CN108785746B - 一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法 - Google Patents

一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法，包括脱脂处理的步骤，且在脱脂处理前设有一次脱细胞处理的步骤，在脱脂处理步骤后设有二次脱细胞处理的步骤和复性处理的步骤。本发明所述的脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法，不仅能快速有效地去除组织中所有的细胞等相关抗原成分，同时能保持其细胞外基质ECM的良好化学组成和机械特性。

Description

一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法
技术领域
本发明属于医用组织修复材料的制备技术领域，尤其是涉及一种以猪小肠为材料的脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法。
背景技术
天然生物组织修复材料，是根据再生医学原理、分子生物学原理及免疫学原理，通过除抗原等一系列技术从天然生物组织中提取出的细胞外基质，是一种超微组织支架--"细胞支架"，把它植入人体后，能起到很好的支架作用，诱导组织细胞向该支架迁移，启动人体自身修复功能，使细胞在该位置上逐渐生长出新的组织，填补受损部位的缺失组织，完成器官组织再生。
猪小肠粘膜下层(porcine small intestinal submucosa，p-SIS)组织修复材料是由猪小肠粘膜下层获得的异种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)材料，是由健康、无病原微生物、在清洁级条件下饲养的家猪小肠制备的新型体内植入生物膜，是具有保护创面、促进组织愈合、再生、修补缺损、细胞载体功能的优良组织修复材料。P-SIS可广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复、部分或全层皮肤损伤。P-SIS生物材料应用前关键的一点就是必须有效去除残留的细胞、细胞膜、DNA等相关抗原性分子，以避免植入人体后产生免疫排斥及严重的炎性反应。
目前常用的脱细胞方法都比较繁琐复杂，主要包括：物理方法、化学方法和消化酶学方法，而且所得产品要不脱细胞不完全，残留抗原性，要不处理过头，降低了最终ECM的机械性能。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法，以克服现有技术的缺陷，不仅能快速有效地去除组织中所有的细胞等相关抗原成分，同时能保持其细胞外基质ECM的良好化学组成和机械特性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，包括一次脱细胞处理的步骤和二次脱细胞处理的步骤，且在两次脱细胞处理的步骤之间设有一脱脂处理步骤。
优选的，所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，包括以下步骤：
S1：预处理：取新鲜猪小肠，清除杂物、刮除表层油脂，柔化肠膜、漂白并杀菌；
S2：一次脱细胞处理：将预处理好的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，转入细胞裂解液中，超声处理或摇荡浸泡后再次漂洗；
S3：脱脂处理：将一次脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，转入脱脂液中，室温摇荡浸泡1-6小时或于4℃过夜；
S4：二次脱细胞处理：将脱脂处理好的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，再次转入新的细胞裂解液中，超声处理或摇荡浸泡后漂洗；
S5：将步骤S4处理后的猪小肠粘膜下层进行冻干、包装、辐照消毒处理。
优选的，步骤S1中预处理的方法为：将取新鲜猪小肠剪开、反复清洗干净，再剪成适当长度，用钝刮刀刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，用去纯净水清洗干净，然后将其置于新配的预处理液中，浸泡30-60分钟后备用；步骤S2和步骤S4中，超声处理的时间均为1-30分钟，摇荡浸泡的时间均为30-120分钟，漂洗用30-45℃去离子水漂洗，漂洗次数为2-5，每次时间为3-60分钟。
优选的，步骤S1中，预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠10-300g/L、过氧化氢5-500g/L、胶体银10-500mg/L；预处理液的pH为1.3-2.5；胶体银为10-100nm胶态微粒银离子；优选的，预处理液的pH为2；预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠100g/L，过氧化氢60g/L，胶体银40mg/L。
优选的，步骤S3中，脱脂液是含有大蒜素和三氯生的三氯甲烷-甲醇混合液，其中大蒜素0.1-5％(wt/v),三氯生0.05-1％(wt/v)，溶剂为三氯甲烷-甲醇；三氯甲烷-甲醇为三氯甲烷和甲醇以体积比为1:2混合成的混合液；优选的，脱脂液中大蒜素和三氯生的含量分别为1％(wt/v)和0.2％(wt/v)。
优选的，一次脱细胞处理和二次脱细胞处理采用相同的细胞裂解液，该细胞裂解液pH为10-12，其主要组分及含量为，以每升计：硼砂1-10g，碳酸钠5-20g，氯化钠l 0.3-5M，EDTA 5-50mM，乙基苯基聚乙二醇1-30g；优选的，细胞裂解液各组分的含量为，以每升计：硼砂1g，碳酸钠10.3g，氯化钠1M，EDTA 20mM，乙基苯基聚乙二醇10g。
优选的，步骤S4和S5之间，还包括复性处理步骤；所述复性处理是将脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层经漂洗、沥干后转入复性溶液中浸泡2-24小时。
优选的，所述复性溶液包括以下各组分：5-50mM Tris-HCl，1-10mM EDTA，1-20％(wt/v)β-环糊精；优选的，β-环糊精的浓度为5-10％(wt/v)；优选的，所述复性溶液还包括浓度为0.5-5mg/L的抗生素，优选的，抗生素为青霉素和硫酸链霉素中的一种或两种；复性溶液体系的pH为7-10。
优选的，复性溶液还包括甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上；甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的使用浓度均为0.2-10mg/L；优选的，甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的使用浓度均为1-5mg/L；优选的，复性溶液还包括维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌中的一种或两种以上；维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌的使用浓度均为0.1-50mg/L；优选的，维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌的使用浓度均为0.1-3mg/L。
优选的，复性溶液还包括细胞生长因子，且使用浓度均为0.1-100ug/L；优选的，细胞生长因子为人血小板源生长因子、人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、人转化生长因子β、人纤连蛋白中一种或两种以上的组合，且单个因子使用浓度均为0.1-100ug/L。
相对于现有技术，本发明所述的一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法具有以下优势：
(1)采用两次脱细胞处理，充分保障细胞及其相关抗原脱的干净，尤其在使用有机溶剂脱脂前先行一次脱细胞处理，这样避免了有机溶剂使一些细胞蛋白被固定在ECM上难以去除的风险。
(2)脱细胞整个过程中，不使用类似SDS这样的强去污剂，避免了基质ECM结构受到伤害；也不使用蛋白酶、DNA水解酶，避免了这些酶的残留污染而成为微量抗原性成分。
(3)引入了复性处理步骤，使基质ECM在温和的溶液中恢复其天然良好的结构和机械性能，并同时赋予其更多有利于肌体细胞贴壁生长的营养因子。
(4)本发明的快速猪小肠粘膜下层(p-SIS)脱细胞方法不仅能有快速有效地去除组织中所有的细胞，同时能保持其细胞外基质ECM的良好化学组成和机械特性，保障其在临床应用上与肌体的相容性、无毒性和促进肌体细胞快速贴壁、生长的功效。
附图说明
图1为本发明实施例1中只经预处理步骤后HE染色观察p-SIS脱细胞效果；
图2为本发明实施例1中经预处理和一次脱细胞处理后HE染色观察p-SIS脱细胞效果；
图3为本发明实施例1中经预处理、一次脱细胞处理和二次脱细胞后HE染色观察p-SIS脱细胞效果。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法，包括以下步骤：
S1：材料预处理：将取新鲜猪空肠剪开、反复清洗干净，再根据需要剪成适当长度，一般为10-20cm长；用钝刮刀刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，用去离子水清洗干净，然后将其置于新配的预处理液中，浸泡30-60分钟后备用。
S2：一次脱细胞处理：将预处理好的猪小肠粘膜下层用去离子水漂洗、沥干，转入细胞裂解液中，超声处理10-30分钟或摇荡浸泡30-120分钟，然后再用30-45℃去离子水漂洗10-60分钟；
S3：脱脂处理：将一次脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层用去离子水漂洗、沥干，转入脱脂液中，室温摇荡浸泡1-6小时或于4℃过夜；
S4：二次脱细胞处理：将脱脂处理好的猪小肠粘膜下层用去离子水漂洗、沥干，再次转入新的细胞裂解液中，超声处理10-30分钟，或摇荡浸泡30-120分钟，然后再用30-45℃去离子水漂洗10-60分钟；
S5：复性处理：将二次脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层用去离子水漂洗、沥干，再次转入复性溶液中室温浸泡2-24小时；
S6：冻干、包装、辐照消毒处理：将复性处理后的猪小肠粘膜下层沥干(不用洗涤)在-20℃预冻后进行冷冻干燥，然后按片分装于塑料薄膜袋中并抽真空密封，最后将其在25KGY下进行辐照消毒。
步骤S1中，预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠10-300g/L、过氧化氢5-500g/L、胶体银10-500mg/L；预处理液的pH为1.3-2.5；胶体银为10-100nm胶态微粒银离子；优选的，预处理液的pH为2；预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠100g/L，过氧化氢60g/L，胶体银40mg/L。预处理液的作用是柔化肠膜，并对其进行漂白、杀菌。
预处理液的制备方法为：称取配方量的硅酸钠、过氧化氢，加入一定量的去离子水中混匀，再量取配方量的胶体银，然后边搅拌硅酸钠、过氧化氢和去离子水的混合溶液，边慢慢添加胶体银，添加完毕后用1N HCl调pH目标值，最后补加去离子水定容，即得本发明脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用预处理液。
步骤S2和S4中，一次脱细胞处理和二次脱细胞处理采用相同的细胞裂解液，该细胞裂解液pH为10-12，其主要组分及含量为，以每升计：硼砂1-10g，碳酸钠5-20g，氯化钠l0.3-5M，EDTA 5-50mM，乙基苯基聚乙二醇1-30g；优选的，细胞裂解液各组分的含量为，以每升计：硼砂1g，碳酸钠10.3g，氯化钠1M，EDTA 20mM，乙基苯基聚乙二醇10g。
细胞裂解液的制备方法为：称取配方量的硼砂、碳酸钠，加入一定量的去离子水中混匀；再按配方量加预先配好的5M的NaCl母液和0.5M的EDTA母液，然后边搅拌边慢慢滴加液体NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，添加完毕后用1N NaOH调pH至目标值，最后补加去离子水定容，即得本发明脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用细胞裂解液。各母液均按公知方法制备。
步骤S3中，脱脂液是含有大蒜素和三氯生的三氯甲烷-甲醇混合液，其中大蒜素0.1-5％(wt/v),三氯生0.05-1％(wt/v)，溶剂为三氯甲烷-甲醇；三氯甲烷-甲醇为三氯甲烷和甲醇以体积比为1:2混合成的混合液；优选的，脱脂液中大蒜素和三氯生的含量分别为1％(wt/v)和0.2％(wt/v)。采用该脱脂液，不仅可以脱脂，同时还兼具除腥味及进一步杀菌的功效。
脱脂液的制备方法为：按体积比1:2取一定量的三氯甲烷和甲醇，并将两者混匀得三氯甲烷-甲醇混合液，再称取配方量的大蒜素和三氯生，将它们溶解于三氯甲烷-甲醇混合液中，即得本发明脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用脱脂液。
步骤S5中，所述复性溶液，以每升计，包括以下各组分：5-50mM Tris-HCl，1-10mMEDTA，1-20％(wt/v)β-环糊精；优选的，β-环糊精的用量为5-10％(wt/v)；优选的，所述复性溶液，以每升计，还包括抗生素0.5-5mg；优选的，抗生素为青霉素和硫酸链霉素中的一种或两种；复性溶液体系的pH为7-10。
某些情况下，复性溶液还包括甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上；甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的使用浓度均为0.2-10mg/L；优选的，甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的使用浓度均为1-5mg/L。
另一些情况下，复性溶液还包括维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌中的一种或两种以上；维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌的使用浓度均为0.1-50mg/L；优选的，维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌的使用浓度均为0.1-3mg/L。
还有一些情况下，复性溶液还进一步包括细胞生长因子，且使用浓度均为0.1-100ug/L；细胞生长因子为人血小板源生长因子、人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、人转化生长因子β、人纤连蛋白中一种或两种以上的组合，且单个因子使用浓度均为0.1-100ug/L。
不同组分的复性溶液有不同的制备方法，有代表性的是基础复性溶液的制备、增强型复性溶液的制备及细胞因子复性溶液的制备，它们的制备方法如下：
基础复性溶液的制备方法包括以下步骤(以配制1000ml量为例)：
(1)按公知方法制备1M Tris-HCl pH7母液和0.5M EDTA pH7母液各1L；称取250gβ-环糊精，加去离子水至1L搅拌使充分溶解后装瓶(母液浓度25％)；然后在120℃进行20分钟热灭菌处理，冷却后备用；
(2)按配方量1000倍，分别称取青霉素和硫酸链霉素，加去离子水混匀制得1000x青霉素链霉素混合母液，然后用0.2-0.45μ滤膜无菌过滤后备用；
(3)按配方量500倍，分别称取赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸进行混合，再加入去离子水混匀，制得500x复合氨基酸母液，然后用0.2-0.45μ滤膜无菌过滤后备用；
(4)取上述1M Tris-HCl pH7母液10ml，0.5M EDTA母液10ml，β-环糊精母液200ml，去离子水至600ml，混合均匀后再加青霉素链霉素混合母液1ml，复合氨基酸母液2ml，加去离子水补至1000ml，混匀且保证各组分浓度在配方含量范围内，即得基础复性溶液1000ml。
增强型复性溶液的制备方法包括以下步骤(以配制1000ml量为例)：
(1)按配方量500倍，分别称取维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、葡萄酸锌各适量进行混合，再加入去离子水将上述各组分溶解制得500x复合维生素b-锌母液，然后用0.2-0.45μ滤膜无菌过滤后备用；
(2)取前述基础复性溶液998ml，再加入复合维生素b-锌母液2ml，混匀，保证各组分浓度在配方含量范围内，即得增强型复性溶液1000ml。
细胞因子复性溶液的制备方法包括以下步骤(以配制100ml量为例)：
(1)称取适量人血清白蛋白(例如30mg)，将其溶解于一定体积(例如30ml)的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)，制得0.1-1％(wt/v)的人血清白蛋白溶液，并按细胞因子个数均分成若干份(例如分3份，每份为10ml的0.1％人血清白蛋白溶液)；
(2)分别取10倍配方量的细胞因子并与适当量的步骤(1)中所述的人血清白蛋白溶液充分混匀溶解，比如：1μg人血小板源生长因子(PDGF)、1μg人转化生长因子β(TGF2β)、1μg人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，分别加入向步骤(1)中所述的人血清白蛋白溶液至10ml；然后用0.2-0.45μ滤膜无菌过滤，便分别制得10x细胞因子母液，(上例为：10x PDGF母液、10x TGF2β母液、10x bFGF母液，细胞因子均浓度为100ng/ml)，冷藏备用；
(3)分别取等量上述步骤(2)上述10x各细胞因子母液混匀，然后加入前述增强型复性液或基础复性液，定容至等同于10倍单个细胞因子母液的体积，(例如：取步骤(2)中所述的10x PDGF母液10ml、10x TGF2β母液10ml、10x bFGF母液10ml，混匀，然后加入前述增强型复性液或基础复性液，定容至100ml)混匀后用0.2-0.45μ滤膜无菌过滤，既得细胞因子复性溶液。
需要说明的是，在某些实施例中，复性处理的步骤(也即步骤S5)是可以省略的。
下面通过实施例1-5来说明本发明一种脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法。
实施例1
1、预处理液的制备
称取硅酸钠(Na2SiO3)100g，过氧化氢60g，加去离子水700ml混匀；量取20-60nm胶体银40mg,然后边搅拌过氧化氢溶液边慢慢添加胶体银，添加完毕后用1N HCl调pH至2.0，最后补加去离子水至1升，即可得本实施例脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用预处理液。
2、细胞裂解液的制备
称取硼砂1g、碳酸钠10.3g，加去离子水700ml混匀；加预先配好的5M NaCl母液200ml，0.5M EDTA母液40ml，然后边搅拌边慢慢滴加10ml液态NP-40(1g/ml)，添加完毕后用1N NaOH调pH至11，最后补加去离子水至1升，即可得本实施例脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用细胞裂解液。各母液均按公知方法制备。
3、脱脂液的制备
分别取三氯甲烷33ml、甲醇66ml，并将两者混匀，得三氯甲烷-甲醇混合液，再分别称取大蒜素1g，三氯生0.2g，将它们溶解于三氯甲烷-甲醇混合液中，即可得本实施例脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用脱脂液。
4、复性溶液的制备
本实施例复性溶液采用基础复性溶液，其制备过程包括以下步骤：
(1)按公知方法制备1M Tris-HCl pH7母液和0.5M EDTA pH7母液各1L，装瓶后在120℃进行20分钟热灭菌处理，冷却后备用；
(2)称取的青霉素和硫酸链霉素各200mg，加去离子水100ml混匀制得青霉素链霉素混合母液(各组分浓度均为2mg/ml)，然后用0.2μ滤膜无菌过滤后备用；
(3)分别称取赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸各500mg进行混合，再加去离子水100ml将各氨基酸混匀，制得复合氨基酸母液(各组分浓度均为5mg/ml)，然后用0.2μ滤膜无菌过滤后备用；
(4)取上述1M Tris-HCl pH7母液10ml，0.5M EDTA母液10ml，去离子水至800ml，加50gβ-环糊精，搅拌使充分溶解，再加青霉素链霉素混合母液1ml，复合氨基酸母液2ml，加去离子水补至1000ml，混匀即得本实施例脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用基础复性溶液。
5、脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法
该制备方法包括如下步骤：材料预处理、一次脱细胞、脱脂、二次脱细胞、复性、冻干、包装、辐照消毒。
1)材料预处理：将取新鲜猪空肠(屠宰5小时内)撕掉外层油脂,沿纵轴剪开，反复清洗干净，再剪成10cm长,用竹板(约长6cm x宽2cm x厚0.2cm)刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，用去离子水清洗干净，直至小肠几乎为白色为止，然后将其于新配的本实施例所述的预处理液中浸泡60分钟，料液比为1:30(wt：V)。
2)一次脱细胞处理：将预处理好的猪小肠粘膜下层(p-SIS)用去离子水漂洗、沥干，转入本实施例所述的细胞裂解液中，料液比为1:30(wt：V)，并置于超声清洗机中处理20分钟，然后再用30-45℃去离子水漂洗3遍，每遍约10分钟。
3)脱脂处理：将一次脱细胞处理后的p-SIS用去离子水漂洗、沥干，转入本实施例所述的脱脂液中，料液比为1:20(wt：V)室温摇荡浸泡3小时。
4)二次脱细胞处理：将脱脂处理后的p-SIS用去离子水漂洗、沥干，再次转入本实施例所述的细胞裂解液中，料液比为1:30(wt：V)，超声处理10分钟，然后再用30-45℃去离子水漂洗3遍，每遍约10分钟。
5)复性处理：将二次脱细胞处理后的p-SIS用去离子水漂洗、沥干，转入本实施例所述的复性溶液中，料液比为：每4cm x10cm面积的p-SIS用10-20ml复性溶液，室温浸泡4小时，浸泡过程中避免膜与膜重叠。
6)冻干、包装、辐照处理：将复性处理后的p-SIS沥干(不用洗涤)在-20℃预冻后进行冷冻干燥，然后按片分装于塑料薄膜袋中并抽真空密封，最后将其在25KGY下进行辐照消毒，得本实施例的脱细胞猪小肠粘膜下层。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法部分省略了步骤5)(也即复性处理的步骤)。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法部分步骤5)中采用增强型复性溶液。
本实施例增强型复性液的制备，包括以下步骤：
(1)分别称取50mg下述组分：维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、葡萄酸锌，加去离子水100ml混匀制得复合维生素b-锌母液(各组分浓度为0.5mg/ml)，然后用0.2μ滤膜无菌过滤后备用；
(2)取实施例1的基础复性溶液498ml，再加入复合维生素b-锌母液2ml，混匀即得本实施例脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备用增强型复性溶液。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法部分步骤5)中采用细胞因子复性溶液复性。
本实施例的细胞因子复性溶液的制备，包括以下步骤：
(1)称取30mg人血清白蛋白，加入30ml磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)混匀使充分溶解，分成3份，每份10ml；
(2)分别取人血小板源生长因子(PDGF)1μg、人转化生长因子β(TGF2β)1μg、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1μg；分别向每个因子中加入步骤(1)制得的人血清蛋白的PBS缓冲溶液至10ml，混匀，然后用0.2μ滤膜无菌过滤，便分别制得10x细胞因子母液：PDGF、TGF2β、bFGF母液，冷藏备用；
(3)取实施例2的增强型复性液21ml，再加入PDGF、TGF2β、bFGF母液各3ml，混匀即得细胞因子复性溶液30ml。
实施例1-4的效果验证部分：本发明的脱细胞猪小肠粘膜下层快速制备方法所制备的脱细胞猪小肠粘膜下层性能检测：
(1)组织学染色观察p-SIS脱细胞效果
按实施例1制备p-SIS，分别在制备步骤1)、2)、4)结束时取样品各一个；每个样品各剪1平方厘米，按公知方法直接脱水进行HE染色(苏木精-伊红染色)，然后在显微镜下观察组织学变化。
实验观察结果：经步骤1)处理后(仅预处理)的p-SIS中仍含有大量的蓝染细胞核(见图1)，经一次脱细胞处理(步骤2))后的p-SIS中仍含有少量的蓝染细胞核(见图2)，经二次脱细胞处理(步骤4))后的p-SIS中无明显细胞残留(见图3)。说明二次脱细胞方法效果显著。
(2)比较不同脱细胞方法对其所制备的p-SIS胶原蛋白及其力学性能的影响
1)样品制备：
按实施例1制备p-SIS，分别在制备步骤1)、4)结束时取样品各一个，记为A1、A4；每个样品精确剪6片，各1平方厘米。
对比实验设置：按实施例1所述步骤制备p-SIS，但将第一次脱细胞时细胞裂解液换成SDS一次脱细胞溶液，SDS一次脱细胞溶液(以每升计)包括如下含量的各组分：1MNaCl，10mM EDTA，50mM Tris-HCl，0.5％(wt/v)十二烷基磺酸钠(SDS)；第二次脱细胞时细胞裂解液换成SDS二次脱细胞溶液(以每升计)：5mM EDTA，10mM Tris-HCl，0.5％(wt/v)十二烷基磺酸钠(SDS)，分别在制备步骤1)、4)结束时取样品各一个，记为B1、B4；每个样品精确剪6片，各1平方厘米。
2)各样品胶原蛋白含量检测
将各样品取3片，按公知的羟脯胺酸法测定样品胶原蛋白含量，每个样品测3片取平均值，结果见表1：
表1.检测不同制备方法对p-SIS胶原蛋白含量的影响
Figure BDA0001720815570000141
Figure BDA0001720815570000151
实验结果显示，用本发明方法二次脱细胞后胶原蛋白比初始原料略低8％，而用SDS法二次脱细胞后胶原蛋白比初始原料低了21％。显然，SDS处理对p-SIS的胶原蛋白有显著影响。
3)各样品力学性能检测
各样品力学性能通过公知的最大拉伸载荷实验来测定，每个样品测3片取平均值，其结果见表2：
表2.检测不同制备方法对p-SIS最大拉伸强度的影响
Figure BDA0001720815570000152
实验结果显示，用本发明方法二次脱细胞后p-SIS的最大拉伸强度比初始原料略有下降，而用SDS法二次脱细胞后p-SIS的最大拉伸强度比初始原料显著下降。显然，SDS处理对p-SIS的胶原结构有显著不利影响。这是因为SDS脱细胞处理时会导致p-SIS发生不可逆变性，张力强度降低。
(3)检测复性处理后脱细胞p-SIS对细胞生长的影响
1)样品制备
将实施例2、实施例1、实施例3和实施例4所述的脱细胞猪小肠粘膜下层(p-SIS)快速制备方法所制备的4个p-SIS样品分别标记为p-SIS1、p-SIS2、p-SIS3和p-SIS4，也即：p-SIS1在制备过程中省略后续复性处理步骤5)(也即对应实施例2)，p-SIS2在后续复性处理中用基础复性溶液(也即对应实施例1)，p-SIS3在后续复性处理中用增强型复性溶液复性(也即对应实施例3)，p-SIS4在后续复性处理中用增强型复性溶液复性(也即对应实施例4)取实施例1-4的样品各1个，进行下述体外细胞实验。
2)细胞毒性试验
将4个p-SIS样品按2.5ml/cm2的比例分别置入无血清培养基中，37℃下静置24h，收集培养液，经0.22μm滤器过滤消毒，既得p-SIS1浸提液、p-SIS2浸提液、p-SIS3浸提液和p-SIS4浸提液，备用。
取对数生长期人脐静脉内皮细胞HUVEC，经胰酶消化、计数，配制2.2×104cells/ml细胞悬液，接种于96孔板，100μl/孔，接种3个96孔板。将每板细胞分成浸提组(共4组)、空白对照组、阳性对照组，每组6个平行孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。24h后镜下观察超过80％的细胞贴壁生长，移去原培养液，4个浸提组分别加p-SIS1浸提液、p-SIS2浸提液、p-SIS3和p-SIS4浸提液各100μl/孔，空白对照组加新鲜培养基DMEM100μl/孔，阳性对照组加含10％二甲基亚砜的培养基100μl/孔。然后放回培养箱继续培养。分别经培养1天、3天、6天后各取一块96孔板，更换新鲜培养基100μl/孔，加10μl的CCK-8溶液充分混匀，培养箱内继续培养2小时，用酶标仪于450nm处测定吸光光度(OD值)，计算各组的平均OD值，结果见表3。
表3.HUVEC细胞毒性实验结果(OD值)
Figure BDA0001720815570000161
备注：DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的；DMSO为二甲基亚砜。
根据表3中的数据换算得细胞相对增值率，具体见表4：
表4.细胞相对增值率RGR(％)
Figure BDA0001720815570000171
备注1：DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的；DMSO为二甲基亚砜。
备注2：RGR计算及细胞毒性等级评定方法为：
细胞相对增殖率(RGR)＝实验组平均OD值/阴性对照组平均OD值×100％；
当RGR≥100％，细胞毒性分级为0；75％≤RGR≤99％，细胞毒性为1；50％≤RGR≤74％，细胞毒性为2；24％≤RGR≤49％，细胞毒性为3；1％≤RGR＜24％，细胞毒性为4，RGR＜1％，细胞毒性为5。
医用生物材料的细胞毒性0级或1级为合格，2级应结合细胞形态综合分析，3-5级为不合格。
实验结果显示，由本发明制备的四个p-SIS样品的浸提液分别培养人脐静脉内皮细胞HUVEC，细胞均生长良好，与阴性对照组(DMEM组)相比，HUVEC细胞增殖在3、6天略有增高，但与阳性对照组(毒性组)有显著差异。根据细胞毒性等级评定方法(具体见表4下方备注2)，本发明所制备的四个p-SIS样品均显示无细胞毒性细胞，细胞相对增值率RGR≥100％，细胞毒性分级为0，符合医用生物材料毒性级别的要求。
3)细胞相容性实验
在无菌操作台上，将4个p-SIS样品按24孔-细胞培养板内侧底部大小，剪成圆片，贴于培养皿内侧底部；取对数生长期人脐静脉内皮细胞HUVEC，经胰酶消化、计数，配制3×104cells/ml细胞悬液，接种于培养皿，0.6ml/孔，将细胞分5组：样品组(p-SIS1、p-SIS2、p-SIS3、p-SIS4)和空白对照组(无p-SIS)，每组3孔，接种3个24孔-细胞培养板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。经培养1天、3天、6天后各取一板，显微镜观察细胞生长情况；然后，更换新鲜培养基300μl/孔，每孔再加30μl的CCK-8溶液(CCK-8溶液为市售的)，充分混匀，培养箱内继续培养2小时，每孔取100ul转移至空白96孔培养板，用酶标仪于450nm处测定吸光光度(OD值)，计算各组的平均OD值，结果见表5。
表5.HUVEC细胞在p-SIS上增殖结果(OD值)
Figure BDA0001720815570000181
实验结果显示，将人脐静脉内皮细胞HUVEC与4个p-SIS样品复合培养，细胞在p-SIS表面比在单纯培养皿表面贴附、伸展的更好，接种2天后在p-SIS上的细胞几乎完全贴壁，逐渐成梭形或多角形，然后开始增殖，1周后细胞融合连接成片，形成单层，形态为长梭形或多角形。在p-SIS上细胞形态与在孔板生长无显著差异。经6天培养，P-SIS上的HUVEC细胞OD值均高于单纯培养皿的对照组，而且p-SIS4>p-SIS3>p-SIS2>p-SIS1>Plate。实验结果表明：p-SIS能明显促进HUVEC的生长和增殖，经过复性处理的比没有复性处理的p-SIS更有利细胞生长，而且显示复性处理时用细胞因子复性液比用增强型复性液更有利于细胞生长，用增强型复性液复性又比用基础复性液复性更有利于细胞生长。
实施例5
1、预处理液的制备
制备方法与实施例1中的“1、预处理液的制备”相同，但硅酸钠(Na2SiO3)浓度改为200g/L，过氧化氢浓度改为180g/L，20-60nm胶体银浓度改为300mg/L。
实验发现，使用该预处理液和实施例1中所述的预处理液分别来处理猪小肠所得结果基本相同，但后者比前者所处理的猪小肠略微柔和，虽然前者杀菌能力更强些。
2、细胞裂解液的制备
制备方法与实施例1中的“2、细胞裂解液的制备”相同，但5M NaCl母液添加量改为50ml，pH值改为9。
实验发现，使用细胞裂解液和实施例1中所述的细胞裂解液分别来处理猪小肠所得结果显示：后者比前者所处理的猪小肠脱细胞效果更好。
3、脱脂液的制备
制备方法与实施例1中的“3、脱脂液的制备”相同，但三氯甲烷:甲醇的用量分别改为40ml:20ml，和30ml:30ml，20ml:40ml(实施1中3的方法)。
实验发现，不同比例的三氯甲烷:甲醇，对猪小肠脱脂有一定影响，在同样方法和处理时间前提下，脱脂效果较好的脱脂液中甲烷:甲醇比例依次是：40ml:20ml>30ml:30ml>20ml:40ml。
4、细胞因子复性溶液的制备
制备方法与实施例4中相同，但分别用基础复性液和增强型复性液稀释细胞因子，来制备两组细胞因子复性溶液。
实验结果显示，用增强型复性液稀释细胞因子制得的细胞因子复性溶液实施例4比用基础复性液稀释细胞因子制得的细胞因子复性溶液营养更丰富，对促进HUVEC细胞生长效果更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：包括一次脱细胞处理的步骤和二次脱细胞处理的步骤，且在两次脱细胞处理的步骤之间设有一脱脂处理步骤，包括以下步骤：
S1：预处理：取新鲜猪小肠，清除杂物、刮除表层油脂，柔化肠膜、漂白并杀菌；
S2：一次脱细胞处理：将预处理好的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，转入细胞裂解液中，超声处理或摇荡浸泡后再次漂洗；
S3：脱脂处理：将一次脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，转入脱脂液中，室温摇荡浸泡1-6小时或于4℃过夜；
S4：二次脱细胞处理：将脱脂处理好的猪小肠粘膜下层漂洗、沥干，再次转入新的细胞裂解液中，超声处理或摇荡浸泡后漂洗；
S5：将二次脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层经漂洗、沥干后转入复性溶液中浸泡2-24小时；
S6：将步骤S5处理后的猪小肠粘膜下层进行冻干、包装、辐照消毒处理；
所述一次脱细胞处理和二次脱细胞处理采用相同的细胞裂解液，该细胞裂解液pH为10-12，其主要组分及含量为，以每升计：硼砂1-10g，碳酸钠5-20g，氯化钠0.3-5M，EDTA 5-50mM，乙基苯基聚乙二醇1-30g。
2.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：步骤S1中预处理的方法为：将取新鲜猪小肠剪开、反复清洗干净，再剪成适当长度，用钝刮刀刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，用纯净水清洗干净，然后将其置于新配的预处理液中，浸泡30-60分钟后备用；步骤S2和步骤S4中，超声处理的时间均为1-30分钟，摇荡浸泡的时间均为30-120分钟，漂洗用30-45℃去离子水漂洗，漂洗次数为2-5，每次时间为3-60分钟。
3.根据权利要求2所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：步骤S1中，预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠10-300g/L、过氧化氢5-500g/L、胶体银10-500mg/L；预处理液的pH为1.3-2.5；胶体银为10-100nm胶态微粒银离子。
4.根据权利要求3所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述预处理液的pH为2；预处理液包括以下质量浓度的各组分：硅酸钠100g/L，过氧化氢60g/L，胶体银40mg/L。
5.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：步骤S3中，脱脂液是含有大蒜素和三氯生的三氯甲烷-甲醇混合液，其中大蒜素0.1-5％wt/v三氯生0.05-1％wt/v，溶剂为三氯甲烷-甲醇；三氯甲烷-甲醇为三氯甲烷和甲醇以体积比为1:2混合成的混合液。
6.根据权利要求5所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述脱脂液中大蒜素和三氯生的含量分别为1％wt/v和0.2％wt/v。
7.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述细胞裂解液各组分的含量为，以每升计：硼砂1g，碳酸钠10.3g，氯化钠1M，EDTA 20mM，乙基苯基聚乙二醇10g。
8.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述复性溶液包括以下各组分：5-50mM Tris-HCl，1-10mM EDTA，1-20％wt/vβ-环糊精；
9.根据权利要求8所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述β-环糊精的浓度为5-10％wt/v；所述复性溶液还包括浓度为0.5-5mg/L的抗生素；抗生素为青霉素和硫酸链霉素中的一种或两种；复性溶液体系的pH为7-10。
10.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：复性溶液还包括甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上，各组分浓度均为0.2-10mg/L。
11.根据权利要求10所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述各组分使用浓度均为1-5mg/L。
12.根据权利要求10所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述复性溶液还包括各组分浓度均为0.1-50mg/L的维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌中的一种或两种以上。
13.根据权利要求12所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：所述复性溶液还包括各组分使用浓度均为0.1-3mg/L的维生素B1、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、硒和锌中的一种或两种以上。
14.根据权利要求1所述的快速制备脱细胞猪小肠粘膜下层的方法，其特征在于：复性溶液还包括细胞生长因子，且使用浓度均为0.1-100ug/L；细胞生长因子为人血小板源生长因子、人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、人转化生长因子β、人纤连蛋白中一种或两种以上的组合，且单个因子使用浓度均为0.1-100ug/L。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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