CN101298627A

CN101298627A - 对s-腺苷甲硫氨酸(sam)的改进分析

Info

Publication number: CN101298627A
Application number: CNA2008100900029A
Authority: CN
Inventors: 徐明旭; 韩庆宏
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2008-11-05
Also published as: EP1997508A2; EP1997508B1; KR20020065925A; EP1250448B1; CA2390057C; WO2001051651A2; CN1416472A; DE60135632D1; JP2004508005A; AU2639701A; JP5058422B2; US20020119491A1; US6713273B2; ATE407217T1; CA2390057A1; EP1997508A3; EP1250448A2; WO2001051651A3; AU2001226397B2

Abstract

本发明提供涉及SAM检测和制备的新方法及新SAHH酶活性在该方法中的应用。还提供涉及新SAHH的其它方法，组合物及试剂盒。

Description

对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进分析

本申请是2001年1月12日以国际申请号PCT/US01/01114提交的中国申请01803726.7的分案申请，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

根据35United States Code§119(e)本申请要求的优先权，来自2000年1月14日提交的临时申请serial No.60176,444，本文在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及新的重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)和其使用方法。本发明还涉及应用SAHH监测供试体的诊断方法，该供试体已给药S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。本发明的改进方法可快速而又精确地评估SAM的浓度。

发明背景

作为“nutraceutical”或处方药给药S-腺苷甲硫氨酸(SAM)最近显示出SAM是一种抗抑郁剂，是一种缓解肝病的预防或治疗组分，提供一种缓解关节炎症状的手段。SAM在此的作用机制尚未完全清楚，但是，已确信SAM和其代谢产物高半胱氨酸的相对浓度影响甲基化水平，而甲基化水平会产生更深的生理影响。由于该药重要，因此期望找到一种可靠而又易实施的方法来监测所给药的浓度。本发明提供一种改进的方法，该方法通过SAHH来评估给药SAM的供试体中该药的治疗性水平。本发明还涉及重组产生的不同于以前报道的SAHH。

S-腺苷高半胱氨酸酶(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SAHH，EC.3.3.1.1)催化SAH到高半胱氨酸和腺苷的可逆性转化(de la Haba和Cantoni，1959)。腺苷的各种结构类似物使许多生物体的SAHH失活，从而导致细胞毒性的产生(Ueland，1982)。核苷类似物对SAHH活性的抑制取决于抑制物的结构和酶的来源。SAHH最初从阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)基因克隆并且已鉴定特征(Bagnara等，1996)。

Minotto，L.，Ko，G.-A.，Edwards，M.R.和Bagnara，A.S.[重组S-腺苷高半胱氨酸酶的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)表达和鉴定，ExperimentalParasitology 90，175-180，1998]进一步描述了阴道毛滴虫(T.vaginalis)SAHH的特征。编码阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中S-腺苷高半胱氨酸酶的基因在大肠杆菌(Escherichia coli)pQE-30的表达有利于描述该酶的特征。6xHisN端标记表达系统(QIAGEN)可一步纯化6毫克rSAHH，该rSAHH可通过使用镍-NTA基质的亲和层析于100ml细菌培养得到。测得重组酶的分子量约为56,000。rSAHH的特性包括与腺苷有相似的表观K_m 20-25μM和与腺苷类似物例如阿糖腺苷(ara-A)有相似的抑制/失活模式。

Minotto等1998的研究结果不同于其他人所发现的水解酶根据酶的来源以各种寡聚形式存在。原核生物SAHH的活性形式是六聚体(Shimizu等，1984)或四聚体(Porcelli等，Biochim.et Biophys.Acta，1164，179-188，1993)。大鼠肝脏(Fujioka和Takata，J.Biol.Chem.，256，1631-1635，1981)和小牛肝脏(Richards等，253，4476-4480，1978)及其它动物源(Doskeland和Ueland，Biochem.et Biophys Acta 708，185-193，1982)的SAHH是四聚体，不过不能确定亚基是否相同或相似。植物源的SAHH的功能形式是同型二聚体(Guranowski和Pawelkiewicz，Fur.J.Biochem.80，517-523，1977)。此文第一次报道以单体形式起作用的SAHH活性(Minotto等，1998)。

发明内容

本发明涉及一种分析样品中SAM水平的改进新方法。一方面，本发明方法可用于分析供试体样品中SAM的治疗性水平，所述供试体例如但并不限于给药此化合物的患者。本方法还可用于分析生物液体中SAM的水平，所述生物液体例如但并不限于供试体血液或其它生物液体。该方法可在体内例如血流或体外例如取自供试体的样品里进行。所述方法可作为诊断方案或治疗方案的一部分。作为治疗方案的一部分，该方法一定程度上可监测治疗情况或进展。

在本发明的一实施方案中，该试验方法可通过样品与甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)，甘氨酸及活性形式SAHH的接触而得以进行。测量样品中一种或更多种反应产物后就可得出样品中SAM的水平，其中反应产物的量与样品中SAM水平成正比。在本发明一实施方案中，直接或间接地测量反应产物高半胱氨酸(HC)。可用任何方法来间接测量HC，包括但并不限于用高半胱氨酸酶处理并且测量一种或更多种反应产物(例如α-酮戊二酸，H₂S或NH₃)的水平。通过测量吸光度或荧光可直接或间接地测定反应产物H₂S。一种测荧光的方法是使用发荧光试剂。

本发明还提供一种新SAHH，编码它的核酸，包含它的组合物及其制备和使用方法。所述SAHH含有SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

编码本发明SAHH的核酸可置于任何合适核酸载体上以增殖，扩增或表达。所述核酸还可与其它核苷酸操作性地连接以容许与一种或多种附加氨基酸共价连接的SAHH表达。附加氨基酸导致产生包含SAHH的杂交或嵌合蛋白。本发明的一优选实施方案中，附加氨基酸是指那些改进本发明中后面SAHH纯化的组氨酸标记(His tag)。

本发明核酸可被导入任何合适的寄主细胞或生物体，例如但并不限于细菌，真菌和高等真核细胞。这些细胞可用于重组表达本发明的核酸，任选地，接着对表达蛋白进行分离和/或纯化。或者，所述核酸还可应用体外表达系统来表达。

本发明的SAHH纯化可由任何方便或合适的方法例如，但并不限于沉淀和/或层析法来完成。在本发明一优选的实施方案中，所述纯化全部或部分是通过基于与组氨酸标记相互作用的亲和层析来实现的。在本发明另一优选的实施方案中，这样纯化的SAHH，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示为一条带。

本发明SAHH还可被配制成组合物，例如包含药剂或赋形剂(excipients)的组合物。所述SAHH还可用于本发明例如上述的试验方法和其它方法中，所述其它方法例如由分析样品中高半胱氨酸向SAH转化来测定高半胱氨酸水平的方法。另一方面，本发明所述SAHH还可用于通过向SAH的转化耗竭体内或体外样品中过多高半胱氨酸的方法中。当然本发明所述样品可以是任何相关生物液体。

更具体地，本发明涉及：

1.评估生物液体样品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的治疗性水平的方法，包括：将甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)，S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或His·SAHH，以及甘氨酸加入该样品中；测量所述样品中一种或多种反应产物，其中所述一种或多种反应产物的水平与样品中SAM水平成正比。

2.项1的方法，其中被检测的产物是高半胱氨酸(HC)。

3.项2的方法，其中所述HC是由下述方法测得，该方法包括用高半胱氨酸酶(HCYase)处理样品，并测定所述高半胱氨酸与HCYase反应得到的至少一种产物的浓度。

4.项3的方法，其中测得的产物是H₂S。

5.项4的方法，其中所述H₂S通过荧光或吸光度而测定。

6.项1的方法，其中所述SAHH包含SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

7.分析含SAM的样品的试剂盒，该试剂盒包括SAHH或His·SAHH，GMT，甘氨酸及使用说明。

8.一种试验，包括：含SAM的生物样品；和GMT，甘氨酸，以及SAHH或His·SAHH，其中SAHH或His·SAHH活性产生一种可测定的产物以确定样品中SAM的量。

9.一种分离的包含SEQ ID NO：1的核酸分子。

10.项9中定义的核酸分子，还包括编码N端6×His标记的序列。

11.有效制备S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有项9定义的核酸分子的盒进行表达。

12.有效制备His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有项10定义的核酸分子的盒进行表达。

13.项11的方法，其中所述盒在大肠杆菌中表达。

14.项12的方法，其中所述盒在大肠杆菌中表达。

15.纯化His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括：用硫酸铵来沉淀含His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的悬浮液以产生上清和沉淀，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项12的方法生成；和对该上清进行组氨酸标记识别型亲和层析。

16.用单个层析步骤纯化His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括使通过项12的方法生成的His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶进行Ni-NAT亲和层析。

17.测定生物液体中高半胱氨酸的方法，包括将所述液体与His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶接触并且测定所述液体中高半胱氨酸向SAH的转化，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项15的方法生成。

18.包含His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的组合物，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为一条带，其中所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由项15的方法制成。

19.耗竭体内或来自体内的生物液体中过量高半胱氨酸的方法，包括使所述液体与项15的方法生成的SAHH接触。

20.一种大肠杆菌宿主细胞，包括项9的核酸分子。

21.一种大肠杆菌宿主细胞，包括项10的核酸分子。

附图说明

图1描述pTrcSAHH插入pTrc多克隆位点NcoI和BamHI。

图2包含SAHH稳定性研究的结果。

图3显示SAHH克隆的筛选。

图4描述pTrcHis·SAHH插入pTrc多克隆位点NcoI和BmaHT。

图5包含His·SAHH稳定性研究的结果。

图6a-c是本发明SAHH核苷酸序列与野生型序列的对比。

实施本发明的方式

本发明提供一种分离和重组核酸，该编码SAHH的核酸包括SEQ IDNO：1，还提供相应SAHH氨基酸序列。另一方面，修饰所述SAHH的基因以编码已修饰的His·SAHH，His·SAHH有6个额外组氨酸位于SAHH基因N-末端。

另一方面，本发明提供增殖和维持核酸的方法及它们在SAHH蛋白表达中的用途。本发明还提供通过一步或两步纯化法纯化SAHH的方法。

在一实施方案中，本发明涉及生物液体中SAM的测量。其中所述“生物样品”指的是从个体中分离出的组织或液体样品，包括但并不限于例如血液，血成分，血浆，血清，脑脊液，淋巴液，尿液，皮肤外的部分，呼吸道，肠道，生殖泌尿道，身体分泌物，眼泪，唾液，乳，淋巴以及从动物，细胞(包括但不限于血细胞)，肿瘤，器官中提取出的其它成分，还包括体外细胞培养的组分样品。优先选用的是在血浆或血清中测量。

其中所述“表达”包括转录和/或翻译。

其中所述术语“包含”及其相关术语在此表示包含的意思。相当于术语“包括”及其相关术语。

除非特别说明，否则所有本发明用到的科学技术术语与本领域普通人员通常理解的意思相同。

SAHH是负责S-腺苷高半胱氨酸(SAH)向高半胱氨酸转化的酶，最终降低SAM水平。由于与SAH或高半胱氨酸(HC)内源水平相比治疗疾病所给药SAM水平非常高，下述方案可用来分析给药SAM的供试体中该化合物的水平。因此，所述试验起到了药物监测装置功能，可用于试剂盒形式中。

下图中显示了该试验的大概情况。

正如此处描述的，由于有效地生成了SAHH或His·SAHH，而且高半胱氨酸酶对高半胱氨酸有高度专一的选择性，从而使所述分析SAM的通常方法得到了改进。尽管高半胱氨酸相对低于SAM的水平，由此确信所估SAM的量没有受到内源SAH或HC显著干扰，如果所用酶专一性较低，体液中存在的半胱氨酸水平显著高于高半胱氨酸的水平就会产生影响。存在荧光试剂时，本发明方法中测得终产物为硫化氢。

SAHH还催化高半胱氨酸到S-腺苷高半胱氨酸转化的逆反应，最终升高SAM水平。该反应适用于另一类型试验，一种测量高半胱氨酸的高半胱氨酸的酶-转化免疫测定。具体地，本发明所述SAHH或His·SAHH将高半胱氨酸定量地转化成SAH，并接着利用标准ELISA试验测量终产物SAH。通过提供充足的或较高的(甚至过量的)SAH使其得以实现。或者，针对SAH的荧光抗体可用来定量生成的SAH。例如，该免疫测定可用于试剂盒并且在约为1-100μM的范围内可用于血浆高半胱氨酸的测定。

本发明所述SAHH或His·SAHH还可用作药剂，特别是在筛选酶的抑制物和失活物时用作药剂并且可能用于例如癌症，疟疾，关节炎和其它疾病的治疗。优选试剂盒形式的SAHH药物，该试剂盒包括一种试验，由于结合高半胱氨酸和利用二烷基苯二胺试剂例如DBPDA测量生成的硫化氢，所以该试验比较简单。

重组SAHH的其它用途包括与SAH类似物结合的治疗性癌基因，充当激活有毒力前体药物的酶，该前体药物毒力由SAHH释放的毒性腺苷类似物来提供。所述腺苷类似物在和Hcy结合成SAH类似物时没有毒性。也可应用高半胱氨酸类似物，例如结合腺苷或腺苷类似物的硒代高半胱氨酸，其结合SAHH和rMETase基因治疗在癌细胞中释放由所述两基因转导的非常毒的硒醇及有毒腺苷类似物。

优选的实施方案包括分析样品的试剂盒。优选的是，试剂盒中含有试验操作说明，该说明可印在试剂盒中的包装插页(insert)上，包装或标签上。要印的还可印在试剂盒中的容器及样品标签上，并且试剂体积要在试验容器上标明。精确说明随所检测物质和/或所用检测方法而定，但是可包括下述说明的一项或多项：如果必要，试剂盒组分和/或样品稀释说明，各试验所用酶体积或浓度说明，试验中所加样品体积说明，所加发荧光试剂说明，产物测定说明，优选的是温度条件，组分添加和混合时间及校准试验结果用到的标准。

本发明可通过任何常规方法制备SAHH。通过实施例但并非对本发明范围的限制，用编码本发明SAHH的合适载体首先转化表达该酶的细菌。接着，在液态培养基上培养(发酵)该转化细菌许多小时，直至达到高密度。如果SAHH编码序列受诱导启动子调控，则可加入合适诱导物。结束培养后，接着就可离心收获细胞，不用时冷冻储存。

先解冻并融化冷冻细胞，然后添加组分沉淀细胞碎片。离心收集碎片，得到的上清中含有SAHH活性。在准备好的层析柱上上样之前，先用合适缓冲液稀释上清。梯度洗脱出所述SAHH，或更优选的是一步微体积洗脱。然后制成储存制剂以备用。

除了上述提供的一步纯化方法外，可用亲和层析法纯化含组氨酸标记的SAHH。通过实施例但并不限于本发明，按照上面所描述的来培养和收获表达带组氨酸标记的SAHH的细菌细胞。接着如上所述解冻并破碎冷冻细胞，制成细胞悬浮液，向悬浮液中加入固态硫酸氨，并将混合物置于冰上，然后离心。随后收集含有SAHH活性的上清，并在预先准备好(已平衡)的Ni-NAT层析柱上样，冲洗该柱，实施一步洗脱法。在制成制剂冷冻储存之前，要先汇集活性成分并对其进行透析。

如下面实施例所述，根据下述步骤SAHH编码序列从阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)克隆并在大肠杆菌中表达。在此提供编码SAHH基因的核苷酸序列，与野生型序列比较，如图6a-c所示与Minotto等，1998公开的序列相当。所述两序列的比较显示出11处点突变。在下面表1列出。

表1SAHH序列的比较

有11处点突变

野生型 A/C′s 氨基酸的变化

No.19 (G)CT (A)CT Ala.→Thr.

No.201 GC(G) GC(C)

No.207 CT(T) CT(C)

No210 AT(T) AT(C)

No.501 GT(C) GT(T)

No.744 GT(G) TG(C)

No.834 GG(G) GG(C)

No.897 CC(T) CC(A)

No.917 G(T)C G(C)C Val.→Ala.

No.1314 GA(T) GA(A) Asp.→Glu.

No.1346 G(T)T G(C)T Val.→Ala.

本发明SAHH酶具有良好性质。例如，SAHH有高度特异性活性至少为1.5U/ml。此外，本发明SAHH克隆高度表达20％总细胞蛋白。而且，附图2和图5显示本发明方法制成的SAHH具备高度稳定性。例如，附图2和图5分别显示SAHH和SAHH·His在45℃可保持三天稳定而无活性丧失。

下面实施例用于说明但并不限制本发明。

实施例1在pQE-30表达载体里克隆SAHH基因

使用寡核苷酸引物通过PCR扩增编码阴道毛滴虫(T.vaginalis)(Bagnara等，1996)SAHH的基因组序列，该寡核苷酸引物分别包含在上游(有义)和下游(反义)引物中改造的BamHI和Pstl的限制酶切位点(两种情况中以下划线标明限制位点)：上游引物，5′TTTTGGATCCGCTTGCAAATCACCTGCTGGTGC3′；下游引物，3′CTGCTATCGAGGGGGACGTCTTTT 5′。将重组表达载体pQE-30转化入大肠杆菌(Escherichia coli)宿主菌株M15[pREP4](Villarejo和Zabin，1974)(QIAGEN)。

实施例2重组SAHH的表达，纯化和分析

含pQE-30-SAHH构建体的克隆在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)大肠杆菌M15中过夜生长。0.1mM IPTG诱导表达，接着在39℃伴随用力振荡生长14小时。于50mM磷酸钠，pH8.0，300mM NaCl中超声处理以破碎收获的细胞。随后12000g离心20分钟。用50mM磷酸钠，pH 6.0，300mM NaCl，含各种浓度咪唑的10％甘油从Ni-NTA柱上差异洗脱出该重组酶。纯化重组酶级份不加甘油的于4℃储藏。而其它级份与甘油混合后(终浓度50％)储存在-20℃和-79℃以确定酶活性受到储藏的影响。通过Pharmacia Biotech SMART层析系统的尺寸排阻毛细管层析法(Superdex200PC柱)在未变性情况下分析活性重组酶大小。

实施例3SAHH在大肠杆菌里的表达

在大肠杆菌里已获得SAHH基因表达，该宿主大肠杆菌提供一种SAHH-阴性环境(Shimizu等，Eur.J.Biochem，141，385-392，1984)。在37℃用1-2mM IPTG诱导时，含重组SAHH基因序列大肠杆菌克隆高度表达该酶，但主要是不溶的“包涵体”。温度降低到30℃并且IPTG浓度降到0.1mM会降低表达水平，导致较大比例地表达可溶性和有活性形式的酶。重组SAHH包含约12％总可溶蛋白。

实施例4重组蛋白的纯化和特征

通过在Ni-NTA柱上亲和层析来纯化重组的SAHH。该酶分子量约为55,000-56,000(图1)。利用Superdex 200PC毛细管柱所得尺寸排阻层析法的结果显示未变性条件下重组酶分子量约为55,000。在这些条件下该酶具有活性，SDS-PAGE显示亚基分子量约为55,000-56,000，这些数据显示T.vaginalis酶的功能形式是单体。该结果不同于其他人的发现，他们发现水解酶以寡聚形式存在，酶的来源决定四级结构。

实施例5S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的发酵与纯化

发酵：

1.取肥大细胞库10μl细菌接种到5ml L.B.上，37℃振荡培养6小时。

2.取步骤1中0.5ml细菌转移到3个含400ml L.B.的瓶中，37℃振荡培养过夜。

3.4℃，3000rpm离心收集细胞，将其悬浮于L.B.中并接种发酵。

4.细胞在发酵器中28℃培养约6小时至其密度为OD600为7。

5.加入0.1mM IPTG诱导细胞，28℃过夜培养。

6.4℃，4000rpm离心收获细胞，-80℃储存以备纯化。

纯化：

1.匀浆器中匀化3次以分解细胞。

2.细胞分解液与2％PEL，30％乙醇，8％PEG混合，在水浴锅中加热到37℃。

3.15000rpm离心30分钟去除细胞碎片，收集上清。

4.加入20mM磷酸钾缓冲液，pH 8.3，1mM DTT和EDTA稀释上清两倍。

5.将上清加到预平衡的DEAE-琼脂糖快速流柱上。

6.该柱预先要用20mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，40mM NaCl，1mM DTT和1mM EDTA预冲洗至0D280低于0.2。

7.用20mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，100mM NaCl，1mM DTT和EDTA洗脱SAHH。

8.向SAHH洗脱液中加入30％甘油和1mM NAD制得终产物。

专一性

高度表达的克隆表达SAHH占总蛋白20％，纯化后，SAHH特异活性为1.64单位/毫克蛋白。纯度超过90％。

稳定性

如下所述配制该酶：20mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，100mM NaCl，30％甘油，1mM DTT，1mM NAD和1mM EDTA。见图2。

实施例6SAHH活性的测量

试剂：分析缓冲液：

20mM磷酸钾缓部液，pH 8.0，1mM DTT和1mM EDTA。

2mM S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)

rHCYase(5毫克/毫升)

L-高半胱氨酸(各种浓度)

40mM DBPDA，溶于6M盐酸中。

40mM高铁氰化钾

试验方法

空白标准曲线试验

分析缓冲液(μl) 940 970 920

rHCYase(μl) 10 10 10

L-高半胱氨酸(μl) --- 20 ---

SAH(μl) 50 --- 50

样品(μl) --- --- 20

充分混匀，37℃培养5分钟。

DBPDA(μl) 50 50 50

高铁氰化钾(μl) 50 50 50

充分混匀，37℃培养10分钟。读取675nm吸光度或EX665nm/EM690nm荧光值。一个单位定义为37℃在rHCYase过量存在下1分钟水解S-腺苷高半胱氨酸1μM。

实施例7rSAHH·His标记的制备

为构建表达载体，通过PCR修饰SAHH基因，5′引物为CATCATCATCATCATCACGCTTGCAAATCACCTACTGG

6×His·Tag

及3′引物为ATGCATGGATCCTTAATAACGGTAAGCATC。

BamHI

pTrc99A(Pharmacia Biotech)用作表达载体。修饰的His rSAHH在SAHH基因N端有6个额外组氨酸密码，在Nco I-钝端和BamHI位点将其插入。大肠杆菌JM109为His·SAHH表达的宿主菌株。

实施例8具有组氨酸标记的重组S-腺苷高半胱氨酸水解酶纯化

细胞破碎

解冻500g表达SAHH的大肠杆菌冷冻细胞(-80℃)，将其悬浮于500ml20mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，其中含有1mM DTT和1mM EDTA。用匀浆器(Hc-8000，Microfluidics International Corporation)于5000psi三次破碎细胞。

硫酸铵沉淀

向破碎细胞悬浮液中加入结晶硫酸铵(20％W/V)，冰上混合20分钟后，在4℃，12000rpm离心30分钟，然后收集上清以备进一步纯化。

Ni-NAT Superflow层析

将含有10mM咪唑的澄清上清加到用结合缓冲液(BindingBuffer)(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，0.5M NaCl，10mM咪唑，1mM EDTA和0.01％α-巯基乙醇)平衡过的Ni-NAT Superflow柱中(2.0×20cm)。用3倍柱体积结合缓冲液冲洗该柱使其280nm的吸光度值达到基线，然后用冲洗缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，0.5M NaCl，50mM咪唑，1mM EDTA和0.01％α-巯基乙醇)冲洗使其280nm的吸光度值达到基线。洗脱缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6，0.5M NaCl，300mM咪唑，1mM EDTA和1mMDTT)洗脱酶。汇集活性级分并用含1mM DTT和1mM EDTA 50倍体积20mM磷酸钾缓冲液透析。终产物用30％甘油和1mM NAD储存在-80℃。

用硫酸铵和亲和层析两步程序来纯化重组SAHase，该程序特别快而且有效。该制品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳产生一条带。上述方法纯化rSAHase特异活性为1.79单位/毫克蛋白。

序列表

<110>抗癌公司(AntiCancer，Inc.)

徐明旭(Xu，Mingxu)

韩庆宏(Han，Qinghong)

<120>高特异活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制备

与高度表达及对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进分析

<130>31276-20026.43

<140>PCT/US 01/01114

<141>2001-01-12

<150>US 60/176,444

<151>2000-01-14

<160>6

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1461

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)

<400>1

atggcttgca aatcacctac tggtgctcca ttcgagtaca gaattgccga catcaacctc 60

catgttctcg gccgtaagga acttaccctt gctgagaagg aaatgccagg tcttatggtt 120

cttcgtgagc gttattccgc ttctaagcca ttgaagggtg tcagaatctc tggttccctc 180

cacatgacag tccagacagc cgtcctcatc gagacactca cagctcttgg tgctgatgtc 240

agatgggctt cctgcaacat cttctctaca caagatacag ccgctgctgc tatcgttgtc 300

ggcccaacag gcacaccaga gaagccagcc ggtatcccag tcttcgcctg gaagggcgaa 360

acactcccag aatactggga gaacacatac cgcgctctca catggccaga tggtcaaggc 420

ccacagcagg ttgtcgatga tggtggtgat gctacactcc tcatctccaa gggcttcgaa 480

ttcgaaacag ccggtgctgt tccagagcca acagaagctg acaacctcga ataccgctgc 540

gttcttgcta cactcaagca ggtcttcaac caagacaaga accactggca cacagttgct 600

gccggcatga acggtgtttc cgaagagaca acaacaggtg tccaccgcct ctaccagctc 660

gagaaggagg gcaaactcct cttcccagcc atcaacgtca acgacgctgt tacaaagtcc 720

aagttcgata acatctacgg ctgccgccac tcccttatcg atggtatcaa ccgtgcttcc 780

gatgtcatga tcggcggcaa gacagctctc gtcatgggtt acggcgatgt cggcaagggc 840

tgcgctcaat ccctccgtgg ccaaggcgct cgcgttatca tcacagaagt cgacccaatc 900

tgcgctctcc aggctgccat ggaaggctac caggtccgcc gcatcgagga agtcgtcaag 960

gatgtcgata tcttcgttac atgcacagga aactgcgata tcatctctgt tgacatgatg 1020

gcccagatga aggataaggc tattgtcggt aacatcggcc acttcgataa cgaaattgat 1080

acagatggcc tcatgaaata cccaggcatc aagcacatcc caatcaagcc agaatacgac 1140

atgtgggaat tcccagatgg ccacgctatc ctccttcttg ctgagggccg ccttcttaac 1200

cttggctgcg ctacaggtca cccatctttc gttatgtcaa tgtcattcac aaaccagaca 1260

ctcgctcagc tcgacctcta cgaaaagaga ggaaatctcg agaagaaggt ttacacactt 1320

ccgaagcatc tcgatgaaga agtcgctcgc ctccacctcg gatctctcga tgtccacctt 1380

acaaagctta cacagaagca ggctgactac atcaacgttc cagttgaggg tccttacaag 1440

tctgatgctt accgttatta a 1461

<210>2

<211>485

<212>PRT

<213>阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)

<400>2

Ala Cys Lys Ser Pro Thr Gly Ala Pro Phe Glu Tyr Arg Ile Ala Asp

1 5 10 15

Ile Asn Leu His Val Leu Gly Arg Lys Glu Leu Thr Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Glu Met Pro Gly Leu Met Val Leu Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys

35 40 45

Pro Leu Lys Gly Val Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr Val Gln

50 55 60

Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Asp Val Arg

65 70 75 80

Trp Ala Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp Thr Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Ile Val Val Gly Pro Thr Gly Thr Pro Glu Lys Pro Ala Gly Ile Pro

100 105 110

Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu Thr Leu Pro Glu Tyr Trp Glu Asn Thr

115 120 125

Tyr Arg Ala Leu Thr Trp Pro Asp Gly Gln Gly Pro Gln Gln Val Val

130 135 140

Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Glu Phe

145 150 155 160

Glu Thr Ala Gly Ala Val Pro Glu Pro Thr Glu Ala Asp Asn Leu Glu

165 170 175

Tyr Arg Cys Val Leu Ala Thr Leu Lys Gln Val Phe Asn Gln Asp Lys

180 185 190

Asn His Trp His Thr Val Ala Ala Gly Met Asn Gly Val Ser Glu Glu

195 200 205

Thr Thr Thr Gly Val His Arg Leu Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Gly Lys

210 215 220

Leu Leu Phe Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ala Val Thr Lys Ser Lys

225 230 235 240

Phe Asp Asn Ile Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Ile Asp Gly Ile Asn

245 250 255

Arg Ala Ser Asp Val Met Ile Gly Gly Lys Thr Ala Leu Val Met Gly

260 265 270

Tyr Gly Asp Val Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ser Leu Arg Gly Gln Gly

275 280 285

Ala Arg Val Ile Ile Thr Glu Val Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala

290 295 300

Ala Met Glu Gly Tyr Gln Val Arg Arg Ile Glu Glu Val Val Lys Asp

305 310 315 320

Val Asp Ile Phe Val Thr Cys Thr Gly Asn Cys Asp Ile Ile Ser Val

325 330 335

Asp Met Met Ala Gln Met Lys Asp Lys Ala Ile Val Gly Asn Ile Gly

340 345 350

Hi s Phe Asp Asn Glu Ile Asp Thr Asp Gly Leu Met Lys Tyr Pro Gly

355 360 365

Ile Lys His Ile Pro Ile Lys Pro Glu Tyr Asp Met Trp Glu Phe Pro

370 375 380

Asp Gly His Ala Ile Leu Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Cys Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Met Ser Phe Thr

405 410 415

Asn Gln Thr Leu Ala Gln Leu Asp Leu Tyr Glu Lys Arg Gly Asn Leu

420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Thr Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Glu Val Ala

435 440 445

Arg Leu Hi s Leu Gly Ser Leu Asp Val Hi s Leu Thr Lys Leu Thr Gln

450 455 460

Lys Gln Ala Asp Tyr Ile Asn Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Ser

465 470 475 480

Asp Ala Tyr Arg Tyr

485

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>3

ttttggatcc gcttgcaaat cacctgctgg tgc 33

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>4

ttttctgcag ggggagctat cgtc 24

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

catcatcatc atcatcacgc ttgcaaatca cctactgg 38

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ctacgaatgg caataattcc taggtacgta 30

Claims

1.评估生物液体样品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的治疗性水平的方法，该方法包括：

将有效量的甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)，有效量的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或His·SAHH，以及甘氨酸加入该样品中；

测量所述样品中一种或多种反应产物，其中所述一种或多种反应产物的水平与样品中SAM水平成正比。

2.权利要求1的方法，其中被检测的产物是高半胱氨酸(HC)。

3.权利要求2的方法，其中所述HC是由下述方法测得，该方法包括用高半胱氨酸酶(HCYase)处理样品，并测定所述高半胱氨酸与HCYase反应得到的至少一种产物的浓度。

4.权利要求3的方法，其中测得的产物是H₂S。

5.权利要求4的方法，其中所述H₂S通过荧光或吸光度而测定。

6.权利要求1的方法，其中所述SAHH包含SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

8.一种测定S-腺苷甲硫氨酸(SAM)浓度的方法，包括：

含SAM的生物样品；和

有效量的甘氨酸N-甲基转移酶(GMT)，甘氨酸，以及S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或N-端组氨酸标记的SAHH(His·SAHH)，

其中SAHH或His·SAHH活性产生一种可测定的产物以确定样品中SAM的量。