ES2335588T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para la elaboracion de las mismas. - Google Patents
Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para la elaboracion de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para mejorar las características de crecimiento de una planta seleccionadas de una o más entre: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo un incremento en la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CDK de tipo B por medio de la introducción y expresión en una planta de una construcción genética que comprende un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.
Description
Plantas que tienen características de
crecimiento mejoradas y método para la elaboración de las
mismas.
La presente invención se relaciona generalmente
con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método
para mejorar las características de crecimiento de las plantas. Más
específicamente, la presente invención se relaciona con un método
para mejorar las características de crecimiento de una planta
incrementando la expresión en una planta de un ácido nucleico que
codifica una proteína CDK (quinasa dependiente de la ciclina) tipo
B por medio de la introducción y expresión en una planta de una
construcción genética que contiene un ácido nucleico para CDK tipo
B que codifica una proteína CDK tipo B que comprende: (i) un motivo
PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia
en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un
dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de activación del
bucle T. La presente invención también se relaciona con plantas
obtenidas por medio de los métodos de la invención, cuyas plantas
han mejorado las características de crecimiento con relación a las
plantas correspondientes de tipo silvestre.
La población mundial siempre en crecimiento y la
disminución de la oferta de tierras cultivables y disponibles para
la agricultura estimulan la investigación agrícola con miras a
mejorar la eficiencia de la agricultura. El medio convencional para
realizar mejoras hortícolas y en los cultivos utiliza técnicas
selectivas de reproducción para identificar plantas que tengan
características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de
reproducción tienen varios inconvenientes, especialmente que esas
técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en
plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos
que no siempre terminan en el paso del rasgo deseado a partir de
las plantas madre. Los avances en biología molecular le han
permitido a la humanidad modificar el germoplasma de plantas y
animales. La modificación por ingeniería genética de plantas
implica el aislamiento y la manipulación de material genético
(típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción
de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la
capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen diferentes
rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Una
característica de interés económico particular es la productividad.
Normalmente se defina la productividad como la producción medible
de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos
de cantidad y/o de calidad. La productividad depende directamente
de varios factores, por ejemplo del número y tamaño de los órganos,
de la arquitectura de la planta (por ejemplo, del número de
ramificaciones), de la producción de semilla y más. El desarrollo
de raíces, la ingesta de nutrientes y la tolerancia al estrés son
también factores importantes en la determinación de la
productividad. Los tipos de estrés típicos a los cuales están
sometidos las plantas incluyen estrés ambiental (abiótico) (tal
como el estrés por temperatura causado por temperaturas atípicas
altas o bajas; estrés causado por deficiencia e nutrientes; estrés
causado por deficiencia de agua (sequía) y estrés biótico (que
puede ser impuesto a las plantas por otras plantas (malas hierbas),
plagas de animales y patógenos). Se puede incrementar la
productividad de un cultivo no solamente por medio de la
optimización de uno de los factores anteriormente mencionados, sino
también por medio de la modificación de los mecanismos inherentes
al crecimiento de una planta.
El mecanismo inherente de crecimiento de una
planta reside en una secuencia altamente ordenada de eventos
colectivamente conocidos como el "ciclo celular". La progresión
a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y
desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para
la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo
celular son altamente conservados en levaduras, mamíferos y
plantas. El ciclo celular típicamente se divide en las siguientes
fases secuenciales: G0 - G1 - S - G2 - M. La replicación o síntesis
del ADN generalmente tiene lugar durante la fase S ("S" es para
síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas ocurre
durante la fase M (la "M" es para mitosis), con fases de
intervención vacías, G1 (durante las cuales crecen las células antes
de la replicación del ADN) y G2 (un período después de la
replicación del ADN durante el cual se prepara la célula para la
división). La división celular se completa después de la
citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han
salido el ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que
están en la fase G0. Las células en esta fase pueden ser
estimuladas para entrar nuevamente al ciclo celular en la fase G1.
La "G" en G1, G2 y G0 significa "vacío". La finalización
del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija reciba
durante la división celular una copia completa del genoma de
los
progenitores.
progenitores.
La división celular está controlada por dos
eventos principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la
síntesis del ADN y la iniciación de la mitosis. Cada transición a
cada uno de estos eventos claves está controlada por un puesto de
control representado por complejos específicos de proteína
(involucrados en la replicación y en la división del ADN). La
expresión de los genes, necesaria para la síntesis del ADN en el
límite entre G1/S está regulada por la familia E2F de factores de
transcripción en células de plantas y de mamíferos (La Thangue,
1994 (Curr. Opin. Cell Biol. 6 (3), 443 - 450); Muller y
colaboradores, 2001 (Genes Dev. 15 (3), 267 - 285); De Veylder y
colaboradores, 2002 (EMBO J. 21 (6), 1360 - 1368)). La entrada en el
ciclo celular es regulada/activada por un complejo E2F/Rb que
integra señales y permite la activación de la transcripción de los
genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases
del ciclo celular, y por lo tanto el progreso a través del ciclo
celular, está conducido por la formación y la activación de
diferentes proteínas quinasas heterodiméricas de serina/treonina,
generalmente denominadas como quinasas dependientes de la ciclina
(CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la
asociación física con una ciclina específica, siendo muy
dependiente el momento de la activación de la expresión de la
ciclina. El enlazamiento de la ciclina induce cambios en la
conformación en el lóbulo N-terminal de la CDK de
asociación y contribuye a la localización y especificidad del
sustrato del complejo. Las CDK monoméricas se activan cuando están
asociadas con ciclinas y así tienen actividad de quinasa. Los
niveles de proteína ciclina fluctúan en el ciclo celular y
representan por lo tanto un factor principal en la determinación del
momento de la activación de la CDK. La activación periódica de
estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo
celular media la regulación temporal de las transiciones del ciclo
celular (puestos de control). Otros factores que regulan la
actividad de la CDK incluyen inhibidores de CDK (los CKl o ICK, KIP,
CIP, INKS), quinasas que activan CDK (las CAK), una CDK fosfatasa
(Cdc25) y una subunidad CDK (CKS) (Mironov y colaboradores, 1999
(Plant Cell 11 (4), 509 - 522); Reed 1996 (Progressin Cell cycle
Research 2, 15 - 27)).
En plantas, se han estudiado hasta ahora dos
clases principales de CDK, conocidas como CDK de tipo A y de tipo
B. Las CDK de tipo A regulan tanto las transiciones de G1 a S como
de G2 a M, mientras que las CDK de tipo B parecen controlar
únicamente el puesto de control de G2 a M (Hemerly y colaboradores,
1995 (EMBO J. 14 (16), 3925 - 3936); Magyar y colaboradores, 1997
(Plant Cell 9 (2), 223 - 235); Porceddu y colaboradores, 2001 (J.
Biol. Chem. 276 (39) 36354 - 36360)). Además, se ha reportado la
presencia de las CDK de tipo C y de las quinasas que activan CDK
(las CAK) (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 -
235); Umeda y colaboradores, 1998 (Proc Natl Acad Sci USA. 95 (9),
5021 - 5026.; Joubes y colaboradores, 2001 (Plant Physiol. 126 (4),
1403 - 1415)), al igual que la presencia de las CDK de tipo D, tipo
E y tipo F (Vandepoele y colaboradores, 2002 (Plant Cell 14 (4),
903 - 916)).
La habilidad para influir sobre el ciclo celular
en una planta, y para modificar por lo tanto diferentes
características de crecimiento de una planta, tendrían muchas
aplicaciones en áreas tales como mejoramiento de cultivos,
reproducción de plantas, producción de plantas ornamentales,
arboricultura, horticultura, silvicultura, la producción de algas o
plantas (por ejemplo para uso como biorreactores, para la producción
de sustancias tales como compuestos farmacéuticos, anticuerpos, o
vacunas, o para la bioconversión de desechos orgánicos o para uso
como combustible en el caso de algas y plantas de alta
productividad).
Se ha encontrado recientemente que el incremento
de la expresión en una planta de un ácido nucleico para CDK de tipo
B que codifica a una proteína CDK de tipo B incluye: (i) un motivo
PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia
en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para
activación del bucle T, les proporciona a las plantas
características mejoradas de crecimiento. Por lo tanto, de acuerdo
a una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un
método para (mejorar) las características de crecimiento de una
planta, que comprende el incremento de la expresión en una planta
de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica a una proteína
CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle
T en donde las características mejoradas de crecimiento se
seleccionan entre uno o más de: un incremento en el área, un
incremento del número de panículas, un incremento en altura, un
incremento en el número de semillas, un incremento en el número de
semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un
incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el
índice de cosecha. Una mayor expresión de un ácido nucleico para
CDK de tipo B es el mejoramiento o la mayor expresión de un ácido
nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B. La mayor expresión,
es mayor comparada con la expresión de una CDK de tipo B en plantas
correspondientes de tipo silvestre. Los métodos para obtener una
mayor o mejor expresión de los genes o de los productos génicos
están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la
sobreexpresión dirigida por un promotor fuerte, el uso de
reforzadores de transcripción o de reforzadores de traducción.
El método para mejorar las características de
crecimiento de las plantas comprende la introducción y expresión en
una planta de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica una
proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación
del bucle T. Se puede introducir el ácido nucleico en una planta,
por ejemplo, por medio de transformación. Por lo tanto, de acuerdo
a un aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un
método para mejorar las características de crecimiento de una
planta que comprende la introducción en una planta, en un formato
expresable, de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica
una proteína CDK de tipo B que incluye: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación
del bucle T, en donde las características mejoradas de crecimiento
se seleccionan entre uno o más de: un incremento en el área, un
incremento del número de panículas, un incremento en altura, un
incremento en el número de semillas, un incremento en el número de
semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un
incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el
índice de cosecha, cada uno con relación a las correspondientes
plantas de tipo
silvestre.
silvestre.
Un "ácido nucleico para CDK de tipo B" como
se lo define aquí es un ácido nucleico/gen que codifica una proteína
que tiene (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores,
1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
Los motivos y los dominios identificados en (i)
hasta (iii) anteriores pueden ser fácilmente identificados por las
personas capacitadas en el arte utilizando técnicas de rutina. Un
ensayo de quinasa puede, por ejemplo, ser realizado como se
describe en Cockcroft y colaboradores, 2000 (Nature, 405 (6786), 575
- 579). El ensayo involucra la molienda de material de la planta en
nitrógeno líquido y resuspender en un material apropiado (tal como
1 ml de Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, NaCl 75 mM, EGTA
15 mM, MgCl_{2} 15 mM, ditiotreitol 1 mM, Tween 20 al 0,1%,
inhibidor completo de proteasa Tm 1X, NaF 1 mM, NaV 0,2 mM,
pirofosfato de Na 2 mM, beta-glicerofosfato 60 mM).
Se homogeniza luego la suspensión 4 x 30 s con 30 s sobre hielo
entre homogenizaciones. Se incuba luego el sobrenadante con 20
microlitros de proteína A - Sefarosa (suspensión al 50%) durante 30
min a 4ºC. Se incuba el sobrenadante con 1 microlitro de antisuero
(dirigido contra el péptido del terminal carboxilo de una proteína
CDC2b, como se describe en Setiady y colaboradores, 1996 (Plant Cell
Physiology 37 (3), 369 - 376) durante 2 h sobre hielo, luego se
añaden 20 microlitros de proteína A - Sefarosa y se agita la muestra
por rotación a 4ºC durante una hora. Se lavan las muestras 2 veces
con amortiguador de quinasa (Tris-HCl 50 mM de pH
7,5, NaCl 100 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM), se resuspenden en 15
microlitros de amortiguador del ensayo (Tris-HCl 50
mM de pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 5 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM,
NaF 1 mM, vanadato de Na 0,2 mM, pirofosfato de Na 2 mM,
beta-glicerofosfato 25 mM, histona H1 0,5 mM como
sustrato, PMSF 0,5 mM, y 74 kBq [ATP gamma con ^{32}P (>185
TBq mmol^{-1}) por 15 microlitros de reacción) y se incuba a
temperatura ambiente durante 30 min. Se puede detener la reacción
por medio de la adición de amortiguador de carga del gel y se
pueden analizar las muestras utilizando SDS-PAGE y
cuantificar utilizando un fosfoimager (Molecular
Dynamics).
Dynamics).
El término "aminoácido para CDK de tipo B"
como se define aquí abarca cualquier secuencia de aminoácidos que
cuando se la utiliza en la construcción de un árbol filogenético de
CDK, tal como el descrito en la Fig. 1, tiende a agruparse
alrededor de las CDK de tipo B en vez de cualquiera de los otros
grupos de CDK. Una persona capacitada en el arte podría determinar
fácilmente si cualquier secuencia de aminoácidos en cuestión cae
dentro de la definición de un "aminoácido para CDK de tipo B"
utilizando técnicas conocidas y software para la elaboración de tal
árbol filogenético, tal como un paquete de programas GCG, EBI o
CLUSTAL, utilizando parámetros por defecto. Por medio de la
construcción de tal árbol filogenético, las secuencias que se
agrupan en el grupo de CDK de tipo B se considera que caen dentro
de la definición de una "CDK de tipo B" y por lo tanto será
útil para llevar a cabo los métodos de la invención. Adicionalmente,
un "aminoácido para CDK de tipo B" como se define aquí es uno
que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores,
1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
La tabla 1 a continuación, muestra las CDK
representativas de tipo B y el motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencias en la posición 2 y/o
4 de izquierda a derecha.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El ácido nucleico/gen que codifica para CDK de
tipo B puede ser aislado o derivado de cualquier planta o alga o
fuente de hongos. Este ácido nucleico puede ser sustancialmente
modificado a partir de su forma nativa en composición y/o en el
ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. El
ácido nucleico para CDK de tipo B puede ser aislado de una especie
monocotiledónea o dicotiledónea, preferiblemente de la familia
Brassicaceae, preferiblemente adicionalmente de
Arabidopsis thaliana. El ácido nucleico es preferiblemente
para una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de tipo B clase 1
seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1 mostradas en la
Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;2
de Arabidopsis thaliana, CDKB1;1 de Lycopersicon
esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK
B1;1de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella
tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK de tipo B clase
1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de
Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es
preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo
B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a
saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de
Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum
majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium,
una CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de
Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza
sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2
es una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.
Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK
B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción
del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar
con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por
la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la
misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como
el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o
por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en
donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID
NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más
preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el
representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por
una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde
la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o
un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de
los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también
abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se
describe aquí más adelante.
Aunque la invención ha sido ejemplificada con
una CDK de tipo B de acuerdo a las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ
ID NO: 5, y los aminoácidos correspondientes de acuerdo a las SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, será claro
para una persona capacitada en el arte que los métodos de acuerdo a
la invención pueden ser practicados también utilizando variantes de
ácidos nucleicos y variantes de aminoácidos, tal como aquellos
definidos aquí más adelante. Por lo tanto, tomado en un contexto
amplio, el término proteína/ácido nucleico "CDK de tipo B"
también abarca variantes de ácidos nucleicos y variantes de
aminoácidos adecuados para la práctica de los métodos de acuerdo a
la invención. Las variantes de ácidos nucleicos y las variantes de
aminoácidos adecuados para la práctica de los métodos de acuerdo a
la invención incluyen a aquellas que caen dentro de la definición
de una "CDK de tipo B", lo cual significa que para la
construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en
la Fig. 1, las variantes de las secuencias de interés tenderían a
agruparse alrededor de las CDK de tipo B y/o cuyas variantes
codifican (en el caso de una variantes de ácido nucleico) y es (en
el caso de una variante de aminoácido) una proteína I que contiene:
(i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de
coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha;
(ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa
para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant
Cell 9 (2), 223 - 235)).
Las variantes adecuadas de ácido nucleico y de
secuencias de aminoácidos útiles en la practica de los métodos de
acuerdo a la invención, incluyen:
- (i)
- Porciones funcionales de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (ii)
- Secuencias capaces de hibridar con un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (iii)
- Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (iv)
- Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (v)
- Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína CDK de tipo B;
- (vi)
- Las CDK mutantes de tipo B.
Un ejemplo de una variante de un ácido
nucleico/gen de tipo B; es una porción funcional de un ácido
nucleico/gen de tipo B. Será claro para una persona capacitada en
el arte que la secuencia de ADN de longitud completa no es un
prerrequisito para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la
invención. Los métodos de acuerdo con la invención pueden ser
practicados convenientemente utilizando porciones funcionales de una
CDK de tipo B. Una porción funcional se refiere a una pieza de ADN
derivada o preparada a partir de una molécula original (más larga)
de ADN que codifica para CDK de tipo B, cuya porción de ADN, cuando
se la introduce y expresa en una planta, produce plantas que tienen
características modificadas de crecimiento, cuya porción codifica
una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T
(Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)). La
porción puede incluir muchos genes con o sin elementos adicionales
de control o puede contener secuencias espaciadoras. La porción se
puede elaborar haciendo una o más supresiones y/o truncamientos a la
secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, de cualquiera de las SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5. Las técnicas para
introducción de truncamientos y de supresiones dentro de un ácido
nucleico son bien conocidas en el arte.
Un ejemplo de una variante adicional de ácido
nucleico que codifica para CDK de tipo B es una secuencia que es
capaz de hibridar con una CDK de tipo B. Convenientemente, se pueden
practicar también los métodos de acuerdo con la presente invención
utilizando secuencias capaces de hibridar con una CDK de tipo B,
particularmente una CDK de tipo B como la representada por
cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, cuyas
secuencias de hibridación son aquellas que caen dentro de la
definición de una "CDK de tipo B", lo cual significa que para
la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en
la Fig. 1, la secuencia de hibridación sería aquella que tiende a
agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de cualquiera de los
otros grupos de CDK y/o cuya secuencia de hibridación codifica a
una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T
(Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
El término "hibridación" como se define
aquí es un proceso en donde las secuencias complementarias de
nucleótidos sustancialmente homólogas se aparen entre sí. El
proceso de hibridación puede ocurrir enteramente en solución, es
decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las
herramientas en biología molecular que confían en tal proceso
incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los
métodos basados en la misma), hibridación sustractiva, extensión
aleatoria del iniciador, mapeo de la nucleasa S1, extensión del
iniciador, transcripción inversa, síntesis de ADNc, despliegue
diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. El
proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos
nucleicos complementarios inmobilizados a una matriz tal como
cuentas magnéticas, cuentas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las
herramientas en biología molecular que cuentan con tal proceso
incluyen el aislamiento de ARNm poli (A+). El proceso de
hibridación puede ocurrir además con uno de los ácido nucleicos
complementarios inmobilizados a un soporte sólido tal como una
membrana de nylon o nitrocelulosa o inmobilizados por ejemplo por
fotolitografía por ejemplo a un soporte de vidrio siliceo (este
último conocido como arreglos de ácido nucleico o microarreglos o
como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología
molecular que cuentan con tal proceso incluyen análisis de
transferencias en gel de ARN y ADN, hibridación de colonias,
hibridación de placas, hibridación in situ e hibridación de
microarreglos. Con el propósito de permitir que ocurra la
hibridación, se desnaturalizan generalmente térmica o químicamente
las moléculas de ácido nucleico para fundir la cadena doble en dos
cadenas sencillas y/o para remover las horquillas u otras
estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La
rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones
tales como la temperatura, la concentración de sal y la composición
del amortiguador de hibridación. Las condiciones de alta rigurosidad
para la hibridación incluyen alta temperatura y/o baja
concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na_{3})
y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o
la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS
(detergente) en el amortiguador de hibridación y/o exclusión de
compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol
(promoviendo el amontonamiento molecular) del amortiguador de
hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación están
descritas, por ejemplo, en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a
laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,
CSH, New York, pero la persona capacitada se dará cuenta que se
pueden diseñar numerosas condiciones diferentes de hibridación en
función de la homología conocida o esperada y/o de la longitud de
la secuencia de ácido nucleico. Se prefieren particularmente
condiciones de hibridación con una rigurosidad suficientemente baja
(al menos en el primer caso) para aislar ácido nucleicos
heterólogos con las secuencias de ADN de la invención definida más
arriba. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad es
4-6x SSC/0,1-0,5% p/v SDS a
37-45ºC durante 2 - 3 horas. Dependiendo de la
fuente y de la concentración del ácido nucleico involucrado en la
hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de
rigurosidad, tales como condiciones medias de rigurosidad. Los
ejemplos de condiciones de rigurosidad media incluyen 1 - 4x
SSC/0,25% p/v SDS \geq 45ºC durante 2 - 3 horas. Un ejemplo de
condiciones de alta rigurosidad incluye 0,1 - 1x SSC/0,1% p/v SDS a
60ºC durante 1-3 horas. La persona capacitada será
consiente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante
la hibridación y lavado y que o bien mantendrán o cambiarán las
condiciones de rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad pueden
empezar bajas y ser incrementadas progresivamente hasta que
proporcionen una hibridación de ácido nucleico para CDK de tipo B,
como se define aquí más arriba. Los elementos que contribuyen a la
heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y
diferencias en el uso preferido del codón.
Otro ejemplo de una variante de CDK de tipo B es
una variante alternativa de empalme de una CDK de tipo B. Los
métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados
también utilizando una variante alternativa de empalme de un ácido
nucleico/gen que codifica para CDK de tipo 3. El término "variante
alternativa de empalme" que fue utilizado aquí, abarca variantes
de un ácido nucleico en el cual los intrones y/o los exones
seleccionados han sido cortados, reemplazados o añadidos. Tales
variantes de empalme s e pueden encontrar en la naturaleza o pueden
ser hechas por el hombre utilizando técnicas conocidas en el arte.
Las variantes de empalme útiles en los métodos de acuerdo con la
invención son las "CDK de tipo B" lo cual significa que para la
construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en
la Fig. 1, la variante de empalme de interés sería una que tiende a
agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de alrededor de
cualquiera de los otros grupos de CDK y/o cuya variante de empalme
I codifica a una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación
del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 -
235)). Preferiblemente la variante de empalme es una variante de
empalme de la secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.
Otro ejemplo de una variante de CDK de tipo B es
una variante alélica. Convenientemente, los métodos de acuerdo con
la presente invención pueden ser practicados también utilizando
variantes alélicas de un ácido nucleico para CDK de tipo B,
preferiblemente una variante alélica de una secuencia representada
por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.
Existen variantes alélicas en la naturaleza y dentro de los métodos
de la presente invención, está abarcado el uso de estos alelos
naturales aislados en los métos de acuerdo con la invención. Las
variantes alélicas útiles en los métodos de acuerdo con la invención
son las "CDK de tipo B" lo cual significa que para la
construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la
Fig. 1, la variante alélica de interés tendería a agruparse
alrededor de las CDK de tipo B y cuya variante alélica codifica a
una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T
(Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
Los ejemplos de variantes de aminoácidos de tipo
B incluyen homólogos, derivados y fragmentos activos de una
proteína CDK de tipo B. Convenientemente, los métodos de acuerdo con
la presente invención pueden ser practicados también utilizando
homólogos, derivados o fragmentos activos de una CDK de tipo B,
utilizando preferiblemente ácido nucleicos que codifican homólogos,
derivados o fragmentos activos de una CDK de tipo B como la
representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ
ID NO: 6.
Los "homólogos" de una proteína CDK de tipo
B abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas
que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de
aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión
que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no
modificada de la cual se derivan. Para producir tales homólogos, se
pueden reemplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos
que tengan propiedades similares (tales como hidrofobicidad,
hidrofilicidad, antigenicidad, y propensión similares para formar o
romper estructuras de hélice \alpha o estructuras de lámina
\beta). Las tablas de sustituciones conservadoras son conocidas
en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman
and Company). Los homólogos útiles en los métodos de acuerdo con la
invención son preferiblemente las CDK de tipo B, lo cual significa
que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel
descrito en la Fig. 1, cualquiera de las secuencias homólogas de
interés tendería a agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez
de cualquier otro tipo de CDK. Tales CDK de tipo B tienen un orden
creciente de preferencia de al menos 60% ó 65% ó 70% ó 75% u 80% u
85% ó 90% ó 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, de identidad de secuencia
o similitud con aquella de la CDK B1;1 de Arabidopsis
thaliana (SEQ ID NO: 2) y cuyo homólogo contiene: (i) un motivo
PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia
en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un
dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para
activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9
(2), 223 - 235)).
Se puede establecer fácilmente por medio de
alineación de secuencias si un polipéptido tienen al menos 60% de
identidad con la CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana. Los
métodos para la alineación de secuencias para comparación son
conocidos en el arte; tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, FASTA y
TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, 1970 (J.
Mol. Biol. 48 (3), 443 - 453) para hallar la alineación de dos
secuencias completas que maximicen el número de coincidencias y
minimice el número de huecos. El algoritmo de BLAST calcula el
porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis
estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software
para llevar a cabo el análisis por BLAST está públicamente
disponible a través del National Centre for Biotechnology
Information. Una proteína que tenga al menos 60% de identidad con la
CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana puede ser fácilmente
identificada por medio de la alineación de una secuencia problema
con secuencias conocidas de CDK de tipo B (ver, por ejemplo la Fig.
1) utilizando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple VNTI
AlignX, con base en un algoritmo modificado de clustal W ((InforMax,
Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con configuraciones por
defecto para penalización de abertura de huecos de 10 y una
extensión del hueco de 0,05.
Dos formas especiales de homología: ortólogos y
parálogos, son conceptos evolucionarios utilizados para describir
la relación ancestral de los genes. El término "parálogos" se
relaciona con duplicaciones de genes dentro del genoma de una
especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogos"
se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a
una relación ancestral. El término "homólogos" como se lo
utiliza aquí también abarca parálogos y ortólogos de las proteínas
útiles en los métodos de acuerdo con la invención.
Ortólogos, por ejemplo, en especies de plantas
monocotiledóneas pueden ser fácilmente encontrados llevando a cabo
la así llamada búsqueda recíproca por medio de blast. Esto puede
hacerse por medio de una primera búsqueda por blast que implica la
comparación de la secuencia en cuestión a través de blast (por
ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2) contra cualquier base
de datos de secuencias, tal como la base de datos públicamente
disponible NCBI que puede encontrarse en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos en el arroz,
la secuencia en cuestión sería comparada, por ejemplo, contra, los
28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa
Nippombare disponible en NCBI. Se pueden utilizar BLASTn o tBLASTX
cuando se parte de nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte
de la proteína, con valores estándar por defecto. Se pueden filtrar
los resultados de la comparación. Las secuencias de longitud
completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no
filtrados son luego nuevamente comparados (segunda comparación)
contra las secuencias de los organismos a partir de los cuales se
derivan las secuencias en cuestión. Los resultados de la primera y
de la segunda comparación son luego comparados. Se encuentra un
ortólogo cuando los resultados de la segunda comparación dados como
aciertos con la similitud más alta, un ácido nucleico o proteína CDK
de tipo B, por ejemplo, si uno de los organismos es
Arabidopsis entonces se encuentra un parálogo. En el caso de
grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido por una árbol
vecino de unión, para ayudar a visualizar el agrupamiento.
Las "variantes de sustitución" de una
proteína son aquellas en las cuales se ha removido al menos un
residuo en una secuencia de aminoácidos e insertado un residuo
diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son
típicamente de residuos individuales, pero pueden estar agrupados
dependiendo de las restricciones funcionales generadas por el
polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del
orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos y las supresiones estarán
en el rango aproximadamente entre 1 y 20 residuos. Preferiblemente,
las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones
conservadoras de aminoácidos. Las variantes de sustitución útiles
en los métodos de la invención serán aquellas que incluyen: (i) un
motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de
coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha;
(ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de
quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997
(Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
Las "variantes de inserción" de una
proteína son aquellas en las cuales se introducen uno o más residuos
de aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las
inserciones pueden incluir fusiones aminoterminales y/o
carboxiterminales así como inserciones dentro de la secuencia de
aminoácidos individuales o de múltiples aminoácidos. Generalmente,
las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más
pequeñas que las fusiones amino o carboxiterminales,
aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de
proteínas o de péptidos de fusión amino o carboxiterminales
incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de
un activador transcripcional como el utilizado en el sistema híbrido
doble de levadura, las proteínas de recubrimiento del fago,
etiqueta de 6 (histidinas), etiqueta de S transferasa de glutationa,
proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato
reductasa, epítopo Tag.100, epítopo c-myc, epítopo
FLAG®, lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), epítopo
HA, epítopo de proteína C y epítodo VSV. Las variantes de inserción
útiles en los métodos de la invención serán aquellos que contienen:
(i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de
coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha;
(iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y
colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2),
223-235)).
Las "variantes de supresión" de una
proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de
la proteína. Las variantes de aminoácidos de una proteína pueden
hacerse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos
conocidas en el arte, tales como la síntesis de péptidos en fase
sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN
recombinante. Los métodos para la recombinación de secuencias de ADN
para producir variantes de sustitución, de inserción o de supresión
de una proteína son conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas
para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el
ADN son conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen
mutagénesis M13, mutagénesis in vitro de
T7-Gen (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site
Directed mutagenesis (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis
dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis
dirigida al sitio. Las variantes de supresión útiles en los métodos
de la invención serán aquellas que incluyen: (i) un motivo PPTALRE
sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para
activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9
(2), 223-235)).
Los métodos para la búsqueda e identificación de
homólogos de CDK de tipo B estarían también en el ámbito de una
persona capacitada en el arte. Los métodos para la alineación de
secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. Tales
métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el
algoritmo de Needleman y Wunsch 1970 (J. Mol. Biol. 48 (3),
443-453) para hallar la alineación de dos secuencias
completas que maximice el número de coincidencias y minimice el
número de huecos. El algoritmo de BLAST calcula el porcentaje de
identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la
similitud entre las dos secuencias. El software para llevar a cabo
el análisis por BLAST está públicamente disponible a través del
National Ceentre for Biotechnology Information.
El término "derivados" se refiere a
péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que
pueden contener sustituciones, supresiones o adiciones de residuos
de aminoácidos de ocurrencia natural y no natural comparados con la
secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la
proteína, por ejemplo, como la representada por cualquiera de las
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. Los "derivados" de
una proteína CDK de tipo B abarcan péptidos, oligopéptidos,
polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos de
aminoácidos alterados, glicosilados, acilados de ocurrencia natural
o de ocurrencia no natural comparados con la secuencia de
aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un
derivado puede incluir también uno o más sustituyentes que no son
aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se
deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado
en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos tal
como, por ejemplo, una molécula reportera que está enlazada para
facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de ocurrencia no
natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína
de ocurrencia natural. Los derivados útiles en los métodos de la
invención serán aquellos que incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para
activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9
(2), 223-235)).
Los "fragmentos activos" de una proteína
CDK de tipo B incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T
(Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2),
223-235)).
Más convenientemente aún, los métodos de acuerdo
con las presente invención pueden ser practicados también
utilizando las CDK mutantes de una planta, cuyas CDK mutantes tienen
al menos una actividad biológica sustancialmente similar,
preferiblemente mejorada, comparadas con las correspondientes
proteínas CDK de tipo silvestre.
De acuerdo con una quinta modalidad de la
presente invención, se proporcionan construcciones genéticas y
vectores para facilitar la introducción y/o la expresión de las
secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la
invención. Por lo tanto, de acuerdo a una quinta modalidad de la
presente invención, se proporciona una construcción genética que
contiene:
- (i)
- un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que incluye: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)); o
- (ii)
- una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (i), dicha secuencia de control incluyendo un promotor constitutivo GOS2 o un promotor de beta-expansina, y opcionalmente
- (iii)
- una secuencia de terminación de la transcripción.
Las construcciones útiles en los métodos de
acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando
tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas
capacitadas en el arte. Las construcciones génicas se pueden
insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles,
adecuados para la trasformación en plantas y adecuados para la
expresión del gen de interés en las células transformadas.
El ácido nucleico que codifica a un mutante de
CDK puede ser cualquiera de los ácido nucleicos que codifican al
mutante descritos aquí anteriormente.
El ácido nucleico/gen que codifica para CDK de
tipo B puede ser aislado de una especie monocotiledónea o
dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae,
preferiblemente adicionalmente de Arabidopsis thaliana. El
ácido nucleico es preferiblemente para una CDK de tipo B clase 1,
tal como una CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de
las CDK de clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de
Arabidopsis thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis
thaliana, CDKB1;1 de Lycopersicon esculentum (tomate),
CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK B1;1 de Medicago
sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella tertiolecta,
preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 1 es una CDK
B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis
thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es
preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo
B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a
saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de
Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum
majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una
CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de
Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa,
preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK
B2;2 de Arabidopsis thaliana.
Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK
B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción
del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar
con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por
la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la
misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como
el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o
por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en
donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID
NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más
preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el
representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por
una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde
la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o
un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de
los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también
abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se
describió aquí anteriormente.
Las plantas son transformadas luego con una
construcción o vector que incluye a la secuencia de interés (es
decir, un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica a una
proteína CDK de tipo B o a un ácido nucleico que codifica a un
mutante de CDK), cuya secuencia está operativamente enlazada a una o
más secuencias de control (al menos un promotor).
Los términos "elemento regulador",
"secuencia de control" y "promotor" son todos utilizados
aquí en forma intercambiable y se los utiliza para referirse a
secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la
expresión de una secuencia con la cual están ligados. Abarcadas por
los términos anteriormente mencionados están las secuencias
reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico
eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la
iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de
caja CCAAT) y elementos regulador adicionales (es decir, secuencias
activadoras secuencia arriba, reforzadoras y silenciadoras) que
alteran la expresión del gen en respuesta a estímulos externos y/o
de desarrollo, o en una forma específica para el tejido. También
esta incluida dentro del término una secuencia reguladora de la
transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede
incluir una secuencia de caja de -35 y/o secuencias reguladoras de
la transcripción de caja -10. El término "elemento regulador"
también abarca una molécula sintética de fusión o derivada que
confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido
nucleico en una célula, tejido u órgano. Los términos "secuencia
de control", "secuencia reguladora", "elemento
regulador" y "promotor" son utilizados aquí en forma
intercambiable. El término "operativamente enlazado" como se
lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia
promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia
promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de
interés.
Convenientemente, el ácido nucleico para CDK de
tipo B puede estar operativamente enlazado con cualquier promotor.
Preferiblemente, en el caso de una CDK B1;1, la expresión está
dirigida por un promotor activo en tejido joven en expansión, tal
como en hojas, flores, tallos y raíces jóvenes. Tal como un
"promotor preferido para tejido joven en expansión" como se
define aquí, se refiere a un promotor que se expresa
predominantemente en tejido joven en expansión, pero no
necesariamente exclusivamente en tal tejido. Preferiblemente, el
"promotor preferido para tejido joven en expansión" es el
promotor EXPB8 de beta-expansina del arroz. Otros
promotores adecuados incluyen cualquier promotor de expansina,
pLEAFY y otros. Preferiblemente en el caso de una CDK B1;2 y CDK
B2;2, la expresión es conducida en una forma constitutiva, más
preferiblemente en donde el promotor constitutivo es un promotor
GOS2. Un promotor constitutivo es transcripcionalmente activo
durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de su
crecimiento y desarrollo. Los ejemplos de promotores constitutivos
de la planta a parecen en la Tabla C como se muestra a
continuación. Los promotores mostrados en la Tabla C a continuación,
pueden ser convenientemente utilizados para llevar a cabo los
métodos de acuerdo con la invención.
Los promotores inducibles son promotores que han
inducido o incrementado la iniciación de la transcripción en
respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico.
Por ejemplo, los promotores inducibles por estrés son activados
cuando se expone una planta a diferentes condiciones de estrés. Los
ejemplos de promotores inducibles por estrés, que son también
adecuados para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la
invención, están expuestos en la Tabla D como se muestra a
continuación. Tales promotores pueden ser útiles también en la
realización de los métodos de la invención ya que el crecimiento
modificado (tal como un mayor crecimiento) inducido en tiempos de
estrés puede tener muchas ventajas.
Los promotores enlistados en las Tablas C y D
son suministrados únicamente como ejemplo y la presente invención
no está limitada por la lista suministrada en dichas tablas.
Aquellos capacitados en el arte serán capaces fácilmente de
suministrar promotores adicionales que sean útiles para la
realización de la presente invención. Los promotores enlistados
pueden ser modificados también para proporcionar especificidad de
expresión según se requiera.
Opcionalmente, se pueden utilizar también una o
más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una
planta. El término "terminadora" abarca una secuencia de
control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad
transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación
de un transcripto primario y la terminación de la transcripción.
Los elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores
transcripcionales así como de la traducción. Aquellos capacitados en
el arte se darán cuenta de secuencias terminadoras y reforzadoras
que pueden ser adecuadas para ser usadas en la realización de la
invención. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser obtenidas
fácilmente por una persona capacitada en el arte.
Las construcciones genéticas de la invención
pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación
que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo
específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una
construcción genética en una célula bacteriana como un elemento
genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de
cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no
se limitan a, el f1-ori y coIE1.
La construcción genética puede incluir
opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza
aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye
cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual
se exprese para facilitar la identificación y/o la selección de
célula que sean transfectadas o transformadas con una construcción
de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se
pueden seleccionar entre marcadores que confieran resistencia a los
antibióticos o a herbicidas. Las células que contienen al ADN
recombinante serán capaces por lo tanto de sobrevivir en presencia
de concentraciones de antibiótico o de herbicida que matarían a
células no transformadas. Los ejemplos de genes marcadores
seleccionables incluyen al gen bar que proporciona resistencia al
herbicida Basta; el gen npt que confiere resistencia al antibiótico
kanamicina; el gen hpt que confiere resistencia a la higromicina.
Se pueden utilizar también marcadores visuales, tales como la
Proteína Fluorescente Verde (GFP, Haseloff y colaboradores, 1997
(Proc Natl Acad Sci USA. 94 (6), 2122 - 2127),
\beta-glucuronidasa (GUS) o luciferasa, como
marcadores seleccionables. Otros ejemplos de genes marcadores
seleccionables adecuados incluyen al gen de resistencia a la
ampicilina (Ampr), gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr), gen
de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia
a la fosfinotricina, gen de neomicina fosfotransferasa (nptII) gen
de resistencia a la higromicina, y el gen del cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT), entre otros.
La presente invención también incluye a las
plantas obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la
presente invención. La presente invención proporciona por lo tanto
plantas obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la
presente invención, cuyas plantas tienen características de
crecimiento mejoradas seleccionadas entre una o más de: un
incremento en el área, un incremento del número de panículas, un
incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un
incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso
total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW)
y un incremento en el índice de cosecha, y cuyas plantas tienen una
mayor expresión de una CDK de tipo B, que codifica a una proteína
CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle
T.
La presente invención también proporciona
plantas que tienen características mejoradas de crecimiento
seleccionadas entre uno o más de: un incremento en el área, un
incremento del número de panículas, un incremento en altura, un
incremento en el número de semillas, un incremento en el número de
semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un
incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el
índice de cosecha, y cuyas plantas tienen una mayor expresión de
una CDK de tipo B, que codifica a una proteína CDK de tipo B que
comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de la quinasa para activación del bucle T.
De acuerdo a una sexta modalidad de la presente
invención, se proporciona un método para producción de plantas
transgénicas que tienen características mejoradas de crecimiento
seleccionadas entre una o más de: un incremento en el área, un
incremento del número de panículas, un incremento en altura, un
incremento en el número de semillas, un incremento en el número de
semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un
incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el
índice de cosecha, que comprende la introducción y la expresión en
una planta de una molécula de ácido nucleico de la invención.
Más específicamente, la presente invención
proporciona un método para la producción de plantas transgénicas
que tiene características mejoradas de crecimiento, cuyo método
comprende:
- (i)
- la introducción y expresión en una planta o en una célula de una planta de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;
- (ii)
- el cultivo de la células de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de una planta madura.
Se puede introducir al propio ácido nucleico
directamente en una célula de una planta o dentro de la misma
planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o en cualquier
otra parte de la planta). De acuerdo con una característica
preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el
ácido nucleico dentro de una planta por medio de
transformación.
El gen/ácido nucleico que codifica para CDK de
tipo Bnes preferiblemente una CDK de tipo B clase 1, tal como una
CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de
clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis
thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;1 de
Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum
majus, CDK B1;1 de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de
Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK
de tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o
una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el
ácido nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal
como una CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos
mostrados en la Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis
thaliana, una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK
B2;1 de Antirrhinum majus, una CDK B2;1 de
Mesembryanthemum crassifolium, una CDK B2;1 1 de Medicago
sativa, una CDK B2;1 de Lycopersicon esculentum y una CDK
B 1 de Oryza sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK
de tipo B clase 2 es una CDK B2;2 de Arabidopsis
thaliana.
Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK
B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción
del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar
con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por
la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la
misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como
el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o
por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en
donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID
NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más
preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el
representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por
una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde
la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o
un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de
los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también
abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se
describió aquí anteriormente.
El término "transformación" como se lo
menciona aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno
dentro de una célula huésped, independientemente del método
utilizado para la trasferencia. El tejido de la planta capaz de una
propagación clonal posterior, ya sea por medio de organogénesis o de
embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética
de la presente invención y regenerar una planta completa a partir
de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los
sistemas de propagación clonal disponibles, y más adecuados para la
especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de
tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones,
cotiledones, hipocotiledondes, megagametofitos, tejido de callo,
tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical,
brotes axilares, y meristemas de la raíz), y tejido inducido de
meristema (por ejemplo, meristema de cotiledon y meristema de
hipocotiledon). Se puede introducir en forma transitoria o estable
al polinucleótido en una célula huésped y mantenerlo en forma no
integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo
puede integrar en el genoma huésped. La célula de la planta
transformada resultante puede ser utilizada luego para regenerar una
planta transformada en una forma conocida por las personas
capacitadas en el arte.
La transformación de una especie de una planta
es hoy en día una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se
pueden utilizar cualquiera entre muchos métodos de transformación
para introducir al gen de interés dentro de un ancestro adecuado de
una célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de
liposomas, electroporación, compuestos químicos que incrementan la
asimilación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de
la planta, bombardeo con una pistola de partículas, transformación
utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar
los métodos a partir del método de calcio/polietilén glicol para
protoplastos (Krens, F. A. y colaboradores, 1982, Nature 296,
72-74; Negrutiu I. y colaboradores, June 1987, Plant
Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de
protoplastos (Shillito R. D. y colaboradores, 1985 Bio/Technol 3,
1099-1102); microinyección dentro de un material de
la planta (Crossway A. y colaboradores, 1986, Mol. Gen Genet 202,
179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein
T. M. y colaboradores, 1987, Nature 327, 70) infección con virus
(no integradores) y similares. Se producen preferiblemente plantas
transgénicas de arroz que expresan un gen que codifica para CDK de
tipo B a través de una transformación mediada por
Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos conocidos
para transformación del arroz, tal como los descritos en cualquiera
de las siguientes publicaciones: solicitud europea de patente
publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199,
612-617, 1996); Chan y colaboradores, (Plant Mol.
Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei y colaboradores,
(Plant J. 6 (2) 271 - 282, 1994), cuyas descripciones se incorporan
aquí como referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad.
En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es
como el descrito ya sea en Ishida y colaboradores, (Nat.
Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o en
Frame y colaboradores, (Plant Physiol. 2002 May; 129(1):
13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí como
referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad.
Generalmente después de la transformación, se
seleccionan células de la planta o agrupaciones celulares por la
presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes
expresables en la planta cotransfectados con el gen de interés,
después de lo cual se regenera el material transformado en una
planta completa.
Después de la transferencia del ADN y la
regeneración, se pueden evaluar las plantas putativamente
transformadas, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por
la presencia del gen de interés, número de copia y/o organización
genómica. Alternativa o adicionalmente, se pueden hacer seguimiento
a los niveles de expresión del ADN recientemente introducido
utilizando análisis de tipo Northern y/o Western, siendo ambas
técnicas conocidas por las personas ordinariamente calificadas en
la técnica.
Las plantas transformadas generadas se pueden
propagar por medio de una variedad de medios, tales como las
técnicas de propagación clonal o de reproducción clásica. Por
ejemplo, se puede autofecundar una primera generación de plantas
transformadas (o T1) para producir transformantes homocigotos de
segunda generación (o T2), y se pueden propagar luego las plantas
T2 a través de técnicas clásicas de reproducción.
Los organismos transformados generados pueden
tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de
células transformadas y de células no transformadas; transformantes
clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para
contener al casete de expresión); injertos de tejidos transformados
y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado
injertado a un retoño no transformado).
La presente invención se extiende claramente a
cualquier célula de planta o planta producida por medio de
cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la
planta y propágulos de las mismas. La presente invención se
extiende además para abarcar a la progenie de una célula primaria
transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que
ha sido producida por medio de cualquiera de los método
anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la
progenie exhiba la(s) misma(s)
característica(s) genotípica(s) y/o
fenotípica(s) como aquellas producidas en los progenitores
por medio de los métodos de acuerdo con la invención. La invención
también incluye células huésped que contienen una molécula aislada
de ácido nucleico que codifica una proteína capaz de modular una
proteína CDK de tipo B, preferiblemente en donde la proteína es una
proteína CDK de tipo B. Las células huésped preferidas de acuerdo
con la invención son células de plantas. La invención se extiende
también a las partes cosechables de una planta, tales como, pero sin
limitarse a, cultivos de semillas, hojas, frutos, flores, tallos,
rizomas, tubérculos y bulbos.
El término "planta" como se lo utiliza aquí
abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y
partes de las plantas, incluidas semillas, brotes, tallos, raíces
(incluidos los tubérculos), y células de plantas, tejidos y
órganos. El término "planta" también abarca por lo tanto
cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido
de callo, hojas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Las
plantas que son particularmente útiles en los métodos de la
invención incluyen algas, helechos, y todas las plantas que
perteneces a la súper familia de Viridiplantae, en particular
plantas monocotiledóneas y dicotiledóneasts, incluyendo forraje o
legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos de alimentos,
árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende
Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp.,
Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp.,
Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens,
Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp.,
Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola,
Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris,
Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna
indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa,
Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp.,
Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus,
Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cold
spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus
spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara
spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan,
Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp.,
Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora,
Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica,
Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba,
Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp.,
Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas,
Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna
spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis,
Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp.,
Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp.,
Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp.,
Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp.,
Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa
spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp.,
Omithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum,
Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp.,
Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp.,
Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum
spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp.,
Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus
communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum,
Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp.,
Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp.,
Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp.,
Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao,
Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp.,
Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp.,
Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus
spp., entre otros.
De acuerdo con una característica preferida de
la presente invención, la planta es una planta de cultivo, tal como
soja, girasol, canola, alfalfa, colza o algodón. Más
preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es
una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar. Lo más
preferible, la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo,
sorgo, mijo o cebada.
Convenientemente, la realización de los métodos
de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen
características mejoradas de crecimiento, seleccionadas entre una o
más de: un incremento en el área, un incremento del número de
panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de
semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un
incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el
peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha,
cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo
silvestre.
El término "mayor rendimiento" como se
define aquí abarca un incremento en biomasa (peso) en una o más
partes de una planta, particularmente las partes que están por
encima del suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor
biomasa de cualquier otra parte cosechable, con relación a la
biomasa de las partes correspondientes de las correspondientes
plantas de tipo silvestre. El término también abarca un incremento
en el rendimiento de semillas. Que incluye un incremento en la
biomasa de la semilla (peso de la semilla) y que se puede ser un
incremento en el peso de las semillas por planta o con base en una
semilla individual, y/o un incremento en el número de semillas
(llenas) y/o en el tamaño de las semillas y/o un incremento en el
volumen de las semillas, cada uno con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre. Un incremento en el
tamaño y/o el volumen de las semillas puede influir también sobre
la composición de las semillas. Un incremento en el rendimiento de
las semillas podría ser debido aun incremento en el número y/o el
tamaño de las flores. Un incremento en rendimiento podría
incrementar también el índice de cosecha, que se expresa como la
proporción de la biomasa total sobre el rendimiento de las partes
cosechables, tal como las semillas. Un incremento en el rendimiento
puede incrementar también el peso de mil granos (TKW) que se
extrapola a partir del peso total del número de semillas llenas. Un
incremento en TKW puede ser el resultado de un incremento en el
tamaño de las semillas y/o en el peso de las semillas.
Tomando al maíz como ejemplo, un incremento en
el rendimiento se puede manifestar como uno o más entre lo
siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o
acre, un incremento en el número de espigas por planta, un
incremento en el número de hileras, el número de granos por hilera,
el peso del grano, el peso de mil granos, la longitud/diámetro de
las espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un
incremento en el rendimiento se puede manifestar por medio de un
incremento en uno o más entre lo siguiente: el número de plantas
por hectárea o acre, el número de panículas por planta, el número de
espiguillas por panícula, el número de flores por panícula, un
incremento en la proporción de semillas llenas, un incremento en el
peso de mil granos, entre otros. Un incremento en rendimiento puede
resultar también en una arquitectura modificada, o puede
presentarse como resultado de una arquitectura modificada.
Ya que las plantas transgénicas de acuerdo con
la presente invención tienen mayor rendimiento, es claro que estas
plantas exhiben una mayor tasa de crecimiento (al menos durante
parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento
de las correspondientes plantas de tipo silvestre. La mayor tasa de
crecimiento puede ser específica para una o más partes de una
planta (incluidas las semillas), o para toda la planta en conjunto.
Una planta que tiene una mayor tasa de crecimiento puede exhibir
incluso una floración temprana. El incremento en la tasa de
crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de
vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida
completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las
etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar
un mayor vigor. El incremento en la tasa de crecimiento puede
alterar el tiempo de la cosecha de una planta permitiendo que las
plantas sean cosechadas más pronto de lo esperado. Si la tasa de
crecimiento se incrementa lo suficiente, puede permitir la siembra
de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo
sembrando y cosechando plantas de arroz seguido por la siembra y
cosecha de más plantas de arroz, todo dentro de un período
convencional de crecimiento) o de diferentes especies de plantas
(por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguida por,
por ejemplo la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o
cualquier otra planta adecuada), incrementando así la producción
anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de
veces (digamos en un año) que cualquier plantas particular puede
crecer y cosecharse). Un incremento en la tasa de crecimiento puede
permitir también el cultivo de plantas transgénicas en un área
geográfica más amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que
las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo son
a menudo determinada por condiciones ambientales adversas ya sea al
momento de la siembra (principios de la temporada) o al momento de
la cosecha (finales de la temporada). Tales condiciones adversas se
pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La mayor velocidad
de crecimiento se puede determinar derivando diferentes parámetros
de las curvas de crecimiento derivadas de los experimentos de
cultivo, pudiendo ser tales parámetros: T-Mid (el
tiempo que se toman las plantas para alcanzar 50% de su tamaño
máximo) y T-90 (tiempo que les toman las plantas
alcanzar 90% de su tamaño máximo).
De acuerdo con una característica preferida de
la presente invención, la realización de los métodos de la
invención resulta en plantas que tienen una tasa de crecimiento
modificada. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para incrementar la tasa de crecimiento de las
plantas, cuyo método comprende incrementar la expresión en una
planta de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a
una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para
activación del bucle T. En los ejemplo se demuestra un incremento en
la tasa de crecimiento por medio del menor tiempo que les toma a
las plantas transgénicas para alcanzar la madures que a las plantas
de control.
Un incremento en el rendimiento también abarca
un mejor desempeño de las plantas bajo condiciones sin estrés así
como bajo condiciones de estrés comparado con las plantas de tipo
silvestre. Las plantas responden típicamente a la exposición al
estrés creciendo más lentamente. Sin embargo, ya que las plantas
transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor
rendimiento y mayor tasa de crecimiento, es claro que las plantas
transgénicas crecerán también más rápidamente durante condiciones
de estrés que las correspondientes plantas de tipo silvestre
expuestas también a las mismas condiciones de estrés. Las
condiciones de estrés serán típicamente los estreses bióticos y/o
abióticos (ambientales) diarios a los cuales puede estar expuesta
una planta. Los estreses abióticos o ambientales típicos incluyen
estreses por temperatura causados por calor atípico o por
temperaturas frías/de congelación; el estrés por salinidad; el
estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos
pueden ser causados también por compuestos químicos. Los estreses
bióticos son aquellos estreses típicamente causados por patógenos,
tales como bacterias, virus, hongos e insectos.
"Arquitectura modificada" como se la define
aquí incluye cualquier cambio en la apariencia de uno o más entre
hojas, brotes, tallos, vástagos, inflorescencia (para plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas), panículas, polen, óvulos,
semilla, embriones, endospermo, recubrimiento de semilla y
aleuronas.
De acuerdo con una característica preferida de
la presente invención, la realización de los métodos de acuerdo con
la presente invención resulta en plantas que tienen arquitectura
modificada. La arquitectura modificada se manifiesta por al menos
por medio de uno entre: un incremento en el área por encima del
suelo, un incremento en el número de panículas y un incremento en
la altura. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para modificar la arquitectura de las plantas,
que comprende el incremento de la expresión en una planta de un
ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína
CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle
T.
Los métodos de acuerdo con la presente invención
resultan en plantas que tienen características mejoradas de
crecimiento, como se describió aquí anteriormente. Estas
características ventajosas de crecimiento se pueden combinar con
otros rasgos económicamente convenientes, tales como rasgos
adicionales de mejoramiento del rendimiento, tolerancia a
diferentes estreses, rasgos que modifican diferentes características
de arquitectura y/o características bioquímicas y/o
fisiológicas.
De acuerdo con una modalidad adicional de la
presente invención, se proporciona el uso de un ácido nucleico/gen
para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que
comprende, (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un
dominio de la quinasa para activación del bucle T. Por ejemplo, se
pueden utilizar las CDK de tipo B en programas de reproducción. La
secuencia de ácido nucleico puede estar sobre un cromosoma, o una
parte del mismo, incluyendo al menos la secuencia de ácido nucleico
que codifica a la proteína CDK de tipo B y preferiblemente también
uno o más miembros de una familia relacionada. En un ejemplo de tal
programa de reproducción, se identifica un marcador de ADN que puede
estar genéticamente enlazado a un gen capaz de modular la expresión
de un ácido nucleico que codifica a una proteína CDK de tipo B en
una planta, cuyo gen puede ser un gen que codifica a la misma
proteína CDK de tipo B o cualquier otro gen capaz de influenciar
directa o indirectamente la expresión de un gen que codifica para
CDK de tipo B y/o la actividad y/o los niveles de una proteína CDK
de tipo B. Este marcador de ADN puede ser utilizado luego en
programas de reproducción para seleccionar plantas que tiene
características de crecimiento alteradas.
Las variantes alélicas de las CDK de tipo B
pueden ser utilizadas programas particulares de reproducción
convencional, tales como en reproducción asistida por marcadores.
Tales programas de reproducción requieren algunas veces de la
introducción de variantes alélicas en las plantas por medio de
tratamiento mutagénico de una planta. Un método mutagénico adecuado
es la mutagénesis EMS. Tiene lugar entonces la identificación de
variantes alélicas, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido
por una etapa de selección para la seleccionar variantes alélicas
superiores de la secuencia en cuestión que dan lugar a
características alteradas de crecimiento de una planta. La
selección se lleva a cabo típicamente por el seguimiento de los
resultados de crecimiento de las plantas que contienen diferentes
variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo,
diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1. Se puede hacer el
seguimiento del resultado del crecimiento en un invernadero o en el
campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzamiento de
plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior,
con otra planta. Esto se podría utilizar, por ejemplo, para hacer
una combinación de características fenotípicas de interés. Las
variantes alélicas también abarcan Polimorfismos de Nucleótidos
Individuales (SNP), así como Polimorfismos Pequeños de
Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente
menor a 100 pb). Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande
de variantes de secuencia en cadenas polimórficas de ocurrencia
natural de la mayoría de los organismos.
La presente invención también se relaciona con
el uso de un gen/ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una
proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin
falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la
posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para
activación del bucle T mejorando las características de crecimiento
de las plantas, seleccionadas entre uno o más de: un incremento en
el área, un incremento del número de panículas, un incremento en
altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el
número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las
semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un
incremento en el índice de cosecha.
El ácido nucleico para CDK de tipo B puede ser
aislado de una especie monocotiledónea o dicotiledónea,
preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente
adicionalmente de Arabidopsis thaliana. El ácido nucleico es
preferiblemente para una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de
tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1
mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis
thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDKB1;1 de
Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum
majus, CDK B1;1 de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de
Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK de
tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una
CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido
nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una
CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la
Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK
B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum
majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una
CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de
Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa,
preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK
B2;2 de Arabidopsis thaliana.
Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK
B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción
del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar
con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por
la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la
misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como
el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o
por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en
donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID
NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más
preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el
representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por
una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde
la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o
un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de
los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también
abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se
describió aquí anteriormente.
La presente invención también se relaciona con
el uso de un gen/ácido nucleico que codifica para CDK de tipo B y/o
con el uso de una proteína CDK de tipo B como reguladores de
crecimiento. Las secuencias de ácido nucleico para CDK de tipo B
descritas aquí anteriormente y las secuencias de aminoácidos de la
CDK de tipo B descritas aquí anteriormente son claramente útiles en
la modificación de las características de crecimiento de las
plantas. La presente invención también proporciona una composición
que contiene una proteína CDK de tipo B como se describió aquí
anteriormente para uso como un regulador de crecimiento.
Por el contrario, las secuencias de acuerdo a la
presente invención pueden ser también objetivos interesantes para
compuestos agroquímicos, tales como herbicidas. Por lo tanto, la
presente invención abarca el uso de los ácidos nucleicos para CDK
de tipo B anteriormente mencionados como objetivos para compuestos
agroquímicos, tales como herbicidas.
La Fig. 1 es un árbol filogenético que muestra
la relación de las CDK de diferentes plantas.
La Fig. 2 es una vista ampliada de la rama A de
CDK del árbol filogenético de la Fig. 1.
La Fig. 3 es un mapa del vector binario para la
expresión en Oryza sativa de un gen CDK B1;1 de
Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor putativo
de beta-expansina, EXPB8 (SEQ ID NO: 14).
La Fig. 4 es un mapa del vector binario para la
expresión en Oryza sativa de un gen CDK B1;2 de
Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor GOS2 (SEQ
ID NO: 15).
La Fig. 5 es un mapa del vector binario para la
expresión en Oryza sativa de un gen CDK B2;2 de
Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor GOS2 (SEQ
ID NO: 15).
La Fig. 6 detalla ejemplos de secuencias útiles
en la realización de los métodos de acuerdo con la presente
invención.
La Fig. 7 es una alineación de secuencias
múltiples CLUSTAL W (1.82) para algunas secuencias representativas
tipo B de CDK. En negrilla se encuentra un motivo en las CDK de tipo
B; subrayado está un dominio catalítico de quinasa y en itálicas se
muestra un dominio de quinasa para la activación del bucle T (Magyar
y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).
Se describirá ahora la presente invención con
referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente a manera
de ilustración.
Manipulación del ADN: a menos que se establezca
otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de
acuerdo con los protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001)
Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring
Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de
Ausubel y colaboradores, (1994), Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para
el trabajo molecular con plantas están descritos en Plant Molecular
Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS
Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications
(RU).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se amplifico la CDK B1;1 de Arabidopsis
por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de
plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU).
Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas,
se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio
del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones
era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de
9,6x10^{5} cfu/ml y, después de la primera amplificación, de
6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se
utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se
utilizaron iniciadores prm0350 (codón de inicio sentido, en
negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5'
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGAGAAGTACGAGAAGCTAGA3')
y prm0351 (codón de detención inverso, complementario, en negrillas,
sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTG
TACAAGAAAGCTGGGT TCAGAACTGAGACTTGTCAAGG3'), que incluyen
los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por
PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en
condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de PCR de 930 pb y
se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se realizó
luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP,
durante la cual se recombinó el fragmento de PCR in vivo con
el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología
Gateway, un "clon de entrada", p0438. Se adquirió el plásmido
pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se utilizó posteriormente el clon de entrada
p0438 en una reacción LR con p3169, un vector de destinación
utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector
contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del
T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un
marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a
recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya
clonada en el clon de entrada. Un promotor putativo de
beta-expansina para expresión en tejido de expansión
joven está localizado secuencia arriba de este casete Gateway.
Después de la etapa de recombinación LR, se
transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la
Fig. 3 (CDK B1;1: sobreexpresión de beta-expansina)
en plantas de Agrobacterium y posteriormente de Oryza
sativa. A las plantas de arroz transformadas se las permitió
crecer y luego fueron examinadas en relación con diferentes
parámetros como se describe en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se amplifico la CDK B1;2 de Arabidopsis
por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de
plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU).
Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas,
se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio
del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones
era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de
9,6x10^{5} cfu/ml y, después de la primera amplificación, de
6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se
utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se
utilizaron iniciadores prm439 (codón de inicio sentido, en
negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5'
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGAGAAATACGAGAAGCTC
3') y prm4401 (codón de detención inverso, complementario, en
negrillas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGAC
CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGG TCAGAACTGAGATTTGTC 3') que
incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para
amplificación por PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq
ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó un fragmento
de PCR de 936 pb y se lo purificó utilizando también métodos
estándar. Se realizó luego la primera etapa del procedimiento
Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombinó el fragmento
de PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de
acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada",
p538. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de
la tecnología
Gateway®.
Gateway®.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se utilizó posteriormente el clon de entrada
p538 en una reacción LR con p640, un vector de destinación utilizado
para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene
como elementos funcionales dentro de los bordes del
T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un
marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a
recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya
clonada en el clon de entrada. Se ubicó un promotor GOS2 para
sobrerregulación secuencia arriba de este casete Gateway.
Después de la etapa de recombinación LR, se
transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la
Fig. 4 (CDK B1;2: sobreexpresión de GOS2) en plantas de
Agrobacterium y posteriormente de Oryza sativa. A las
plantas de arroz transformadas se las permitió crecer y luego fueron
examinadas en relación con diferentes parámetros como se describe
en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se amplifico la CDK B2;2 de Arabidopsis
por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de
plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU).
Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas,
se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio
del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones
era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de
9,6x10^{5} cfu/ml, después de la primera amplificación, de
6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se
utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se
utilizaron iniciadores prm2213 (codón de inicio sentido, en
negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5'
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGACAACAATGGAGTTAA
3') y prm2214 (codón de detención inverso, complementario, en
negrillas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAA
GAAAGCTGGGT TCAGAGAGAGGACTTGTCAG 3'), que incluyen los
sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR.
Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en
condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de PCR de 948 pb y
se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se realizó
luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP,
durante la cual se recombinó el fragmento de PCR in vivo con
el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología
Gateway, un "clon de entrada", p2660. Se adquirió el plásmido
pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se utilizó posteriormente el clon de entrada
p2660 en una reacción LR con p640, un vector de destinación
utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este
vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del
T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un
marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a
recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya
clonada en el clon de entrada. Se ubicó un promotor pGOS2 para
sobreexpresión secuencia arriba de este casete Gateway.
Después de la etapa de recombinación LR, se
transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la
Fig. 5 (CDK B2;2: sobreexpresión de GOS2) en plantas de
Agrobacterium y posteriormente de Oryza sativa. A las
plantas de arroz transformadas se las permitió crecer y luego fueron
examinadas en relación con diferentes parámetros como se describe
en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se generaron aproximadamente 15 a 20
transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los
transformantes primarios de las cámaras de cultivo de tejido a un
invernadero para crecimiento y cosecha de semilla T1. Se retuvieron
5 eventos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 para la
presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se
seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían al
transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1
que carecían del transgén (nulicigotos), haciendo seguimiento
visual de la expresión del marcador.
Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de
variantes) como modelo estadístico para la evaluación completa de
las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una
prueba F sobre todos los parámetros medidos, para todas las plantas
de todos los eventos transformados con el gen de interés. Se llevó a
cabo la prueba F para revisar el efecto del gen sobre todos los
eventos de transformación y para determinar el efecto total del gen
o "el efecto global del gen". Los datos significativos, como se
determinaron por medio del valor de la prueba F, indican un efecto
del "gen", lo cual significa que el fenotipo observado es
provocado por causas más allá de la simple presencia o la posición
del gen. En el caso de la prueba F, el umbral de significación para
un efecto global del gen está establecido en un nivel de
probabilidad del 5%.
Para revisar el efecto de los genes en un
evento, es decir, para un efecto específico en línea, se llevó a
cabo una prueba t dentro de cada evento utilizando conjuntos de
datos de las plantas transgénicas y las correspondientes plantas
nulas. "Plantas nulas" o "Segregantes nulos" son las
plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas,
pero de las cuales se ha segregado el transgén. Las plantas nulas
pueden ser descritas también como los transformantes homocigotos
negativos. El umbral de significación para la prueba t está
establecido en un nivel de probabilidad del 10%. Dentro de una
población de eventos de transformación, algunos eventos pueden
estar por debajo o por encima de este umbral de la prueba t. Esto se
basa en la hipótesis de que un gen podría tener únicamente un
efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de
este efecto que depende de la posición no es raro. Esta clase de
efecto del gen puede ser denominada también como un "efecto de
línea de un gen". El valor p se obtiene por comparación del valor
t con la distribución t o alternativamente, por comparación F con
la distribución F. El valor p significa la probabilidad de que la
hipótesis nula (siendo la hipótesis nula que "no existe efecto
del transgén") sea
correcta.
correcta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron las plantas T1 seleccionadas
(aproximadamente 10 con el transgén y aproximadamente 10 sin el
transgén) a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta con un
código de barras único para relacionar sin ambigüedades los datos
del fenotipo con la planta correspondiente. Se cultivaron las
plantas T1 seleccionadas sobre tierra en macetas de 10 cm de
diámetro bajo las siguientes características ambientales: período de
luz = 11,5 h, intensidad de la luz = 30.000 lux o más, temperatura
durante el día = 28ºC o superior, temperatura durante la noche =
22ºC, humedad relativa = 60 - 70%. Se cultivaron las plantas
transgénicas y los correspondientes nulicigotos uno al lado del
otro en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de cultivo hasta
la etapa de maduración, se transfirieron varias veces las plantas a
través de una cámara digital para toma de imágenes y se las
fotografió. Se tomaron cada vez imágenes digitales puntuales (2048 x
1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos a
partir de seis ángulos diferentes. Se derivaron los parámetros
descritos más abajo en una forma automatizada a partir de todas las
imágenes digitales de todas las plantas, utilizando un software
para análisis de
imágenes.
imágenes.
En las tablas de resultados que se muestran a
continuación, cada fila corresponde a un evento. Se reportan las
diferencias numéricas entre las plantas positivas y las plantas
negativas (dif) así como la diferencia en porcentaje entre estas
plantas (dif en %). El valor p significa la probabilidad producida
por la prueba t para cada línea de planta. La última fila muestra
los números promedio para todos los eventos. En esta fila, el valor
p es el valor p de la prueba
F.
F.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el área de la planta por encima del
suelo haciendo un recuento del número total de píxeles de las
partes de la planta por encima del suelo discriminadas de las que
están por debajo del suelo. Se promedió este valor para las
fotografías tomadas al mismo tiempo desde los diferentes ángulos y
se los convirtió a un valor físico de superficie expresado en mm
cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área de
la planta por encima del suelo medida de esta manera se correlaciona
con la biomasa de las partes de la planta por encima del
suelo.
suelo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 1, la línea 3
produjo un incremento significativo en el área por encima del suelo
para plantas transgénicas con relación a las plantas de control, con
un valor p a partir de la prueba t de 0,0011. Las líneas 2 y 4
también mostraron un incremento en el área de la planta por encima
del suelo con relación a aquellas de las plantas de control. Se
observó un incremento total del 10% en el área por encima del suelo
de las plantas transgénicas comparada con las plantas de
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 2, las líneas 11 y
12 produjeron un incremento significativo en el área de la planta
por encima del suelo con respecto a los valores p de la prueba t de
0,0002 y 0,0573. Fue claro también un efecto total del gen de un
valor p de 0,0178 a partir de la prueba F. Se observó un incremento
total del 11% en el área por encima del suelo de las plantas
transgénicas comparada con las plantas de control. La línea 11 fue
confirmada también en la generación T2 (ver Tabla 4 a continuación)
con un incremento del 30% comparado con los correspondientes
nulicigotos y con un valor p a partir de la prueba t de 0,0002.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la altura de la planta por medio de
la distancia entre las líneas horizontales que pasan a través del
borde superior de la maceta y el píxel más elevado correspondiente a
una parte de la planta por encima del suelo. Este valor fue
promediado para las fotografías tomadas en el mismo momento a partir
de diferentes ángulos, y convertido, por calibración, a una
distancia física expresada en mm. Los experimentos mostraron que la
altura de la planta medida de esta manera se correlaciona con la
altura de la planta medida manualmente con una regla.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 5 se muestran los resultados. Como
se observa, la línea 3 mostró un incremento significativo en la
altura de la planta con relación a las correspondientes plantas de
control (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0045).
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 6 muestra un incremento en altura en la
generación T1 para las líneas 11 y 12. Como se muestra en la Tabla
7, la línea 11 mostró un incremento significativo en altura en las
plantas de la generación T2 con relación a las plantas de control y
produjo un valor p a partir de la prueba t de 0,019.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cosecharon, las panículas primarias maduras,
se las empacó en bolsas, marcadas con un código de barras y luego
secadas durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las
panículas y se recolectaron y contaron todas las semillas. Se
separaron las cáscaras llenas de las cáscaras vacías utilizando un
dispositivo de soplado de aire. Se descartaron las cáscaras vacías
y se contó nuevamente la fracción restante. Se pesaron las cáscaras
llenas sobre una balanza analítica. Este procedimiento produjo el
conjunto de parámetros relacionados con las semillas descritos a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este fue medido contando el número de cascaras
cosechadas de una planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 8
anterior. Como se observa, la línea 3 produjo un incremento
significativo en el número total de semillas producidas por las
plantas transgénicas con relación al número total de semillas
producidas por las plantas de control (con un valor p a partir de la
prueba t de 0,0002).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en la Tabla 9, la línea 11
mostró un incremento significativo (con un valor p a partir de la
prueba t de 0,0047) en el número total de semillas de las plantas
transgénicas con relación al número total de semillas de las
plantas de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el número de semillas llenas
contando el número se cáscaras llenas que quedaron después de la
etapa de separación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 10
anterior. Como se observa, la línea 3 produjo un incremento
significativo en el número de semillas llenas con relación a aquel
de las plantas de control (con un valor p a partir de la prueba t
de 0,0072).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en la Tabla 11, la línea 11
mostró un incremento en el número de semillas llenas con relación a
las plantas de control con un valor p a partir de la prueba t de
0,0091. Se observó una diferencia total de 14% para el número de
semillas llenas de plantas transgénicas con relación al número de
semillas llenas para las correspondientes plantas de control. Los
resultados de la generación T2 se observan en la Tabla 12, con la
línea 11 desempeñándose particularmente bien.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió el rendimiento total de semillas
pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 13
anterior. Como se observa, la línea 13 mostró un incremento
significativo (con un valor p a partir de la prueba t de 0,005) en
el peso total de las semillas de las plantas transgénicas con
relación al peso total de las semillas de las correspondientes
plantas no transgénicas. Se observó un incremento total del 16%
para el peso total de las semillas de las plantas transgénicas
versus el peso total de las semillas de las plantas de
control.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en la Tabla 14, la línea 11
mostró un incremento significativo en el peso total de las semillas
de las plantas transgénicas con relación al peso total de las
semillas de las plantas de control con un valor p a partir de la
prueba t de 0,0139. Los resultados de la generación T2 se observan
en la Tabla 15 a continuación, con la línea 11 desempeñándose
particularmente bien.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El índice de cosecha en la presente invención se
define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el
área por encima del suelo (mm^{2}), multiplicado por un factor
106.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 16
anterior. Como se observa, la línea 3 mostró un mayor índice de
cosecha para las plantas transgénicas con relación al índice de
cosecha de las plantas de control (con un valor p a partir de la
prueba t de 0,0201).
\vskip1.000000\baselineskip
Peso de Mil Granos (TKW): este parámetro se
extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso
total.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados de las generación T1 se muestran
en la Tabla 18. La Tabla 19 muestra los resultados de la generación
T2. Como se observa, la línea 11 muestra un incremento significativo
en el TKW de las plantas transgénicas con relación al TKW de las
plantas de control con un valor p a partir de la prueba t de
0,0347.
\vskip1.000000\baselineskip
Se modelaron las mediciones semanales del área
de la planta para obtener una curva de crecimiento para cada
planta. Se graficó el área de la planta (en mm^{2}) contra el
tiempo (en días) y a partir de la curva de crecimiento resultante
se calcularon los siguientes parámetros.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 13
anterior. Como se observa, las líneas 21 y 27 muestran incrementos
significativos en la tasa de crecimiento de las plantas transgénicas
con relación a la tasa de crecimiento de las plantas de control,
con incrementos de 4 días observados en ambos casos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se clona una CDK de tipo B bajo el control de un
promotor constitutivo o de un promot preferido del tejido joven en
expansión en un vector de transformación de la planta adecuado para
la transformación del maíz mediada por Agrobacterium. Los
vectores y métodos para la transformación del maíz se seleccionan de
aquellos descritos en cualquiera de los documentos: EP0604662,
EP0672752, EP0971578, EP0955371, EP0558676, Ishida y colaboradores,
(Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50); y
Frame y colaboradores, (Plant Physiol. 2002 May;
129(1):
13-22).
13-22).
Las plantas transgénicas elaboradas por estos
métodos se cultivan en el invernadero para la producción de
semillas T1. Se revisa la heredabilidad y el número de copias del
transgén por medio de PCR cuantitativo en tiempo real y análisis de
transferencias tipo Southern. Los niveles de expresión del transgén
se determinan por medio de PCR inversa y análisis tipo Northern. Se
seleccionan las líneas transgénicas con inserciones de copias
individuales del transgén y con niveles variables de expresión del
transgén para la producción de semillas T2.
Se germinaron las semillas de la progenie y
crecieron en un invernadero en condiciones adaptadas para el maíz
(período de luz 16:8, temperatura durante el día 26 - 28ºC y
temperatura durante la noche de 22 - 24ºC) así como condiciones de
bajo contenido de agua, bajo contenido de nitrógeno, y exceso de
NaCl. En el caso de autofecundación, se utilizan como controles
segregantes nulos de la misma línea parental, así como de plantas de
tipo silvestre del mismo cultivo. Se evalúan las plantas de la
progenie resultantes de la autofecundación o de los cruzamientos
para los diferentes parámetros de biomasa y de crecimiento,
incluidos la altura de la planta, el espesor del tallo, el número
de hojas, el área total por encima del suelo, el verdor de las
hojas, el tiempo de maduración, el tiempo de floración, el número
de espigas, el tiempo de cosecha. Se evalúan también las semillas de
estas líneas para los cambios en diferentes parámetros, tales como
el tamaño del grano, el rendimiento total de granos por planta, y
la calidad del grano (contenido de almidón, contenido de proteína y
contenido de aceite).
Se seleccionan las líneas que se mejoran en
forma más significativa comparadas con las correspondientes líneas
de control para un análisis de campo posterior y reproducción
asistida por marcadores, con el objetivo de transferir los rasgos
transgénicos validados en el terreno en germoplasma comercial. El
análisis del maíz para los parámetros relacionados con el
crecimiento y la productividad en el campo, se lleva a cabo
utilizando protocolos bien establecidos. En forma similar, la
introgresión de loci específicos (tal como los transgenes que
contienen loci) de un germoplasma en otro se lleva a cabo también
utilizando protocolos bien establecidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet WO 9903977 A [0042]
- \bullet EP 0971578 A [0118]
- \bullet EP 1198985 A1 [0055]
- \bullet EP 0955371 A [0118]
- \bullet EP 0604662 A [0118]
- \bullet EP 0558676 A [0118]
- \bullet EP 0672752 A [0118]
- \bullet EP 03077811 A [0122]
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<151>
2003-09-05
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<160> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 936
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador sentido: prm0350
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aagtacgaga agctaga
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador antisentido: prm0351
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagaactgag acttgtcaag g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador sentido: prm439
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aaatacgaga agctc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador antisentido: prm440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtcagaactg agatttgtc
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador sentido: prm2213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aacaatggag ttaa
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador antisentido: prm2214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagagagagg acttgtcag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Un método para mejorar las características de
crecimiento de una planta seleccionadas de una o más entre: un
incremento en el área, un incremento del número de panículas, un
incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un
incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso
total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW)
y un incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo
un incremento en la expresión en una planta de un ácido nucleico que
codifica a una proteína CDK de tipo B por medio de la introducción
y expresión en una planta de una construcción genética que comprende
un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK
de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle
T.
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en donde dicha CDK de tipo B se deriva de una fuente de una planta,
alga u hongo.
3. Un método de acuerdo a la reivindicación 2,
donde dicha CDK de tipo B derivada de una planta es preferiblemente
de una planta dicotiledónea, preferiblemente adicionalmente de la
familia Brassicaceae, preferiblemente la secuencia de ácido
nucleico es de Arabidopsis thaliana.
4. Un método de acuerdo a las reivindicaciones 1
a 3, en donde dicha CDK de tipo B es una CDK de tipo B clase 1,
preferiblemente una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una
CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana.
5. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones, en donde dicha CDK de tipo B es una CDK de tipo B
clase 2, preferiblemente una CDK B2;2 de Arabidopsis
thaliana.
6. Un método de acuerdo a la reivindicación 4,
en donde dicho ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado
por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia
de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o
secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que
contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de la quinasa para activación del bucle T.
7. Un método de acuerdo a la reivindicación 4,
en donde dicho ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado
por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia
de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o
secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que
contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de la quinasa para activación del bucle T.
8. Un método de acuerdo a la reivindicación 5,
en donde dicho ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado
por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia
de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o
secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que
contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio
de la quinasa para activación del bucle T.
9. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha CDK de tipo B se selecciona
entre
- (a)
- Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (b)
- Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;
- (c)
- Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína CDK de tipo B;
- (d)
- Las CDK mutantes de tipo B.
en donde dicha CDK de tipo B de (a), (b), (c), y
(d) contienen cada una: (i) un motivo PPTALRE sin falta de
coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o
en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de
quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle
T.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 4, 6, 9, en donde la expresión de dicho ácido
nucleico para CDK B1;1 está dirigida por un promotor preferido del
tejido joven de expansión, preferiblemente donde dicho promotor es
un promotor de beta expansina.
11. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 4, 7, 9, en donde la expresión de dicho ácido
nucleico para CDK B1;2 y en donde de dicho ácido nucleico para CDK
B2;2 está dirigida por un promotor constitutivo, preferiblemente
donde dicho promotor es un promotor GOS2.
\newpage
12. Las plantas obtenidas por un método de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde
dichas plantas contienen una construcción genética que
comprende:
- I.
- Un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T; y
- II.
- una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de I, comprendiendo dicha secuencia de control un promotor constitutivo GOS2 o un promotor de beta expansina.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Una construcción que comprende:
- (a)
- Un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;
- (b)
- Una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (a), dicha secuencia de control que contiene un promotor constitutivo GOS2, un promotor de beta expansina; y opcionalmente
- (c)
- una secuencia de terminación de la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Una construcción de acuerdo a la
reivindicación 13, en donde dicho ácido nucleico de (a) es un ácido
nucleico para CDK B1;2 como el representado por la SEQ ID NO: 3 o
por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico
capaz de hibridar con él, cuyo pacido nucleico codifica una proteína
CDK B1;2 como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo,
derivado o fragmento activo del mismo, donde dicha porción o
secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que
contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un
dominio de la quinasa para activación del bucle T, y en donde dicho
homólogo, derivado o fragmento activo comprende: (i) un motivo
PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia
en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un
dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa
para activación del bucle T.
15. Una construcción de acuerdo a la
reivindicación 13, en donde dicho ácido nucleico de (a) es un ácido
nucleico para CDK B2;2 como el representado por la SEQ ID NO: 5 o
por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico
capaz de hibridar con él, cuyo pacido nucleico codifica una proteína
CDK B2;2 como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo,
derivado o fragmento activo del mismo, donde dicha porción o
secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que
contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con
una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda
a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un
dominio de la quinasa para activación del bucle T, y en donde dicho
homólogo, derivado o fragmento activo comprende: (i) un motivo
PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia
en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio
catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para
activación del bucle T.
16. Un método para la producción de una planta
transgénica que tiene características mejoradas de crecimiento
seleccionadas entre una cualquiera o más de: un incremento en el
área, un incremento del número de panículas, un incremento en
altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el
número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las
semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un
incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo las
etapas de:
- (a)
- la introducción en una planta o en una célula de una planta por medio de la transformación de una planta de una construcción genética que comprende un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;
- (b)
- el cultivo de la células de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de una planta madura.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Una planta transgénica que tiene
características mejoradas de crecimiento seleccionadas entre una
cualquiera o más de: un incremento en el área, un incremento del
número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el
número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas,
un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el
peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha,
teniendo dicha planta una mayor expresión de un ácido nucleico para
CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B con relación
a las correspondientes plantas de tipo silvestre y cuya planta
incluye una construcción de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15.
18. Una planta trangénica de acuerdo a la
reivindicación 17, en donde dicha planta es una planta
monocotiledónea.
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