JP2015513097A - 院内感染に対する易感染性を判定するための方法 - Google Patents

院内感染に対する易感染性を判定するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】院内感染に対する易感染性を判定するための方法の提供。【解決手段】本発明は、院内感染に対する患者の易感染性を判定する方法であって、生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定することを含む方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には医療分野に関し、特に集中治療の分野に関する。
より具体的には、本発明は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、好ましくは敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するための方法に関する。
院内感染は公衆衛生上の大きな問題である。入院患者は、本質的に、免疫適格性を直接損なう病状や全身状態によって、免疫防御が低下したり悪化したりしていることが多い。これらの患者、特に栄養不良の患者又は低年齢児や高齢者の患者（老人や幼児）は、一般的に特に感染しやすく、とりわけ院内感染を発症しやすい。
院内感染の発生率は、他の病院内区域に比べて集中治療室において顕著に高い。この区域において院内感染の発生率が高いのは、いくつかの内因性リスク因子の有害な組合せによるものである。そのような内因性リスク因子としては、患者の侵襲的処置（人工呼吸、尿道カテーテルや他のカテーテル挿入）への曝露、患者の重症度（及び関連する併存症）、処置（複数回輸血や鎮静処置）が挙げられる。しかしながら、衛生上及び監視上（外因性リスク）のあらゆる措置をとり、これらの内因性リスク因子を考慮したところで、院内感染の発生率には変化が見られないか、わずかに減少するのみである。
したがって、院内感染に対する患者の易感染性を判定することは、個別化を提案したり、致死的転帰を辿る追加のリスクをできるだけ最小限に抑えたりするために不可欠である。
本発明者らの知る限り、院内感染に対する易感染性の増大と関連した現在唯一知られている免疫学的マーカーは、院内感染した患者では単球での発現（ｍＨＬＡ−ＤＲ）が減少するＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血球型抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）−ＤＲ）マーカーである。しかしながら、フローサイトメトリーによって示されるこのマーカーの発現には特別な設備（フローサイトメーター）が必要であり、この特別な設備は、生物学のプラットフォームでは使用することができず（血液学や免疫学を専門とする研究所での使用に限られる）、使用する際の標準が確立されていない。そのため、ｍＨＬＡ−ＤＲの測定を日常的に行うことはできない。
したがって、院内感染に対する患者の易感染性を簡便かつ迅速に予測できる他の免疫学的マーカーに対するニーズが現実に存在する。院内感染するリスクが最も高い患者を特定することができれば、より適合しかつより的の絞られた予防的治療を行うことができるであろう。
このような状況において、本発明は、患者の院内感染のリスクが高いことを予測するための新規なバイオマーカー、特に、集中治療室入院患者、及び／又は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害（手術、やけど、外傷など）を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、好ましくは敗血症性ショック患者に対する新規なバイオマーカーを提供することを目的とする。したがって、このバイオマーカーの発現量を測定することにより、院内感染に対する患者の易感染性を簡便かつ迅速に判定することができ、それに応じて必要な予防上の措置をとることができる。
したがって、第１の態様によれば、本発明の主題は、院内感染に対する患者の易感染性を判定する方法であって、
・上記患者から採取した生体サンプル又は被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定する工程と、
・ｓＣＤ１２７の発現を参照値と比較した後に、院内感染に対する易感染性が高いと結論づける工程と
を含む方法である。
したがって、院内感染に対する易感染性を判定するための本発明の方法は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で行う方法である。
ｓＣＤ１２７は、ＩＬ−７受容体の一つであるＣＤ１２７の可溶型又血漿型である。ＣＤ１２７、すなわち、ＩＬ−７受容体のα鎖は、７５ｋＤａの糖タンパク質であり、造血因子受容体のスーパーファミリーの一つである。ＣＤ１３２（共通γｃ鎖）と会合して膜で発現され、ＩＬ−７受容体を形成する。この受容体は、リンパ球の分化、生存及び増殖に重要な役割を果たしている。ＣＤ１２７は、２１９個のアミノ酸（ａａ）を有する細胞外領域と、２５個のアミノ酸を有する膜貫通領域と、１９５個のアミノ酸を有する細胞質内領域とからなる。ＣＤ１２７をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生成される、ｓＣＤ１２７と呼ばれる可溶型／血漿型の存在は、１９９０年にＧｏｏｄｗｉｎ ＲＧら（Ｃｅｌｌ，１９９０，２３，９４１−９５１）により開示されているが、その生物学的機能については今日まで充分に明らかになっていない。
「院内感染」とは、あらゆる感染、主に細菌感染であるが、ウィルス感染や真菌感染も含む感染のうち、患者管理（診断、治療、緩和ケア、予防的治療、リハビリ治療）の間又はその後に医療施設内で起こる感染であって、患者管理を始めた時点では潜伏も発症もしていない感染を意味する。感染状態が患者管理を始めた時点でははっきりと分からない場合、少なくとも４８時間、あるいは潜伏期間よりも長い時間が経過した後であれば、一般的には院内感染とされる。
本発明において、「全身性炎症反応症候群」又は「ＳＩＲＳ」とは、以下の基準のうち少なくとも２つを伴う反応を意味する。体温＞３８℃若しくは体温＜３６℃、心拍数＞９０／分、呼吸数＞２０／分若しくはｐａＣＯ２＜３２ｍｍＨｇ、白血球数＞１２，０００／ｍｍ３若しくは白血球数＜４，０００／ｍｍ３（Ｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，１９９２，１６４４−１６５５）。
本発明において、「ｓＣＤ１２７」とは、ＩＬ−７受容体のα鎖、又は、ＩＬ７Ｒ、又は、ＩＬ７Ｒ−ＡＬＰＨＡ、又は、ＩＬ７ＲＡ、又は、ＣＤＷ１２７とも呼ばれるＩＬ−７受容体の可溶型又は循環型（血漿型又は血清型ともいう）をいい、具体的には、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１９９０，２３，９４１−９５１に説明されていたり、Ｃｒａｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１８４，４６７９−４６８７において分析されている。
特に、本発明におけるｓＣＤ１２７の参照核酸配列は、好ましくは以下のものである。Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６８６８５，ＨＰＲＤ−ＩＤ：００８９３ ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００２１８５．２，Ｖｅｇａ ｇｅｎｅｓ：ＯＴＴＨＵＭＧ００００００９０７９１。
また、本発明におけるｓＣＤ１２７の参照タンパク質配列は、好ましくは以下のものである。ＮＰ＿００２１７６ ＸＰ＿９４２４６０；ｖｅｒｓｉｏｎ：ＮＰ＿００２１７６．２ ＧＩ：２８６１０１５１。
本発明の方法を用いて試験される被験サンプルは、院内感染に対する易感染性を判定することが望まれる患者から採取した生体サンプルである。特に、上記生体サンプルは、ｓＣＤ１２７マーカーを含んでいる可能性のあるものから選択する。
本発明は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者に特に好ましく適用される。したがって、本発明の方法において使用する生体サンプルは、集中治療室入院患者、及び／又は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害（手術、やけど、外傷など）を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、特に敗血症性ショック患者から採取するのが好ましい。本発明の方法において使用する生体サンプルは敗血症性ショック患者から採取するのが特に好ましい。
第１の好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって、院内感染に対する患者の易感染性を判定できる。すなわち、第１の参照値と比較してｓＣＤ１２７が被験サンプル中で過剰発現していることが明らかになった場合に、院内感染するリスク又は院内感染に対する易感染性が高いと結論づけることができる。
「過剰発現」とは、発現量が統計学的に有意に増加していることを意味する。
この実施形態においては、第１の参照値は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者であって、院内感染していないことが分かっている患者、特に院内感染していないことが分かっている敗血症患者、好ましくは院内感染していないことが分かっている敗血症性ショック患者から採取した生体サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現量に相当するものであってもよい。この場合、第１の参照値を与えるｓＣＤ１２７の発現の上記測定は、並行して行う、すなわち、院内感染に対する易感染性を判定することが求められる患者から採取したサンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定と同時に行うのが好ましい。ただし、参照サンプルの採取は被験サンプルの採取より前に行われる。
この第１の参照サンプルは、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた患者であって、院内感染していないことが分かっている患者、特に院内感染していないことが分かっている敗血症患者、好ましくは院内感染していないことが分かっている敗血症性ショック患者から採取したサンプルのプールで測定されたｓＣＤ１２７発現量の平均値に相当するものであってもよい。この場合、第１の参照値を与えるｓＣＤ１２７の発現の上記測定は、院内感染に対する易感染性を判定することが求められる患者から採取したサンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定よりも前に行うことが好ましい。ただし、「プール」される参照サンプルは、被験サンプルの採取よりも前に採取される。
この第１の好ましい実施形態において、特に敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するために、被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定、及び、必要であれば第１の参照値を得るために使用する生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定（すなわち、第１の参照値を生体サンプルから得た場合）は、敗血症性ショック発症後１０日以内又は１０日目（Ｄ１０）、好ましくは敗血症性ショック発症後７日以内又は７日目（Ｄ７）、より好ましくは敗血症性ショック発症後４日以内又は４日目（Ｄ４）、特に敗血症性ショック発症後３日以内又は３日目（Ｄ３）に行う。
第２の好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって、院内感染に対する患者の易感染性を判定できる。すなわち、被験サンプルで測定されたｓＣＤ１２７の発現が第２の参照値と比較して有意に減少していない場合に、院内感染するリスク又は院内感染に対する易感染性が高いと結論づけることができる。被験サンプルで測定されたｓＣＤ１２７の発現の減少率が第２の参照値と比較して２５％以下、特に２０％以下の場合に、院内感染するリスクが高いと結論づけるのが特に好ましい。
この第２の参照値は、同一患者から事前に採取した生体サンプル、すなわち被験サンプルの採取よりも前に採取した生体サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現量に相当するものであってもよい。「事前に」又は「前に」とは、被験サンプルを採取する際にそれよりも早く行うこと又は採取時よりも前に行うことを意味する。
この第２の好ましい実施形態において、特に敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するために、被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定は、敗血症性ショック発症後１０日目又は約１０日目（Ｄ１０）、好ましくは敗血症性ショック発症後７日目又は約７日目（Ｄ７）、より好ましくは敗血症性ショック発症後４日目又は約４日目（Ｄ４）に行う。
事前のサンプル採取は、例えば、敗血症性ショック発症後４８時間以内又は４８時間経過時であって、被験サンプルの採取の２４時間以上前に行うことができる。事前のサンプル採取は、敗血症性ショック発症後４８時間以内又は４８時間経過時に行われ、被験サンプルの採取は、事前のサンプル採取後４８時間以内又は４８時間経過時に行われるのが好ましい。
したがって、全ての場合、被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を実際に測定する前に、本発明の方法は、第１の参照値又は第２の参照値のいずれかの参照値を事前に取得することを含んでもよく、上記参照値を被験サンプル中で検出された発現量と比較することにより、被験サンプルを採取した患者が院内感染するリスクが高いか否かを結論づけることができる。
したがって、被験サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現値と比較されるのは、これらの参照値、すなわち事前に又は同時に得られた第１の参照値又は第２の参照値のいずれかである。
本発明の方法を実施するサンプル（ここでは被験サンプルともいう）は、ヒト由来又は動物由来であってもよく、好ましくはヒト由来である。
したがって、被験サンプルは様々な種類のものであってよい。特に、該サンプルは、例えば血液、全血（例えば静脈ルートから採取したもの、すなわち白血球、赤血球、血小板及び血漿を含むものなど）、血清、血漿及び気管支肺胞洗浄液から選択される生体液である。
上記患者から採取した被験サンプルは血漿サンプル又は血清サンプルであるのが好ましい。
第１の参照値又は第２の参照値のいずれかの参照値を測定することができるサンプル（「参照サンプル」ともいう）は、様々な種類のものであってよく、特に被験サンプルについて上述したような生物学的種類のもの（生体液）であってもよい。これらの生体サンプルは、被験生体サンプルと同じ種類のものであるか、あるいは、少なくとも、ｓＣＤ１２７の発現を検出及び／又は定量する際に参照とするのに適合した種類のものであるのが有利である。
特に第１の参照値を得るために、これらのサンプルは、院内感染の易感染性を判定することが望まれる試験対象又は患者と同じ特徴又は大半の共通の特徴を有する人、特に同じ性別及び／又は類似の若しくは同じ年齢及び／又は同じ民族出身の人から採取するのが好ましい。この場合の参照サンプルは、事前にｓＣＤ１２７値の平均値を含むように調整されていれば、どのようなサンプルでもよく、生体サンプルであってもそうでなくてもよい。このｓＣＤ１２７値の平均値は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた患者であって、院内感染していないことが分かっている患者、特に院内感染していないことが分かっている敗血症患者、好ましくは院内感染していないことが分かっている敗血症性ショック患者から採取した生体サンプルのプールで測定された量に相当するものである。この場合、ある特に好ましい変形例によれば、参照サンプルは、院内感染していないことが分かっている１人又は複数の敗血症性ショック患者から採取したものである。
特に第２の参照値を得るために、参照サンプルは、上記同一患者から採取した生体サンプル、すなわち、院内感染に対する易感染性を判定することが望まれる患者であって、被験サンプルを採取する患者から採取した生体サンプルである。この参照サンプルは、事前のサンプル、すなわち、被験サンプルを採取する際に事前に採取した生体サンプルである。
本発明においては、「発現を測定する」とは、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で測定することを意味する。また、この語は、ｓＣＤ１２７をタンパク質レベルで検出及び定量することを示すものである。この目的のために、ｓＣＤ１２７タンパク質の有無の判定、及び／又は、ｓＣＤ１２７タンパク質の発現の測定に応じて、当業者に周知のあらゆる検出及び／又は定量の方法を用いて本発明を実施することができる。ｓＣＤ１２７タンパク質の発現を測定する方法の例としては、特にＣｒａｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１８４，４６７９−４６８７に記載の方法が挙げられる。
特に、ｓＣＤ１２７の発現量の測定は、その発現の有無の判定及び／又はその発現量の定量を直接的又は間接的に行うことを可能にする、ｓＣＤ１２７に特異的なツール又は試薬を用いて行う。
ｓＣＤ１２７を検出及び／又は定量することを可能にする上記ツール又は試薬のなかでは、特に特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、例えば「一本鎖」抗体Ｓｖが挙げられる。
上記ツール又は試薬のなかでは、ＩＬ−７受容体の可溶型に特異的なもの、すなわち、該受容体の不溶性の細胞／膜型であるＣＤ１２７を認識しないものが特に好ましい。しかしながら、分析するサンプルの種類（例えば、血漿又は血清、対、細胞又は全血を含む生体サンプル）などの他の手段によって２つの型を識別することが可能であれば、ＩＬ−７受容体の可溶型ｓＣＤ１２７と細胞型ＣＤ１２７の両方を認識するツール又は試薬を使用することができる。
ｓＣＤ１２７の検出及び／又は定量をタンパク質レベルで行う際には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ＩＲＭＡ法、ＦＩＡ法、ＣＬＩＡ法、ＥＣＬ法、フローサイトメトリー又は免疫細胞学的手法などの標準的な手法を用いることができる。
ｓＣＤ１２７の発現をタンパク質レベルで、好ましくはＥＬＩＳＡ法を用いて、測定するのが特に有利である。
本発明において、特にこの特定の実施形態によれば、ｓＣＤ１２７の発現を、好ましくはモノクローナル又はポリクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体、特にモノクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体を用いて測定するのが好ましい。例えば、特にＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｒ）社から市販されているヒトＲ３４．３４モノクローナル抗ＣＤ１２７抗体や、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）社から市販されているポリクローナル抗ＣＤ１２７抗体が挙げられる。
ｓＣＤ１２７の発現の測定に関して上述した記載や好ましい形態は全て、該発現を被験サンプルや参照サンプルで測定する際にも同様に適用される。
第２の態様によれば、本発明の別の主題は、院内感染に対する患者の易感染性を判定するための、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でのｓＣＤ１２７の測定の使用である。
好ましくは、上記使用は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、好ましくは敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するためのものであるのが特に有利である。本発明の使用は、院内感染に対する敗血症性ショック患者の易感染性を判定できるものであるのが好ましい。
さらに、本発明の使用のために、ｓＣＤ１２７の発現をタンパク質レベルで、特にＥＬＩＳＡ法を用いて、測定するのが好ましい。
特に、ｓＣＤ１２７の発現は、モノクローナル又はポリクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体、好ましくはモノクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体を用いて測定してもよい。この本発明の第２の態様においても、上述した抗体を使用することができる。
より広義には、上記方法やその組合せに関する上述の全ての好ましい実施形態もまた、本発明の使用の好ましい実施形態を構成する。
第３の態様によれば、本発明の別の主題は、生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で測定するためのキットであって、
・上記生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定することを可能にする特異的ツール又は試薬と、
・院内感染していることが分かっている患者から採取したサンプルのプールで測定された平均量に相当する量のｓＣＤ１２７を含むように調整されたサンプルである陽性対照サンプル、及び／又は、院内感染していないことが分かっている患者から採取したサンプルのプールで測定された平均量に相当する量のｓＣＤ１２７を含むように調整されたサンプルである陰性対照サンプルと
を含むキットである。
したがって、本発明のキットは、上記生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定することを可能にする特異的ツール又は試薬と、少なくとも１つの対照サンプルとを含む。
本発明のキットは、特に、患者、とりわけ敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定できる。
生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定することを可能にする、本発明のキットに含まれる特異的ツール又は試薬は、ｓＣＤ１２７の発現をタンパク質レベル又はｓＣＤ１２７活性レベル、好ましくはタンパク質レベルで検出及び／又は定量することを可能にするものが好ましい。
特に好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、モノクローナル又はポリクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体、特にモノクローナル抗体を含む。
他の陽性対照サンプルとして、院内感染していることが分かっている患者から採取したサンプルも挙げられる。同様に、他の陰性対照サンプルとして、院内感染していないことが分かっている患者から採取したサンプルも挙げられる。陽性対照であれ陰性対照であれ、この種の対照サンプルは、１人又は複数の集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた１人又は複数の患者、特に１人又は複数の敗血症患者、好ましくは１人又は複数の敗血症性ショック患者から採取するのが好ましい。例えば、上記キットは、１人又は複数の集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた１人又は複数の患者であって、院内感染していないことが分かっている患者、特に院内感染していないことが分かっている１人又は複数の敗血症性ショック患者から採取した陰性対照サンプルを含んでいてもよい。
上記キットは、陽性対照サンプルと陰性対照サンプルの両方、特に、上述のように調整したサンプルからそれぞれ選択される陽性対照サンプルと陰性対照サンプルの両方を含んでいるのが好ましい。
また本発明は、本発明の方法を実施するための、特に院内感染に対する患者の易感染性を判定するための、本発明のキットの使用も包含する。上記使用は、好ましくは、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、好ましくは敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するための使用である。本発明のキットの使用は、院内感染に対する敗血症性ショック患者の易感染性を判定できるものであるのが好ましい。
上記方法やその組合せに関する上述の全ての好ましい実施形態もまた、本発明のキット及びその使用の好ましい実施形態を構成する。
他の種々の特徴は、本発明の主題の実施形態を例示的に説明した付属の図面（ただし本発明はこの例に限定されない）を参照して、以下の説明から明らかになるであろう。
ＩＬ−７の血漿中濃度について、３５人の敗血症性ショック患者（１〜２日目（１−２）及び３〜４日目（３−４））の結果と、３０人の健常ボランティア（ＨＶ）の結果を示す。“ＨＶ”に対して＊＊ｐ＜０．００５（マン・ホイットニーのＵ検定） 上記結果の“ＮＳ”患者群と“Ｓ”患者群との比較を示す。 上記結果の“ＮＩ” 患者群と“Ｎｏ ＮＩ”患者群との比較を示す。 ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ１２７の発現について、３５人の敗血症性ショック患者（１〜２日目及び３〜５日目）の結果と、３０人の健常ボランティア（ＨＶ）の結果を示す。§ｐ＜０．０５（１つの同一患者群内の経時変化（ウィルコクソンの対応のあるｔ検定）） ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ１２７の発現について、３５人の敗血症性ショック患者（１〜２日目及び３〜５日目）の結果と、３０人の健常ボランティア（ＨＶ）の結果を示す。“ＨＶ”に対して＊ｐ＜０．０５（マン・ホイットニーのＵ検定） ｓＣＤ１２７の血漿中濃度について、３５人の敗血症性ショック患者（１〜２日目及び３〜４日目）の結果と、３０人の健常ボランティアの結果を示す。§§ｐ＜０．００５（１つの同一患者群内の経時変化（ウィルコクソンの対応のあるｔ検定）） 上記結果の“ＮＳ”患者群と“Ｓ”患者群との比較を示す。§ｐ＜０．０５ §§ｐ＜０．００５（１つの同一患者群内の経時変化（ウィルコクソンの対応のあるｔ検定）） 上記結果の“ＮＩ”患者群と“Ｎｏ ＮＩ”患者群との比較を示す。“Ｎｏ ＮＩ”に対して＃ｐ＜０．０５ ＃＃ｐ＜０．００５（マン・ホイットニーのＵ検定）；§§ｐ＜０．００５（１つの同一患者群内の経時変化（ウィルコクソンの対応のあるｔ検定）） ＨＬＡ−ＤＲマーカーの発現について、３５人の敗血症性ショック患者（１〜２日目及び３〜４日目）の結果と、３０人の健常ボランティアの結果を“ＮＩ”又は“Ｎｏ ＮＩ”患者群によって示す。
＜方法＞
＜ＩＬ−７の血漿中濃度の測定＞
ＩＬ−７の血漿中濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から市販されているＬＵＭＩＮＥＸ（ＴＭ）法を利用したキット（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ サイトカイン／ケモカイン／成長因子アッセイ：ＢｉｏＰｌｅｘ Ｐｒｏ試薬キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７１−３０４０７０）及びシングルプレックスＩＬ−７）を用いて、サプライヤーの使用説明書に従って測定した。
＜ＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）の細胞発現の測定＞
手短に言うと、全血５０μｌを、フィコエリトリン−テキサスレッド（ＥＣＤ）と結合した抗ＣＤ４抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、＃６６０４７２７）５μｌ、又は、ＥＣＤを結合した抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、＃７３７６５９）５μｌと、フィコエリトリン（ＰＥ）と結合した抗ＣＤ１２７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、＃ＩＭ１９８０Ｕ）１０μｌとの存在下、室温、暗所で１５分間インキュベートした。次に赤血球を低張溶解液により溶血させ、自動ＴＱ−Ｐｒｅｐシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて自動溶血により細胞を固定した。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上でのＣＤ１２７の膜発現は、フローサイトメトリーによって測定した。
＜ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−７受容体の可溶型（ｓＣＤ１２７）のアッセイ＞
コーティング
５００ｍｌの水中に０．８ｇのＮａ２ＣＯ３、１．４ｇのＮａＨＣＯ３、０．１ｇのＮａＮ３を含むように、コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）を調製した。
コーティング緩衝液で希釈した捕獲抗体（Ａｂ）（マウスモノクローナル抗体、抗ＣＤ１２７、ヒト、Ｒ３４．３４、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｒ）社）１００μＬをアッセイプレートの各ウェルに入れた（［Ａｂ］＝８μｇ／ｍＬ）。それから、プレートにカバーをかけて４℃で一晩インキュベートした。
その後、ウェルの内容物を吸引し、少なくとも３００μＬの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄用緩衝液で３回ウェルを洗浄した。洗浄毎に全ての液体を注意深く除去した。最後の洗浄の後、プレートを吸収紙上にひっくり返して、痕跡量の緩衝液を全て除去した。
ブロッキング
各ウェルごとに１５０μＬのブロッキング緩衝液（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて非特異的な固定をブロッキングした後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
再度、ウェルの内容物を吸引し、少なくとも３００μＬの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄用緩衝液で３回ウェルを洗浄した。洗浄毎に全ての液体を注意深く除去した。最後の洗浄の後、プレートを吸収紙上にひっくり返して、痕跡量の緩衝液を全て除去した。
サンプル及び対照
Ｃ．Ｊａｎｏｔ−Ｓａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，２８，１１５−１２３に従って、下記表１に示すように、５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ希釈用緩衝液で希釈した組換えヒトＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：３０６−ＩＲ）を用いて参照範囲を得た。
Figure 2015513097
１００μＬのサンプル又は対照（即時再構成し、６０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度で分注したＣＤ１２７Ｆｃキメラの溶液）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
再度、ウェルの内容物を吸引し、少なくとも３００μＬの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄用緩衝液で３回ウェルを洗浄した。洗浄毎に全ての液体を注意深く除去した。最後の洗浄の後、プレートを吸収紙上にひっくり返して、痕跡量の緩衝液を全て除去した。
検出抗体
ＰＢＳ／５％ＦＢＳで希釈した検出抗体（１％ＴＢＳ−ＢＳＡ１ｍＬで再構成したビオチン化ポリクローナル抗ＣＤ１２７ヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）社））１００μＬを各ウェルに加え（［Ａｂ］＝２００ｎｇ／ｍＬ）、次にプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
再度、ウェルの内容物を吸引し、少なくとも３００μＬの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄用緩衝液で３回ウェルを洗浄した。洗浄毎に全ての液体を注意深く除去した。最後の洗浄の後、プレートを吸収紙上にひっくり返して、痕跡量の緩衝液を全て除去した。
検出
１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを各ウェルに添加した（［ストレプトアビジン−ＨＲＰ］＝８μＬ／ｍＬ）。プレートにカバーをかけて室温で３０分間インキュベートした。
再度、ウェルの内容物を吸引し、少なくとも３００μＬの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０洗浄用緩衝液で３回ウェルを洗浄した。洗浄毎に全ての液体を注意深く除去した。最後の洗浄の後、プレートを吸収紙上にひっくり返して、痕跡量の緩衝液を全て除去した。この洗浄工程では、吸引前にウェルに洗浄用緩衝液を１〜２分間しみ込ませた。
２本の瓶のＴＭＢ発色基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、＃ＸＸ７ＬＦ１ＵＣ）を等体積で混合した。この基質溶液１００μＬを各ウェルに入れた。プレートにカバーをかけて室温で３０分間インキュベートした。
最後に、４５０ｎｍでの吸光測定によりプレートの読み取りを行った。
＜ＨＬＡ−ＤＲの単球発現の測定＞
測定は、フローサイトメトリー法を用いてＥＤＴＡ加全血の直接染色によって行った。
以下の２つの抗体を５０μＬの全血とともに（室温、暗所で３０分間）インキュベートした。
・５μＬのフルオレセイン結合抗ＣＤ１４抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、Ｒｅｆ．：ＩＭ０６４５）。これにより、白血球の中から単球を同定することができる。
・１０μＬのフィコエリトリン結合抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｒｅｆ．：３４７４０１）。これにより、細胞表面上でのＨＬＡ−ＤＲ発現を定量できる。
次に赤血球を除去した。１ｍｌの溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社により参照番号３４９２０２で市販されている）を１：１０の希釈率で加えて（室温、暗所で１５分間）溶血させた。
次に、この細胞をフローサイトメーター（ＦＣ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で分析した。
結果を陽性細胞に対する百分率（％）として表す。陽性の閾値はアイソタイプ対照（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ ＰＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｒｅｆ．：３４９０５３）によって決定した。
結果
敗血症性ショック発症後１〜２日目及び３〜４日目の３５人の敗血症性ショック患者から血漿サンプルを採取した後、保管した（後ろ向きコホート）。ＩＬ−７及びｓＣＤ１２７の各血漿中濃度、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ１２７の発現、単球でのＨＬＡ−ＤＲの発現などの異なるパラメータやマーカーを測定した。敗血症性ショックで集中治療室に入院してから２８日後時点で、３５人の患者のうち１３人（３７％）の患者は死亡し（“ＮＳ”）、２２人の患者は生存していた（“Ｓ”）。６人（１７％）の患者が院内感染し（“ＮＩ”）、２９人の患者は院内感染の発症を免れていた（“Ｎｏ ＮＩ”）。
同じ測定を３０人の健常ボランティア（ＨＶ）にも行った。
得られた結果をこれらのボランティア又は患者の異なる母集団に対するマン・ホイットニーのＵ検定を用いて比較し、付属の図１〜４にまとめた。
この結果によれば、二次感染した患者のＩＬ−７の血漿中濃度は、院内感染を発症しなかった患者と比較して、１〜２日目では有意に減少しているが、３〜４日目では有意ではなかった（図１Ｃ）。一方、生存患者（“Ｓ”）と死亡患者（“ＮＳ”）の間では変化がないままであった。
さらに、ＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）の細胞での発現は、敗血症性ショック発症後も維持され（図２Ａ及び２Ｂ）、生存患者（“Ｓ”）と死亡患者（“ＮＳ”）の間に差はなく、院内感染した患者（“ＮＩ”）と院内感染しなかった患者（“Ｎｏ ＮＩ”）の間にも差はなかった（結果はここには示していない）。
敗血症性ショック発症時に見られたＩＬ−７受容体の可溶型すなわちｓＣＤ１２７の血漿中濃度のわずかな増加は、統計学的に有意なものではなく、時間の経過とともに「正常」値に戻った（図３Ａ）。
一方、ｓＣＤ１２７の血漿中濃度は生存患者（“Ｓ”）と死亡患者（“ＮＳ”）の間では変化がないままなのに対し（図３Ｂ）、院内感染した“ＮＩ”患者のｓＣＤ１２７の血漿中濃度は、院内感染しなかった“Ｎｏ ＮＩ”患者と比較して顕著に増加した（図３Ｃ）。
また、院内感染した“ＮＩ”患者では、ｓＣＤ１２７の血漿中濃度が時間が経過しても変化しないが（１〜２日目と３〜４日目の間）、これは院内感染しなかった“Ｎｏ ＮＩ”患者とは対照的である（図３Ｃ）。
比較のために、同一コホートの患者において従来技術のマーカーＨＬＡ−ＤＲの発現について検討したが、従来技術で明確に確立されている知見に反し、院内感染した“ＮＩ”患者と院内感染しなかった“Ｎｏ ＮＩ”患者の間ではこのマーカーの発現が減少するという証拠は得られなかった（図４）。
この違いは、おそらくここで検討したコホートのサイズが従来技術の検討において分析されたコホートと比べて小さいことに関連していると思われるが、この違いはＨＬＡ−ＤＲと比べてｓＣＤ１２７マーカーが適切であることを実証している。ここで検討したコホートのサイズの違いはあれ、この結果は、本発明によるｓＣＤ１２７の発現の検討が、院内感染に対する患者の易感染性に関して有益な情報を与えるものであることを示している。
したがって、これら全ての結果は、ｓＣＤ１２７の発現の測定は、患者、特に、集中治療室入院患者、及び／又は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害（手術、やけど、外傷など）を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者、好ましくは敗血症性ショック患者の院内感染に対する易感染性を判定するために有益な免疫学的マーカーであることを示している。
本発明は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の改良が可能であることから、本明細書に記載し、例示した実施例に限定されるものではない。

Claims (24)

  1. 院内感染に対する患者の易感染性を判定するための方法であって、
    前記患者から採取した生体サンプル又は被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定する工程と、
    ｓＣＤ１２７の発現を参照値と比較した後に、院内感染に対する易感染性が高いと結論づける工程と
    を含む方法。
  2. 前記生体サンプルは、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者から採取したものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生体サンプルは、敗血症性ショック患者から採取したものであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 第１の参照値と比較してｓＣＤ１２７が前記被験サンプル中で過剰発現していることが明らかになった場合に、院内感染に対する易感染性が高いと結論づけることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記第１の参照値は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群すなわちＳＩＲＳを生じさせる傷害を受けた患者であって、院内感染していないことが分かっている患者、特に院内感染していないことが分かっている敗血症患者から採取した生体サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現量に相当するか、又は、該患者から採取したサンプルのプールで測定されたｓＣＤ１２７発現量の平均値に相当することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１の参照値は、院内感染していないことが分かっている敗血症性ショック患者から採取した生体サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現量に相当するか、又は、該患者から採取したサンプルのプールで測定されたｓＣＤ１２７発現量の平均値に相当することを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定、及び、必要であれば前記第１の参照値を得るために使用する前記生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定は、敗血症性ショック発症後１０日以内又は１０日目（Ｄ１０）、好ましくは敗血症性ショック発症後７日以内又は７日目（Ｄ７）、より好ましくは敗血症性ショック発症後４日以内又は４日目（Ｄ４）、さらに好ましくは敗血症性ショック発症後３日以内又は３日目（Ｄ３）に行うことを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記被験サンプルで測定されたｓＣＤ１２７の発現が第２の参照値と比較して有意に減少していない場合、好ましくは、前記被験サンプルで測定されたｓＣＤ１２７の発現の減少率が前記第２の参照値と比較して２５％以下、好ましくは２０％以下の場合に、院内感染に対する易感染性が高いと結論づけることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記第２の参照値は、前記同一患者から事前に採取した生体サンプル、すなわち前記被験サンプルの採取よりも前に採取した生体サンプルで測定されたｓＣＤ１２７発現量に相当することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 前記被験サンプル中のｓＣＤ１２７の発現の測定は、敗血症性ショック発症後１０日目又は約１０日目（Ｄ１０）、好ましくは敗血症性ショック発症後７日目又は約７日目（Ｄ７）、より好ましくは敗血症性ショック発症後４日目又は約４日目（Ｄ４）に行うことを特徴とする、請求項３、８又は９に記載の方法。
  11. 前記事前のサンプル採取は、敗血症性ショック発症後４８時間以内又は４８時間経過時であって、前記被験サンプルの採取の２４時間以上前に行うことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記事前のサンプル採取は、敗血症性ショック発症後４８時間以内又は４８時間経過時に行われ、前記被験サンプルの採取は、前記事前のサンプル採取後４８時間以内又は４８時間経過時に行われることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記患者から採取した前記被験サンプルは血漿サンプル又は血清サンプルであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ｓＣＤ１２７の発現をタンパク質レベルで、好ましくはＥＬＩＳＡ法を用いて、測定することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ｓＣＤ１２７の発現を抗ｓＣＤ１２７抗体、特にモノクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体を用いて測定することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 院内感染に対する患者の易感染性を判定するための、イン・ビトロ又はエクス・ビボでのｓＣＤ１２７の測定の使用。
  17. 前記患者は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた患者、特に敗血症患者、なかでも重症敗血症患者であることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
  18. 前記患者は敗血症性ショック患者であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
  19. ｓＣＤ１２７の発現をタンパク質レベルで、好ましくはＥＬＩＳＡ法を用いて、測定することを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の使用。
  20. ｓＣＤ１２７の発現を抗ｓＣＤ１２７抗体、好ましくはモノクローナル抗ｓＣＤ１２７抗体を用いて測定することを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の使用。
  21. 生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現をイン・ビトロ又はエクス・ビボで測定するためのキットであって、
    前記生体サンプル中のｓＣＤ１２７の発現を測定することを可能にする特異的ツール又は試薬と、
    院内感染していることが分かっている患者から採取したサンプルのプールで測定された平均量に相当する量のｓＣＤ１２７を含むように調整されたサンプルである陽性対照サンプル、及び／又は、院内感染していないことが分かっている患者から採取したサンプルのプールで測定された平均量に相当する量のｓＣＤ１２７を含むように調整されたサンプルである陰性対照サンプルと
    を含むキット。
  22. 前記特異的ツール又は試薬は、ｓＣＤ１２７の発現を、好ましくはタンパク質レベルで、検出及び／又は定量化することを可能にすることを特徴とする、請求項２１に記載のキット。
  23. 院内感染に対する患者の易感染性を判定するための、請求項２１又は２２に記載されるようなキットの使用であって、前記患者は、集中治療室入院患者、及び／又は、手術、やけど、外傷などの、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を生じさせる傷害を受けた患者である、使用。
  24. 院内感染に対する敗血症性ショック患者の易感染性を判定するための、請求項２３に記載のキットの使用。
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