CN103145819B - 两种蛋白质及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用 - Google Patents
两种蛋白质及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了两种蛋白质及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。所述蛋白质A为序列表序列1所示的蛋白质；所述蛋白质B为序列表序列4所示的蛋白质。实验证明，蛋白质A和B编码基因不表达的双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2的耐盐性明显高于野生型拟南芥，而单纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1和cdkb1;2的耐盐性与野生型相同，说明蛋白质A和B共同作用，具有调控植物耐盐性的作用。本发明为研究植物耐盐性开辟了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及两种蛋白质及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。
背景技术
联合国粮农组织的调查结果显示,全球6%的陆地面积遭受着土壤盐渍化的侵蚀，20%的灌溉农业受到不同程度的盐害威胁。土壤盐渍化正肆无忌惮地吞噬着人类赖以生存的有限的土地资源，成为严重制约农业生产的一个全球性问题。土壤盐渍化是非生物胁迫中限制农作物生长和增产的主要的环境因素，不合理的灌溉和工业的不断发展,还在加速这种趋势。因此,对植物耐盐的研究，有助于人们了解植物的耐盐机制，对于通过转基因技术提高植物的耐盐能力是非常有必要的。
在植物研究领域，拟南芥(Arabidopsis thaliana)被公认为是理想的模式植物（其作用与实验鼠、果蝇等模式生物相当），是高等植物中最早完成基因组序列测序的植物，已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥基因组含有大约2.9万个基因，对植物特别是拟南芥而言，利用突变技术已成为研究基因功能一种有效的方法。目前已经可以得到大量拟南芥T-DNA插入突变体，便于开展对拟南芥生长发育及对逆境胁迫的研究。在拟南芥中已克隆到许多和盐胁迫相关的基因，如SOS相关基因，HKT1;1等。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到与之同源的序列，有关拟南芥的绝大多数发现也都能应用于其他植物研究。对拟南芥的研究将帮助科学家找到农作物抵抗逆境胁迫条件并提高产量的方法。面对农作物生产中日益严重的土壤盐碱化问题，克隆植物耐盐基因并对其功能进行研究，对尽快培育作物耐盐品种有重要的实践意义，而且对盐碱地的生态环境改善具有更好的实践指导意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供蛋白质A和B在调控目的植物耐盐性中的应用；所述蛋白质A为序列表序列1所示的蛋白质；所述蛋白质B为序列表序列4所示的蛋白质；所述蛋白质A和B均来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）。
在上述应用中，所述调控目的植物耐盐性可为提高目的植物的耐盐性。
在上述应用中，所述提高目的植物的耐盐性包括抑制所述目的植物中所述蛋白质A和B编码基因表达的步骤。
在上述应用中，所述蛋白质A的编码基因可为序列表序列2或3所示的基因；和/或，所述蛋白质B的编码基因可为序列表序列5或6所示的基因。
在上述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥（Arabidopsis thaliana），具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐盐性提高的拟南芥的方法，包括如下步骤：以拟南芥的突变体cdkb1;1和cdkb1;2为亲本进行人工杂交，获得F1代植株；再将所述F1代植株进行自交，获得F2代植株；将所述F2代植株或其自交后代植株作为待测植株丙，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选，获得与所述突变体cdkb1;1、突变体cdkb1;2和/或野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比耐盐性提高的拟南芥：
以所述待测植株丙的基因组DNA为模板，用引物对A、B、C1和C2分别进行PCR扩增，当所述引物对A的扩增产物中无1.2kb条带、所述引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、所述引物对C1的扩增产物中含0.75kb条带、和所述引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，所述待测植株丙为所述耐盐性提高的拟南芥；
所述引物对A由引物1-LP和1-RP组成；所述引物对C1由引物Lba1和1-RP组成；所述引物对B由引物2-LP和2-RP组成，所述引物对C2由引物Lba1和2-RP组成；
所述引物1-LP为序列表序列3的第1114—1134位所示的单链DNA；
所述引物1-RP为与序列表序列3的第2228—2249位核苷酸段反向互补的单链DNA；
所述引物2-LP为与序列表序列6的第3657—3677位核苷酸段反向互补的单链DNA；
所述引物2-RP为序列表序列6的第2558—2578所示的单链DNA；
所述引物Lba1为序列表序列7所示的单链DNA；
所述突变体cdkb1;1是以拟南芥生物资源中心（Arabidopsis BiologicalResource Center，ABRC）的编号为Salk_073457的突变体或其自交后代植株作为待测植株甲，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选后获得：以待测植株甲的基因组DNA为模板，用所述引物对A和所述引物对C1分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当所述引物对A的扩增产物中无1.2kb条带、且所述引物对C1扩增产物中含0.75kb条带时，所述待测植株甲为所述突变体cdkb1;1；
所述突变体cdkb1;2是以拟南芥生物资源中心（Arabidopsis BiologicalResource Center，ABRC）的编号为Salk_133560的突变体或其自交后代植株作为待测植株乙，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选后获得：以待测植株乙的基因组DNA为模板，用所述引物对B和引物对C2分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当所述引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、且所述引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，所述待测植株乙为所述突变体cdkb1;2。
实验证明，取蛋白质A和B编码基因不表达的双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2的种子，在正常条件下培养4天的萌发幼苗移至150mM NaCl条件下生长5天，幼苗白化率为21.4%，明显低于野生型拟南芥的70.9%；在125mM和150mMNaCl条件下萌发的幼苗白化率分别为1.1%和9.5%，明显低于野生型拟南芥的6.3%和38.3%；在正常条件下培养7天的萌发幼苗移至土壤中正常生长2周后浇灌200mMNaCl生长2周，幼苗白化率为9.2%，明显低于野生型拟南芥的58.3%。而单纯合T-DNA插入的突变体cdkb1;1和cdkb1;2的耐盐性与野生型相同，说明蛋白质A和B共同作用，具有调控植物耐盐性的作用。本发明为研究植物耐盐性开辟了一条新的途径。
附图说明
图1为拟南芥突变体的T-DNA插入位置及PCR检测结果。
图2为编号为Salk_073457的突变体待测植株的PCR检测结果。其中，图A为用引物对A进行PCR扩增的产物；图B为用引物对C1进行PCR扩增的产物；图A和B中的泳道M从上至下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1—9分别为不同待测植株的扩增产物。
图3为编号为Salk_133560的突变体待测植株的PCR检测结果。其中，图A为用引物对B进行PCR扩增的产物；图B为用引物对C2进行PCR扩增的产物；图A和B中的泳道M从上至下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1—7分别为不同待测植株的扩增产物。
图4为双纯合插入突变体cdkb1;1/1;2的PCR检测结果。图A为用引物对A进行PCR扩增的产物；图B为用引物对C1进行PCR扩增的产物；图C为用引物对B进行PCR扩增的产物；图D为用引物对C2进行PCR扩增的产物；图A—D中，泳道1—5分别为不同待测植株的扩增产物，泳道M从上至下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图5为RT-PCR检测双突变体cdkb1;1/1;2中蛋白质A和B编码基因的表达结果。其中，从上至下第一行为检测蛋白质A编码基因表达的结果，第二行为检测蛋白质B编码基因表达的结果，第三行为检测对照基因表达的结果；从左至右第一列为野生型哥伦比亚生态型拟南芥（Col）的结果，第二列为双突变体cdkb1;1/1;2的结果。
图6为突变体cdkb1;1、cdkb1;2和双突变体cdkb1;1/1;2萌发后移苗进行皿上耐盐实验的结果。其中，图A和B为移苗至1/2MS培养基中的结果，图C和D为移苗至1/2MS培养基+150mM NaCl中的结果，第一排和第二排由竖线分开的五组幼苗从左至右分别为野生型拟南芥（Col）、突变体cdkb1;1、突变体cdkb1;2、Col、双突变体cdkb1;1/1;2。
图7为双突变体cdkb1;1/1;2在不同NaCl浓度条件下萌发幼苗的白化情况。其中，图A—D各培养皿中的NaCl浓度依次为0mM、100mM、125mM、150mM，每皿中横线上方为野生型哥伦比亚生态型拟南芥（Col），下方为双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2。
图8为幼苗在土壤中的耐盐实验的结果。其中，第一行为正常处理，第二行为耐盐处理；左列为野生型拟南芥（Col），右列为双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的野生型拟南芥为野生型哥伦比亚生态型拟南芥Col-0（以下简称WT或Col）,购自拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological ResourceCenter，ABRC）。
实施例1、抑制蛋白质A和B编码基因表达的双突变体cdkb1;1/1;2的获得
1、以野生型哥伦比亚生态型拟南芥Col-0的T-DNA纯合插入突变体cdkb1;1和cdkb1;2为亲本，进行人工杂交，获得F1代植株；再将所述F1代植株进行自交，获得F2代植株；将所述F2代植株进行PCR筛选，获得双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2；
所述T-DNA纯合插入突变体cdkb1;1是从购自拟南芥生物资源中心（ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC）的编号为Salk_073457的突变体自交后代植株中经PCR鉴定后获得的；该突变体的T-DNA插入位置为拟南芥AtCDKB1;1基因（NCBI编号为At3g54180）编码区域第四个外显子（如图1中的A图所示）；AtCDKB1;1基因编码序列表序列1所示的蛋白质A，编码该蛋白质的基因组上的全长基因序列如序列表序列3所示（2398bp），序列3中的开放阅读框序列如序列表序列2所示（930bp）。
所述T-DNA纯合插入突变体cdkb1;2是从购自拟南芥生物资源中心（ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC）的编号为Salk_133560的突变体自交后代植株中经PCR鉴定后获得的；该突变体的T-DNA插入位置为拟南芥AtCDKB1;2基因（NCBI编号为At2g38620）编码区域第一个外显子（如图1中的B图所示）；AtCDKB1;2基因编码序列表序列4所示的蛋白质B，编码该蛋白质的基因组上的全长基因序列如序列表序列6所示（4644bp），序列6中的开放阅读框序列如序列表序列5所示（936bp）。
所述编号为Salk_073457的突变体和编号为Salk_133560的突变体均为野生型哥伦比亚生态型拟南芥Col-0的单拷贝T-DNA插入突变体。
所述T-DNA纯合插入突变体cdkb1;1和cdkb1;2及双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2的鉴定或筛选的方法如下：
1）引物设计
根据被插入基因AtCDKB1;1和AtCDKB1;2的序列分别设计引物对A（由引物1-LP和1-RP组成）和引物对B（由引物2-LP和2-RP组成），再根据T-DNA插入左边界的序列设计1条引物Lba1；
上述引物序列如下：
1-LP:5’-CTGGTGTTGACATGTGGTCTG-3’（与序列表序列3的第1114—1134位相同）；
1-RP:5’-CGTCAGAATGCCAGTTGTGTAC-3’（与序列表序列3的第2228—2249位反向互补）；
2-LP:5’-TGAAACTCAGAATCACCAGGG-3’（与序列表序列6的第3657—3677位反向互补）；
2-RP:5’-TTTATTATGGGTTGTGGCTGC-3’（与序列表序列6的第2558—2578位相同）；
Lba1:5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’（序列表序列7）。
2）PCR扩增及电泳检测
以编号为Salk_073457的突变体自交后代植株的基因组DNA为模板，用引物对A（由引物1-LP和1-RP组成）和引物对C1（由引物Lba1和1-RP组成）分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当引物对A的扩增产物中无1.2kb条带、引物对C1扩增产物中含0.75kb条带时，待测植株为纯合T-DNA插入；当引物对A的扩增产物中含1.2kb条带、引物对C1的扩增产物中含0.75kb条带时，待测植株为杂合T-DNA插入，部分结果如图2所示，其中，泳道2、3、5、6、7所对应的待测植株为纯合T-DNA插入（即T-DNA纯合插入突变体cdkb1;1），泳道1所对应的待测植株为杂合T-DNA插入，泳道4、8、9所对应的待测植株为纯合非T-DNA插入（即野生型）。
以编号为Salk_133560的突变体自交后代植株的基因组DNA为模板，用引物对B（由引物2-LP和2-RP组成）和引物对C2（由引物Lba1和2-RP组成）分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，待测植株为纯合T-DNA插入；当引物对B的扩增产物中含1.1kb条带、引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，待测植株为杂合T-DNA插入，部分结果如图3所示，其中，泳道1、2所对应的待测植株为纯合T-DNA插入（即T-DNA纯合插入突变体cdkb1;2），泳道3、5、6、7所对应的待测植株为杂合T-DNA插入，泳道4所对应的待测植株为纯合非T-DNA插入（即野生型）。
以突变体cdkb1;1和cdkb1;2杂交F2代植株的基因组DNA为模板，用引物对A、B、C1和C2分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当引物对A扩增产物中无1.2kb条带、引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、引物对C1的扩增产物中含0.75kb条带且引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，则待测植株为双纯合T-DNA插入（即双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2）。部分结果如图4所示，泳道1、2、3、4、5均为双纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1/1;2。
2、双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2的RT-PCR鉴定
随机取双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2的幼苗，用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA,反转录合成cDNA，再以该cDNA为模板，分别用引物对RT-A、引物对RT-B和引物对RT-CK进行PCR扩增，以野生型拟南芥（Col）为对照；将扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。
结果表明：双纯合T-DNA插入的双突变体cdkb1;1/1;2中蛋白质A和B的编码基因均不表达，野生型拟南芥中蛋白质A和B的编码基因均表达。
所述引物对RT-A用于检测蛋白质A编码基因的表达，其序列如下：
RT-A-F：5’-ATGGAGAAGTACGAGAAGCTAG-3’（与序列表序列2的第1—22位相同）；
RT-A-R：5’-GAACTGAGACTTGTCAAGGCTG-3’(与序列表序列2的第906—927位反向互补)。
所述引物对RT-B用于检测蛋白质B编码基因的表达，其序列如下：
RT-B-F：5’-ATGGAGAAATACGAGAAGCTC-3’（与序列表序列5的第1—21位相同）；
RT-B-R：5’-GAACTGAGATTTGTCAAGGCT-3’（与序列表序列5的第913—933位反向互补）。
所述引物对RT-CK用于检测看家基因ACTIN2的表达，其序列如下：
RT-CK-F:5’-CTTACAATTTCCCGCTCTGC-3’，
RT-CK-R:5’-GTTGGGATGAACCAGAAGGA-3’。
实施例2、突变体cdkb1;1、cdkb1;2和双突变体cdkb1;1/1;2耐盐性鉴定
1、萌发后移苗进行皿上耐盐实验
取野生型拟南芥（简称为WT或Col）、纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1和cdkb1;2（简称为cdkb1;1和cdkb1;2）、及双纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1/1;2（简称为cdkb1;1/1;2或cdkb1;11;2）的种子，消毒后接种于1/2MS培养基（不另添加NaCl）上垂直生长4天，然后移苗至另添加终浓度为150mM的NaCl的1/2MS培养基上垂直生长5天（图6中的C和D），以移苗至1/2MS培养基（不另添加NaCl）上垂直生长5天（图6中的A和B）为对照，统计幼苗的白化率（即叶片白化苗数占转移幼苗总数的百分比），每30个幼苗为一个重复，每种处理设3次重复，结果用平均值在表1中表示。
表1.萌发后移苗进行皿上耐盐实验的白化率（%）统计结果
| 株系 | 1/2MS培养基 | 1/2MS培养基+150mM的NaCl |
| WT | 0 | 70.9 |
| cdkb1;1 | 0 | 72.1 |
| cdkb1;2 | 0 | 71.5 |
| cdkb1;1/1;2 | 0 | 21.4 |
图6和表1的结果表明：cdkb1;1/1;2的幼苗白化率明显低于WT，表现出较强的耐盐性。cdkb1;1和cdkb1;2的结果与WT无显著差异，说明只有在蛋白质A和蛋白质B的转录或表达受到抑制时，拟南芥植株才表现出耐盐性。
2、在不同NaCl浓度条件下的萌发实验
取野生型拟南芥（简称为WT或Col）、双纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1/1;2（简称为cdkb1;1/1;2或cdkb1;11;2）的种子，消毒后接种于另添加NaCl终浓度分别为0mM、100mM、125mM和150mM的1/2MS培养基的培养皿中，每皿一半播种100粒左右WT种子、一半播种100粒左右cdkb1;1/1;2种子，于22℃、每天24小时光照（光照强度为100μmol·m-2·s-1）和环境相对湿度为60—70%的条件下培养10天（如图7所示），统计每皿中WT和cdkb1;1/1;2萌发的幼苗白化率（即叶片白化苗数占萌发幼苗总数的百分比），每种处理3皿重复，结果取平均值，如表2所示。
表2.不同NaCl浓度条件下萌发的幼苗白化率（%）结果
| 株系 | 0mM | 100mM | 125mM | 150mM |
| WT | 0 | 0 | 6.3 | 38.3 |
| cdkb1;1/1;2 | 0 | 0 | 1.1 | 9.5 |
图7和表2的结果表明：在125mM和150mM NaCl条件下，cdkb1;1/1;2的幼苗白化率明显低于WT，表现出较强的耐盐性。
3、幼苗在土壤中的耐盐实验
取野生型哥伦比亚生态型拟南芥（简称为WT或Col）、双纯合T-DNA插入突变体cdkb1;1/1;2（简称为cdkb1;1/1;2或cdkb1;11;2）的种子，消毒后分别按照如下方式进行耐盐实验：先在1/2MS培养基（不另添加NaCl）上垂直生长7天，然后移入含土壤的小花盆中正常培养两周后，一部分进行正常处理（每三天浇水一次），另一部分进行耐盐处理（每三天浇200mM NaCl一次，与正常处理的浇水量相同），2周后（幼苗生长情况如图8所示），统计幼苗的白化率（即叶片白化苗数占移栽幼苗总数的百分比），每30个幼苗为一个重复，每种处理设3次重复，结果用平均值表示，如表3所示。
表3.幼苗在土壤中耐盐实验的白化率统计结果
| 株系 | 浇水 | 浇200mM NaCl |
| WT | 0 | 58.3% |
| cdkb1;1/1;2 | 0 | 9.2% |
图8和表3的结果表明：cdkb1;1/1;2的幼苗白化率明显低于WT，表现出较强的耐盐性。
Claims (7)
1.蛋白质A和B在调控目的植物耐盐性中的应用；所述蛋白质A为序列表序列1所示的蛋白质；所述蛋白质B为序列表序列4所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控目的植物耐盐性为提高目的植物的耐盐性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述提高目的植物的耐盐性包括抑制所述目的植物中所述蛋白质A和B编码基因表达的步骤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述蛋白质A的编码基因为序列表序列2或3所示的基因；和/或，所述蛋白质B的编码基因为序列表序列5或6所示的基因。
5.根据权利要求1—4中任一所述的应用，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
7.一种培育耐盐性提高的拟南芥的方法，包括如下步骤：以拟南芥的突变体cdkb1;1和cdkb1;2为亲本进行人工杂交，获得F1代植株；再将所述F1代植株进行自交，获得F2代植株；将所述F2代植株或其自交后代植株作为待测植株丙，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选，获得与所述突变体cdkb1;1、突变体cdkb1;2和/或野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比耐盐性提高的拟南芥：
以所述待测植株丙的基因组DNA为模板，用引物对A、B、C1和C2分别进行PCR扩增，当所述引物对A的扩增产物中无1.2kb条带、所述引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、所述引物对C1的扩增产物中含0.75kb条带、和所述引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，所述待测植株丙为所述耐盐性提高的拟南芥；
所述引物对A由引物1-LP和1-RP组成；所述引物对C1由引物Lba1和1-RP组成；所述引物对B由引物2-LP和2-RP组成，所述引物对C2由引物Lba1和2-RP组成；
所述引物1-LP为序列表序列3的第1114—1134位所示的单链DNA；
所述引物1-RP为与序列表序列3的第2228—2249位核苷酸段反向互补的单链DNA；
所述引物2-LP为与序列表序列6的第3657—3677位核苷酸段反向互补的单链DNA；
所述引物2-RP为序列表序列6的第2558—2578所示的单链DNA；
所述引物Lba1为序列表序列7所示的单链DNA；
所述突变体cdkb1;1是以拟南芥生物资源中心的编号为Salk_073457的突变体或其自交后代植株作为待测植株甲，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选后获得：以待测植株甲的基因组DNA为模板，用所述引物对A和所述引物对C1分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当所述引物对A的扩增产物中无1.2kb条带、且所述引物对C1扩增产物中含0.75kb条带时，所述待测植株甲为所述突变体cdkb1;1；
所述突变体cdkb1;2是以拟南芥生物资源中心的编号为Salk_133560的突变体或其自交后代植株作为待测植株乙，按照包括如下步骤的方法进行PCR筛选后获得：以待测植株乙的基因组DNA为模板，用所述引物对B和引物对C2分别进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当所述引物对B的扩增产物中无1.1kb条带、且所述引物对C2的扩增产物中含1.1kb条带时，所述待测植株乙为所述突变体cdkb1;2。
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