BR122021026851B1 - Processo de determinação in vitro da susceptibilidade a infecções nosocomiais - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se a um processo de determinação da susceptibilidade a infecções nosocomiais em um paciente, compreendendo a medição da expressão de sCD127 em uma amostra biológica.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao domínio médico em geral e, em particular, ao domínio da reanimação.

[0002] Mais precisamente, a invenção refere-se a um processo de determinação da susceptibilidade às infecções nosocomiais em um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica ou SIRS, em particular em um paciente em estado séptico, notadamente severo, e preferivelmente um paciente em choque séptico.

[0003] As infecções nosocomiais são um problema de saúde pública significante. Os pacientes hospitalizados têm com frequência, por natureza, defesas imunes diminuídas ou alteradas, devido às patologias podendo diretamente atingir as suas competências imunes, ou devido ao seu estado geral. Estes pacientes e, em particular, as pessoas desnutridas ou com idades extremas de vida (pessoas idosas, lactentes) são especialmente sensíveis às infecções em geral e, em particular, ao aparecimento de infecções nosocomiais.

[0004] A predominância das infecções nosocomiais é claramente mais elevada nas unidades de reanimação que a observada em outros setores hospitalares. A incidência considerável das infecções nosocomiais neste setor explica-se pela conjunção deletéria dos vários fatores de risco endógenos: uma exposição do paciente a procedimentos invasivos (ventilação artificial, sonda urinária, cateterismo), a gravidade dos pacientes (bem como as co-morbidades associadas) e as terapêuticas (transfusões múltiplas, sedação). No entanto, apesar do conjunto das medidas de higiene e de vigilância (riscos exógenos) e a consideração destes fatores de risco endógenos, a incidência das infecções nosocomiais permanece estável ou diminui modestamente.

[0005] Determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais é, portanto essencial para poder propor uma decisão personalizada e, assim, tentar minimizar os riscos adicionais de falecimentos.

[0006] De acordo com o conhecimento dos inventores, o único marcador imunológico atualmente conhecido para ser associado a uma susceptibilidade aumentada às infecções nosocomiais é o marcador HLA-DR (Human Leukocyte Antigen-DR) cuja expressão sobre os monócitos (mHLA-DR) é diminuída nos pacientes que desenvolvem infecções nosocomiais. Contudo, a expressão deste marcador, desenvolvida em citometria em fluxo necessita um equipamento específico (citômetro em fluxo), que não está disponível sobre os patamares de biologia (uso reservado a laboratórios especializados de hematologia ou de imunologia) e cuja normalização de utilização não é estabelecida. A medição de mHLA-DR não pode, portanto, ser realizada como rotina.

[0007] Assim, existe uma real necessidade de dispor de outros marcadores imunológicos que permitem prever, de modo fácil e rápido, a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais. Com efeito, poder identificar os indivíduos com maior risco de contrair infecções nosocomiais permitiria reservar aos mesmos terapêuticas preventivas mais adaptadas e mais alvo-marcadas.

[0008] É neste contexto que a presente invenção propõe-se fornecer um novo biomarcador preventivo de um risco aumentado às infecções nosocomiais em um paciente, e notadamente um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão (cirurgia, queimadura, traumatismo...) gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS), em particular em um paciente em estado séptico, notadamente severo e, preferivelmente, em um paciente em choque séptico. O estudo do nível de expressão deste biomarcador permite assim determinar, de modo fácil e rápido, a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais e tomar as disposições preventivas necessárias.

[0009] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção tem, portanto, por objeto um processo de determinação da susceptibilidade às infecções nosocomiais em um paciente, compreendendo as etapas seguintes:

[0010] - medir a expressão de sCD127 em uma amostra biológica proveniente do referido paciente ou amostra a testar,

[0011] - concluir por uma susceptibilidade aumentada às infecções nosocomiais após comparação da expressão de sCD127 em relação a um valor de referência.

[0012] O processo de determinação da susceptibilidade às infecções nosocomiais de acordo com a invenção é, portanto, um processo realizado in vitro ou in vivo.

[0013] O sCD127 é a forma solúvel ou plasmática do CD127, receptor IL-7. O CD127 ou cadeia alfa do receptor IL-7 é uma glicoproteína de 75 kDa membro do superfamília dos receptores aos fatores de crescimento hematopoiéticos. Ele é expresso em nível de membrana em associação com o CD 132 (cadeia yc comum) para formar o receptor de ITL-7. Este receptor desempenha um papel importante na diferenciação, a sobrevivência e a proliferação linfocítica. O CD 127 é constituído de uma parte extracelular de 219 aminoácidos (aa), uma parte transmembranar de 25 aa e uma parte intracitoplásmica de 195 aa. A existência de uma forma solúvel/plasmática, nomeada sCD127, gerada por emenda alternativa do mRNA codificando o CD127 foi descrita em 1990 por Goodwin RG et al., Cell, 1990, 23, 941-951, mas a sua função biológica continua até agora pouco conhecida.

[0014] Entende-se por “infecção nosocomial”, qualquer infecção, principalmente bacteriana, mas igualmente viral e fúngica, que ocorre em um estabelecimento de saúde durante ou no decurso de uma intervenção (diagnóstico, terapêutico, paliativo, preventivo ou educativo), de um paciente, e que não estava nem presente nem em incubação no início do evento. Quando o estado infeccioso não é conhecido com precisão no início da intervenção, um prazo pelo menos de 48 horas ou um prazo superior ao período de incubação é aceito correntemente para definir uma infecção nosocomial.

[0015] No sentido da invenção, entende-se por “resposta inflamatória sistêmica” ou “SIRS”, uma resposta associando pelo menos dois dos critérios seguintes: Temperatura > 38 °C ou < 36 °C, Frequência cardíaca > 90/minutos, Frequência respiratória > 20/minuto ou paCO2 <32 mmHg, Leucócitos > 12.000/mm3 ou < 4.000/mm3 (Bone et al., Chest, 1992, 1644-1655.

[0016] No âmbito da invenção, entende-se “sCD127” a forma solúvel ou forma circulante (ainda chamada forma plasmática ou sérica) do receptor de IL-7, ainda chamado cadeia alfa do receptor de IL-7 ou IL7R ou IL7R-ALPHA ou IL7RA ou CDW127e, em particular, como descrito por Goodwin et al., Cell, 1990, 23, 941-951 e dosado por Crawley et al., Journal of Immunology, 2010, 184, as 4679-4687.

[0017] Em particular, as sequências nucléicas de referência para sCD127 de acordo com a invenção são preferivelmente as seguintes: Ensembl: ENSG00000168685, HPRD-ID: 00893 Sequência nucleotídica: N 002185,2, Vega genes: OTTHUMG00000090791.

[0018] Além disso, as sequências protéicas de referência para sCD127 de acordo com a invenção são preferivelmente as seguintes: NP_002176 XP_942460; versão: NP_002176.2 GI: 28610151.

[0019] A amostra a testar no âmbito do processo da invenção é uma amostra biológica proveniente do paciente do qual se deseja determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais. Em particular, tal amostra biológica é escolhida entre os susceptíveis de conter o marcador sCD127.

[0020] A presente invenção apresenta uma aplicação particularmente preferida junto aos pacientes hospitalizados em reanimação e/ou que sofreram uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica ou SIRS. Portanto, a amostra biológica realizada no âmbito do processo da invenção é preferivelmente proveniente de um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão (cirurgia, queimadura, traumatismo.) gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS), em particular proveniente de um paciente em estado séptico, notadamente severo e, em particular, proveniente de um paciente em choque séptico. De modo particularmente preferido, a amostra biológica realizada no âmbito do processo da invenção é proveniente de um paciente em choque séptico.

[0021] De acordo com um primeiro modo de realização preferido, o processo da invenção permite determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais, isto é, concluir a um risco aumentado de desenvolver uma infecção nosocomial ou uma susceptibilidade aumentada para as infecções nosocomiais, quando uma superexpressão de sCD127 é evidenciada na amostra a testar em relação a um primeiro valor de referência.

[0022] Por “superexpressão”, entende-se um aumento estatisticamente significativo do nível de expressão.

[0023] Neste modo de realização, o primeiro valor de referência pode corresponder ao nível de expressão de sCD127 medido em uma amostra biológica proveniente de um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica ou SIRS que, como se sabe, não desenvolveu infecção nosocomial, notadamente de um paciente em estado séptico que, como se sabe, não desenvolveu infecção nosocomial, e preferivelmente de um paciente em choque séptico que, como se sabe, não desenvolveu infecção nosocomial. Neste caso, esta medição da expressão de sCD127 que constitui o primeiro valor de referência é preferivelmente efetuada em paralelo, isto é, ao mesmo tempo que a medição da expressão de sCD127 que é realizada na amostra proveniente do paciente no qual se procura determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais, embora a tomada da amostra de referência tenha sido efetuada anteriormente à da amostra a testar.

[0024] Este primeiro valor de referência pode igualmente corresponder a um valor médio do nível de expressão de sCD127 que é medido sobre um “pool” de amostras proveniente de pacientes hospitalizados em reanimação e/ou que sofreram uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo., gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS) que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial, notadamente de pacientes em estado séptico que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial, e preferivelmente de pacientes em choque séptico que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial. Neste caso, esta medição da expressão de sCD127 que constitui o primeiro valor de referência preferivelmente é efetuada previamente à medição da expressão de sCD127 que é realizada na amostra proveniente do paciente junto ao qual se procura determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais, embora a tomada das amostras de referência destinadas a serem agrupadas em “pools” seja efetuada anteriormente à da amostra a testar.

[0025] Neste primeiro modo de realização preferido, e notadamente para determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais de um paciente em choque séptico, a medição da expressão de sCD127 na amostra a testar e, conforme o caso, na amostra biológica utilizada para obter o primeiro valor de referência, isto é, quando o primeiro valor de referência é obtido a partir de uma amostra biológica, é realizada nos 10 dias ou a 10 dias (D10) após o choque séptico, preferivelmente nos 7 dias ou a 7 dias (D7) após o choque séptico, de modo ainda preferido nos 4 dias ou a 4 dias (D4) após o choque séptico e, em particular, nos 3 dias ou a 3 dias (D3) após o choque séptico.

[0026] De acordo com um segundo modo de realização preferido, o processo da invenção permite determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais, isto é, concluir a um risco aumentado de desenvolver uma infecção nosocomial ou uma susceptibilidade aumentada às infecções nosocomiais, quando a expressão de sCD127, que é medida na amostra a testar, não é diminuída significativamente em relação a um segundo valor de referência. De modo particularmente preferido, conclui-se a um risco aumentado de desenvolver uma infecção nosocomial se a expressão de sCD127, que é medida na amostra a testar, não for diminuída em mais de 25%e, em particular, não diminuída em mais de 20%, em relação a este segundo valor de referência.

[0027] Este segundo valor de referência pode corresponder ao nível de expressão de sCD127 medido em uma amostra biológica proveniente do mesmo referido paciente quando de uma tomada anterior, isto é, em uma amostra biológica que foi tomada anteriormente em relação à amostra a testar. Por “anteriormente” ou “por anterior”, entende-se de modo mais precoce no tempo ou previamente à tomada da amostra a testar.

[0028] Neste segundo modo de realização preferido, e notadamente para determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais de um paciente em choque séptico, a medição da expressão de sCD127 na amostra a testar é realizada em cerca de ou a 10 dias (D10) após o choque séptico, preferivelmente em cerca de 7 ou a 7 dias (D7) após o choque séptico, preferivelmente ainda em cerca de 4 ou a 4 dias (34) após o choque séptico.

[0029] A tomada anterior pode, por exemplo, ser efetuada em 48 h ou a 48h após o choque séptico e pelo menos 24h antes à da amostra a testar, e preferivelmente a tomada anterior é efetuada em ou a 48h após o choque séptico e o da amostra a testar é efetuada nas 48h que seguem a tomada anterior ou a 48h após a tomada anterior.

[0030] Assim, todos os casos, antes da medição da expressão de sCD127 propriamente dita na amostra a testar, o processo da invenção pode compreender a obtenção prévia do valor de referência, quer seja o primeiro valor de referência ou o segundo valor de referência, em que o nível de expressão que será detectado na amostra a testar poderá ser comparado a fim de concluir em um risco aumentado ou não de desenvolver infecções nosocomiais no paciente do qual a amostra a testar é proveniente.

[0031] É, portanto, a estes valores de referência, quer seja o primeiro valor de referência ou o segundo valor de referência, obtidos previamente ou ao mesmo tempo, que será comparado o valor da expressão de sCD127 que é medido na amostra a testar.

[0032] A amostra sobre a qual o processo da invenção é implementado, ainda nomeada aqui amostra a testar, pode ser de origem animal ou humana, e preferivelmente humana.

[0033] Portanto, a amostra a testar pode ser de diferentes naturezas. Em particular, esta amostra é um líquido biológico, por exemplo escolhido entre o sangue, o sangue total (como coletado da via venosa, isto é, contendo as células brancas e vermelhas, as plaquetas e o plasma), o soro, o plasma e o líquido de lavagem broncoalveolar.

[0034] Preferivelmente, a amostra a testar proveniente do paciente é uma amostra de plasma ou de soro.

[0035] As amostras a partir das quais podem ser determinados os valores de referência, quer seja o primeiro valor de referência ou o segundo valor de referência, ainda nomeados “amostras de referência”, podem ser de diferentes naturezas e notadamente de natureza biológica tal como foi mencionada acima se tratando de amostra a testar (fluidos biológicos). Com vantagem, estas amostras biológicas são da mesma natureza que a da amostra biológica a testar ou no mínimo de uma natureza compatível para constituir uma referência quanto à detecção e/ou a quantificação da expressão de sCD127.

[0036] Para obter o primeiro valor de referência em particular, estas amostras são preferivelmente provenientes de pessoas tendo as mesmas características ou uma maioria de características comuns, notadamente do mesmo sexo e/ou de uma idade similar ou idêntica e/ou de mesma origem étnica, com as do indivíduo ou paciente em quem se deseja determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais. A amostra de referência pode igualmente neste caso ser constituída por qualquer amostra, biológica ou não biológica, que foi previamente calibrada para conter um valor médio de sCD127 correspondendo ao nível que foi medido sobre um “pool” de amostras biológicas provenientes de pacientes, hospitalizados em reanimação e/ou que sofreram uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS) que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial, notadamente de pacientes em estado séptico que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial, e preferivelmente de pacientes em estado séptico que, como se sabe, não desenvolveram de infecção nosocomial. Neste caso, e de acordo com uma variante particularmente preferida, a amostra de referência é proveniente de um ou de pacientes em choque séptico que, como se sabe, não desenvolveu (desenvolveram) infecção nosocomial.

[0037] Para obter o segundo valor de referência em particular, a amostra de referência é uma amostra biológica proveniente do mesmo referido paciente, isto é, do paciente em quem se deseja determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais e do qual é proveniente a amostra a testar, mas obtida partir de uma tomada anterior, isto é, de uma amostra biológica que foi tomada anteriormente no tempo em relação à amostra a testar.

[0038] No sentido da presente invenção, o termo “medir a expressão” é entendido como sendo uma medição in vitro ou in vivo. Além disso, este termo propõe-se designar ia detecção e a quantificação de sCD127 a nível proteico. Para esse efeito, qualquer método de detecção e/ou quantificação bem conhecido do versado na técnica pode ser utilizado para a implementação da invenção, quer seja em relação com a determinação da presença e/ou a medição da expressão da proteína sCD127. A título de exemplo do método de medição da expressão da proteína sCD127, pode- se notadamente citar o descrito por Crawley et al., Journal of Immunology, 2010, 184, 4679-4687.

[0039] Em particular, a medição do nível de expressão de sCD127 é realizada através de instrumentos ou reagentes que são específicos de sCD127 e que permitem, direta ou indiretamente, determinar a sua presença e/ou quantificar o seu nível de expressão.

[0040] Entre os instrumentos ou reagentes capaz(es) de detectar e/ou quantificar sCD127, pode-se notadamente citar anticorpos específicos, policlonais ou monoclonais, preferivelmente monoclonais, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, por exemplo dos anticorpos “cadeia simples” Sv.

[0041] Entre estes instrumentos ou reagentes, preferem-se notadamente os que são específicos da forma solúvel do receptor IL-7, isto é, que não reconhecem CD127 que é a forma celular/ membranar não solúvel deste receptor. Pode-se, no entanto, utilizar instrumentos ou reagentes que reconhecem ao mesmo tempo a forma solúvel ou sCD127 e a forma celular do receptor IL-7 ou CD127, enquanto for possível distinguir estas duas formas por outro meio, como por exemplo a natureza da amostra analisada (por exemplo, plasma ou soro versus amostra biológica contendo células ou sangue total).

[0042] Quando a detecção e/ou a quantificação de sCD127 é realizada a nível proteico, as técnicas padrões como o Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, citometria de fluxo ou imunocitologia podem ser utilizadas.

[0043] De modo particularmente vantajoso, a expressão de sCD127 é medida a nível proteico, e preferivelmente com a ajuda de uma técnica ELISA.

[0044] De acordo com a invenção e, em particular, neste modo de realização particular, o nível de expressão de sCD127 preferivelmente é medido com a ajuda de anticorpos anti-sCD127, monoclonais ou policlonais, e notadamente de anticorpos monoclonais anti-sCD127. Por exemplo, pode-se notadamente citar os anticorpos monoclonais anti-CD127 humano R34.34 comercializados pela empresa Beckman Coulter® ou os anticorpos policlonais anti-CD127 comercializados pela empresa R&D Systems®.

[0045] Todas as indicações e preferências mencionadas acima com referência à medição da expressão de sCD127 são aplicáveis indiferentemente quer seja para a medição desta expressão na amostra a testar e na amostra de referência.

[0046] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção tem igualmente por objeto a utilização da medição, in vitro ou in vivo, da expressão de sCD127 para determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais.

[0047] De modo preferido, esta utilização é particularmente vantajosa para determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais de um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica ou SIRS, em particular de um paciente em estado séptico, notadamente severo, e preferivelmente de um paciente em choque séptico. Preferivelmente, a utilização de acordo com a invenção permite determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais de um paciente em choque séptico.

[0048] Além disso, no âmbito da utilização de acordo com a invenção, a expressão de sCD127 é preferivelmente medida a nível proteico e, em particular, com a ajuda de uma técnica ELISA.

[0049] Em particular, a expressão de sCD127 pode ser medida com a ajuda de anticorpos anti-sCD127, monoclonais ou policlonais, e preferivelmente de anticorpos monoclonais anti-sCD127. Os anticorpos citados acima podem igualmente ser utilizados para este segundo aspecto da invenção.

[0050] Mais amplamente, todos os modos de realização preferidos que são mencionados acima com relação ao processo e suas combinações constituem igualmente modos de realização preferidos tratando-se de sua utilização.

[0051] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção tem também por objeto um kit para a medição, in vitro ou in vivo, da expressão de sCD127 em uma amostra biológica, compreendendo:

[0052] - instrumentos ou reagentes específicos permitindo medir a expressão de sCD127 na referida amostra biológica, e

[0053] - uma amostra controle positivo que é uma amostra calibrada para conter a quantidade de sCD127 que corresponde à quantidade média medida em um “pool” de amostras de pacientes, que, como se sabe, desenvolveram uma infecção nosocomial, e/ou uma amostra controle negativo que é uma amostra calibrada para conter a quantidade de sCD127 que corresponde à quantidade média medida em um “pool” de amostras de pacientes, que, como se sabe, não desenvolveram uma infecção nosocomial.

[0054] Assim, o kit de acordo com a invenção compreende instrumentos ou reagentes específicos permitindo medir a expressão de sCD127 na referida amostra biológica e, pelo menos, uma amostra controle.

[0055] O kit de acordo com a invenção permite em particular determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais em um paciente, e notadamente um paciente em choque séptico.

[0056] Preferivelmente, os instrumentos ou reagentes específicos permitindo medir a expressão de sCD127 em uma amostra biológica que estão presentes no kit da invenção permitem detectar e/ou quantificar a expressão de sCD127, quer seja a nível proteico ou a nível da atividade de sCD127, e preferivelmente a nível proteico.

[0057] De acordo com um modo de realização particularmente preferido, o kit da invenção contém anticorpos anti-sCD127, monoclonais ou policlonais e, em particular, anticorpos monoclonais.

[0058] Outra amostra controle positivo pode igualmente ser uma amostra proveniente de um paciente que, como se sabe, desenvolveu uma infecção nosocomial. Do mesmo modo, outra amostra controle negativo pode igualmente ser uma amostra proveniente de um paciente que, como se sabe, não desenvolveu infecção nosocomial. Quer seja para um controle positivo ou negativo, este tipo de amostra controle é preferivelmente proveniente de um ou de vários paciente(s) hospitalizado(s) em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo..., gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS), notadamente de um ou de vários paciente(s) em estado séptico, e preferivelmente de um ou de vários paciente(s) em choque séptico. Por exemplo, o kit pode conter uma amostra controle negativo proveniente de um ou de vários paciente(s) hospitalizado(s) em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo., gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS), que, como se sabe, não desenvolveu (desenvolveram) infecção nosocomial, em particular proveniente de um ou de vários paciente(s) em choque séptico que, como se sabe, não desenvolveu (desenvolveram) infecção nosocomial.

[0059] De modo preferido, o kit compreende ao mesmo tempo uma amostra controle positivo e uma amostra controle negativo sendo, em particular, escolhidas, cada uma entre as amostras calibradas como definido acima.

[0060] A invenção cobre igualmente a utilização de um kit de acordo com a invenção para realizar o processo da invenção e, em particular, para determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais, preferivelmente em um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo., gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS), em particular em um paciente em estado séptico, notadamente severa, e preferivelmente um paciente em choque séptico. Preferivelmente, a utilização do kit de acordo com a invenção permite determinar a susceptibilidade às infecções nosocomiais em um paciente em choque séptico.

[0061] Todos os modos de realização preferidos que são mencionados acima com relação ao processo e suas combinações constituem igualmente modos de realização preferidos tratando-se do kit de acordo com a invenção e a sua utilização.

[0062] Diversas outras características surgem da descrição feita abaixo em referência às figuras em anexo que mostram, a título de exemplos não limitativos, formas de realização do objeto da invenção e em que:

[0063] - a figura 1 representa a concentração IL-7 plasmático em 35 pacientes em choque séptico em dias 1-2 (1-2) e 3-4 (3-4) e 30 indivíduos sãos “HV” (A) e a comparação destes resultados de acordo com os grupos de pacientes “NS” ou “S” (figura 1B) e os grupos de pacientes “NI” ou “Não NI” (figura 1C). ** p<0,005 versus “HV” - Teste U de Mann Whitney;

[0064] - a figura 2 representa a expressão de CD127 sobre as células T CD4+ (figura 2A) e sobre as células T CD8* (figura 2B) em 35 pacientes em choque séptico em dias 1-2 e 3-5 e 30 indivíduos sãos “HV”. *p<0,05 versus “HV” - Teste U de Mann Whitney; § p<0,05 - evolução no tempo em um mesmo grupo de pacientes - Wilcoxon paired t-test .

[0065] - a figura 3 representa a concentração de sCD127 plasmático em 35 pacientes em choque séptico em dias 1-2 e 3-4 e 30 indivíduos sãos (figura 3A) e a comparação destes resultados de acordo com os grupos de pacientes “NS” ou “S” (figura 3B) e os grupos de pacientes “NI” ou “Não NI” (figura 3C). # p<0,05 ## p<0,005 versus “Não NI” - Teste U de Mann Whitney; § p<0,05 §§ p<0,005 - evolução no tempo em um mesmo grupo de pacientes - Wilcoxon paired t-test.

[0066] - a figura 4 representa a expressão do marcador HLA-DR em 35 pacientes em choque séptico em dias 1-2 e 3-4 e 30 indivíduos sãos de acordo com os grupos de pacientes “NI” ou “Não NI”.

MÉTODOS Medição da concentração em IL-7 plasmático

[0067] A concentração de IL-7 plasmático foi medida graças a um kit que utiliza a técnica LUMINEX™ comercializado pela empresa BioRad (Bio-Plex Pro Cytokine, Chemokine and Growth Factor Assays: BioPlex Pro Reagent Kit, BioRad #171-304070 e SinglePlex IL-7) seguindo as instruções do fornecedor.

Medição da expressão celular do receptor de IL-7 (CD127)

[0068] Resumidamente, 50μl de sangue total são incubados na presença de 5μl de Ac anti-CD4 copulado Ficoeritina-TexasRed (ECD) (BeckmanCoulter #6604727) ou de 5μl de Ac anti-CD8 copulado ECD (BeckmanCoulter #737659) bem como 10 μl de Ac anti-CD127 copulado a ficoeritrina (PE) (BeckmanCoulter #IM1980U) durante 15 minutos a temperatura ambiente e no escuro. Os glóbulos vermelhos depois são lisados graças a uma lise hipotônica e as células fixadas graças a uma lise automática realizada sobre um autômato TQ-Prep (BeckmanCoulter). A expressão de membrana de CD127 na superfície de linfócitos T CD4+ ou CD8+ é, por fim, medida por citometria em fluxo. Dosagem da forma solúvel do receptor IL-7 (sCDX27) por ELISA “Coating” (Revestimento)

[0069] Um tampão de “coating” foi preparado para conter 0,8 g Na2CO3, 1,4 g NaHCO3, 0,1 g NaN3 em 500 ml de água (pH 9,6).

[0070] 100 μL de anticorpos (Ac) de captura (anticorpo monoclonal de camundongos anti-CD127 humano R34.34, Beckman Coulter®) diluídos no tampão de “coating” (foram depositados por cavidade em uma placa ([Ac] = 8 pg/mL). A placa foi recoberta depois para ser incubada a 4°C durante uma noite.

[0071] O conteúdo das cavidades foi aspirado depois e as cavidades foram lavadas 3 vezes com pelo menos 300μL de tampão de lavagem PBS-Tween2o 0,05%. Todo o líquido foi retirado com cuidado a cada lavagem. Após a última lavagem, a placa foi virada sobre papel absorvente a fim de eliminar todos os traços de tampão. “Blocking” (Bloqueio)

[0072] A fixação não específica foi bloqueada com a ajuda de 150 μL de tampão de bloqueio por cavidade (10% soro bovino fetal (FBS) de /PBS-Tween20 0,05%), depois a placa foi incubada durante 1h a 37°C.

[0073] Outra vez, o conteúdo das cavidades foi aspirado e as cavidades foram lavadas 3 vezes com pelo menos 300μL de tampão de lavagem PBS-Tween20 0,05%. Todo o líquido foi retirado com cuidado a cada lavagem. Após a última lavagem, a placa foi virada sobre papel absorvente a fim de eliminar todos os traços de tampão. Amostras e controles

[0074] Uma gama padrão foi realizada com quimera recombinante humano IL- 7Rα/CD127 Fc (R&D Systems - Número de Catálogo: 306-IR) diluído no tampão de diluição PBS 5% FCS, como descrito na tabela 1 abaixo e de acordo com C. Janot- Sardet et al. Journal of Immunological Methods, 2010, 28, 115-123.

[0075] 100 μL de amostra ou controle (solução de quimera CD127 Fc reconstituídos extemporaneamente e divididos em alíquotas em concentrações de 60ng/ml e 10ng/ml) foram adicionados em cada cavidade, depois a placa foi incubada durante 1h a 37°C

[0076] Novamente, o conteúdo das cavidades foi aspirado e as cavidades foram lavadas 3 vezes com pelo menos 300μL de tampão de lavagem PBS-Tween2o 0,05%. Todo o líquido foi retirado com cuidado a cada lavagem. Após a última lavagem, a placa foi virada sobre papel absorvente a fim de eliminar todos os traços de tampão. Anticorpos de detecção

[0077] 100 μl de anticorpos de detecção (anticorpos de cabra policlonal anti- CD127 biotinilado reconstituídos com 1 mL de TBS-BSA 1%, R&D Systems®) diluídos em PBS/5% FBS foram adicionados em cada cavidade ([Ac] = 200 ng/mL), depois a placa foi incubada durante 1h a 37°C.

[0078] De novo, o conteúdo das cavidades foi aspirado e as cavidades foram lavadas 3 vezes com pelo menos 300μL de tampão de lavagem PBS-Tween20 0,05%. Todo o líquido foi retirado com cuidado a cada lavagem. Após a última lavagem, a placa foi virada sobre papel absorvente a fim de eliminar todos os traços de tampão. Revelação

[0079] 100 μL de Estreptavidina-HRP foram adicionados a cada cavidade ([Estreptavidina-HRP] = 8 pL/mL). A placa foi recoberta depois para ser incubada durante 30 min em temperatura ambiente.

[0080] De novo, o conteúdo das cavidades foi aspirado e as cavidades foram lavadas 3 vezes com pelo menos 300μL de tampão de lavagem PBS-Tween20 0,05%. Todo o líquido foi retirado com cuidado a cada lavagem. Após a última lavagem, a placa foi virada sobre papel absorvente a fim de eliminar todos os traços de tampão. Nesta etapa de lavagem, as cavidades foram embebidos com o tampão de lavagem 1 a 2 min antes da aspiração.

[0081] Os dois frascos da solução de substrato colorimétrico TMB (3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina, bioMérieux #XX7LF1UC) foram misturados volume a volume. 100 μL desta solução de substrato foram depositados em cada cavidade, a placa foi recoberta depois para ser incubada durante 30 min em temperatura ambiente.

[0082] Por último, a leitura da placa foi efetuada por medição da absorvência a 450 nm.

Medição da expressão monocitária de HLA-DR.

[0083] A medição foi realizada pela técnica de citometria em fluxo, através de uma marcação direta em sangue total tomado sobre EDTA.

[0084] Os dois anticorpos seguintes foram incubados com 50 μL de sangue total (30 minutos em temperatura ambiente e no escuro):

[0085] - 5 μL de anticorpos anti-CD14, copulados fluoresceína (Beckman Coulter Immunotech, - Ref. : IM0645), permitindo identificar os monócitos entre os leucócitos)

[0086] -10 μL de anticorpos anti-HLA-DR, copulados ficoeritrina (Becton Dickinson - Ref. : 347401), permitindo quantificar a expressão de HLA-DR na superfície das células.

[0087] Os glóbulos vermelhos foram eliminados depois: lise por adição de 1 ml de solução lise (comercializada pela empresa Becton Dickinson sob a referência 349202) diluída (1/10) (15 minutos em temperatura ambiente e no escuro).

[0088] As células foram depois analisadas sobre um citômetro de fluxo (FC500 - Beckman Coulter).

[0089] Os resultados são expressos em % de células positivas, o limiar de positividade sendo definido graças a um controle isotípico (Mouse IgG2a PE Becton Dickinson - Ref. : 349053).

RESULTADOS

[0090] As amostras de plasma foram tomadas de 35 pacientes em choque séptico em dias 1-2 (D1-2) e 3-4 (D3-4) após choque séptico, depois foram armazenadas (coorte retrospectivo). Diferentes parâmetros ou marcadores foram medidos como as concentrações de IL-7 e de sCD127 plasmáticos, e a expressão de CD127 sobre as células T CD4+, e a expressão de HLA-DR sobre os monócitos. Em 28 dias após admissão em reanimação para choque séptico, 13 pacientes não sobreviveram (“NS”) isto é, 37% enquanto que 22 pacientes sobreviveram (“S”) sobre os 35 pacientes. Além disso, 6 pacientes contraíram uma infecção nosocomial (“NI”) isto é, 17%, enquanto que 29 pacientes permaneceram isentos de qualquer episódio nosocomial (“Não NI”).

[0091] As mesmas medições foram efetuadas igualmente sobre 30 indivíduos sãos voluntários (HV).

[0092] Os resultados obtidos foram comparados com a ajuda de um teste II de Mann Whitney nestas diferentes populações de indivíduos ou pacientes e são reagrupados sobre as figuras 1 a 4 em anexo.

[0093] Estes resultados mostram que a concentração de IL-7 plasmático é significativamente diminuída (em D1-2, mas não é significativa em D3-4 nos pacientes que desenvolvem uma infecção secundária em relação aos pacientes que não encontraram nenhum episódio nosocomial (figura 1C), enquanto que permanece inalterada entre os pacientes sobreviventes “S” ou não sobreviventes “NS”.

[0094] Além disso, a expressão celular do receptor de IL-7 (CD127) é conservada após choque séptico (figura 2A e 2B), e sem nenhuma diferença entre os pacientes sobreviventes “S” ou não sobreviventes “NS” ou os pacientes que desenvolveram uma infecção nosocomial “NI” ou sem “Não NI” (resultados não representados).

[0095] O leve aumento da concentração plasmática da forma solúvel do receptor de IL-7 ou sCD127 observado no início do choque séptico não é estatisticamente significativo e retorna aos valores “normais” com o tempo (figura 3A).

[0096] Em contrapartida, enquanto que a concentração plasmática de sCD127 permanece inalterada entre os pacientes sobreviventes “S” ou não sobreviventes “NS” (figura 3B), observa-se um aumento marcado da concentração plasmática de sCD127 nos pacientes “NI” que apresentaram uma infecção nosocomial em relação aos pacientes “Não NI” que não contraíram uma infecção nosocomial (figura 3C).

[0097] Além disso, observa-se igualmente que a concentração plasmática do sCD127 não evolui no tempo (entre D1-2 e D3-4) nos pacientes “NI” que apresentaram uma infecção nosocomial, contrariamente aos pacientes “Não NI” que não contraíram uma infecção nosocomial (figura 3C).

[0098] A título de comparação, o estudo da expressão do marcador da arte anterior HLA-DR sobre a mesma coorte de pacientes não permitiu colocar em evidência a diminuição da expressão deste marcador entre os pacientes “NI” que apresentaram uma infecção nosocomial e os pacientes “Não NI” que não contraíram uma infecção nosocomial (figura 4), contrariamente ao que é claramente estabelecido na arte anterior.

[0099] Esta diferença, provavelmente ligada ao tamanho da coorte presentemente estudada que é menor em relação à das coortes analisadas nos estudos da arte anterior, permite destacar a pertinência do marcador sCD127 em relação a HLA-DR. Com efeito, apesar do tamanho da coorte que foi estudada aqui, os resultados mostram que o estudo da expressão de sCD127 de acordo com a invenção é informativo quanto à susceptibilidade dos pacientes às infecções nosocomiais.

[0100] Em consequência, o conjunto destes resultados demonstra que a medição da expressão de sCD127 é um marcador imunológico útil para determinar a susceptibilidade de um paciente às infecções nosocomiais, em particular, os pacientes hospitalizados em reanimação e/ou que sofreram uma agressão (cirurgia, queimadura, traumatismo...) gerando uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e, em particular, pacientes em estado séptico, notadamente severo, e preferivelmente pacientes em choque séptico.

[0101] A invenção não é limitada aos exemplos descritos e representados porque diversas modificações podem ser introduzidas na mesma sem sair de seu quadro.

Claims (8)

1. Processo de determinação in vitro da susceptibilidade às infecções nosocomiais em um paciente hospitalizado em reanimação e/ou tendo sofrido uma agressão, como cirurgia, queimadura, traumatismo, gerando uma resposta inflamatória sistêmica ou SIRS, em particular proveniente de um paciente em estado séptico, notadamente severo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas seguintes: - medir a expressão de sCD127 a nível proteico, com a ajuda de anticorpos anti-sCD127, em uma amostra biológica proveniente do referido paciente ou amostra a testar, - concluir por uma susceptibilidade aumentada às infecções nosocomiais após comparação da expressão de sCD127 em relação a um valor de referência que corresponde ao nível de expressão de sCD127 medido em uma amostra biológica proveniente de um mesmo referido paciente quando de uma tomada anterior, isto é, em uma amostra biológica que foi tomada anteriormente em relação à amostra a testar, quando a expressão de sCD127, que é medida na amostra a testar, não é diminuída significativamente em relação ao referido valor de referência, de preferência quando a expressão de sCD127, que é medida na amostra a testar, não é diminuída em mais de 25% e, de preferência, não diminuída em mais de 20%, em relação ao referido valor de referência.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é proveniente de um paciente em choque séptico.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a medição da expressão de sCD127 na amostra a testar é realizada em cerca de ou 10 dias (D10) após o choque séptico, preferivelmente cerca de ou 7 dias (D7) após o choque séptico, preferivelmente ainda cerca de ou 4 dias (D4) após o choque séptico.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a tomada anterior é efetuada em ou a 48h após o choque séptico e pelo menos 24h antes daquela da amostra a testar.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo fato de que a tomada anterior é efetuada em ou a 48h após o choque séptico e a da amostra a testar é efetuada nas 48h que seguem a tomada anterior ou a 48h após a tomada anterior.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra a testar proveniente do referido paciente é uma amostra de plasma ou de soro.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a expressão de sCD127 é com a ajuda de uma técnica ELISA.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a expressão de sCD127 é medida com a ajuda de anticorpos monoclonais anti-sCD127.

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