MXPA01013424A - Clasificacion para compuestos que modulan la fuga protonica de las mitocondrias. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo de clasificacion para la identificacion de compuestos que modulan un sitio regulador sensible a AMP en mitocondrias, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con la mitocondria en presencia de un substrato para la respiracion en presencia de un sistema regulador de pH; b) medir un indice de regimen metabolico; y c) identificar compuestos que modulan el regimen metabolico. Alternativa o adicionalmente, se puede medir un potencial de membrana, La invencion tambien comprende un sitio regulador para una fuga de proton de mitocondria que esta relacionado con el portador de nucleotido de adenina, un ensayo de union y un ensayo funcional.

Description

CLASIFICACIÓN PARA COMPUESTOS QUE MODULAN LA FUGA PROTÓNICA DE LAS MITOCONDRIAS , La presente invención se refiere a un sitio regulador novedoso, relacionado con el portador de nucleótido de adenina, que modula la actividad de ia fuga protónica de las mitocondrias; y ai uso de este sitio en métodos de clasificación novedosos para compuestos que son útiles en el tratamiento de trastornos del peso del cuerpo; por ejemplo, obesidad y caquexia, y condiciones comórbidas relacionadas que incluyen, pero sin limitación a ellas: diabetes y dislipidemias. La fosforilación oxidante es la síntesis de trifosfato de adenosinj (ATP) a partir de difosfato de adenosina (ADP) y fosfato inorgáni<í (P¡) por la mitocondria, impulsada por el gradiente protónico electroquímico que se establece durante el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria. Durante la transferencia de electrones, los protones son bombeados desde la matriz mitocóndrica hacia ei espacio de intermembrana. Los protones se difunden nuevamente hacia la matriz a través de la ATP-sintasa que produce ATP. Sin embargo, no todo el retroflujo protónico ocurre por medio de ATP-sintasa. El retroflujo protónico, que no está acoplado a la síntesis de ATP, está definido como una actividad desacopladora. Cuando se añade oligomicina (un inhibidor del flujo protónico a través del dominio de membrana de la ATP- sintasa) a mitocondrias aislados, las mitocondrias continúan consumiendo oxígeno a una velocidad baja. Este proceso es conocido como "fuga protónica" o "fuga de protones" (Brand y coautores, Biochimica et Biophysica Acta 1187 (1994) 132-139). Esta fuga protónica a través de la membrana interna de la mitocondria es estimulada para constituir hasta el 35-50% de la respiración del músculo esqueletal (Rolfe D. F. S. y Brand M. D. (1996) Am. J. Physiol., 271S C1380-C1389). En ausencia de fosforilación oxidante, todos los protones bombeados por la cadena respiratoria fuera de las mitocondrias, regresan a las mitocondrias por esta fuga protónica. La fuga protónica mitocóndrica constituye una proporción importante del régimen metabólico basal de un organismo. Hasta ahora no se había sabido de reguladores que actuaran de manera aguda en este proceso biológico. Sin embargo, se ha informado recientemente un aumento de 15% en la velocidad de respiración mitocóndrica del músculo esqueletal (estado 4) provocado por concentraciones suprafísiológicas (4.16 mM) de monofosfato de citidina (CMP) (Jekabson M. y Horwitz B. A. (1998) FASEB J., 12 No. 5, parte II, 4714). Los autores sugirieron una posible regulación por CMP de la fuga protónica en las mitocondrias del músculo esqueletal. Sin embargo, nuestros resultados no confirmaron este efecto en concentraciones hasta de 1 mM. En un examen sistemático de los efectos de quince nucleótidos sobre las mitocondrias del músculo esqueletal, se ha descubierto, sorprendentemente, que únicamente un nucleótido, a saber, el monofosfato de adenosina (AMP) tuvo efecto a concentraciones fisiológicamente relevantes. Se encontró que AMP incrementaba la velocidad de respiración en reposo y duplicaba la conductancia protónica de las mitocondrias del músculo esqueletal de ratas. La presente invención provee métodos de clasificación para identificar compuestos que modulan la fuga protónica de las mitocondrias, ¡nteractuando en este sitio regulador novedoso. Los compuestos que modulan la fuga protónica, según la presente, pueden ser probados ahora en presencia o ausencia de AMP. La carencia de un efecto aditivo indica que ei compuesto está actuando en este sitio novedoso. Los compuestos que activan esta fuga protónica novedosa, regulada por AMP, aumentarán la velocidad metabólica basal y, por consiguiente, pueden ser útiles para tratar la obesidad y las condiciones comórbidas relacionadas. Los compuestos que inhiben la fuga protónica regulada por AMP, novedosa, disminuirán la velocidad metabólica basal y, por consiguiente, pueden ser útiles para tratar caquexia y condiciones de pérdida de peso relacionadas. En un aspecto adicional, la presente invención provee un sitio regulador novedoso para una fuga protónica de la mitocondria, donde el sitio es activado por medio de monofosfato de adenosina (AMP). La presente invención provee un método de clasificación para la identificación de compuestos que modulan un sitio regulador sensible al AMP en la mitocondria, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mltocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir un índice de velocidad metabólica; y c) identificar compuestos que modulen la velocidad metabólica. De preferencia el método comprende adicionalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados con mitocondrias en presencia de AMP y medir un índice de velocidad metabólica; y b) comparar el índice de velocidad metabólica en presencia de AMP y en ausencia de AMP y, de esa manera, identificar los compuesto en los que no hay efecto aditivo sobre la velocidad metabólica, como compuestos que modulan el sitio regulador sensible a AMP. Se puede usar el método para identificar compuestos que son adecuados para uso en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo. Típicamente se usa el método para identificar compuestos que activen el sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, en cuyo caso, en el paso c), se identifica los compuestos que incrementan la velocidad metabólica. Dichos compuestos pueden ser útiles para tratar la obesidad y trastornos relacionados. Alternativamente se usa el método para identificar compuestos que inhiban el sitio regulador sensible a AMP, en cuyo caso, en el paso c) se identifica los compuestos que disminuyen la velocidad metabólica. Se puede usar dichos compuestos para tratar caquexia y trastornos relacionados. La presente invención provee también un método de clasificación para identificar compuestos que modulen un sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con la mitocondria, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir el potencial de membrana; y c) identificar los compuestos que cambien el potencial de membrana. De preferencia el método comprende adiclonalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados con mitocondrias aisladas, en presencia de AMP y medir el potencial de membrana; y b) comparar el potencial de membrana en presencia de AMP y en ausencia de AMP y, de esa manera, identificar los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre el potencial de membrana, como compuestos que modulan el sitio regulador sensible a AMP. Típicamente se usa el método para identificar compuestos que activen un sitio regulador sensible a AMP en las mitocondrias, en cuyo caso, en el paso c), se identifica los compuestos que disminuyan el potencial de membrana. Dichos compuestos pueden ser útiles para tratar obesidad y condiciones relacionadas. Alternativamente se usa el método para identificar compuestos que inhiban el sitio regulador sensible a AMP, en cuyo caso, en el paso c), se identifica los compuestos que aumenten el potencial de membrana, bichos compuestos pueden ser útiles para tratar caquexia y condiciones relacionadas. La presente invención provee también un método de clasificación para identificar compuestos que modulen un sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias en presencia de un substrato para respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir la velocidad metabólica y medir el potencial de membrana; y c) identificar los compuestos que cambien la velocidad metabólica y que cambien el potencial de membrana. De preferencia el método comprende adicionalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados con las mitocondrias, en presencia de AMP, y medir la velocidad metabólica y medir el potencial de membrana; y b) comparar la velocidad metabólica y el potencial de membrana en presencia de AMP y en ausencia de AMP y, de tal manera, identificar los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre la velocidad metabólica y el potencial de membrana, como los compuestos que activen el sitio regulador, sensible a AMP. Típicamente el método es usado para identificar los compuestos que activan un sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, en cuyo caso, en el paso c), se identifica los compuestos que aumenten la velocidad metabólica y que disminuyan el potencial de membrana. Dichos compuestos pueden ser útiles I para tratar la obesidad y condiciones relacionadas. En una modalidad de la presente invención se provee un método de clasificación para la identificación de compuestos que activen el sitio regulador sensible a AMP en las mltocondrias, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir el consumo de oxígeno; y c) identificar los compuestos que aumenten el consumo de oxígeno. De preferencia el método comprende adicionalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados, con mitocondrias, en presencia de AMP, y medir el consumo de oxígeno; y b) comparar el consumo de oxígeno, en presencia de AMP y en ausencia de AMP, y de esa manera identificar los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre el consumo de oxígeno, como compuestos que activan el sitio regulador sensible a AMP. La presente invención provee también un método de clasificación para identificar compuestos que activen el sitio regulador sensible a AMP en las mitocondrias, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir el potencial de membrana; y c) identificar compuestos que disminuyan el potencial de membrana. De preferencia el método comprende adicionaimente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados con mitocondrias, en presencia de AMP y medir el potencial de membrana; y b) comparar el potencial de membrana en presencia de AMP y en ausencia de AMP y, de esa manera, identificar los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre el potencial de membrana, como compuestos que activan el sitio regulador sensible a AMP. La presente ¡nvención provee también un método de clasificación para identificar compuestos que activen un sitio regulador sensible a AMP, en las mltocondrias, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mltocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir el consumo de oxígeno y medir el potencial de membrana; y c) identificar los compuestos que aumenten el consumo de oxígeno y que disminuyan ei potencial de membrana. De preferencia el método comprende adicionalmente los pasos de: a)poner en contacto los compuestos identificados, con mitocondrias, en presencia de AMP, y medir el consumo de oxígeno y medir el potencial de membrana; y b) comparar el consumo de oxígeno y el potencial de membrana, en presencia de AMP y en ausencia de AMP, e identificar de esa manera los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre el consumo de oxígeno y el potencial de membrana, como compuestos que activan el sitio regulador sensible a AMP. Alternativamente se usa el método para identificar compuestos que inhiban un sitio regulador sensible a AMP en las mltocondrias, en cuyo caso, en el paso c), se identifica los compuestos que disminuyen la velocidad metabólica y que aumentan el potencial de membrana. Dichos compuestos pueden ser útiles para tratar caquexia y condiciones relacionadas. Adecuadamente, las mitocondrias son mitocondrias aisladas o están presentes en células intactas. De preferencia las mitocondrias son mitocondrias de músculo esqueletal aisladas. Es más preferible que las mitocondrias sean mitocondrias de músculo esqueletal de rata, aisladas. Se prefiere que estén presentes las mitocondrias en células eucarióticas intactas, o que estén presentes en cortes de tejidos de origen mamífero o en líneas de células de origen mamífero. A menos que el contexto lo indique de otra manera, cuando se usa el término "mitocondria" o su plural en relación con un método de clasificación de la invención, el término incluye también cualquier parte adecuada o cualquier derivado de las mitocondrias. Por "parte adecuada o derivado de mitocondrias" se quiere decir cualquier parte o su derivado que contenga el sitio regulador sensible a AMP, y que experimente metabolismo que pueda ser medido como se describe aquí, y que tenga un potencial de membrana que pueda ser medido. Una parte adecuada o derivado de las mitocondrias incluye las vesículas submitocóndrica y también pueden incluir la reconstitución de componentes purificados (como el ANC), en sistemas de membrana artificial. Hay una variedad de métodos, bien conocidos en la técnica, tanto para preparar estas vesículas como para analizar su actividad de transporte posteriormente (por ejemplo, Methods of Enzymology, tomo LV, 1979; Bioenergetics: Oxidative Phosporylation, ed. S. Fleisher y L. Packer). En particular las vesículas de membrana incluyen las vesículas de la membrana mltocóndrica interna. A menos que el contexto lo Indique de otra manera, cuando se usa el término "potencial de membrana" en relación con un método de clasificación de ia invención, el término incluye también el gradiente de pH, que es el otro componente de la fuerza motriz protónica. Así pues, en los métodos de clasificación relevantes, se puede medir el gradiente de pH en lugar de, o además de, el potencial de membrana. Se prefiere medir el potencial de membrana. Se puede usar cualquier substrato para respiración. De preferencia el substrato para la respiración es una sal succinato, una sal glutamato o una sal malato, por ejemplo, como sal de potasio o como sal de sodio. Es más preferible que el substrato sea una sal succinato, por ejemplo, succinato de potasio o succlnato de sodio. Se prefiere llevar a cabo el método de clasificación en presencia de un inhibidor del uso de otros substratos endógenos (un inhibidor de complejo 1). Cuando se emplea una sal succinato, se lleva a cabo de preferencia el método de clasificación en presencia del inhibidor de complejo 1 rotenona, para inhibir la utilización de otros substratos endógenos. Se prefiere llevar a cabo el método de clasificación en concentraciones variables de un inhibidor del transporte de electrones. Más preferible, se selecciona el inhibidor de transporte de electrones de una sal malonato, mixotiazol o una sal cianuro. Muy preferible el inhibidor del transporte de electrones es una sal malonato, por ejemplo, la sal de sodio o de potasio. Adecuadamente se puede usar cualquier indicador de la velocidad metabólica, conocido por los expertos en la materia. Se prefiere seleccionar el índice de velocidad metabólica de los siguientes: velocidad de crecimiento de célula, consumo de oxígeno; producción de calor, producción de radical libre, producción de lactato, utilización de glucosa o emisión de dióxido de carbono [Los procedimientos experimentales para medir estos índices de velocidad metabólica se encuentran en Obesity, editores P. Bjorntorp y B. N. Brodoff, publicado por J. B. Lippincott Company, 1992, capítulo 8 The Biochemistry of Energy Expenditure, por J. P. Flatt y las referencias citadas allí]. Se prefiere más que el índice de la velocidad metabólica sea el consumo de oxígeno. Cuando se está midiendo el potencial de membrana, el método de clasificación de preferencia es efectuado en presencia de un cambiador de protón/potasio, por ejemplo, nigericina, para reducir al mínimo el gradiente de pH. Se prefiere medir el potencial de membrana usando: a) electrodos selectivos al ion para catión metiltrifenilfosfonio (TPMP) (o catión tetrafenilfosfonio (TPP)), donde se ha añadido TPMP (o TPP) al sistema de prueba; b) usando tintes con potencial de membrana fluorescentes, donde los cambios en el potencial de membrana son medidos mediante un fluorímetro que registra los cambios en la respuesta fluorescente debidos a la división; o c) TPMP o TPP radiomarcados. Un tinte adecuado es (dimetil(am¡noestirll)-1-metllpiridinio (DSMP)), que puede ser usado para medir el potencial de membrana tanto en células intactas como en mitocondrias aisladas. Se puede medir el gradiente de pH usando métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo: a) electrodos para pH; b) tintes fluorescentes; o c) sondas radiomarcadas. Es preferible que se lleve a cabo las mediciones del consumo de oxígeno y/o el potencial de membrana en presencia de un inhibidor de la síntesis de ATP, por ejemplo, oligomicina. Se prefiere medir el consumo de oxígeno usando un electrodo para oxígeno. Se usa aquí el término sistema regulador para significar un sistema capaz de soportar las mitocondrias, y comprende un agente reguiador, por ejemplo, HEPES, y un protector osmótico, por ejemplo, KCl. El sistema regulador opcionalmente comprende además un agente quelatador, por ejemplo, EGTA; y/o un fosfato inorgánicos, por ejemplo, fosfato diácido de potasio, y/o un depurador de ácido graso libre, por ejemplo, BSA desgrasado. Se puede usar los métodos de clasificación mencionados arriba, de la presente ¡nvención, para identificar compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de un trastorno en el peso del cuerpo. En particular se puede usar los métodos que identifican los compuestos que activen un sitio regulador sensible a AMP, en la mitocondria, para identificar compuestos que son adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y de trastornos relacionados. Los métodos que identifican compuestos que inhiben un sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, pueden ser usados para identificar compuestos que sean adecuados en el tratamiento de caquexia y de trastornos relacionados. De preferencia, en los métodos de la invención, es probable que los compuestos con un perfil de actividad indeseable, y que disminuyen el potencial de membrana y disminuyen la velocidad metabólica (por ejemplo, el consumo de oxígeno), sean venenos metabólicos, y son desechados. Además, los estimuladores de la respiración aumentarían el potencial de membrana y aumentarían la velocidad metabólica (por ejemplo, el consumo de oxígeno), y también son desechados. Los compuestos pueden no ser útiles si activan el poro de transición de la permeabilidad mitocóndrica o si inhiben la actividad de cambio ADP/ATP del ANC. Se puede analizar el efecto de los compuestos sobre la actividad de cambio de ADP/ATP del ANC usando los métodos descritos en M. Stubbs Inhibitors of the adenina nucleotide translocase, 1979, Pharmac. Ther., 7:329-349. La investigación ulterior ha mostrado que este efecto en el AMP es antagonizado por los inhibidores y los substratos del portador de nucleótido de adenina (ANC), lo que sugiere que el ANC es el mediador molecular de este efecto en el AMP. El portador de nucleótido de adenina (ANC) mitocóndrico es un eslabón clave en la función oxidante de los organismos, ya que cambia el ATP generado dentro de la mitocondria por ADP en el citosol (resumido por C. Fiore y coautores, 1998, Biochimie 80: 137-150). La inhibición de determinados agentes (tales como atractilato y boncrecato) bloquea esta función, previene el metabolismo aeróbico y, a dosis mayores, provoca la muerte, que es el resultado de la imposibilidad de que la mitocondria genere ATP. El análisis genético indica que hay tres isoformas de ANC, sumamente conservadas, codificadas por tres diferentes genes en los mamíferos, denominados ANC1, 2 y 3, respectivamente. En las especies de mamíferos parece que ANC2 es la isoforma clave, ya que es expresada de manera ubicua en todos los tejidos, y se induce la expresión en cantidades variables, dependiendo de la actividad I respiratoria del tejido. En contraste, ANC1 es expresado en cantidades muy altas, predominantemente en el corazón y en el músculo esqueletal y los datos de exterminación genética (B. H. Graham y coautores, Nature Genetics, 1997, 16: 226-234) indican que esta isoforma es importante para el metabolismo aeróbico en estos tejidos únicamente. ANC3, por otra parte, es expresado únicamente a niveles muy bajos en algunos tejidos (si acaso) y parecería tener poca relevancia funcional. Los organismos inferiores (incluyendo los insectos, las levaduras y las plantas) también tienen requerimiento de ANC y tienen tres isoformas, aunque de menor homología. El ANC es miembro de la familia bien caracterizada de transportadores mitocóndricos, todos los cuales tienen pesos moleculares aproximados a los 32,000 Da. Se ha aclarado recientemente que, por lo menos in vitro, ANC tiene otras actividades, que comprenden el flujo iónico, además de la reacción de intercambio ADP/ATP. La evidencia que usa ANC purificado, reconstituido, sugiere ahora que esta proteína también es un componente clave del poro de transición de la permeabilidad mitocóndrica, que se activa en la apoptosis (N. Brustovetsky y M. Kllngenber, 1996, Biochemistry 35: 8483-8488). Se activa esta abertura de poro de permeabilidad por medio del actractilato y es inhibida por el ácido boncréquico (ambos, Inhibidores del cambio ADP/ATP). La evidencia sugiere también que esa proteína está incluida, por lo menos en parte, en los efectos de desacoplamiento observados, de los ácidos grasos, al actuar como un poro para el ácido ionizado (resumido por V. Skulachev, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1363:100-124). Estos datos sugieren que, por lo menos bajo ciertas circunstancias, el ANC comparte cierta actividad con las proteínas desacopladoras relacionadas. No hay enseñanzas ni sugerencias en la técnica anterior de que el ANC esté implicado en la obesidad. En la actualidad el ANC no ha representado un blanco farmacológico potencial para estimular la velocidad metabólica, como el poro de permeabilidad o el desacoplamiento mediado por ácido graso no está a disposición para manipulación farmacológica (toxicidad y actividad no específica, respectivamente). Esta es la primera demostración de que la activación específica de la actividad de desacoplamiento el ANC es posible. Ya que ia activación de esta actividad de desacoplamlento se manifiesta como un aumento sustancial en la fuga protónica, este mecanismo puede ser usado para aumentar la velocidad metabólica basal para el tratamiento de la obesidad y de la diabetes, y de condiciones relacionadas. En otro aspecto, la presente invención provee un sitio regulador novedoso sobre el portador de nucleótido de adenina, que es regulado por AMP, y que activa una fuga protónica novedosa. En un aspecto preferido, este sitio regulador novedoso está presente en ANC1. Además, la presente invención también provee el uso de este sitio regulador novedoso en la identificación de compuestos que son útiles en el tratamiento de trastornos de peso del cuerpo, tales como la obesidad, y de condiciones relacionadas; y de caquexia. En otro aspecto adicional, ia presente invención provee un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo; comprendiendo el método el paso de identificar un compuesto que se una selectivamente a ANC. En una modalidad, el compuesto disminuye la actividad de fuga protónica del ANC. Por ejemplo, se puede unir el compuesto de manera sustancialmente reversible o sustancialmente irreversible al sitio activo del ANC. En otra modalidad, se puede unir el compuesto a una porción del ANC que no sea el sitio activo, a fin de que interfiera con la unión del ANC a su substrato. En otra modalidad adicional más, el compuesto puede unirse a una porción de ANC, a fin de disminuir la actividad del ANC mediante un efecto alostérico. La invención provee un método de clasificación para la identificación de compuestos que sean útiles en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas; comprendiendo el método el paso de identificar un agonista del efecto AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC. La invención provee también un método de discriminación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de la caquexia y de condiciones relacionadas, comprendiendo el método el paso de identificar un antagonista del efecto AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC. En un aspecto adicional más, la presente invención provee un análisis de unión para identificar compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas, que comprende los pasos de: a) Incubar una preparación que contiene ANC con un ligando marcado, para producir una preparación que contiene ANC marcado; b) poner en contacto un compuesto de prueba con la preparación que contiene ANC marcado; y c) identificar un compuesto que reduzca la cantidad de ligando marcado, presente en la preparación que contiene ANC, como un compuesto que puede ser adecuado para uso en el tratamiento de la obesidad. En un aspecto adicional, la presente invención provee un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo; comprendiendo el método el paso de identificar un compuesto que module la fuga protónica mitocóndrlca por medio de un ANC. En otro aspecto más, el método presente provee también un método de clasificación funcional para identificar compuestos que modulen la fuga protónica mitocóndrlca, mediada por un ANC, que comprende los pasos de: a) incubar un compuesto de prueba con células que contienen un ANC y medir un índice de velocidad metabólica y/o el potencial de membrana; b) incubar un compuesto de prueba con células de control, en el que el ANC usado en el paso a) está ausente o está presente a niveles menores que en el paso a), y medir un índice de velocidad metabólica y/o potencial de membrana; y c) identificar un compuesto que dé lugar a una velocidad metabólica diferente y/o un potencial de membrana diferente en el paso a), en comparación con el paso b), como un compuesto que modula la fuga protónica mitocóndrica, mediada por un ANC. Es preferible que las células de control no muestren efecto AMP. Típicamente se identifica un compuesto que dé lugar a una velocidad metabóiica incrementada y/o un potencial de membrana disminuido, en el paso c), como un compuesto que mejora la fuga protónica mediada por ANC. Alternativamente se identifica un compuesto que da lugar a una velocidad metabólica disminuida o un potencial de membrana incrementado, como compuesto que reduce la fuga protónica mediada por un ANC. Los compuestos identificados como moduladores de la fuga protónica mediada por un ANC pueden ser útiles para tratar trastornos de peso del cuerpo. Los compuestos identificados como mejoradores de la fuga protónica pueden ser útiles en el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados, mientras que los compuestos identificados como reductores de la fuga protónica pueden ser útiles para tratar la caquexia y trastornos relacionados.

Adecuadamente la preparación que contiene ANC comprende uno de los siguientes: a) preparaciones de tejido intacto, por ejemplo, preparaciones de tejido de mamífero, por ejemplo, tejido del músculo esqueletal o tejido cardiaco de humano, bovino o roedor; b) líneas de células, procedentes de una fuente de músculo esqueletar, por ejemplo, células C2C12, G7, G8 o L7 de ratón, células L6 o L8 de rata, o SJCRH30 humanas; o procedentes de una fuente cardiaca, por ejemplo, células H9c2 (2-1) de rata, o del tejido del músculo liso aórtico, por ejemplo, A7r5 de rata o T/G HA-VSMA humanas; c) células (por ejemplo, células de levadura) en las que se ha introducido ANC por medios genéticos; d) células aisladas de tejidos, por ejemplo, de tejidos cardiaco o de músculo esqueletal; e) membranas; f) mitocondrias; g) membranas mitocóndricas; o h) ANC aislado, de preferencia en forma purificada. Se prefiere preparar la preparación que contiene ANC usando técnicas de clonación de genes. Usando técnicas de transfección, se puede introducir la secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de ANC que modula la fuga protónica mitocóndrica mediada por ANC, en un anfitrión celular, por ejemplo, una línea de células de mamífero o en células de levadura, para incrementar el nivel de la actividad de ANC (regulación ascendente), o bien para introducir una isoforma de ANC que no estaba presente inicialmente, usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Luego se puede aislar una preparación que contiene ANC, de estas células. Alternativamente se puede emplear otros medios para incrementar la cantidad de ANC. Se puede someter a los animales a un tratamiento farmacológico, por ejemplo, con hormonas tiroides, por ejemplo, T3 o T4, o tensión ambiental, por ejemplo, calor o frío, o sobrealimentación, antes de la eliminación de la preparación que contiene ANC. Se puede recoger la preparación que contiene ANC de cepas genéticamente modificadas de animales, por ejemplo, de ratones ob/ob, ratas Zucker, y de cepas en las que ciertos genes y ciertas proteínas han sido inactivados por medios genéricos, incluyendo omisiones de genes mitocóndricos. Alternativamente, se puede tratar las células con suero de crecimiento alterado o con agentes farmacológicos, por ejemplo, con hormonas tiroides, por ejemplo, T3 o T . Se prefiere que la preparación que contiene ANC sea una línea de células o una preparación de membrana a partir de una línea de células o de tejidos. Se prefiere más que la preparación que contiene ANC sea una línea de células que ha sido regulada de manera ascendente opcionalmente. De manera adecuada las células que contienen un ANC incluyen, pero sin limitación a ellas: a) líneas de células procedentes de una fuente de músculo esqueletar, por ejemplo, las células C2C12, G7, G8 o L7 de ratón; las células L6 o L8 de rata, o SJCRH30 humanas; o procedentes de una fuente cardiaca, por ejemplo, células H9c2 (2-1) de rata, o de una fuente de músculo liso aórtico, por ejemplo, A7r5 de rata o T/G HA-VSMA humanas; b) células (por ejemplo, células de levadura) en las que se ha introducido ANC por medios genéticos; c) células aisladas de tejidos, por ejemplo, de tejidos del músculo cardiaco o esqueletal, o d) mitocondrias aisladas de a), b) o c) señaladas inmediatamente arriba. Las células que contienen un ANC de preferencia son reguladas de manera ascendente en forma similar a la descrita antes para la preparación que contiene ANC. Quienes sean expertos en la materia entenderán que las células de control de preferencia son de la misma fuente que las células de prueba. Adecuadamente, la preparación que contiene ANC comprende ANC1, ANC2 o ANC3, o mezclas de ellos. Se prefiere que la preparación que contiene ANC comprenda ANC1. Adecuadamente el ligando marcado es un compuesto que interactúa con el ANC que ha sido radiomarcado o marcado de manera fluorescente, mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, o un compuesto que es un inhibidor de ANC como resultado de la marcación fluorescente. Los inhibidores adecuados de la actividad de cambio ATP/ADP del ANC, como resultado del mareaje fluorescente, incluyen, pero sin limitación a ellos, los siguientes: ATP, ADP o AMP, marcados de manera fluorescente. Los substratos adecuados para ANC, que pueden ser radiomarcados o marcados de manera fluorescente incluyen, pero sin limitación a ellos, los siguientes: ADP o ATP. Se prefiere que el ligando marcado sea atractilato radiomarcado o marcado de manera fluorescente, o ATP o ADP marcados de manera fluorescente. Se prefiere más que el ligando marcado sea atractilato radiomarcado o marcado de manera fluorescente. Lo que más se prefiere es el ligando marcado atractilato radiomarcado. Quienes sean expertos en la materia entenderán que, cuando el ligando está radiomarcado, se requiere de un paso adicional de filtración o centrifugación, o de un paso de lavado, para eliminar la etiqueta no unida. Quienes sean expertos en la materia entenderán que puede ser necesario el tratamiento previo de las células usadas en el análisis de unión, para facilitar la permeabilidad de las células al ligando marcado, por ejemplo, un tratamiento previo con detergente. Este método de clasificación tiene la ventaja de que puede ser usado en análisis de clasificación de elevada producción, para probar grandes cantidades de compuestos de manera rápida y, por lo tanto, identificar compuestos que pueden ser adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas. El término "condiciones comórbidas asociadas", cuando es usado en este documento, significa condiciones médicas conocidas por los expertos en la materia, que están asociadas con los trastornos del peso del cuerpo. El término incluye, pero sin limitación a ellos, los siguientes: diabetes, incluyendo diabetes mellitus no dependiente de la insulina, tolerancia a la glucosa dañada, síndromes de lípido, caquexia, hiperglicemia e hiperlipldemia; niveles elevados de ácido úrico y niveles de lípidos, en mamíferos, particularmente en humanos. Además, la presente ¡nvención puede ser útil para identificar compuestos para el tratamiento o prevención de trastornos metabólicos y de condiciones que surgen de ellas, por ejemplo, incrementadas por termogénesis de la actividad de ejercicio, y velocidad metabólica incrementada, aumento de peso asociado con el tratamiento con fármacos; osteoartritis y gota; cánceres asociados con aumento de peso, disfunción menstrual o cálculos vesiculares. La presente invención puede ser útil para identificar compuestos para prevenir enfermedades cardiovasculares, ayudar a perder peso después del embarazo y para ayudar a perder peso después de haber dejado de fumar. Se usa la caquexia para denotar un estado de trastorno constitucional, desnutrición y estado general de enfermedad-salud. Los principales signos de esta condición son: enflaquecimiento del cuerpo, piel lívida no sana y ojos fuertemente carentes brillo. Los ejemplos específicos incluyen, pero sin limitación a ellos: caquexia inducida por cáncer y por SIDA. Quienes sean expertos en la materia entenderán que el ANC aislado, usado, puede ser proteína purificada o proteína recombinante, obtenida por métodos conocidos por los expertos en la materia, y como se describe más adelante. Además, se puede reconstituir el ANC purificado, en estructuras de membrana artificial (por ejemplo, liposomas) para caracterizar adicionalmente su función y su regulación. Se puede desarrollar métodos de análisis mejorados para ANC. Por ejemplo, se puede identificar la estructura tridimensional de los sitios activos de la proteína mediante cristalografía, lo que aumentará el conocimiento de la estructura y de la función. Se puede usar la creación de modelos en computadora para identificar compuestos que sea probable que interactúen en estos sitios activos y, por consiguiente, aumenten las probabilidades de identificar los compuestos que tienen propiedades terapéuticas útiles. Se podría desarrollar un análisis específico para identificar compuestos que interactúan en estos sitios activos. Se prefiere que un compuesto seleccionado por cualquiera de los métodos de clasificación mencionados arriba o cualquiera de los análisis de la invención, como adecuado para el tratamiento de la obesidad o de una condición relacionada, es clasificado en una clasificación adicional por su adecuación para tratar la obesidad o una condición relacionada. En particular se prefiere que se clasifique el compuesto en un modelo animal de obesidad, y que se seleccione los compuestos que tengan un efecto deseado en este modelo (por ejemplo, que demuestren reducir o prevenir la obesidad en un grado útil) para estudio ulterior o para uso en el tratamiento. En particular se prefiere que el compuesto sea clasificado en un modelo animal usado para medir la velocidad metabólica basal (I. Connoley y coautores, 1999, Br. J. Pharmacol, 126: 1487-1495), y que los compuestos que tengan un efecto deseado en este modelo (Incrementado para la obesidad y disminuido para la caquexia) sean seleccionados para estudio adicional.

De manera similar, se prefiere que un compuesto seleccionado por cualquiera de los métodos de clasificación mencionados más atrás y de los análisis de la ¡nvención, como adecuado para el tratamiento de la caquexia, sea clasificado en una clasificación adicional por su adecuación para tratar la caquexia. En particular, se prefiere que el compuesto sea clasificado en un modelo animal de caquexia, y que se seleccione los compuestos que tengan un efecto deseado en este modelo (por ejemplo, se demuestra que reducen o que previenen la caquexia en un grado útil), para estudio ulterior o para uso en el tratamiento. Se apreciará que en los métodos descritos aquí, que pueden ser métodos para clasificar un fármaco, un término bien conocido por los expertos en la materia, el compuesto seleccionado puede ser un compuesto parecido a fármaco o un compuesto que conduzca al desarrollo de un compuesto parecido a fármaco. El término "compuesto parecido a fármaco" es bien conocido por los expertos en la materia, y puede incluir el significado de un compuesto que tiene características que lo hacen adecuado para uso en medicina, por ejemplo, como ingrediente activo en un medicamento. Así, por ejemplo, un compuesto parecido a fármaco puede ser una molécula que puede ser sintetizada por las técnicas de la química orgánica; de manera menos preferible, mediante técnicas de biología molecular o de bioquímicas, y de preferencia es una molécula pequeña, que puede tener menos de 5000 dalton y que puede ser soluble en agua. Un compuesto parecido a fármaco puede exhibir adicionalmente aspectos de interacción selectiva con una proteína particular o proteínas particulares, y puede estar biodisponible y/o ser capaz de penetrar en las membranas celulares a que se destina; pero se apreciará que estos aspectos no son esenciales. El término "compuesto que conduce a", o "compuesto conductor" también es bien conocido por los expertos en la materia y puede incluir el significado de que el compuesto, si bien no es adecuado en sí mismo para uso como fármaco (por ejemplo, debido a que sólo es débilmente potente contra su destino pretendido, no es selectivo en su acción, es inestable, es escasamente soluble, es difícil de sintetizar o tiene mala biodisponibilidad) puede proveer un punto de partida para el diseño de otros compuestos que pueden tener características más convenientes. Se apreciará que los métodos de clasificación y los análisis de la invención pueden identificar compuestos conductores. Un aspecto adicional de la ¡nvención provee un compuesto ¡dentificable o identificado en un método de clasificación o análisis de la invención. Otro aspecto adicional provee el compuesto para uso en medicina, es decir, empacado y presentado para uso en medicina. El compuesto puede ser útil para tratar un trastorno del peso del cuerpo y así, un aspecto adicional de la ¡nvención provee un método para tratar un trastorno del peso del cuerpo en un paciente; comprendiendo el método administrar al paciente un compuesto identificable o identificado en los métodos de clasificación o análisis de la ¡nvención. La ¡nvención provee también el uso de un compuesto identificable o identificado en los métodos de clasificación o análisis de la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno del peso del cuerpo. Los compuestos que están identificados o son identificables en las clasificaciones o los análisis, que son útiles para encontrar compuestos para tratar la obesidad (como se detalló más atrás) son usados en el método para tratar la obesidad o condiciones relacionadas. Los compuestos que son identificados o identificables en las clasificaciones o los análisis, que son útiles para encontrar compuestos para tratar la caquexia (como se detalló más atrás) son usados en el método para tratar la caquexia o las condiciones relacionadas. Otro aspecto de la invención provee un método para tratar un paciente con obesidad, o con una condición comórbida relacionada; comprendiendo el método administrar al paciente un agonista del sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, o un agonista del efecto de AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC. Otro aspecto más de la invención provee el uso de un agonista de un sitio regulador sensible a AMP, en la mitocondria, o un agonista del efecto de AMPO sobre la fuga protónica mediada por ANC, en la fabricación de un medicamento para tratar la obesidad, o una condición comórbida relacionada. Se ha descubierto que tres análogos de AMP, a saber: el 5'-monofosfato de 6-cloropurinarribosida, el 5'-monofosfato de cordeclpin y el 5'-monofosfato de xantosina, demostraron actividad importante en la disminución del potencial de membrana y, por lo tanto, tienen uso potencial en el tratamiento de la obesidad y de condiciones comórbidas relacionadas. En otro aspecto de la presente invención se provee un método para tratar un paciente con obesidad o con una condición comórbida relacionada; comprendiendo el método administrar ai paciente un agonista de un sitio regulador sensible a AMP, en la mitocondria, o un agonista del efecto de AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC. En otro aspecto más, la presente invención provee el uso de un agonista de un sitio regulador sensible a AMP en la mltocondria, o un agonista del efecto de AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC en la fabricación de un medicamento para tratar la obesidad o una condición comórbida relacionada. En otro aspecto, la presente invención provee una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP En otro aspecto más, la presente ¡nvención provee métodos para identificar esa proteína o esas proteínas. El término "involucrado en" cubre las proteínas sobre las cuales el AMP tiene una acción directa y que afecta directamente la fuga protónica y las proteínas que ¡nteractúan con AMP y luego afectan la fuga protónica por medios indirectos. Un primer método para identificar una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada comprende los pasos de: a) poner en contacto AMP o un análogo del mismo con la mitocondria, en presencia de un sustrato para respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir el consumo de oxígeno y/o el potencial de membrana; c) poner en contacto AMP o un análogo del mismo con la mitocondria, en presencia de un sustrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador, en presencia de un inhibidor específico conocido de una proteína mitocóndrica; d) medir el consumo de oxígeno y/o el potencial de membrana; e) identificar una proteína cuyo inhibidor reduzca el incremento en el consumo de oxígeno y/o la disminución en el potencial de membrana provocado por AMP, como una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP. El término "un análogo del mismo" significa un compuesto que tiene un efecto sobre la fuga protónica similar al de AMP, o que tenga mayor afinidad. Quienes sean expertos en la materia entenderán que se requiere de experimentos de control necesarios para validar este método. Por ejemplo, sería conveniente incubar la mitocondria con el inhibidor de proteína específica para garantizar que no hubiera ningún efecto directo del Inhibidor de proteína sobre la fuga protónica. Sería conveniente también incubar la mitocondria en el sistema regulador, como controlador. Un segundo método para identificar una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP comprende los pasos de: a) poner en contacto AMP o un análogo del mismo, con la mitocondria de una composición de proteína modificada, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) comparar el efecto de AMP o un análogo de gran afinidad sobre el consumo de oxígeno y/o el potencial de membrana sobre la mitocondria, con una composición de proteína modificada, con mitocondria de control; c) identificar las modificaciones en la composición de proteína que afectan el incremento en el consumo de oxígeno y/o la disminución en el potencial de membrana, provocado por AMP y, por consiguiente, identificar la(s) proteina(s) correspondiente(s) que está(n) ¡nvolucrada(s) en la fuga protónica activada por AMP. Se puede obtener la mitocondria de composición proteínica modificada mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, se puede recoger la mltocondria de animales que han sido sometidos a tensión, por ejemplo, por exceso de alimentación, por alimentación Insuficiente, por calor, frío, movimiento restringido, etc., o cuyo ambiente ha sido manipulado de otra manera. Alternativamente, se puede usar la dosificación de animales con agentes farmacológicos para alterar la composición proteínica de la mitocondria. Alternativamente se puede recoger la mitocondria de razas modificadas genéticamente de animales, por ejemplo, ratones ob/ob, ratas Zucker y razas en las que ciertos genes y proteínas han sido inactivados por medios genéticos, incluyendo omisiones de genes mitocóndricos. Un tercer método para identificar una proteína que está Involucrada en la fuga protónica activada por AMP comprende los pasos de: a) extraer las proteínas de la mitocondria y separar y purificar esas proteínas por medio de métodos conocidos por los expertos en la materia; b) incubara las proteínas separadas con un AMP fluorescente, radíomarcado o marcado de otra manera, o un análogo del mismo, en un análisis de unión adecuado, usando métodos conocidos por los expertos en la materia; c) Identificar aquellas proteínas puras que se unen a AMP marcado o su análogo, como proteínas involucradas en la fuga protónica activada por AMP; y d) secuenciar parcialmente la proteína purificada y usar técnicas conocidas por los expertos en la materia, para construir sondas que permitan la identificación del gene. Un cuarto método para identificar una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP comprende los pasos de: a) extraer las proteínas de la mitocondria e incubarlas con una versión de AMP o su análogo, marcada por fotoafinidad, usando métodos conocidos para los expertos en la material, para marcar proteínas; b) extraer posteriormente, aislar y purificar esas proteínas, mediante métodos conocidos por los expertos en la materia; c) identificar la estructura de esas proteínas; y d) identificar esas proteínas como proteínas involucradas en la fuga protónica activada por AMP; y e) secuenciar parcialmente la proteína purificada y usar técnicas conocidas por los expertos en la materia para construir sondas que permitan identificar el gene. Un método preferido para purificar una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP comprende hacer pasar las proteínas extraídas, obtenidas como se describió previamente, a través de una columna que contiene AMP inmovilizado o un análogo del mismo. En otro aspecto, la presente invención provee un método de clasificación para la identificación de compuestos que activen un sitio regulador sensible a AMP, en la mitocondrla, que comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP, en un análisis de unión de proteína, e identificar los compuestos que tengan elevada afinidad de unión como los compuestos que activan un sitio regulador sensible a AMP, en la mltocondria. Quienes sean expertos en la materia entenderán que la proteína usada puede ser proteína purificada o proteína recombinante obtenida mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, como se describe más adelante. Una vez que se ha identificado la proteína, se puede desarrollar métodos de análisis mejorados. Por ejemplo, se puede identificar la estructura tridimensional de los sitios activos de la proteína mediante cristalografía, lo que aumentará el conocimiento de la estructura y de la función. Se puede usar la creación de modelos en computadora para identificar los compuestos que probablemente interactúen con esos sitios activos y, por lo tanto, incrementen las probabilidades de identificar compuestos que tengan propiedades terapéuticas útiles. Se podría desarrollar un análisis específico para identificar compuestos que interactúen en esos sitios activos. Además, la proteína de destino puede ser reconstituida en estructuras de membrana artificial (por ejemplo, liposomas) para caracterizar adiclonalmente la función y su regulación. En otro aspecto de la presente invención provee un gene que expresa una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP. En otro aspecto la presente ¡nvención provee un método para identificar este gene. Un método para identificar un gene que exprese una proteína que está involucrada en la fuga protónica activada por AMP, que comprende los pasos de: a) buscar bases de datos genómicos e identificar genes que tengan un dominio de unión a AMP; b) expresar esos genes en las células; c) aislar la mitocondria de dichas células; y d) determinar qué mitocondrias tienen una respuesta alterada a AMP (cuando se las compara con el control) y por tanto, determinar cuáles de estos genes son responsables de la fuga protónica activada por AMP. Una vez que se ha identificado el gene, se puede desarrollar métodos de análisis mejorados, de la siguiente manera.

En primer lugar se puede utilizar un método de análisis en el que, una vez que se ha identificado una región promotora del gene, mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, el gene puede ser regulado de manera ascendente para producir proteína adicional en una célula de destino, incrementando así la sensibilidad del análisis. En otras palabras, se puede expresar en exceso la proteína en un sistema de expresión adecuado, como los conocidos por los expertos en la materia. En segundo lugar, se puede generar la fuga protónica regulada por AMP en las células, que normalmente no la tengan, y se puede usar dichas células en el análisis de clasificación. En un aspecto adicional, la presente invención provee un sitio regulador para una fuga protónica mitocóndrica, donde el sitio está activado por monofosfato de adenosina (AMP).

En otro aspecto, la presente ¡nvención provee el gene identificado por los métodos anteriores. En otro aspecto, la presente invención provee la proteína que actúa como un sitio regulador para una fuga protónica mitocóndrica, donde el sitio es activado por AMP. En otro aspecto más, ia presente invención provee la proteína identificada por los métodos identificados antes.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Se estudió el efecto de la adenoslna, los monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de adenosina, guanosina, citidina, timidina y urídína, a una concentración de 1 mM, sobre la velocidad de respiración en estado 4 (definido más abajo) y ia fuga protónica de la mitocondria del músculo esqueletal de rata.

AISLAMIENTO DE LA MITOCONDRIA DEL MÚSCULO ESQUELETAL Se mató ratas Wlstar hembras (de 4 a 8 semanas de edad) aturdiéndolas, después sometiéndolas a dislocación cervical y se disecó inmediatamente el músculo esqueletal de los miembros delanteros, se pesó y se colocó en un vaso de precipitados previamente pesado, que contenía medio C-P 1 (0.1 M de KCl, 0.05 M de Tris-HCl, 2 mM de EGTA, pH 7.4). Se aisló las mitocondrias de acuerdo con los métodos de Chappell J. B. y Perry S. V. (1954) Nature (London) 173, 1094-1095 y Bhattacharya y coautores (1991) Anal. Biochem., 192, 344-349. En breve, se colocó el tejido en un mosaico de porcelana previamente enfriado y se desmenuzó con una cuchilla afilada. Se procesó el tejido y se lo lavó adicionalmente, triturando con unas tijeras afiladas y enjuagando con medio C-P 1 cuatro a cinco veces, luego se escurrió de medio y se dejó agitando en un vaso de precipitados sobre hielo que contiene medio C-P 2 (0.1 M de KCl, 0.05 M de Tris-HCl, 2 mM de EGTA, 1 mM de ATP, 5 mM de MgCI2, 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA, acrónimo por su designación en inglés: Bovine Serum Albumin) y 187 U de proteasa (nagarse)/g de tejido, pH 7.4), durante cuatro minutos. Se homogeneizó el tejido en el mismo medio, usando un homogeneizador de tejido Polytron. Se dejó agitando el tejido homogeneizado en el mismo medio, sobre hielo, durante otros seis minutos y luego se centrifugó a 490 g durante 10 minutos. Se filtró el sobrenadante a través de muselina y se centrifugó nuevamente a 10368 g durante 10 minutos. Se volvió a suspender las pellas mitocóndricas en C-P 1, se combinó y se volvió a centrifugar a 10368 g durante 10 minutos. Se efectuó una última centrifugación a 3841 g y finalmente se volvió a suspender la pella en aproximadamente 500 µl de C-P 1. Se determinó la concentración de proteína mediante el método de Biuret.

MEDICIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO Se midió la velocidad de respiración en ausencia de difosfato de adenosina (ADP) (estado 4) y en presencia de oligomicina (para inhibir cualquier síntesis de ATP) como indicador crudo de la conductancia de protón mitocóndrico. Se midió el consumo de oxígeno usando un electrodo para oxígeno del tipo Clark (Hansatech, Gran Bretaña) mantenido a 37°C. Antes de cualquier operación experimental, se comprueba rutinariamente la linealidad del electrodo para oxígeno, midiendo la velocidad desacoplada (es decir, la velocidad de respiración en presencia del desacoplador (FCCP a 0.2 µM) y se calibró el electrodo de oxígeno con el volumen apropiado de medio oxigenado (es decir, medio equilibrado con aire). Se supuso que la concentración de oxígeno del medio saturado con aire, a 37°C, era de 406 nmol/ml (Reynafarje B y coautores (1985), Anal. Biochem., 145, 406-418). Se midió el consumo de oxígeno en ausencia (estado 4) y en presencia (estado 3) de 250 µM de ADP. La razón de control respiratorio de la mltocondria del músculo esqueletal (consumo de oxígeno en estado 3/estado 4) fue aproximadamente 4.0, con succinato como substrato. Para las mediciones se añadió 0.5 mg de proteína mitocóndrica por ml de medio de análisis (120 mM de KCl, 5 mM de KH2P04, 3 mM de HEPES, 1 mM de EGTA y 0.3% de BSA desgrasado, pH 7.2) a la cámara de electrodo de oxígeno seguido por 5 µM de rotenona, 1 µg/ ml de oligomicina y 4 mM de succinato. Posteriormente se añadió monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridlna, a ia cámara de electrodo de oxígeno, a una concentración de 1 mM. Se llevó el pH de cada solución de nucleótido a 6-7, de manera que no ocurrió modificación en el pH de la mezcla de reacción después de su adición.

MEDICIÓN DE LA FUGA PROTÓNICA La velocidad a la que efectúan el ciclo los protones a través de la membrana interna mitocóndrica, que no contribuye a la síntesis de ATP por medio de fosforilación oxidante, está dada por la relación observada entre el potencial de membrana mitocóndrica y la velocidad de consumo de oxígeno durante la titulación con los inhibidores de cadena transportadora de electrones. Esta es una relación no lineal, que sugiere que la velocidad de disipación de la energía redox (reducción-oxidación) varía con el potencial de la membrana (Brown, G. C. y Brand M. D. (1991), Biochim. Biophys.

Acta, 1059, 55-62). Se determinó simultáneamente la velocidad de l respiración y el potencial de membrana mitocondrica usando electrodos para oxígeno y electrodos sensibles a la sonda TPMP + , dependiente del potencial; y se estableció la respuesta cinética de la fuga protónica a potencial durante las titulaciones del potencial con inhibidores del transporte de electrones (Brand, M. D. (1995) Bioenergetics. A Practical approach (Brown, G. C. y Cooper C. E., eds.), IRL Press, páginas 39-62). Para cada operación se añadió a la cámara de electrodo para oxígeno 0.5 mg de proteína mitocóndrica por ml de medio de análisis 8120 mM de KCl, 5 mM de KH2PQ4, 3 mM de HEPES, 1 mM de EGTA y 0.3% de BSA desgrasado, pH 7.2). Antes de las mediciones, se calibró el electrodo con adiciones secuenciales de hasta 2 µM de TPMP. Se añadió 5 µM de rotenona para prevenir la respiración en substratos endógenos enlazados a NAD. Se añadió 1 µg/ml de ATP-sintasa mitocóndrica, inhibida con oligomicina y 75 ng/ml de nigericina, para llevar la diferencia en el pH a través de la membrana mitocóndrica interna, casi a cero. Se usó 4 mM de succinato como substrato. Se efectuó secuencialmente las adiciones de malonato hasta de 2 mM. Al final de cada operación se añadió el FCCP de desacoplador a 0.2 µM, para disipar el potencial de membrana, de modo que se liberó el TPMP por la mítocondría nuevamente al medio. Se tomó la corrección de unión a TPMP para ei músculo esqueletal como 0.35 (µl/mg de proteína)"1 (Rolfe D. F. S. y coautores (1994) Giochim. Biophys Acta, 1118, 405-416). Se midió la actividad de fuga protónica de varios análogos de AMP, usando el tinte fluorescente sensible al potencial de membrana, DSMP.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE Mq2* LIBRE Se determinó la concentración de Mg2+ libre a partir del Mg2+ total en el medio de análisis. Se calculó las constantes de estabilidad aparente a partir de las constantes de estabilidad absolutas, tomadas de (Fablato A. y Fabiato A. (1979), J. Physiol.

Paris, 75, 463-505) a una temperatura y una concentración iónica precisas.

RESULTADOS En presencia de ollgomicina (para inhibir la ATP-sintasa), AMP estimuló la respiración de la mltocondria del músculo esqueletal de rata en 55 ± 1.9 por ciento (n = 15; p <0.001). La activación de AMP mostró saturación simple (figura 1) con el efecto medio-máximo a 80 µM de AMP (figura 1b), que está en la escala fisiológica (Arabadjis, P. G., Tullson, P. C. y Terjung, R. L., Am. J. Physiol., 264, C1246-C1251 (1993)). La estimulación por AMP no fue afectada por la adición de 2 mM de Mg, 1 mM de ECTA o 50 µM de pentafosfato de diadenosina (para prevenir el metabolismo de AMP a través de la adenilato-cinasa) o mediante pH entre 6.5 y 7.3. La activación con AMP no fue afectada por la eliminación ni por la adición de albúmina, lo que sugiere que no depende de los ácidos grasos libres. No hubo efecto sobre la respiración de ADP, ATP ni de los monofosfatos o difosfatos de nucleosida de guanina, citosina, timina o uracilo, a 1 mM. En ausencia de Mg adicional o de EDTA cada uno de los trifosfatos de nucleosida estimuló la respiración en 60 por ciento; pero esto se explicó totalmente por la quelatación del Mg contaminante endógeno, que es un inhibidor potente de la conductancia protónica basal en la mitocondria muscular (Cadenas, S., Jones, R. B. y Brand, M. D., 8th Int. Congr. Obesity, París, Resumen HTP10 (1998)). Para probar si AMP activa directamente la conductancia protónica de la mitocondria, se analizó su cinética, midiendo la respuesta de la velocidad de fuga protónica a su fuerza impulsora, el potencial de membrana mltocóndrica (Brand, M. D,, Chien, L-F., Ainscow, E. K., Rolfe, D. F. S. y Porter, R. K., Biochim. Biophys Acta, 1187, 132-139 (1994), Brand, M. D., Brindle, K. M., Buckingham, J. A., Harper, J. A., Rolfe, D. F. S. y Stuart, J. A., Int. J. Obesity, 23, Suppl. 6, S3-S-11 (1999), Brand, M. D., Mol. Cell. Biochem., 184, 13-20 (1998)). 1 mM de AMP incrementó la velocidad de fuga protónica (medida como la velocidad de consumo de oxígeno insensible a la oligomicina), a todos los valores del potencial de membrana; aumentó la conductancia protónica de la mltocondria aproximadamente al doble a través de toda la escala de fuerzas de impulso (figura 2a). El AMP no tuvo efecto sobre la cinética general de las reacciones de oxidación del substrato (no mostrada). AMP también duplicó la conductancia protónica de la mitocondria del músculo esqueletal, aislada de la rana Rana temporaria (figura 2b). Puesto que la rana es ectoterma, esto indica que la función fisiológica primaria de la activación de AMP no es la termogénesis. Se ha informado de otros efectos de nucleótido sobre la conductancia protónica mitocóndrica. El ejemplo clásico es la inhibición del nucleótido de purina de la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) del tejido adiposo café (Rafael, J., Ludolph, JH.-J., y Hohorst, H.-J., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 350, 1121-1131 (1969)). UCP1 tiene gran afinidad para GDP, ATP y ADP, y también hay inhibición por AMP, con K0 5 de 110 µM (Huang, S.-G y Klingenberg, M., Biochemistry, 34, 349-360(1995)). El efecto del AMP sobre UCP1 parece reflejar la especificidad relativamente amplia de la inhibición por los nucleótidos de purina, al contrario de la activación de AMP en el músculo esqueletal, que es sumamente específico para AMP. Se ha propuesto que los homólogos de UCP1, UCP2 y UCP3, actúan como desacopladores (Bouillaud, F., Int. J. Obesity, 23, Suppl. 6, S19-S23 (1999)) (aunque esto es controversial (Brand, M. D., Brindle, K. M., Buckingham, J. A., Harper, J. A., Rolfe, D. F. S. y Stuart, J. A., Int. J. Obesity, 23, Suppl. 6, S3-S11 (1999), Cadenas, S., Buckingham, J. A., Samec, S., Seydoux, J. Dulloo, A. G. y Brand, M. D., Int. J. Obesity 23, suppl. 5, p. S99 (1999)), y hay cierta evidencia de que son regulados por la unión de nucleótido (Négre-Salvayre, A., Hirtz, C, Carrera, G., Cazenave, R., Troly, M., Salvayre, R., Pénicaud, L. y Casteilla, L., FASEB J., 11, 809-815 (1997), Echtay, K. S., Liu, Q., Caskey, T. Winkler, E. Frischmuth, K., Bienengráber, M y Klingenberg, M., FEBS Lett., 450, 8-12 (1999)). CMP estimula la conductancia protónica mitocóndrica, pero a concentraciones más altas que las probadas aquí: K05 fue aproximadamente 4 mM (Jekabsons, M y Horwitz B. A., FASEB J., 12, A813 (1998)). Los nucleótidos de purina y el carboxiatractilato Inhiben la elevada conductividad protónica de los mltocondrias de hígado fetal (Valcarce, C. y Cuezva, J. M., FEBS Lett., 294, 225-228 (1991)). ATP estimula la trayectoria de conductancia protónica en las mitocondrias de levadura, pero AMP no tiene efecto a todas las concentraciones usadas aquí (Prieto, S., Bouillaud, F. y Rial, E. Arch. Biochem. Biophys., 334, 43-49 (1996). Se investigó la posibilidad de que la activación con AMP de la conductancia protónica estuviera mediada por homólogos de UCP1. Recientemente se ha demostrado que el dejar sin alimento durante 24 horas a ratas, condujo a cantidades incrementadas de ARNm de UCP2 y UCP3 en el músculo esqueletal, y de la proteína UCP3 en las mltocondrias del músculo esqueletal, pero no alteró la conductancia protónica (Cadenas, SI., Buckingham, J. A., Samec, S., Seydoux, J., Dulloo, A. G. y Brand, M. D., Int. J. Obesity, 23, suppl. 5, página S99 (1999)). La figura 2c muestra que el efecto estimulante de 1 mM de AMP no se incrementó, pese al aumento al doble de la proteína UCP3 medida por manchado de Western (Cadenas, S., Buckingham, J. A., Samec, S., Seydoux, J. Dulloo, A. G. y Brand, M. D., Int. J. Obesity, 23, suppl. 5, pág. S99 (1999)) en las mismas preparaciones mitocóndricas. Esta observación sugiere que AMP no activa la conductancia protónica por los efectos sobre UCP3. Se investigó la posibilidad de que la activación con AMP de la conductancia protónica estuviera mediada por otro miembro de la familia de transportadores de membrana interna mitocóndrica, el portador de nucleótido de adenina, que cambia el ADP citosólico por ATP mitocóndrico, a través de la membrana mitocóndrica interna (Klingenberg, M., Enzymes Biol. Membr., 4, 511-553 (1985)). Este portador tiene un solo sitio de unión que mira alternativamente al citosol o a la matriz. El sitio de unión está descrito como específico para los substratos, ADP y ATP (Klingenberg, M., Enzymes Biol. Membr., 4, 511-553 (1985)), pero también se puede unir a (Huber, T., Kllngenberg, M. y Beyer, K., Biochemistry, 38, 762-769 (1999)) o transportar (Kiviluoma, K. T., Peuhkurlnen, K. J., y Jassinen, I. E., Biochim. Biophys. Acta, 974, 274-281 (1989)) el AMP. El aspecto de diagnóstico del portador es su inhibición específica por el atractilato, el carboxiatractilato y el bongcrecato. Se encontró que el incremento en la velocidad de respiración en estado 4 de la mitocondria muscular, provocado por 1 mM de AMP fue prevenido e invertido por 22.5 nmol de atractilato o 2.4 nmol de carboxiatractiiato por mg de proteína mitocóndrica, lo que implica fuertemente el portador del nucleótido de adenina en el efecto de AMP. La estimulación con 200 µM de AMP fue abolida por 1 mM de ATP o 1 mM de ADP, pero no por los demás nucleótidos de purina o de pirimidina mencionados más arriba (que no son buenos substratos para el portador del nucleótido de adenina), lo que apoya esta conclusión. No hubo dependencia del tiempo en la activación de, ni en la inhibición del carboxiatractilato, lo que sugiere que la activación con AMP fue directamente sobre el portador del nucleótido de adenina, y no un resultado de la absorción de AMP, seguida por la activación de un blanco diferente dentro de las mitocondrias. Los ácidos grasos activan la fuga protónica por medio del portador de nucleótido de adenina (Skulachev, V. P., Biochim. Biophys. Acta, 1363, 100-124 (1998)), pero dos líneas de evidencia sugieren que la activación con AMP es diferente: la activación con AMP ocurrió en presencia de albúmina (que quelata los ácidos grasos) y contrariamente a la activación con ácido graso, fue mucho menor en las mitocondrlas del hígado (figura 2d). Una correlación interesante emergió de la distribución en el tejido de la activación con AMP de la conductancia protónica, por el portador de nucleótido de adenina. AI contrario del músculo esqueletal, hubo poco o ningún efecto de 1 mM de AMP sobre la conductancia protónica en mitocondrias de hígado de rata (figura 2d). La estimulación de la respiración en estado 4 por 1 mM de AMP en la mitocondria, de cuatro tejidos de rata, fue 55% en el músculo esqueletal, 41% en el corazón, 27% en el riñon y 7 por ciento en el hígado. Se ha identificado dos isoformas del portador de nucleótido de adenina (ANC1 y ANC3) con 98 por ciento de homología en la secuencia de aminoácido, en ratas. ANC1, como proporción del ARNm de ANC total es 81 por ciento en el músculo esqueletal, 63 por ciento en el corazón, 35 por ciento en el riñon y 25 por ciento en el hígado (Domer, A., Olesch, M., Giessen, M., Pauschinger, M. y Schultheiss, J.-P., Biochim. Biophys. Acta, 1417, 16-24 (1999)). La idéntica jerarquización de la potencia de AMP y la abundancia relativa del ARNm de ANC1 en estos cuatro tejidos, eleva la hipótesis de que es el ANC1 el que está involucrado en la estimulación con AMP de la conductancia protónica del mltocondria. La conductancia protónica, activada con AMP, del portador de nucleótido de adenina es alta. De la figura 2, es aproximadamente 300 nmol de H + /min/mg de proteína en estado 4; aproximadamente 35% de la velocidad de cambio de ADP/ATP del portador en estado 3. En las mitocondrias de tejido adiposo oscuro, UCP1 aumenta la conductancia protónica basal hasta 25 veces (Nicholls, D. G., Eur. J. Biochem., 77, 349-356 (1977)). La conductancia protónica basal es cuantitativamente similar en las mitocondrias del músculo esqueletal de rata y del tejido adiposo oscuro de cuyos (compárese la figura 2a con la figura 3 en [Nicholls, D. G., Eur. J. Biochem., 77, 349-356 (1977)]), y el contenido de UCP1 en las mitocondrias del tejido adiposo oscuro, adaptado al frío (0.5-0.8 nmol/mg de proteína) (Nicholls, D. G., Eur. J. Biochem., 77, 349-356 (1977)), es similar al contenido del portador de nucleótido de adenina en las mitocondrias del músculo esqueletal (1.5 nmol/mg de proteína (Letellier, T., Malga, M. y Mazat, J.-P., Biochim. Biophys. Acta, 1141, 58-64 (1993)), de modo que el transporte protónico a través de la trayectoria activada por AMP sobre el portador de nucleótido de adenina, es aproximadamente 3-4 por ciento de la velocidad máxima de transporte protónico por UCP1. Del estudio de los análogos de AMP a los que se hizo referencia previamente, se identificó tres compuestos (obtenibles de Sigma Chemical Company Ltd., Fancy Road, Poole Dorset, Inglaterra), que demostraron actividad importante en la disminución del potencial de membrana. Se determinó la magnitud del efecto sobre el potencial de membrana, comparado con el efecto de AMP bajo las mismas condiciones (definido AMP como 100%). También se determinó la potencia de los compuestos sobre el potencial de membrana y se expresó como un valor Cl50 (determinado AMP como 93 micromoles). Se da a continuación los detalles: 1) 5'-monofosfato de 6-cloropurinarribosida 93.02%, 170 micromoles 2) 5'-monofosfato de cordecipln 58.98%, 163 micromoles 3) 5'-monofosfato de xantosina 61.74%, 119 micromoles. Estos resultados demuestran que los análisis de la presente invención son adecuados para identificar compuestos que tengan la actividad deseada. Los compuestos que incrementan la fuga protónica son adecuados como tratamientos potenciales para la obesidad y condiciones comórbidas relacionadas. Puesto que la fuga protónica en el músculo es un aporte importante en la velocidad metabólica normal (Rolfe, D. F. S., Newman, J. M. B., Buckingham, J. A., Clark, M. G. y Brand, M. D., Am. J. Physiol., 276, C692-C699 (1999)), la conductancia protónica estimulada por AMP podría formar parte de un mecanismo fisiológico de regulación aguda de la disipación de energía y la velocidad metabólica normal, que la cambia potencialmente en 5-10%. Los cambios sostenidos en la velocidad metabólica de esta magnitud, podrían tener efectos dramáticos sobre el peso del cuerpo, de modo que la conductancia protónica estimulada por AMP, de las mitocondrias del músculo esqueletal, es un blanco potencial para los productos farmacéuticos anti-obesidad y anti-caquexia. La figura 1a muestra el efecto de AMP sobre la respiración en reposo de las mitocondrias de músculo esqueletal de ratas. Los análisis en ei electrodo para oxígeno de Clark contenían 0.5 mg de proteína mitocóndrica/ml, 120 mM de KCl, 5 mM de KH2PO4, 3 mM de HEPES, 2 mM de MgCI2, 1 mM de EGTA, 0.3% de BSA desgrasado, 5 µM de rotenona, 1 µg/ml de ollgomicina y 4 mM de succinato, pH 7.2, 37°C. Las mitocondrias tuvieron razones de control respiratorio de 4.2 ± 0.4 (S. D.). Los datos son las medias ± S. E. M. para n = 6-12 (excepto a 50 µM de AMP, donde n = 2). b. Diagrama de Hanes de los datos en a. r2 = 0.98. La intersección en el eje horizontal da K0.5 para AMP = 80 µM. La figura 2 muestra el efecto de AMP sobre la conductancia protónica mitocóndrica. Las mitocondrias fueron de a. el músculo esqueletal de ratas alimentadas ad libitum; b. el músculo esqueletal de ranas (Rana temporaria); c. el músculo esqueletal de ratas dejadas sin alimento 24 horas; d. el hígado de rata. Estuvo ausente (círculos llenos) o presentes (círculos en blanco) 1 mM de AMP. Se midió la velocidad de respiración y el potencial de membrana simultáneamente, usando electrodos sensibles al oxígeno y a la sonda TPMP* dependiente del potencial. Para a y c, se incubó las mltocondrias del músculo esqueletal de rata como en la figura 1, con 80 ng/ml de nlgericin y 50 µM de pentafosfato de diadenosina. Se calibró el electrodo para TPMP con adiciones secuenciales hasta 2 µM de TPMP. Se añadió secuencialmente malonato hasta 2 mM para cambiar el potencial mitocóndrico. Después de cada operación se añadió 0.2 µM de FCCP para liberar TPMP para corrección de línea básica. La corrección para unión de TPMP fue 0.35 (µl/mg de proteína)"1. Los datos son la media ± S. E. M. de a, siete, o c, tres experimentos efectuados por triplicado. Para b, se incubó las mltocondrias de rana (preparación basada en la referencia 25), como en a, pero a 1 mg de proteína/ml, 5 mM de succinato, sin pentafosfato de diadenosina, pH 7.4, 25°C. Se añadió TPMP hasta 2.55 µM y el malonato hasta 5.3 mM. Se usó 2.9 µM de FCCP y se supuso que la unión de TPMP era 0.4 (µl/mg de proteína)"1. Los datos son la media y la escala de dos experimentos efectuados por duplicado. Para d se incubó las mitocondrias de hígado como en a, pero a 1 mg de proteína/ml. Se añadió TPMP hasta 5 µM y malonato hasta 5 mM. Se usó 2 µM de FCCP y se supuso que la unión de TPMP era 0.4 (µl/mg de proteína)"1. Los datos son la media y la escala de dos experimentos efectuados por triplicado.

Claims (60)

REIVINDICACIONES

1.- Un sitio regulador para una fuga protónica de la mltocondria, caracterizado porque el sitio es activado por monofosfato de adenosina.

2.- El uso de un sitio regulador de conformidad con la reivindicación 1, en un análisis de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de un trastorno de peso del cuerpo, tal como obesidad o caquexia o condiciones comórbidas relacionadas.

3.- Un método de clasificación para identificar compuestos que modulan un sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración en presencia de un sistema regulador; b) medir un índice de la velocidad metabólica; y c) identificar los compuestos que modulen la velocidad metabólica.

4.- Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de a) poner en contacto los compuestos identificados en la reivindicación 3 con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador y en presencia de AMP y medir un indicador de velocidad metabólico; y b) comparar la velocidad metabólica del paso (b) de la reivindicación 3 y el paso (a) de la reivindicación 4 e identificar compuestos donde no hay un efecto aditivo sobre velocidad metabólica como compuestos que modulan el sitio regulador sensible al AMP.

5.- Un método de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, caracterizado además porque en el paso c) se Identifica los compuestos que aumenten la velocidad metabólica como compuestos que activan un sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias.

6.- Un método de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado además porque en el paso c) se identifica los compuestos que disminuyan la velocidad metabólica como compuestos que inhiban un sitio regulador sensible al AMP en las mltocondrias.

7.- Un método de clasificación para identificar compuestos que modulan un sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias en presencia de un substrato para la respiración en presencia de un sistema regulador; b) medir el potencial de membrana; y c) identificar los compuestos que cambien el potencial de membrana.

8.- Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados en la reivindicación 7 con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador y en presencia de AMP, y medir el potencial de membrana; y b) comparar el potencial de membrana en el paso (b) de la reivindicación 7 y el paso (a) de la reivindicación 8, e identificar ios compuestos en los que no hay un efecto aditivo sobre el potencial de membrana, como compuestos que modulan el sitio regulador sensible al AMP.

9.- Un método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque en el paso c) se identifica los compuestos que disminuyen el potencial de membrana como compuestos que activan el sitio regulador sensible al AMP en la mltocondria.

10.- Un método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además en el paso c) se identifica los compuestos que aumentan el potencial de membrana como compuestos que inhiben el sitio regulador sensible al AMP en la mltocondria.

11.- Un método de clasificación para identificar compuestos que modulen un sitio regulador sensible al AMP en mitocondrias, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto un compuesto de prueba con mitocondrias en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador; b) medir un índice de velocidad metabólica y medir el potencial de membrana; y c) identificar los compuestos que cambian la velocidad metabólica y cambian el potencial de membrana como compuestos que modulan el sitio regulador sensible al AMP.

12.- Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de: a) poner en contacto los compuestos identificados en la reivindicación 11 con mitocondrias, en presencia de un substrato para la respiración, en presencia de un sistema regulador y en presencia de AMP, medir un indicador de la velocidad metabólica, y medir el potencial de membrana; y b) comparar la velocidad metabólica y el potencial de membrana en el paso (b) de la reivindicación 11 y en el paso (a) de la reivindicación 12, e identificar los compuestos en los que no hay efecto aditivo sobre la velocidad metabólica y el potencial de membrana, como compuestos que modulan el sitio regulador sensible al AMP.

13.- Un método de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado además porque en el paso c) se identifica los compuestos que aumentan el régimen metabólico y disminuyen el potencial de membrana, como compuestos que activan el sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias.

14.- Un método de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado además porque en el paso c) se identifica los compuestos que disminuyen el régimen metabólico y aumentan el potencial de membrana como compuestos que inhiben el sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias.

15.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y 11 a 14, caracterizado además porque el indicador de la velocidad metabólica es el consumo de oxígeno.

16.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizado además porque las mitocondrias son mitocondrias aisladas o una parte adecuada de ellas o un derivado de ellas.

17.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizado además porque las mitocondrias son mitocondrias de músculo esqueletal, o una parte adecuada de ellas o un derivado de ellas.

18.- Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque las mitocondrias de músculo esqueletal son mitocondrias de músculo esqueletal de rata.

19.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizado además porque las mltocondrias están presentes en células eucarióticas intactas.

20.- Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque las células Intactas presentes en cortes de tejido de origen de mamífero o líneas de células de origen de mamíferos.

21.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizado además porque está presente un inhibidor de complejo 1.

22.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizado además porque el substrato es una sal succlnato.

23.- Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque el inhibidor de complejo 1 es rotenona.

24.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 22, caracterizado además porque se lleva a cabo el método en presencia de concentraciones variables de un inhibidor dei transporte de electrones.

25.- Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque se selecciona el inhibidor de transporte de electrones de una sal malonato, mixotiazol o una sal cianuro.

26.- Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el inhibidor del transporte de electrones es una sal malonato.

27.- Un método de clasificación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque se mide el consumo de oxígeno mediante un electrodo para oxígeno.

28.- Un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 26, caracterizado además porque se mide el potencial de membrana usando electrodos selectivos para iones.

29.- Un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 26, caracterizado además porque se mide el potencial de membrana usando tintes fluorescentes para el potencial de membrana.

30.- Un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque está presente un inhibidor de la síntesis de ATP.

31.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 30 para la Identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo.

32.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 9 y 13, para la identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y condiciones relacionadas.

33.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 10 y 14 para la identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la caquexia y condiciones relacionadas.

34.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo, caracterizado el método porque comprende el paso de identificar un compuesto que se una selectivamente a ANC.

35.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de la obesidad y condiciones relacionadas, caracterizado el método porque comprende el paso de identificar un agonista de ANC.

36.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de la caquexia y condiciones relacionadas, caracterizado el método porque comprende el paso de identificar un antagonista de ANC.

37.- Un análisis de unión para la Identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas, caracterizado porque comprende los pasos de: a) incubar una preparación que contiene ANC con un ligando marcado para producir una preparación que contiene ANC marcado; b) poner en contacto un compuesto de prueba con la preparación que contiene ANC marcado; y c) identificar un compuesto que reduce la cantidad de ligando marcado presente en la preparación que contiene ANC, como un compuesto que puede ser adecuado para uso en el tratamiento de la obesidad.

38.- Un análisis de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la preparación que contiene ANC comprende uno de los siguientes: a) preparaciones de tejido intacto; b) líneas de células, de una fuente de músculo esqueletal o de una fuente cardiaca o de una fuente de músculo liso aórtico; c) células en las que se ha introducido ANC por medios genéticos; d) células aisladas de tejidos, por ejemplo, de tejidos de músculo cardiaco o esqueletal; e) membranas; f) mitocondrias; g) membranas mitocóndricas, o h) ANC aislado, de preferencia en forma purificada.

39.- Un análisis de conformidad con la reivindicación 37 o con la reivindicación 38, caracterizado además porque la preparación que contiene ANC es una línea de células que está opcionalmente regulada en sentido ascendente.

40.- Un método de análisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, caracterizado además porque el ligando marcado es atractilato radiomarcado o marcado de manera fluorescente, o ATP o ADP marcados de manera fluorescente.

41.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo, caracterizado el método porque comprende el paso de identificar un compuesto que modula la fuga protónica mitocóndrica mediada por un ANC.

42.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas, caracterizado el método porque comprende el paso de: identificar un compuesto que incremente la fuga protónica mitocóndrica, mediada por ANC.

43.- Un método de clasificación para identificar compuestos que sean útiles en el tratamiento de la caquexia y de condiciones relacionadas, caracterizado el método porque comprende el paso de identificar un compuesto que reduzca la fuga protónica mitocóndrica mediada por ANC.

44.- Un método de clasificación (funcional) para identificar compuestos que modulen la fuga protónica mediada por un ANC, caracterizado porque comprende los pasos de: a) incubar un compuesto de prueba con células en las que se regula de manera ascendente un ANC y medir un indicador de la velocidad metabólica o el potencial de membrana; b) incubar un compuesto de prueba con células de control, en las que el ANC usado en el paso a) está ausente o está presente a niveles inferiores que en el paso a), y medir un indicador de la velocidad metabólica o el potencial de membrana; y c) identificar un compuesto que da lugar a una velocidad metabólica diferente o un potencial de membrana diferente en el paso a) en comparación con el paso b), como un compuesto que modula la fuga protónica mediada por un ANC.

45.- Un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque en el paso c) se identifica un compuesto que da lugar a una velocidad metabólica incrementada o un potencial de membrana disminuido, como un compuesto que incrementa la fuga protónica mediada por un ANC.

46.- Un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque en el paso c) se identifica un compuesto que da lugar a una velocidad metabólica disminuida o potencial de membrana incrementado como un compuesto que reduce la fuga protónica mediada por un ANC.

47.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, para identificar compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo.

48.- Un método de conformidad con la reivindicación 45 para la Identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la obesidad y de condiciones relacionadas.

49.- Un método de conformidad con la reivindicación 46 para la identificación de compuestos que sean adecuados para uso en el tratamiento de la caquexia y de condiciones relacionadas.

50.- Un método o análisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 49, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de clasificar un compuesto identificado como adecuado para uso en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo en otra clasificación para determinar si es adecuado en el tratamiento de un trastorno del peso del cuerpo.

51.- Un método o análisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 9, 13, 35, 42, 45 y 48, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de clasificar un compuesto identificado en otra clasificación, para determinar si es adecuado para tratar la obesidad o una condición relacionada.

52.- Un método o análisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 10, 14, 36, 43, 46 y 49, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de clasificar un compuesto identificado en otra discriminación para determinar si es adecuado en el tratamiento de la caquexia o de una condición relacionada.

53.- Un compuesto identificable en un método o análisis de clasificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 52.

54.- Un compuesto identificado en un método o análisis de clasificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 52.

55.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 53 o 54 para uso en medicina.

56.- Un método para tratar un trastorno del peso del cuerpo en un paciente, caracterizado el método porque comprende administrar al paciente un compuesto de acuerdo con la reivindicación 53 o 54.

57.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 53 o 54 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno del peso del cuerpo.

58.- Un método para tratar un paciente con obesidad o con una condición comórbida relacionada, caracterizado el método porque comprende administrar al paciente un agonista de un sitio regulador sensible a AMP en la mitocondria, o un agonista del efecto de AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC.

59.- El uso de un agonista de un sitio regulador sensible al AMP en las mitocondrias o un agonista del efecto de AMP sobre la fuga protónica mediada por ANC en la fabricación de un medicamento para tratar la obesidad o una condición comórbida relacionada.

60.- Un método de conformidad con la reivindicación 58, o el uso de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el activador de un sitio regulador sensible al AMP en la mitocondria es cualquiera de 5'-monofosfato de 6-cloropurinarribosida, 5'-monofosfato de cordecipln y 5'-monofosfato de xantosina.