학적 검사를 수행하였다(도 3 및 도 4 참조).

시험물질의 적용 3개월 후 육안으로 관찰하였을 때, 대조군에 비하여 실험군의 경우에서 주입된 필러가 보다 많이 남아있는 것으로 관찰되었다(도 2 참조). 또한, 무흉선 무모 백서의 필러 적용부위 피부를 적출하여 육안검사와 조직학적 검사를 수행하였다. 육안검사 결과, 남아 있는 필러는 대조군에서 보다 실험군에서 많이 남아있는 것으로 관찰되었다(도 3 참조).

실험군에 대한 조직학적 검사결과 히알루론산 유도체가 콜라겐과 세포들 사이에서 신생조직과 함께 존재하는 것으로 관찰되었으며, 이러한 신생조직은 히알루론산 유도체와 함께 넣어준 SVF 세포 중의 섬유아세포와 상기 섬유아세포가 분비한 물질인 것으로 확인되었다(도 3 참조). 즉, 히알루론산 유도체와 세포를 복합하여 사용하였을 때, 히알루론산 유도체 단독 사용의 경우에서 보다 우수한 효력을 나타내었다.

또한, 이때 생성되는 신생조직은 함께 주입한 세포가 분비한 인간유래 콜라겐과, 남아있는 히알루론산이 함께 복합되어있는 것을 관찰할 수 있었다(도 4 참조). 이로써 히알루론산 유도체만 존재하는 경우와는 달리 SVF 세포와 히알루론산 유도체를 복합적으로 사용하는 경우에 매우 장시간 동안 필러로서의 효과를 기대할 수 있다.

상기의 결과를 종합하여 볼 때, 히알루론산 유도체 단독으로 사용한 경우보다 SVF 세포와 복합하여 사용하는 경우에서 필러로서의 효과가 보다 우수하다고 볼 수 있다.

Claims (4)

1. 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포(human adipose tissue-derived stromal vascular cell)와 히알루론산 유도체를 포함하는 복합 필러.
2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체가 1,4-부탄디올디글라이시딜 에테르를 사용하여 가교된 히알루론산 유도체인 것인 복합 필러.
3. 제1항에 있어서, 상기 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포가 10⁶개/ml 내지 10⁸개/ml로 포함되는 것인 복합 필러.
4. 제1항에 있어서, 상기 인간지방조직 유래 스트로마 혈관 분획 세포가 배양되지 아니한 것인 복합 필러.

Images