MXPA06012258A - Metodos para modificar las caracteristicas de plantas. - Google Patents

Abstract

Se describen polinucleotidos aislados, polipeptidos, y plantas transgenicas. Las plantas transgenicas pueden exhibir una o mas caracteristicas fenotipicas alteradas con relacion a una planta control, entre las que se incluyen altura aumentada, peso aumentado de semillas, velocidades fotosinteticas aumentadas, niveles disminuidos de campestanol, o niveles aumentados de 6-desoxocatasterona.

Description

MÉTODOS PARA MODIFICAR LAS CARACTERÍSTICAS DE PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polinucleótidos que codifican para polipéptidos, tales como por ejemplo, los polipéptidos que funcionan en la trayectoria biosintética brassinoesteroidea, 'las plantas transgénicas que incluyen la misma, y los métodos para modificar las • características fenotípicas de la planta » utilizando los mismos. Más' particularmente, la invención se 'relaciona con plantas transgénicas que exhiben niveles aumentados de uno o más de los siguientes metabolitos: sacarosa, glutamato (ácido glutámico), o ácido linoleico. Además, la invención se relaciona con plantas transgénicas que exhiben niveles aumentados de 6-desoxocatasterona y/o niveles disminuidos de campestanol. Las plantas transgénicas también pueden exhibir potencial aumentado de crecimiento,' tamaño aumentado' (por ejemplo, altura), rendimiento aumentado de semillas, relleno más uniforme de las semillas (por ejemplo, - monocotiledóneas) , peso aumentado de las semillas por planta, semillas aumentadas por planta', una velocidad más rápida de crecimiento, fotosíntesis más eficiente, o tolerancia mejorada a la sequía.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las demandas aumentadas en las industrias agrícolas y forestales debido al crecimiento poblacional a nivel mundial han dado por resultado en esfuerzos para aumentar la producción y/o tamaño de plantas . Aunque un medio para aumentar el tamaño de las plantas se realiza a través de programas para . el ' cultivo de plantas, estos programas de cultivo típicamente llevan tiempo y un trabajo intensivo. La manipulación genética de las' características de las plantas a través de la . introducción de _ ácidos nucleicos exógenos- que confieren un rasgo, conveniente, por otro lado, pueden llevar menos tiempo y ' posiblemente se puedan aplicar a través de una variedad de especies de plantas. .Las plantas producen varios esteroides y esteróles, denominados brassinoesteroides (BRs, por sus siglas en ingles) algunos de los cuales funcionan como hormonas para .estimular el crecimiento., Existen más de 40 BRs conocidos, típicamente con entidades de oxígeno características a .µno o más de las posiciones C-2, C-6, C-22, y C-23. Brassinolide (BL, por sus' siglas en ingles) es la forma más bioactiva- de.' los • BR para estimular el crecimiento., . Arabidopsis CPD y DWF4 son proteínas de citocromo P450 que catalizan los pasos enzimáticos en la trayectoria biosintética BL; los mismos son 43% idénticos a nivel de aminoácidos. Durante la . biosíntesis de BL, DWF4 cataliza la oxidación de camp'estanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona, mientras que CPD cataliza ' la dirección 3' del paso adyacente, la hidroxilación de' 6-desoxocatasterona en C-23 para producir 6-desoxiteasterona.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente sé 'proporcionan polinucleótidos aislados, polipéptidos codificados mediante los mismos, y plantas transgénicas que incluyen los mismos.. • Una' planta transgénica puede-' '-demostrar • . características, " fenotípicas deseadas con relación a una planta 'control, tal como por ejemplo, uno o - más de altura aumentada, velocidad fotosintética aumentada, niveles aumentados- de uno o más metabolitos tales como por .ejemplo, sacarosa, glutamato, o ácido linoleico, y nivel aumentado de 6-desoxocatasterona, un nivel disminuido de caiíipestanol, actividad aumentada (por ejemplo, actividad enzimática) , eficiencia acuosa mejorada, peso aumentado de las semillas por planta, semillas aumentadas por planta, >y tolerancia aumentada a la • •. . . ' sequía.. • . •• '•' En la •• presente ' también se _ proporcionan polipéptidos funcionalmente ' comparables (homólogos y ortólogos) con la proteína P450 ,de Arabídopsis conocida como DWF4 y una secuencia de polipeptídica de consenso para estos homólogos y ' ortólogos. • DWF4 desempeña una función importante - en la síntesis de brassinoesteroides que funciona como las hormonas estimuladoras del crecimiento en plantas. De esta forma, la invención proporciona, entre otras cosas; polinucleótidos aislados que codifican para los polipéptidos P4so. Los polipéptidos P5o en algunos casos pueden funcionar en la trayectoria biosintétíca de brassinoestér?'idea. Por ej'emplo, algunos - de los polipéptido.s P450 pueden realizar una actividad enzimática de DWF4, por ejemplo, , la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. La • exposición - también proporciona plantas transgénicas que incluyen los polinucleótidos descritos en la presente, y los métodos para .elaborar los mismos. La expresión de los polipéptidos en plantas puede dar por resultado en no o más efectos fenotípicos, tales como por ejemplo, tamaño aumentado dé ' la planta (por ejemplo, altura, biomasa) y/o una velocidad más ..rápida de crecimientoP-' rendimiento' aumentado de semillas; relleno mejorado de semilla (por ejemplo, para monocotiledóneas tales como por ejemplo, arroz/' trigo, y maíz); niveles aumentados de metabolitos tales como por ejemplo, sacarosa, glutamato, A ácido* i' linoléico; un nivel disminuido de campestanol.; un nivel aumentado ,-de 6-des.oxocatasterona; velocidades fotos?ntética , aumentadas; eficacia acuosa mejorada; o tolerancia mejorada a la sequía; En otros casos, la expresión de los polipéptidos puede proporcionar actividades bioquímicas o enzimáticas no presentes normalmente en Aa planta (por ejemplo, no presentes en la totalidad o únicamente en ciertos tejidos) , o puede proporcionar niveles aumentados de estas actividades bioquímicas. En ciertos casos, la expresión de los polipéptidos puede complementar las funciones bioquímicas o enzimáticas ya presentes en la planta, o puede dar por resultado en una actividad enzimática alterada (por ejemplo, actividad aumentada, actividad disminuida, o una actividad diferente) . La inhibición de la expresión de los polipéptidos P5o en plantas, por ejemplo, mediante los métodos con base en anti-sentido, ARNi, o ribozima, puede dar por resultado en una tolerancia mejorada de las plantas a la sombra (por ejemplo, según se indica por el alargamiento representado bajo condiciones de sombra) . Por consiguiente, en un aspecto, se proporcionan polinucleótidos aislados. Un polinucleótido aislado puede incluir una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido ' que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente, el 85% o más con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. Un polinucleótido aislado puede incluir una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia del consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, por ejemplo, un polipéptido que corresponde a la secuencia de consenso. Un polipéptido puede ser efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. Un polinucleótido 'además puede incluir un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido, tal como por ejemplo, un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. En algunos casos, un promotor de expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. En algunos casos, un promotor constitutivo es 35S. En algunos casos, un polipéptido codificado no exhibe una identidad de secuencia del 93% o mayor con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 3. En otros casos, un polinucleótido aislado puede incluir una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde el polinucleótido comprende además un elemento control del promotor de expresión amplia vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. También se proporcionan en la presente los vectores recombinantes que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. Un vector recombinante puede incluir un elemento control vinculado funcionalmente al polinucleótido, en donde el polinucleótido incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia aproximadamente del 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia del aminoácido que corresponde a la secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2. En otro aspecto, también se proporcionan plantas transgénicas. Una planta transgénica puede incluir al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID ÑO: 4) según se muestra en la Figura 2, con la condición de que el polipéptido codificado no exhiba una identidad de secuencia del 93% o mayor con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO: 3. El polipéptido puede ser efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar la 6-desoxocatasterona. En algunos casos, un polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El elemento control puede ser un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. Un promotor de expresión amplia se puede seleccionar del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. El promotpf p326 puede ser efectivo para provocar la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. Una planta transgénica puede exhibir un fenotipo alterado con relación a una planta- control. El fenotipo alterado se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, un aumento en el nivel de 6-desoxocatasterona, una disminución en el nivel de campestanol,, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semilla's, un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a una planta control. Un perfil metabólico alterado puede ser un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a una planta control. Una planta transgénica puede ser ohocotiledónea, tal co o por ejemplo, arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz. Una planta transgénica puede ser una dicotiledónea . En otro aspecto, una planta transgénica no es una planta Arabidopsis thaliana ni Nicotiana tabacum . Esta planta transgénica puede incluir al menos un polinucleótido exógeno, el polinücleótido exógeno incluye un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% ? mayor con la secuencia de- aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2. El polinucleótido exógeno puede comprender además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El elemento control puede ser un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. El promotor de expresión amplia se puede seleccionar del grupo que consiste de: p326„ YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. El promotor p326 puede ser efectivo para provocar la expresión de-1 polipéptido en el retoño y la punta del retoño. Una planta transgénica puede exhibir un fenotipo alterado con - relación a una planta control. Un fenotipo alterado se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, una disminución en un nivel de campestanol, una velocidad fbtosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semilla por planta y una altura aumentada con relación a la planta control. Un perfil metabólico alterado puede ser un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control. Una planta transgénica puede ser una monocotiledónea, tal como por ejemplo, arroz, .trigo> pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz. La planta -transgén'ica puede ser una dicotiledónea. Un polipéptido puede ser" efectivo para catalizar lá oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona . En otra modalidad, se proporciona una planta transgénica que incluye al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente .el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde la planta transgénica exhibe un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona con relación a una planta control. El polinucleótido exógeno puede incluir además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Un elemento control puede ser un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. Un promotor de expresión amplia se puede seleccionar del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. Un promotor p326 puede ser efectivo para provocar la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. Una planta transgénica puede exhibir un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, una disminución en un nivel de campestanol, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de semillas por planta, y un peso aumentado con relación a la planta control. Una planta transgénica puede ser una monocotiledónea tal como por ejemplo, arroz, trigo, pasto aromático, ' centeno, cebada, sorgo, o maíz, o una dicotiledónea, según se describió anteriormente. Un polipéptido puede ser efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. En otro aspecto, en. la presente se proporciona una planta transgénica que incluye al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia, de aproximadamente el 85% 12- - . .. . -. o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde la planta transgénica exhibe una disminución en un nivel de campestanol con relación a una planta control. El polinucleótido exógeno además puede incluir un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El elemento control puede ser un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. El promotor de expresión amplia sé puede seleccionar del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. Un promotor p32ß puede ser efectivo para provocar la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. La planta transgénica además puede exhibir un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas; un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. Una planta tra.nsgénica puede ser una monocotiledónea, tal como . por ejemplo, arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz, o una dicotiledónea.' Un polipéptido puede ser efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. En otra modalidad, se proporciona una planta transgénica que comprende al menos un polinucleótido exógeno. El polinucleótido exógeno pueden incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la 'SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control de expresión amplia vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Un promotor de expresión amplia se puede seleccionar del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. La' planta transgénica puede exhibir un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, una disminución en un nivel de campestanol, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. . Un perfil metabólico alterado puede ser un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea, tal como por ejemplo, arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz. Una planta transgénica puede ser una dicotiledónea. Un polipéptido puede ser eficaz para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona . En un aspecto adicional, se proporciona una planta transgénica que incluye al menos un polinucleótido exógeno. El polinucleótido exógeno puede incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el' 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso' .(SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde la planta transgénica exhibe una velocidad fotosintética aumentada con relación a una planta control. El polinucleótido exógeno puede incluir además un .elemento control vinculado funcionalmente con el ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Un elemento control puede ser un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. Un promotor de expresión amplia se puede seleccionar del grupo que consiste de: p326,- YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. Un promotor de expresión amplia puede ser p326 que puede ser efectivo para provocar la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. Una planta transgénica puede exhibir además un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, una- disminución en un nivel de campestanol, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de semillas por la planta, y una 'altura aumentada con relación a la planta control. Un perfil metabólico alterado puede ser un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control. Una • planta transgénica puede ser una monocotiledónea, tal como por ejemplo, arroz, trigo, pasto -aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz, o puede ser . una dicotiledónea. Un polipéptido puede ser eficaz para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. También se proporcionan los métodos para producir plantas transgénicas. Un método para producir una planta transgénica puede incluir (a) introducir cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada. También se proporciona una semilla de cualquier planta transgénica descrita en la presente. En otro aspecto, se proporcionan polipéptidos aislados. Un polipéptido aislado puede (a) tener una identidad de secuencia de aproximadamente 85% o mayor con la secuencia -de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) incluir una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, con la condición de que el polipéptido codificado no exhiba una identidad dé secuencia del 93% o mayor con las secuencias de ' aminoácido mostradas en la SEQ ID N0:1 o la SEQ ID NO: 3. La exposición también proporciona los métodos para alterar una o más características fenotípicas de una planta. Por ejemplo, se proporciona un método para aumentar el nivel de uno o más metabolitos seleccionados del grupo qué consiste de sacarosa, glutamato, y ácido linoleico. El método incluye: (a) introducir cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde' la planta transgénica exhibe un nivel aumentado de uno o más- metabolitos . También se describe uh método para aumentar un nivel de uno o más metabolitos seleccionados del grupo que consiste de sacarosa, glutamato, y ácido linoleico en una planta, el método incluye: (a) introducir en la célula vegetal un polinucleótido aislado descrito en la presente, por ejemplo,? que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 2) un polipéptido que comprende una secuencia del aminoácido que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) mostrada en la Figura 2 para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal en donde la planta transgénica exhibe un nivel aumentado de uno o más metabolitos. En otro aspecto, se proporciona un método para aumentar un nivel de 6-desoxocatasterona en una planta. El método incluye a) introducir en una célula vegetal un polinucleótido aislado como se describe en la presente, por ejemplo, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2, o 2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2; para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada en donde la planta transgénica exhibe un nivel disminuido de 6-desoxocatasterona.

Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para disminuir un nivel de campestanol. en una planta. El método incluye: a) introducir en una célula vegetal un polinucleótido aislado descrito en la presente, por ejemplo, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2, o 2) un polipéptido que comprende una secuencia del aminoácido que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, para producir una- célula vegetal transformada; y (b) producir un planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada en donde la planta transgénica exhibe un nivel disminuido de campestanol. Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para aumentar la velocidad fotosintética de una planta que incluye (a) introducir en una célula vegetal un polinucleótido aislado descrito en la presente, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la 'secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2, o 2) un polipéptido que comprende una secuencia del aminoácido que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, para producir r una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada donde los planta transgénica exhibe una velocidad fotosintética aumentada. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se comprenderá en general por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica a prueba de la presente invención métodos y materiales similares. o equivalentes a aquellos descritos en la presente, más adelante se describirán los métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se Incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, el control será la presente especificación, incluyendo las definiciones. Los detalles de una o más modalidades de la invención se muestran en los dibujos acompañantes y la descripción posterior. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos para DWF4 de Arabidopsis (SEQ ID NO:l) y dos polipéptidos funcionalmente comparables con DWF4 de Arabidopsis : SEQ ID NO: 2 de maíz y la SEQ ID NO: 3 de arroz. Con respecto a la SEQ ID NO: 2, la ID del clon Ceres se refiere a la designación interna de la secuencia. Con respecto a la SEQ ID NO: 3, el "gi" corresponde a la designación en la base de datos pública NCBl, seguida por una breve descripción del identificador del clon BAC y la secuencia de proteínas. La Figura 2 es una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) para los polipéptidos funcíonalmente comparables con DWF4 de Arabidopsis . La secuencia de consenso incluye los polipéptidos P5o que tienen actividades DWF4, por ejemplo, que tienen una actividad 22- -hidroxilasa. La secuencia de consenso indica que los aminoácidos aparecen en cada posición. La secuencia de consenso contiene letras tanto minúsculas como mayúsculas. Las letras mayúsculas representan la abreviatura estándar del aminoácido de una sola letra, mientras que las letras minúsculas representan las clases de aminoácidos; "t" se refiere a aminoácidos diminutos, los cuales son específicamente alanina, glicina, serina y treonina; "p" se refiere a aminoácidos polares que son específicamente asparigina y glutamina; "n" se refiere a aminoácidos negativamente que son específicamente, ácido aspártico y ácido glutámico; "+" se refiere a residuos cargados positivamente que son específicamente lisina, arginina, e histidina, "r" se refiere a residuos aromáticos que son específicamente fenilalanina, tirosina, y 5 triptofano; "a" se refiere a residuos alifáticos, que son específicamente isoleucina, valina, leucina, y metionina. Los intervalos de aminoácidos aceptables en la secuencia de consenso se identifican con los símbolos "< >". Por ejemplo <1> significa que es aceptable un intervalo de 0 hasta 1 aminoácido; <2-4> significa que es aceptable un intervalo de dos a cuatro aminoácidos. La Figura 3 muestra la secuencia para un antisentido DWF4 (DWF4a/s; SEQ ID N0:5); véase el Ejemplo 3. 5 La Figura 4 demuestra la alineación entre DWF4 de Arabidopsis thaliana y DWF4 de Oryza de Sativa a nivel del aminoácido. Las dos secuencias son 69% idénticas entre sí.

Las ubicaciones de los dominios de unión con el ancla membranosa, ricos en prolina, de unión con 02, de unión con 0 esteroides, de función desconocida, y de unión con heme, se muestran mediante los subrayados 1 hasta 6 respectivamente.

Los aminoácidos idénticos se bloquean en la sombra gris más oscura. La Figura 5 demuestra las secuencias de '5 nucleótidos para diversos promotores utilizados en la presente. La Figura 6 es una gráfica que muestra una comparación de las velocidades fotosintéticas (PS, por sus siglas en ingles) a diferentes intensidades de luz entre las plantas transgénicas descritas en la presente y los controles. Las velocidades de PS se midieron sobre la hoja indicadora intacta a una concentración de C02 "de 380 ppm, una temperatura de 25°C, e intensidades luz de 0, 20, 50, 100, 200, 500, 1000,1500, 2000 µmol m~2s"A La velocidad de PS en cada punto de luz representa el promedio de 3 plantas. Las barras representan la desviación estándar. La , Figura 7 muestra las secuencias de polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de DWF4 Arabidopsis thaliana , Zea mays, y Oryza sativa descritos en la presente. La Figura 8 . muestra las secuencias de polipéptidos para diversos ortólogos de polipéptidos DWF4, por ejemplo, los ortólogos de C-22-a-hidroxilasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Promotor, Constitutivo':' los promotores denominados en la presente como "promotores constitutivos" estimulan los niveles detectables de transcripción de . una secuencia vinculada funcionalmente en la totalidad de los tejidos vegetal bajo la mayoría, aunque no necesariamente todas, las condiciones y estados ambientales de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de transcripción 35S del virus mosaico de coliflor (CaMV, por sus siglas en ingles) , los promotores pl3879 y p32449 de Arabidopsis, el promotor 1' ó 2 ' derivado del T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones para inicio de transcripción a partir de diversos genes vegetales, tales como por ejemplo, el promotor de ubiquitina-1 del 'maíz. Promotor de expresión amplia: un promotor puede ser de "expresión amplia" en el sentido en el que se utiliza en la presente, cuando estimula la transcripción en muchos, aunque no todos,- los tejidos vegetales. Por ejemplo, un promotor de expresión amplía puede estimular la - transcripción de una secuencia vinculada funcionalmente en uno o más del tallo, retoño, punta de retoño (tubérculo) , y hojas, aunque puede estimular la transcripción débilmente o no en la totalidad de tejidos tales como por ejemplo, los tejidos reproductores de 'las flores y semillas en desarrollo. En ciertos casos, ."un promotor de expresión amplia vinculado funcionalmente a una secuencia puede estimular la transcripción de la secuencia vinculada en un retoño de planta a un nivel que sea al menos dds veces (por ejemplo, al menos 3, 5, 10, ó 20 veces) mayor que el nivel de transcripción en un tejido de raíz o una semilla en desarrollo. En otros casos, un promotor de expresión amplia puede estimular la transcripción en un retoño de planta a un nivel que sea al menos dos veces (por ejemplo, por lo menos 3, 5, 10, ó 20 veces) mayor que el nivel de transcripción en un tejido reproductor de una flor. En vista de lo anterior, el promotor CaMV 35S no se considera un promotor de expresión amplia. Los ejemplos de promotores de expresión amplia para utilizarse en la presente invención incluyen p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. • Dominio: los dominios son huellas o firmas que se pueden utilizar para caracterizar las familias de proteínas y/o porciones de proteínas . Estas huellas o firmas pueden comprender conservados: (1) secuencia primaria; y/o (2) estructura secundaria; y/o (3) conformación tridimensional. En general, un dominio puede ser asociado con una familia de proteínas o motivos. Típicamente, estas familias y/o motivos se han correlacionado con actividades in vi tro y/o in vivo específicas. Un dominio puede ser de cualquier longitud, incluyendo la totalidad de la secuencia de una proteína. Las descripciones detalladas de los dominios P4so citocromáticos, familias y motivos asociados, y actividades correlacionadas de los polipéptidos de la presente invención se describen más adelante. Como se describe en la presente, los polipéptidos que tiene uno o más dominios designados que exhiben un porcentaje particular de identidad de secuencia con otro polipéptido pueden exhibir al menos una actividad bioquímica que se exhibe por el otro polipéptido, o pueden afectar un fenotipo vegetal de una forma similar. Endógeno: el término "endógeno", dentro del contexto de la presente invención, se refiere a cualquier secuencia de polinucleótidos, polipéptidos o proteínas que sea una porción natural de' una célula o un organismo regenerado a partir de esa célula. Exógeno: "exógeno" se refiere a un polinucleótido que se haya introducido en el genoma de una célula hospedera o, un organismo mediante cualquier otro medio distinto de una cruza sexual. Típicamente, un polinucleótido" exógeno se integra establemente dentro del genoma de una célula u organismo hospedero. Los ejemplos de medios mediante los cuales se puede introducir un polinucleótido en .plantas y células vegetales se describen más adelante, e incluyen la transformación suministrada por Agrobacterium, métodos biolísticos, electroporación, técnicas in planta, y lo semejante. Una planta que contiene el ácido nucleico . exógeno se puede hacer referencia en la presente como la planta T-y para la planta transgénica primaria, una planta T2 para la primera generación, y T3, T , etc., para la segunda y posterior generaciones de planta. La progenie T2 es el resultado de la auto-fertilización de una planta Tx. La progenie T3 es el resultado de la auto-fertilización de una planta T2. Se apreciará que un polinucleótido exógeno puede haberse introducido en una progenitora y no al interior de la célula o planta bajo consideración. Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un ácido nucleico exógeno puede ser la progenie de una • cruza entre una planta transformada establemente y una planta no transgénica. Esta progenie se considera para que contenga el polinucleótido exógeno. Por consiguiente, las plantas BCi, BC2, y BC3 así como también las plantas Fi, F2, y F3 similarmente pueden contener los polinucleótidos exógenos . Polipéptidos funcionalmente comparables: esta frase describe aquellos polipéptidos que tienen al menos una característica en común.. Estas características incluyen similitud o identidad de secuencia, actividad bioquímica, similitud de patrón transcripcional, y actividad fenotípica. Típicamente, las proteínas funcionalmente comparables comparten alguna similitud o identidad de secuencia. Dentro de esta definición, se considera que los homólogos y ortólogos serán funcionalmente comparables. Además, las proteínas funcionalmente comparables pueden compartir al menos una actividad bioquímica. Por ejemplo, los polipéptidos funcionalmente comparables pueden ser "comparables bioquímicos", por ejemplo, pueden, actuar sobre el mismo reactivo para proporcionar el mismo producto. Un comparable bioquímico puede o no exhibir la misma cinética, afinidad con el reactivo, o tiempo de producción para proporcionar el producto, aunque todavía se puede considerar funcionalmente comparable debido a que se proporciona el mismo producto final. Otra clase de polipéptídos funcionalmente comparable son "comparables ' fenotípicos" que afectan la misma característica física, tal como por ejemplo, el tamaño o altura aumentados de la planta o el perfil metabólico alterado. Los polipéptidos se pueden considerar comparables fenotípicos incluso si los polipéptidos afectan la misma característica física, aunque a un grado diferente. Por ejemplo, los polipéptidos comparables afectan la misma característica (por ejemplo, puede dar por resultado en una altura aumentada) en donde la medición cuantitativa debida a • uno de los polipéptidos comparables es de aproximadamente 20% o más del otro; por ejemplo, aproximadamente 20 hasta 30%; aproximadamente 30 hasta 40%; aproximadamente 40 hasta 50%; aproximadamente 50 hasta 60% ; aproximadamente 60 hasta 70%; aproximadamente 70 hasta 80%; aproximadamente 80 hasta 90%; " o aproximadamente 90 hasta 100%. De esta forma, dos polipéptidos pueden ser comparables fenotípicos aunque una proteína aumenta la altura de la planta en un 10% y la otra aumenta la altura de planta en un 15%. Gen: el término "gen", en el sentido en el que se utiliza en el contexto de la presente invención, abarca toda la secuencia reguladora y codificante asociada contiguamente con una unidad hereditaria individual con una función genética. Los genes pueden- incluir secuencias no codificantes que modulan la función genética que incluye de manera enunciativ , aquellas que especifican poliadenilación, regulación transcripcional, conformación de ADN, conformación de cromatina, grado y posición de los sitios de metilación de unión de las proteínas que controlan todos los mismos. Los genes comprendidos de "exones" (secuencias codificantes) , que se pueden interrumpir por "intrones" (secuencias no codificantes) , codifican para proteínas. Una función genética del gen puede requerir únicamente la ... expresión de ARN o la producción de proteínas, o sólo puede requerir la unión de proteínas y/o ácidos nucleicos sin la expresión asociada. En ciertos casos, los genes adyacentes entre sí, pueden compartir la secuencia de tal forma que un gen se superpondrá con el otro. Un gen se puede encontrar dentro del genoma o un organismo, cromosoma artificial, plásmido, vector, etc., o una entidad aislada por separada.

Secuencias heterólogas: "secuencias heterólogas", son aquellas no vinculadas funcionalmente y/o que no son contiguas entre si por naturaleza. Por ejemplo, un promotor proveniente del maíz se considera heterólogo con una secuencia de región codificante de Arabidopsis . También, un promotor proveniente de un gen que codifica para un factor de crecimiento proveniente de maíz se considera heterólogo con una secuencia que codifica para el receptor de maíz para el factor de crecimiento: Las secuencias de elementos -' r guladores, tales como por ejemplo, UTRs o las secuencias de terminación en el extremo 3' que no se originan por naturaleza del mismo gen como la secuencia codificante se origina, se consideran heterólogos para la secuencia codificante. Los elementos vinculados funcionalmente por naturaleza y contiguos entre sí, no son heterólogos entre sí. Por otro lado, estos mismos elementos siguen estando vinculados funcionalmente aunque se tornan heterólogos y se coloca entre los mismos otra secuencia de relleno-. De esta forma, el promotor y las secuencias codificantes de un. gen de maíz que expresa un transportador de aminoácidos no son heterólogos entre sí, aunque el promotor y- la secuencia codificante de un gen de maíz vinculado funcionalmente de .una forma novedosa son heterólogos. Homólogos: en la presente invención, "homólogos" se refiere por ejemplo, a un gen, ácido nucleico, polinucleótido, o polipéptido que comparte algún grado de similitud o identidad de secuencia con un gen, ácido nucleico, polinucleótido, o polipéptido de interés. Esta similitud puede ser únicamente un fragmento de la secuencia y puede representar un dominio (por ejemplo, un dominio estructural o funcional) . Las actividades bioquímicas o efectos fenotípicos -de las entidades -homologas no necesariamente son iguales o similares, aunque si lo pueden ser. Promotor inducible: un "promotor inducible" en el contexto de la presente invención, se refiere a un promotor que se regula bajo ciertas condiciones, tales como por ejemplo, luz, concentración química, concentración de proteínas, condiciones en un organismo, célula, u organelo, etc. Un ejemplo típico de un promotor inducible, que se puede utilizar con los polinucleótidos de la presente invención, es PARSK1, el promotor proveniente del gen Arabidopsis que codifica para una enzima de serina-treonina cinasa, y el promotor se induce mediante deshidratación, ácido abscísico y cloruro de sodio (Wang y Goodman, Plant J. 8:37 (1995)). Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por los promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, o la presencia de luz.

Vinculado funcionalmente: un elemento control "vinculado funcionalmente" a una secuencia codificante se une a esa secuencia codificante de tal forma que se alcance la expresión de la secuencia codificante bajo condiciones compatibles con los elementos control. Los elementos control no necesariamente deben estar contiguos con la secuencia codificante. De esta forma, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias de intercalación sin traducir aún transcritas entre un promotor y una secuencias codificantes de tal forma que el promotor se "vincule operativamente" a la secuencia codificante. Ortólogos: en la presente invención "ortólogos" se refiere a un segundo ácido nucleico que codifica para un producto génico o polipéptido que realiza una actividad bioquímica similar o afecta un fenotipo de una forma similar que el producto del primer ácido nucleico. El ortólogo típicamente tendrá un grado de similitud o identidad de secuencia con el primer ácido nucleico. De esta forma, un ácido nucleico ortólogo puede codificar para un polipéptido que exhibe un grado de similitud de secuencia con un polipéptido codificado por un primer ácido nucleico. La similitud de secuencia se puede encontrar dentro de uno o más dominios funcionales y/o estructurales o a lo largo de la longitud total de la secuencia codificante de los ácidos nucleicos y/o sus polipéptidos correspondientes . Identidad de secuencia porcentual: en general, el término "identidad" se refiere a la correspondencia exacta de nucleótido a nucleótidos o aminoácido a aminoácidos de dos polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente. Dos o más secuencias (polinucleótido o polipéptido) se pueden comparar al determinar su ' "identidad de secuencia porcentual". 'En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "identidad de secuencia porcentual" se refiere al grado de identidad entre una secuencia de interrogación determinada y una secuencia original. Una identidad porcentual para cualquier ácido nucleico de interrogación o secuencia de aminoácidos, por ejemplo, una C22-a-hidroxilasa, con relación a un ácido nucleico original o secuencia de aminoácidos se puede determinar como sigue. Un ácido nucleico de interrogación o secuencia de aminoácidos se alinea a una o más secuencias de ácido nucleico original o aminoácidos utilizando el programa de computadora ClustalW, que permite las alineaciones de las secuencias de ácido nucleico o de proteínas que serán llevados a cabo a ' través de su longitud total (alineación total) . ClustalW calcula la mejor coincidencia entre una de las secuencias de interrogación, 'y una o más originales, y las alinea de tal forma 'que se puedan determinar identidades, similitudes y diferencias. En una secuencia de interrogación, una secuencia original, o ambas, se pueden insertar los intervalos de uno o más residuos para aumentar al máximo las alineaciones de secuencia. Para una rápida alienación por pares de secuencias de ácido nucleico, se utilizan los siguientes parámetros: tamaño de la palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de mareaje: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalidad de intervalo: 5. Para una alineación múltiple de secuencias de ácido nucleico, se utilizan 'los .siguientes parámetros: penalidad de abertura del intervalo: 10.0; penalidad de extensión del intervalo: 5.0; y transiciones de peso: sí. Para una rápida alineación por pares de las secuencias de proteínas, se utilizan los siguientes parámetros: tamaño de la palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de mareaje: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; penalidad de intervalo: 3. . para? una alineación múltiple de secuencias de proteínas, se, utilizan los siguientes parámetros: matriz de peso:- blosum; penalidad de abertura del intervalo: 10.0; penalidad de extensión del intervalo: 0.05; intervalos hidrofílicos: encendido; residuos hidrofílicos: GPSNDQERK; penalidades de intervalo , residuo específico: encendido. La salida es una alineación de secuencia, que refleja la relación entre las ' secuencias. ClustalW se puede correr, por ejemplo, en el sitio de Baylor College of Medicine (BCM, por sus siglas en ingles) Search Launcher <http : //searchlauncher.bcm. tmc. edu/multi-align/multi-align.html> o en el sitio de European Bioinformatics Institute <http://www.ebi.ac.uk/clustalw>. Para determinar una identidad porcentual entre una secuencia de interrogación y una secuencia original, ClustalW divide- el número de bases coincidentes o aminoácidos entre el.' número' de bases o aminoácidos de la secuencia más corta, y multiplica el resultado por 100. La salida es la identidad porcentual de la secuencia original con respecto a la secuencia- de interrogación. Por ejemplo, si una secuencia de • interrogación y una secuencia original cada una tuvieron 500 pares de bases de largo y tuvieron 200 bases coincidentes (o idénticas) , la original - podría tener una identidad de secuencia del 40 por ciento con respecto a la secuencia de original. Si • las dos secuencias comparadas tienen diferentes longitudes, . el número de coincidencias se divide entre -la más corta de las dos longitudes de secuencia. Por ejemplo, si 100 aminoácidos coincidieron entre un polipéptido de interrogación 400 y un polipéptido original de aminoácidos 500, el polipéptido original podría tener una identidad del 25 por ciento con respecto al polipéptido de interrogación. Si la secuencia 1 más corta es menor a 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, el número de coincidencias se divide entre 150 (para las bases de ácido nucleico) o 50 (para aminoácidos), y se multiplica por 100 para obtener una identidad porcentual . En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido original adecuado tiene que ser mayor a la identidad de secuencia del -40% (por ejemplo, una identidad de secuencia del >40%, >50%, . >60%, >70%, >75%, >80%, >85%, >86%,, >87%, '>88%, >89%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96'%, >97%, >98%, o >99%) con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de interrogación (por ejemplo,- las SEQ ID NOS : 2 y 3) . En algunas modalidades, la secuencia de nucleótido de un ácido nucleico original adecuado tiene que ser mayor a la identidad de secuencia del 70% (por ejemplo, una identidad de secuencia del >75%, >80%, >85%, > 90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >S6%, >97,%, >98%,. o >99%) con respecto a la secuencia de nucleótidos . ' del ácido nucleico de interrogación. Se observa que el valor de identidad porcentual se puede redondear al décimo más cercano. Por ejemplo, 78.11, 78.12, 78.13, y 78.14 se redondean hacia abajo de 78.1, mientras que 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, y 78.19 se redondean hasta 78.2. Se debe observar que el valor de longitud siempre será un número entero.

Promotor vegetal: un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar (estimular) la transcripción en células vegetales. Estos promotores no necesitan ser de origen vegetal. Por ejemplo, los promotores derivados de virus vegetales, tales como por ejemplo, el promotor CaMV35S, o Agrobacterium tumefaciens tal como por ejemplo, los promotores de T-ADN, pueden ser promotores vegetales. Un ejemplo típico ,de un promotor vegetal de origen vegetal es el promotor de ubiquitiriá-1 (ubi-1, por sus siglas en ingles) de maíz. También se 'conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica otros promotores vegetales. Promotor: el término "promotor", en el sentido en el que se -utiliza en la presente, se refiere a una región de determinantes de secuencia ubicada en la dirección 5' desde el inicio de la transcripción de un gen y que están implicados en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar y modular la transcripción. Un promotor basál es la secuencia mínima necesaria para el ensamble de un complejo de transcripción requerido para el inicio de transcripción. Los promotores básales con, frecuencia incluyen un elemento "TATA box" ubicado usualmente entre los nucleótidos 15 y 35 en la dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción. Los promotores básales algunas veces . incluyen . -una elemento "CCAAT box" (típicamente una secuencia CCAAT) y/o una secuencia GGGCG, usualmente ubicada entre los nucleótidos 40 y 200, de preferencia los nucleótidos 60 a 120, en la dirección 5' desde el sitio de inicio de la transcripción. Secuencia reguladora: los términos "secuencia reguladora", y "elemento control", se utilizan indistintamente y hacen referencia a cualquier secuencia de nucleótidos que influya la transcripción o inicio de traducción y velocidad, y estabilidad y/o movilidad de la transcripción o producto polipeptídico. Las secuencias reguladoras incluyen de manera enunciativa: promotores, elementos para el control de promotores, secuencias para unión de proteínas, UTRs 5' y 3', sitio de inicio transcripcional secuencia de término, secuencia de poliadenilación, intrones, ciertas secuencias dentro de una secuencia codificante, etc. Rigor: "rigor" en el sentido en el que se utiliza en la presente, es . una función de la longitud de la solución de ensayo, la composición de la solución de ensayo (contenido G + C) , y la concentración salina, la concentración de solventes orgánicos, y la temperatura de hibridación o condiciones de lavado. El rigor típicamente se compara por el parámetro Tm que es la temperatura a la cual el 50% de las moléculas complementarias en el proceso de hibridación se hibridan, en los términos de una temperatura diferencial de Tm. Las condiciones de alto rigor son aquellas que proporcionan una condición de Tm - 5°C hasta Tm - 10°C. Las condiciones de rigor media o moderada son aquellas que proporcionan Tm - 20 °C hasta Tm - 29 °C. Las condiciones de rigor bajo son aquellas que proporcionan una condición de Tm - 40 °C hasta Tm - 48 °C. La relación de las condiciones de hibridación para Tm (en °C) se expresa en la ecuación matemática: Tm = 81.5-16.6(log10[Na+]) + 0.41 (%G+C) - (600/N) (1) en donde N es la longitud de la solución de ensayo. Esta ecuación funciona bien para las soluciones de ensayo de 14 hasta 70 nucleótidos de longitud que son idénticos a la secuencia blanco. La siguiente ecuación para Tm de los híbridos de ADN-ADN es útil para las soluciones de ensayo en la variación de 50 a mayor de 500 nucleótidos, y para las condiciones que incluyen un solvente orgánico (formamida) .

Tm = 81.5+16.6 log { [Na+] / (1+0.7 [Na+] ) } +0.41 (%G+C) -500/L 0.63{% de formamida) f (2) en donde L es la longitud de la solución de ensayo en el híbrido. (P. Tijessen, ??Hybridization with Nucleic Acid Probes" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P. C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdam.) La Tm de la ecuación (2) se afecta por la naturaleza del híbrido; para los híbridos de ADN-ARN Tm es 10-15 °C superior al calculado-, para los híbridos ARN-ARN Tm es 20-25 °C superior. Debido a que la Tm disminuye en aproximadamente 1°C para cada disminución del 1% en la homología cuando se utiliza una solución de ensayo larga (Bonner . , et al-, J. Mol . Biol . 81: 123 (1973)), las condiciones de rigor se pueden ajustar para favorecer la detección de genes idénticos o miembros de familias relacionadas. La ecuación (2) se deriva asumiendo el equilibrio y por lo tanto, la irrigación de acuerdo con la presente invención de mayor preferencia se realiza bajo condiciones de la solución de ensayo en exceso y durante un tiempo suficiente hasta alcanzar el equilibrio. El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio se puede disminuir mediante la inclusión de un acelerador de hibridación tal como por ejemplo, sulfato de dextrano u otro polímero de alto volumen en la' solución tampón de hibridación. La astringencia se puede controlar durante la reacción de hibridación o después de que se haya presentado la hibridación al alterar' las condiciones salinas y de temperatura de las soluciones de lavado utilizadas. Las fórmulas mostradas anteriormente son igualmente válidas cuando se utilizan para calcular el rigor de la solución de lavado. Los rigores de la solución de lavado preferidos dependen de las variaciones establecidas anteriormente; el alto rigor es 5-8 °C por" debajo de la Tm media o el rigor moderado es 26-29°C por debajo de la Tm y el rigor bajo es 45-48 °C por debajo de la Tm. Prácticamente libre 'de:' una composición que contiene A está "prácticamente libre de" B cuando al menos el 85% en peso del A+B total en la composición es A. De preferencia, A comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de A+B en la composición, de mayor preferencia al menos aproximadamente 95% o incluso ' 99% en peso. Por ejemplo, un gen o secuencia de ADN vegetal se puede considerar prácticamente libre de otros genes o secuencias de ADN vegetales. Sitio para el inicio de traducción: en el contexto de la presente invención, un "sitio" usualmente es un ATG en la transcripción de ADNc, más usualmente el primer ATG. Un ADNc individual, sin embargo, puede tener múltiples sitios para inicio de traducción. Sitio para inicio de .transcripción: "sitio para inicio de transcripción" se utiliza en la presente invención para describir el punto en el cual se inicia la transcripción. Este punto típicamente se ubica aproximadamente 25 nucleótidos en la dirección 3' de un sitio de unión con TFIID, tal como por ejemplo, una TATA box. La transcripción puede iniciar en uno o más sitios dentro del gen, y un gen individual puede tener múltiples sitios para inicio de transcripción, algunos de los cuales pueden ser específicos para la transcripción en un tipo de célula o tejido particular. Región sin traducir (UTR) : una "UTR" es cualquier serie contigua de bases nucleotídicas que se transcriben, pero que están sin traducir. Estas regiones sin traducir se pueden asociar con funciones particulares tales como por ejemplo, aumentar la estabilidad del mensaje del ARNm. Los ejemplos de las UTR incluyen de manera enunciativa: señales de poliadenilación, secuencias para terminaciones, secuencias ubicadas entre el sitio para inicio salida de transcripción y el primer exon (5' UTR) y las secuencias ubicadas entre el último exon y al final del ARNm ( 3 r UTR) . Vector: por vector se debe entender cualquier elemento genético, tal como por ejemplo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, etc., que sea capaz de transferir secuencias de polinucleótidos a codocitos. En general, un vector tiene la capacidad de replicarse cuando se asocia con los elementos control adecuados. De esta forma, el término incluye la clonación y los vehículos de expresión, así como también los vectores virales y vectores de Integración. Ácido nucleico o polinucleótido: en el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "ácido nucleico" o "polinucleótido" se utilizan de manera indistinta y hacen referencia tanto a ARN y ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico, ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente) , y análogo del ácido nucleico que contengan ADN (o ARN) . Los polinucleótidos ' pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden estar en la orientación sentido' o anti-sentido. Ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm, por -sus siglas en ingles), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, soluciones de ensayo de ácido nucleico, y cebadores. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se pueden producir mediante técnicas estándar. Por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) se pueden utilizar para obtener un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia nucleotídica descrito en la presente. PCR se refiere a un procedimiento - o técnica en el • cual los ácidos nucleicos blanco se amplifican enzimáticamente. La información de secuencias provenientes de los extremos de la región de interés o más allá típicamente se emplea para designar cebadores de oligonucleótido que sean idénticos en la secuencia a las cadenas opuestas del patrón que será amplificado. PCR se puede utilizar para amplificar las secuencias específicas a partir del ADN así como también ARN, incluyendo ' las secuencias provenientes del ADN genómico total o ARN celular total. Los cebadores típicamente tienen de 14 hasta 40 nucleótidos de longitud, aunque pueden variar de 10 nucleótidos hasta cientos de nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 15, .20, 25, 27, 34, 40, 45, 50, 52, 60, 65, 70,75, 82, 90, 102, 150, 200, 250 nucleótidos de longitud) . Las técnicas de PCR generales se describen, por ejemplo en PCR Primer : A Laboratory Manual, Ed. por Dieffenbach, C. and Dveksler, G-, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Cuando se utiliza ARN, una fuente de patrón, puede utilizarse transcriptasa inversa , para sintetizar las cadenas de ADN complementario (ADNc) . La reacción en cadena de ligasa, la amplificación del desplazamiento de cadenas, la replicación de secuencia auto-sostenida o la amplificación con base en una secuencia de ácido nucleico también se pueden utilizar para obtener ácidos nucleicos aislados. Véase, por ejemplo, Lewis, 1992,' Genetic Engineering ' News, 12: 1; Guatelli et al . , 1990, Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 87: 1874-1878; and Weiss, 1991, Science, 254: 1292. Los ácidos nucleicos aislados de la invención, también se pueden sintetizar químicamente, ya sea como una molécula de ácido nucleico individual (por ejemplo, utilizando una síntesis de. ADN automatizada en la dirección la 3 ' a 5' utilizando tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucleótidos. . Por ejemplo, uno o más pares de oligonucleótidos largos (por ejemplo, de >100 nucleótidos)- se puede sintetizar para que contenga la secuencia deseada, con cada par que contenga un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 15 nucleótidos) de tal forma que se forme un dúplex cuando se fije el par de oligonucleóti'dos . La ADN polimerasa se utiliza para extender los oligonucleótidos, dando por resultado en una molécula de ácido nucleico de doble cadena individual por par de oligon?cleótidos, que luego se puede ligar en un vector. . , Los ácidos nucleicos aislados de la invención también se pueden obtener mediante mutagénesis. Por ejemplo, una secuencia de ácido,' nucleico de referencia se puede mutar utilizando técnicas estándar incluyendo mutagénesis oligonucleótido dirigida y mutagénesis sitio dirigida a través de PCR-. Véase, Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Edited ' by. Ausubel, F. M et al., 1992. Los análogos de ácido nucleico se pueden modificar en la entidad base, la entidad de azúcar, o la estructura de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones a la estructura incluyen el uso de enlaces sin cargar (por ejemplo,' fosfonatos de metilo, fosfotriéste'res, fosfamidatos, carbamatos, etc.), y enlaces cargados (ppr. ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Las modificaciones a la estructura también pueden incorporar enlaces peptídicos, por ejemplo, para dar por resultado en un enlace tipo PNA.. Las modificaciones en la entidad base incluyen desoxiuridina para desoxitimidina, y 5-metil-2' -desoxicitidina o 5-bromo-2' -desoxicitidina para desoxicitidina. Las modificaciones de la entidad de azúcar incluyen la modificación del 2 ' hidroxilo de la ribosa azúcar para formar los azúcares 2' -O-metilo o 2'-0-alilo. La estructura de desoxirribosa, .fosfato se puede modificar para producir los ácidos nucleicos morfolino, en los cuales cada entidad base se enlaza a un anillo de morfolina de seis miembros, o los ácidos nucleicos peptídicos, en los cuales la estructura de desoxifosfato se reemplaza por una estructura de pseudopéptido y se retienen las cuatro bases. Véase, Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7 (3) : 187-195; y Hyrup et al. (1996) Bioorgan.

Med. Chem. 4(l):5-23. Además, la estructura de desoxifosfato se puede reemplazar con, por ejemplo, una estructura de fosforotioato o fosforoditioato, una fosforoamidita, o una estructura de fosfotriéster de alquilo. El ácido nucleico puede ser de doble cadena o una sola cadena (es decir, una cadena individual sentido o una anti-sentido) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, "aislado", cuando . se hace referencia a un ácido nucleico o polinucleótido, se refiere a un ácido nucleico o polinucleótido que se separa de otro ácido nucleico o moléculas de polinucleótido que estén presentes en un genoma, por ejemplo, .un genoma vegetal, incluyendo los ácidos nucleicos o polinucleótidos que normalmente flanquean uno o ambos lados del ácido nucleico o polinucleótido en el genoma. El término "aislado", en el sentido en el que se utiliza en la presente, con respecto a ácidos nucleicos o polinucleótidos también incluye cualquier secuencia que no se presente en la naturaleza, debido a que estas secuencias que no se presentan en la naturaleza no- se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en el genoma que se presenta en la naturaleza. Un ácido nucleico o p?linucleótido aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, con la condición de que una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontrados se flanqueen inmediatamente a esa molécula de ADN en un genoma que' se presenta en la naturaleza se retire o esté ausente. De esta forma, un ácido nucleico aislado, incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como una molécula por separado (por ejemplo, un ácido nucleico sintetizado químicamente, o un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante . PCR o un tratamiento de endonucleasa de restricción) .independiente de otras secuencias así como también,, el ADN que se incorpora dentro de un vector, un plásmido replicante autónomamente, un virus (por ejemplo, un retrovirus, lentivirus, adenovirus, o virus del herpes) , o el ADN genómico de una procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico manipulado mediante ingeniería tal como por ejemplo, una molécula de • ADN que forma parte de un híbrido o ácido nucleico de fusión. Un ácido nucleico que existe entre cientos de millones de otros ácidos nucleicos dentro de, por ejemplo, de las bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas, o porciones de gel que contienen una restricción del ADN genómico se digieren, y no se consideran un ácido nucleico aislado. -Polipéptido: El término "polipéptido" se utiliza en su sentido más amplio para, hacer referencia a un compuesto de dos o más aminoácidos sub-unitarios, análogos de aminoácidos, u otro peptidomiméticos . Las sub-uhidades pueden estar enlazadas mediante enlaces peptídicos u otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. El término "aminoácido" se- refiere a aminoácidos ya sea naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo los isómeros ópticos D/L. Las proteínas, análogos, mutantes de longitud total y fragmentos de los mismos se abarcan por esta definición. Por "aislado", con respecto a un polipéptido, se debe entender que el polipéptido1 se separa a algún grado de los componentes celulares con los cuales se encuentra normalmente por naturaleza. Un polipéptido aislado puede proporcionar una mayor banda individual sobre un gel de poliacrilamida sin reducción. En ciertos casos, un polipéptido se "purifica". El término "purificado" en el sentido en el que se utiliza e la presente, de preferencia significa al menos aproximadamente 75% en peso o más (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100%) de polipéptidos del mismo tipo que están presentes con relación a todos los polipéptidos en, por ejemplo, una mezcla. Los polipéptidos aislados se pueden obtener, por ejemplo, mediante la extracción de una fuente natural, mediante síntesis química, o mediante la producción recombinante en una célula hospedera o planta transgénica. Para producir recombinantemente polipéptidos, una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de interés se puede ligar en un vector de expresión y se puede utilizar para transformar una célula hospedera, bacteriana, eucariota, o vegetal (por ejemplo, células de insecto, levadura, mamífero, o vegetales) . En los sistemas bacterianos, se puede utilizar una cepa de Escherichia coli tal como por ejemplo, BL-21. ' Los vectores de E. coli adecuados incluyen la series .pGEX de vectores que producen proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en ingles) . Dependiendo del vector utilizado, la E. coli trasformada se hace crecer típicamente de manera exponencial, luego se estimula con isopropiltiogalactopiranósido (IPTG, por sus siglas en ingles) antes de la recolección. En general, las proteínas de fusión expresadas son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir - de células Usadas mediante la adsorción de perlas de glutation-agarosá seguida por la elusión en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan trombina o los sitios de escisión con el factor Xa proteasa de tal forma que el producto géni.co blanco clonado, se pueda liberar de la entidad GST. Alternativamente,' se pueden utilizar marcas His 6X para facilitar el aislamiento. En células hospederas < eucariotas, para expresar polipéptidos se pueden utilizar ' varios sistemas de expresión con base viral. Un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención se puede clonar en, por ejemplo, un vector del baculoviral tal como por ejemplo, pBlueBac (Invitrogen, Carlsbad, CA) y luego se puede utilizar para co-transfectar células de insectos tales como por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9, por sus siglas en ingles) con ADN tipo silvestre - de Autographa cali omica de múltiples pliegues envueltos en virus de polihidrosis nuclear (AcMNPV, por áus siglas en ingles) . Los virus recombinantes para producir polipéptidos de la invención se pueden identificar mediante metodología estándar. Líneas - celulares de mamífero que expresan establemente los polipéptidos, se pueden producir al utilizar vectores de expresión con los elementos control adecuados y un marcador seleccionable. Por ejemplo, el vector de expresión eucariota pcADN3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) es adecuado para la expresión de polipéptidos en una célula tal como por ejemplo,' células ováricas de hámster chino (CHO, por sus siglas- en ingles)', células COS-l, células 293 renales embriónicas humanas, células NIH3T3, células BHK21, células MDCK, células ST, células PK15, o células endbteliales vasculares' humanas (HUVEC, por sus siglas en ingles) . En algunos casos, el .vector pcADN3, se puede utilizar para expresar un polipéptído en células BHK21 en donde vector incluye un promotor CMV y un gen de resistencia a antibióticos . G418. Después. de la introducción del vector de expresión, se pueden seleccionar líneas celulares estables, por ejemplo, mediante la resistencia a antibióticos para G418, kanamicina, o higromicina. Alternativamente, las secuencias amplificadas se pueden ligar en un vector de expresión mamífero tal como por ejemplo pcADN3 .(Invitrogen, San Diego,- CA) y luego - se puede transcribir y traducir 'in vitro utilizando extracto de germen de trigo y lísato de' reticulocitos de conejo. Todavía en otros casos, las células vegetales se pueden transformar co.n una estructura de ácido nucleico recombinante para expresar el polipéptido, según se describió anteriormente y en los ejemplos posteriores. El polipéptido entonces se ' puede extraer y purificar utilizando técnicas conocidas a aquellos con experiencia normal en este campo.

Pol±nucleótidos y Pol±pépt±dos Los polinucleótidos descritos en la presente son de interés debido a que las plantas transgénicas que los incluyen pueden exhibir • características fenotípicas alteradas con relación a una planta control. Por ejemplo, una planta transgénica puede exhibir un perfil metabólico alterado. Un perfil metabólico alterado puede incluir niveles modificados de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico, según se analizará más adelante. En "algunos casos, las plantas transgénicas pueden exhibir un nivel aumentado de 6-desoxocatasterona, y/o un nivel disminuido de campestanol. En algunos casos, una planta transgénica que expresa este polipéptido puede exhibir una velocidad fotosintética aumentada. Estas características fenotípicas alteradas se pueden utilizar para aprovechar o aumentar al máximo los productos vegetales. ' Por ejemplo, .un polinucleótido y/o polipéptido de la presente, invención se puede utilizar para aumentar los niveles de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico en una planta; o para aumentar los niveles de 6-desoxocatasterona en una planta; o para disminuir los niveles de campestanol en una planta; o para aumentar la velocidad fotosintética de una- planta. En ciertos casos, se modifica más de una característica fénotípica, por ejemplo, un nivel - aumentado de, 6-desoxocatasterona y un nivel disminuido de campestanol. Como consecuencia, las plantas transgénicas pueden , tener un potencial de crecimiento mejorado con biomasa, altura, rendimiento de semillas, peso de- la semillas aumentados, o un relleno mejorado de semillas. De esta forma, los polinucleótidos y polipéptidos son útiles en la preparación de plantas transgénicas que tengan aplicación particular en las industrias agrícolas y forestales. En particular, se proporcionan, el polinucleótido P5o aislado y las secuencias polipeptídicas, incluyendo las variantes homólogos, ortólogos, fusiones, y fragmentos de la secuencia de polinucleótídos, y los polipéptidos funcionalmente comparables con los polipéptidos Pso. Un polinucleótido P450 aislado o polipéptido pueden ser un homólogo y/o un ortólogo con un polinucleótido de DWF4 de Arabidopsis o el polipéptido- DWF4. ' Un polihucleótido Pso aislado o polipépt-ido - puede ser un homólogo y/o ortólogo para un polinucleótido que codifica para una 22-a-hidroxilasa o un polipéptido 22-a-hidroxilasa. De esta forma el polinucleótido DWF4 aislado y las secuencias polipeptídicas de DWF4, incluyendo los polipéptidos DWF4 funcionalmente comparables con DNF4 de Arabidopsis, se describen en la presente. DWF4 es un polipéptido P5o citocromático que, -'entre otras actividades, cataliza la de campestanol en C-22 'para producir 6-desoxocatasterona. Por consiguiente, en ciertos casos, una secuencia polipeptídica pueden exhibir una actividad bioquímica o afectar un fenotipo vegetal de forma similar a un polipéptido ' DWF4 y representa un polipéptido funcionalmente. comparable bioquímico o fenótípico con la proteína DWF4 de Arabidopsis. Los polinucleótidos de la invención incluyen ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos Pso citocromáticos . Las SEQ ID NOs: 1-3 muestran el polinucleótido y las secuencias polipeptídicas de tres proteínas P50 de Arabidopsis, maíz, y arroz, respectivamente. Las secuencias de Arabidopsis y arroz son los polipéptidos DWF4 que codifican para una enzima de 22-a-hidroxilasa. El polipéptido de maíz (SEQ ID NO: 2) se identificó como un ortólogo ' DWF4 a través de comparaciones de secuencia' de una biblioteca de las secuencias polipeptídicas de maíz contra un número de bases de datos de polipéptidos, incluyendo un Pso, una planta, y una base de datos patentada y a través de la evaluación de las características fenotípicas de las plantas transgénicas que expresan el polipéptido de maíz (SEQ ID NO: 2) con relación a las plantas transgénicas que expresan el polipéptido DWF4 de Arabidopsis (SEQ ID N0:1) o el polipéptido DWF4 de arroz (SEQ ID N0:3). Véanse los ejemplos, siguientes, y la Figura 4, que muestran una alineación entre el polipéptido DWF4 de Arabidopsís y polipéptido DNF4 de arroz. Los homólogos, ortólogos, fragmentos, fusiones, complementos, o complementos inversos de los polímeros polinucleótidos descritos ; (y- polipéptidos codificados) también se contemplan. Como se observó anteriormente, los homólogos y ortólogos de un polipéptido se pueden denominar como polipéptidos funcionalmente comparables. Los homólogos de polipéptidos funcionalmente comparables exhiben niveles particulares de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos de maíz mostrada en la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tenga una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, una identidad de secuencia de aproximadamente del 86, 87, 90, ,92, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100%. Una proteína funcionalmente comparable puede ser un ortólogo de DNF4 de Arabidopsis . Una proteína funcionalmente comparable puede ser un ortólogo de un polipéptido que tenga una actividad C-22 a-hidroxilasa. La Figura 8 muestra las secuencias polipeptídicas para varios ortólogos de DWF4 de Arabidopsis . En algunos casos, un polinucleótido aislado puede incluir un ácido nucleico que codifica para polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso de un polipéptido de DWF4 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO:4). Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que corresponde a la secuencia de consenso para un polipéptido de DWF4 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO:4A En algunos casos, el polinucleótido que incluye además un promotor de expresión amplia vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Se puede utilizar cualquier promotor de expresión amplia, incluyendo sin limitación, los únicos descritos adicionalmente en la presente. En algunos casos, un polinucleótido aislado puede incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia del aminoácido que corresponde a la secuencia de consenso para un polipéptido de DWF4 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 4), con la condición de que el polipéptido codificado no exhiba una identidad de secuencia del 93% o mayor (por ejemplo, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 97%, 98%, ó 99%) con las secuencias de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO: 3. Los polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de- consenso se pueden utilizar, por ejemplo, para producir plantas transgénicas con una o más de las .siguientes características fenotípicas: velocidades fotosintéticas modificadas (por ejemplo, aumentadas) , - niveles . aumentados de 6-desoxocatasterona, niveles disminuidos de campe'stanol, perfiles modificados, de métabolitos, por ejemplo, niveles aumentados de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico, rendimiento aumentado de semillas, relleno mejorado de semillas, altura aumentada de- la planta, etc. En ciertos casos, un polipéptido descrito en la presente puede ser una proteína ortóloga funcionalmente comparable con DWF4 de Arabidopsis según se determina por el polipéptido que realiza al menos una de las actividades bioquímicas de DWF4 o afecta un fenotipo vegetal de una forma similar a DWF4. De esta forma, un polipéptido puede catalizar una reacción similar como DWF4 o afectar un fenotipo vegetal de una forma similar a DWF4. Por ejemplo, DWF4 de Arabidopsis, se sabe que cataliza la oxidación de campestanol C-22 para formar 6-desoxocatasterona. DWF4 también cataliza la hidroxilación de 6-oxocampestanol para producir catasterona. Un polipéptido de la invención también puede realizar uno o ambos de estos pasos enzimáticos . En ciertos casos, un polipéptido funcíonalmente comparable exhibe al menos el 60% de una actividad bioquímica de la proteína DWF4 de Arabidopsis por ejemplo, al menos 70%, 80%, 90%, ó 95% de una actividad bioquímica. Los métodos por evaluar las actividades bioquímicas se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica, e incluyen análisis enzimáticos (por, ejemplo, para evaluar Vmax, Km, Kcat, Kx, etc. ) , análisis de alimentación de radio-rastreadores, etc. En particular, los niveles del sustrato y producto para un paso enzimático determinado se pueden evaluar utilizando técnicas analíticas conocidas por aquellos con experiencia normal en este campo (por ejemplo, GC-MS) . Por ejemplo, los niveles de intermediarios químicos en la trayectoria BL se pueden evaluar en plantas transgénicas que incluyen un polinucleótido que codifica para un polipéptido descrito en la presente. Los niveles se pueden comparar con relación a los niveles en una planta control. Los niveles de intermediarios químicos en plantas transgénicas se pueden evaluar en diversas etapas del desarrollo, 'por ejemplo, la producción de semillas o en etapas adultas, o utilizando diversos tejidos (por ejemplo, semillas, hojas, retoños, tallos, .flor, etc.). Una disminución en el nivel de campestanol y/o un aumento en el nivel de 6-desoxocatasterona puede ser indicativo de que un polipéptido es un ortólogo para DNF4 de Arabidopsis .

Vectores recombinantes y células hospederas La invención también proporciona vectores recombinantes y células hospederas que incluyen cualquiera del polinucleótidos aislados descritos anteriormente. Como se indicará con mayor detalle más adelante, se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica una variedad de vectores recombinantes. .Un vector recombinante puede incluir una secuencia de la presente invención con cualesquiera secuencias reguladoras transcripcionales y/o de traducción deseadas, tales como por ejemplo, promotores, las UTR, y las secuencias para terminación, en el extremo 3' . Los vectores también pueden incluir orígenes de replicación, regiones de unión estructural (SAR, por sus siglas en ingles) , marcadores, secuencias homologas, intrones, etc. El vector también puede incluir un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células vegetales. El marcador típicamente codifica resistencia a biocidas, en particular resistencia antibiótica, tal como por ejemplo, resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia -a herbicidas, tal como por ejemplo, resistencia a clorosulfuro o fosfinotricina. Típicamente, un vector recombinante incluirá un polinucleótido y un elemento control vinculado funcionalmente al polinucleótido de tal • forma que una secuencia de codificación polipeptídica en el polinucleótido se pueda transcribir y traducir, por ejemplo, en una célula hospedera. Un elemento control puede ser un promotor, ' muchos de los cuales se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica. Por ejemplo, se pµede incluir un promotor vegetal, tal como por ejemplo, uno que dirija la transcripción del gen en la totalidad o ciertos tejidos' de una planta regenerada, por ejemplo, un promotor constitutivo tal como por ejemplo, 35S o un promotor de expresión amplia' tal como por ejemplo, p326. En estos cosos, , el promotor se vincula funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés. Alternativamente, el promotor vegetal puede dirigir la transcripción de una secuencia de la invención en un tejido específico (promotores tejido- específicos) o de otra manera bajo un control ambiental preciso (promotores inducibles) . Como se indicó anteriormente, diversos promotores vegetales, incluyendo los promotores constitutivos, tejidos específicos, de expresión amplia, e. inducibles,' se conocen por aquellos con experiencia en la técnica y se pueden utilizar en la presente invención. Una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante también se puede incluir. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a partir de otros diversos genes vegetales, o de T-ADN. En ciertos casos, se puede incluir un promotor de expresión amplia. Por ejemplo, los promotores de expresión amplia tales como por ejemplo, p326, P0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190 se pueden utilizar. En estos casos, un polinucleótido vinculado funcionalmente a un promotor de expresión amplia puede ser cualquiera de los polinucleótidos descrito anteriormente, por ejemplo, aquellos que incluyen ácidos nucleicos que codifican para las SEQ ID NOs: 1-3 o la secuencia de aminoácidos DWF4 de 'consenso mostrada en la Figura 2, o un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico que ' codifica para uh polipéptido que exhibe una identidad de secuencia de al menos aproximadamente . el 85% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 86%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%,' 97%, 98%, 99% ó 100%) con las ID SEQ NOs: 1-3. En los casos en donde se emplea un promotor constitutivo tal como por ejemplo, 35S, un polinucleótido puede incluir un ácido nucleico que codifica para- un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85% o mayor con' la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, una identidad de secuencia de aproximadamente 86, 87, 90, 92, 95,96, 97,98, 99, ó 100%) , o puede incluir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene uña secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de consenso para un polipéptido de DWF4 mostrado en la -Figura 2 (SEQ ID NO: 4), con la condición de que pl polipéptido codificado no exhiba una identidad de secuencia del 93% o mayor (por ejemplo, 94, 94.5, 95, 95.5, 96,97, 98', 99 ó 100%) con las secuencias de aminoácidos mostradas en -la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO: 3. Los vectores recombinantes se pueden utilizar para transformar una variedad de células vegetales para preparar plantas transgénicas. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores se conocen en la , técnica. Típicamente, se preparan estructuras de ADN recombinantes que incluyen las secuencias de polinucleótidos de la invención insertadas en un vector que sea adecuado para la transformación de células vegetales. La estructura se puede realizar utilizando técnicas de ADN recombinante estándar (Sambrook et al. 1989) . La estructura del vector puede ser cualquiera de aquellas típicas en la técnica tales como por ejemplo, plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BACs, YACs y PACs.

Plantas trans gén±cas La invención también proporciona plantas transgénicas que incluyen un polinucleótido exógeno o vector recombinante según se describe en la presente. Cualquiera de los polinucleótidos o vectores recombinantes descritos anteriormente se pueden introducir en el genoma de una variedad de hospederos vegetales mediante varios métodos conocidos, incluyendo electroporación, microinyección, y métodos biolísticos. Alternativamente, los polinucleótidos o vectores se pueden combinar con regiones de flanqueo de T-ADN adecuadas y se pueden introducir en un .vector hospedero de Agrobacterium tumefaciens convencional. Estas técnicas de transformación 'suministradas por Agrobacterium tumefaciens incluyen desarmar y el uso de vectores binarios, así como se sabe bien en la técnica. Otras • técnicas de transferencia y transformación génica incluyen transformación de protoplastos, a través de calcio o PEG, absorción provocada por electroporación de ADN descubierto, electroporación de tejidos vegetales, y bombardeo de microproyectiles. La expresión ectópica de la secuencia de la invención se puede llevar a cabo utilizando un enfoque de "ingreso". Aquí, el primer componente, una "línea activadora", es una planta transgénica que comprende un activador trahscripci?nal vinculado funcionalmente a un promotor. El. segundo componente comprende la secuencia de ADNc deseada vinculada funcionalmente a la secuencia/región de unión blanco del activador transcripcional. El segundo componente se transforma en la "línea activadora" o se utiliza para transformar una planta hospedera para producir una línea "blanco" que se cruce con la "línea activadora" mediante métodos de cultivo normales. En cualquier caso, el resultado es el mismo. Es decir, el promotor conduce la producción de la proteína activadora transcripcional que luego se une a la región de unión blanco para facilitar la expresión del ADNc deseado. Cualquier promotor que funcione en plantas se puede utilizar en el primer componente, tal como por ejemplo, un promotor constitutivo, un promotor tejido u órgano específico, o un promotor de expresión, amplia, según se describió anteriormente. Los polipéptidos activadores transcripcionales adecuados incluyen, de manera enunciativa: aquellos que codifican para HAP1 y GAL4. La secuencia de unión reconocida y dirigida por la proteína activadora transcripcional seleccionada se utiliza en el segundo componente. Las células vegetales transformadas producidas mediante los métodos anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta que posea él genotipo transformado. Las técnicas de regeneración pueden depender de la manipulación de fitoh?rmonas . en medio de crecimiento para tejido cultivos, y puede depender de un marcador de biocida y/o herbicida introducido con el polinucleótido de interés. La regeneración también se puede obtener a partir de protoplastos, callo, explantaciones, órganos, polen, embriones, vegetales o partes de los mismos. Una célula transformada, callo, tejido, o planta se puede identificar y aislar al seleccionar o tamizar el material vegetal sometido a ingeniería para características o actividades particulares,' por ejemplo, aquellas codificadas por los genes marcadores o los genes de resistencia a antibióticos. Estas metodologías de tamizado o selección son bien conocidas por aquellos con experiencia normal en la técnica. Además, para identificar los transformantes se pueden utilizar métodos físicos y bioquímicos. Los métodos incluyen análisis Southern y amplificación mediante PCR (por ejemplo, para la detección de un polinucleótido) ; transferencias Northern, protección con SI RNasa, extensión de cebadores, o amplificación mediante RT-PCR para detectar y examinar las transcripciones de ARN; análisis enzimáticos para detectar la actividad enzimática o de ribositas de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel proteínico, transferencias Western, inmunoprecipitación, e inmunoanálisis de enzima vinculados para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como por ejemplo, hibridación in situ, tinción enzimática, e inmunotinción también se pueden .utilizar para detectar la presencia o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos. Los métodos para realizar todas las técnicas a las que se hace referencia son bien conocidos. Después de que se incorpora establemente un polinucleótido en una planta transgénica, esta se puede introducir en otras plantas mediante cruce sexual, por ejemplo, mediante técnicas de cultivo estándar. Los polinucleótidos ( descritos anteriormente se pueden utilizar para transformar varias plantas y sistemas celulares vegetales, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los polinucleótidos y polip'éptidos encontrarán aplicación particular en las áreas agrícolas y forestales. Un grupo adecuado de especies vegetales incluye dicotiledóneas, tales como por ejemplo, cárcamo, alfalfa, soya, café, semilla de colsa (alto contenido de ácido erúcico y cañóla), o girasol. También son adecuadas las monocotiledóneas tales como por ejemplo, maíz, trigo, centeno, cebada, avena, arroz, mijo, amaranto, pasto aromático, o sorgo. Cosechas de vegetales o cosechas de raíces, tales como por ejemplo, lechuga, zanahoria, cebolla, brócoli, chícharos, maíz dulce, maíz palomero, tomate, papa, frijoles (incluyendo, frijoles, frijoles blancos, frijoles secos, frijoles verdes) y lo semejante analizados, así como también, cosechas de fruta tales como por ejemplo, uva, fresa, pina, melón (por ejemplo, sandía, cantalupo) , durazno, pera, manzana, cereza, naranja, limón, toronja, ciruela, mango, plátano, y palma. De esta forma, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar con plantas dicotiledóneas que pertenecen a los órdenes Magniolales , iniciales , Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales , Ranunculales, Papeverales , Sarraceniaceaer , Trochodendrales , Haniamelidales, Euconiiale's, Leitneriales, Myricales, Fágales, Casuar inales , Caryophyllales, Bátales, Polygonales, Pluinbaginales r Dilleniales , Theales , Málvales, Urticales , Lecythidales , Viólales, Salicales, Capparales r Ericales r Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales , Podostemales, Halo rag ale s r Myrtales, Cornales , Proteales , Santales , Raf fies iales , Celastrales , Euphorbiales , . Rhamnales , Sapindales, Juglandales , Geraniales, Polygalales, Uinbellales, Gentianales , Polemoniales , Lamíales , Plantaginales , Scrophulariales , Cainpanulales , Rubiales, Dípsacales, y Asterales . Los métodos descritos en la presente también se pueden utilizar con plantas monocotiledóneas que pertenecen - a los órdenes Alismatales , Hydrocharitales , Naj adales , Triurídales , Commelinales , Eriocaulales, Restionales, Poales , Juncales , Cyperales , Typhales, Brome?iales , Zingiberales , Afecales , Cyclanthales , Pandanales , Árales , Lilliales, , y Orchidales, o con plantas que pertenecen a Gymnospermae, por ejemplo, Piñales, Ginkgoales , Cycadales ,y Gnetales . La invención también utiliza una amplia variedad de especies vegetales, incluyendo las especies provenientes de los géneros Allium, Alseodaphne, Anacardíum, Arachis , Aspar agus , Atropa , Avena , Beilschmiedia , Brassica , Citrus , Citrullus , Capsicum, Catha anthus , Carthamus, Cocculus , Cocos, Coffea , Crotón, Cucumis , - Cucúrbita , Daucus , Duguetia , Elaeis, Eschscholzia , ' Ficus, Fragaria , Glaucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis , Hevea , Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca., Landolphia , Linuni , Litsea , Lolium, Lupinus, Lycopersicon, , Malus, Manihot, Majorana , Medicago, Musa , , Nicotiana , Olea , Oryza , Panicum, Pannesetum, Papaver, Parthenium, Persea , Pliaseolus, Pinus, Pistachia , Pisum, Pyr' us, ' Prunus, Raphanus, Rhizocarya , Ricinus , Sécale, Senecio, Sinomenium, Sinapis , Solanum, Sorghum, Stephania , Theobroma , .Trigonella , Triticum, Vicia , Vinca , Vitis, Vigna y Zea . Un grupo adecuado de especies con las cuales la practicar de la invención incluye plantas productoras de alcaloides, por ejemplo, plantas provenientes de Papaveraceae, Berberidaceae , Lauraceae, Menispermaceae , Euphorbiaceae , Leguminosae, . Boraginaceae , Apocynaceae, Asclepiadaceae , Liliaceae, Gnetaceae, Erythroxylaceae, Convolvulaceae, Ranunculaecéae, Rubiaceae, Solanaceae, y las familias ' Rutaceae. La familia Papaveraceae por ejemplo, la familia contiene . aproximadamente 250 especies encontradas principalmente en . las regiones templadas del norte del mundo e incluye plantas tales como por ejemplo, amapola de California y amapola de opio. Los géneros útiles dentro de la familia Papaveraceae incluyen el Papaver (por ejemplo, Papaver bracteatuin, Papaver oriéntale, Papaver setigerum, y Papaver somniferum) , Sanguinaria ,. Dendromecon, • , Glaucium, Meconopsis , Chelidonium, Eschscholzioideae (por ejemplo, Eschscholzia , Eschscholzia california) , y los géneros Argemone (por ejemplo, Argemone hispida , Argeinone mexicana , y Argemone munita) . Otras especies productoras de alcaloide con las cuales se práctica esta invención incluyen Crotón salutaris , Crotón balsamífera , Sinomenium acutum, Stephania cepharantha, Stephania zippeliana, Litsea sebiferea, Alseodaphne perakensis, Cocculus Xaurifolius, Duguetia obovata, Rhizocarya racemifera , y Beilschmiedia oreophila. Otro grupo adecuado de especies con el cual se practica la invención incluyen plantas productoras de terpenoides, por ejemplo, las plantas provenientes de los géneros Aesculus, Anamirta, Andrographis , Artemisia, Betula, Bixa, Cannabis, Centella, Chrysanthemum, Tanacetum, Cinnamomum, Citrullus , Luffa, .Coleus, Cúrcuma, Cymbopogan, Daphne, Euphorbia , , Glicine Glycyrrhíza, Gossypium, Guayule, Hevea, Isodon, Rabdosia, Rabdosia, Mentha, Salvia, Rosmarinus, Simarouba, Taxus., thymus, y Tripterygíum.. Otras especies adecuadas incluyen Lycopersicum esculentum, Nicotiana spp.- (por ejemplo, Nicotiana tabacum) , Capsicum spp. (incluyendo C. annuum) , Parthenium argentatum Gray, Mentha spicata-, M pulegium, M piperita, Thymus vulgaris ' ' L. , Origanum vulgare, Rosmarinus offícinalis, Melissa officinalis , Theobroma cacao, Lavandula augustifolia, Salvia of icinalis , Coffea arábica, Hevea benthamiana , Hevea guianensus, Hevea brasiliensis , Manihot glaziovii, Manihot • d?chotoma, Castilla elástica , Picus elástica, Funtimia elástica, Landolphia kirkii, Landolphia gentilli,' Landolphia heudelotii,- Landolphia' owariensis , Crytostegia grandiflora, Crytostegia madagascariansis , Taraxacum- megalorhizon , Palaquim gutta, Manílkara bidentata , y Manilkara zapata . En ciertos casos, una planta transgénica no es una planta Arabidopsis thaliana o Nicotiana tabacum . En algunos casos, una planta transgénica no es un miembro de la familia Solanaceae o de la familia Brassicaceae. Por ejemplo, una planta transgénica puede no ser una planta Arabidopsis thaliana o Nico'tianá tabacum cuando comprende al menos un polinucleótido exógeno, en donde polinucleótido exógeno incluye un ácido nucleico . que codifica para un polipéptido: (a) que tiene una identidad de. secuencia de aproximadamente el 85% q mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ .ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2. Las plantas transgénicas pueden exhibir cualquiera de las actividades bioquímicas de los polipéptidos descritos anteriormente. Por ejemplo, una planta transgénica puede exhibir al menos una de las actividades bioquímicas de DWF4 de Arabidopsis, por ejemplo, una actividad 22- -hidroxilasa. Los métodos para evaluar las actividades bioquímicas ' se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica; véase, por ejemplo, lo anterior. Las plantas transgénicas se pueden utilizar para proporcionar una planta que tenga un fenotipo vegetal • alterado (por ejemplo, • en comparación con una planta control) . Un polipéptido puede afectar el fenotipo de una planta (por ejemplo, una planta transgénica) cuando se expresa en la planta, por ejemplo, a los tiempos adecuados o en los tejidos adecuados. Los efectos fenotípícos se evalúan típicamente con relación a una planta control que no expresa el polinucleótido exógeno de interés, tal como por ejemplo, una planta tipo silvestre correspondiente, una planta no transgénica • correspondiente para el pblinucleótido exógeno de- interés aunque de otra manera isogénica para ' la planta transgénica de interés, o una planta isogénica correspondiente en la cual la expresión del polipéptido se suprime, inhibe, o no se induce (es decir, cuando la expresión está bajo el control de un promotor inducible) . Se puede decir que una. planta "no expresa" un polipéptido cuando la planta exhibe menos del 10% (por ejemplo, menos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, . 0.001%) de la cantidad del polipéptido - o ARNm que codifica , para el polipéptido exhibido por la planta de interés. La expresión se puede evaluar mediante métodos ' conocidos por , aquellos con experiencia normal en este campo, por ejemplo, amplificación RT-PCR, transferencias Northern, protección con SI ARNasa, extensiones ' con cebadores, transferencias Westhern; electroforesis en gel de proteína, inmunoprecipitación, inmunoanálisis enzima-vinculados, análisis en tablilla y espectrometría ásica. Se debe observar que si se expresa un polipéptido bajo el control de un promotor tejido específico o de expresión amplia, la expresión se puede evaluar en la planta total o selectivamente en un tejido deseado. - De manera similar, si se expresa un polipéptido en, un tiempo particular, por ejemplo, en un tiempo particular en el desarrollo o durante la inducción, la expresión se puede evaluar selectivamente a un periodo de tiempo deseado.' Un efecto fenotípico puede ser un perfil metabólico alterado con relación' a una planta control. Por ejemplo, una planta transgénica puede exhibir niveles aumentados de uno o más de los siguientes metabolitos: sacarosa, glutamat? (ácido glutámico), o ácido linoleico. En ciertos casos, cuando se expresa un polipéptido descrito en la presente en una planta transgénica, la planta transgénica puede exhibir una- concentración de sacarosa (por ejemplo, en el tejido de lá hoja) que es de 10% hasta aproximadamente 30% mayor (por ejemplo, aproximadamente 12 hasta aproximadamente 3.0%; entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25%, entre , aproximadamente 18 hasta aproximadamente .25%, o entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20% mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. En algunos casos, cuando un polipéptido descrito en la presente se expresa en una planta transgénica, como la planta transgénica puede exhibir una concentración de ácido glutámico (por ejemplo, en el tejido de las hojas) que está entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 65% mayor (por ejemplo, entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30%; entre aproximadamente 20 hasta aproximadamente 45%; entre aproximadamente 30 hasta aproximadamente 60%; entre aproximadamente 40 hasta aproximadamente 65%; entre aproximadamente 30 hasta aproximadamente 55%; entre aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30% mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. Todavía en otros casos, cuando un polipéptído descrito en la presente se expresa en una planta transgénica, la planta transgénica puede exhibir una concentración de ácido linoleico (por ejemplo, en un tejido de hojas) que está entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% mayor (por ejemplo, entre aproximadamente 15% hasta aproximadamente 35%; entre aproximadamente 20% hasta aproximadamente 45%; entre aproximadamente 30% hasta aproximadamente 48%; entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35% mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. Las plantas transgénicas en ciertos casos puede no exhibir un aumento en el nivel de ciertos aminoácidos distintos, carbohidratos, ácidos grasos o ácidos orgánicos con relación a una planta control, por ejemplo, ciertos compuestos mostrados en la Tabla 3. Un efecto fenotípico puede ser una velocidad fotosintética aumentada con relación a una planta control.

Los métodos para medir las velocidades fotosintéticas se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica para una especie de planta determinada. Por ejemplo, una planta transgénica puede 'exhibir una velocidad fotosintética aumentada - a una cierta temperatura, intensidad de luz, (por ejemplo, densidad de flujo fotónico fotosintético (PPFD, por sus siglas en ingles) ) , humedad, o concentración de de dióxido de carbono con relación a una planta control . Una temperatura para evaluar las velocidades fotosintéticas puede ser entre aproximadamente 5°C hasta 45 °C, o cualquier valor entre las mismas (por ejemplo, entre aproximadamente 10 °C, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 32°C) . Los -valor.es. de humedad -pueden variar entre aproximadamente 5% hasta aproxim damente 80%, o cualquier valor entre los mismos (por ejemplo, entre aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, o aproximadamente 70%) . La intensidad de luz (PPFD) puede ser entre aproximadamente 0 µmol m_2s_1 hasta aproximadamente 4000 µmol pf2s-1, o cualquier valor entre los mismos (por ejemplo, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2200, 2500, 2750, 2900, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, ó 3900 µmol m-2s-1) . Las concentraciones de dióxido de carbono pueden variar entre aproximadamente 25 ppm hasta aproximadamente 1000 ppm, o cualquier valor entre las misas, por ejemplo, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente '360, aproximadamente 380, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 760, • aproximadamente 800, aproximadamente 900, o aproximadamente 950 ppm) . Se puede utilizar cualquier combinación de temperaturas, intensidades de luz, humedad, y concentraciones del dióxido de carbono. Por ejemplo, en algunos casos, una planta .transgénica puede exhibir una velocidad fotqsintética aumentada con relación a una planta control a una concentración de dióxido de carbono de 360 .ppm, un nivel de humedad de aproximadamente 50-55%, una temperatura de aproximadamente 25 °C, sobre la variación de los PPFD entre aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 2000 µmol pAs-1- Un efecto f'enotípico puede ser un aumento o disminución en un nivel de un intermedio químico en la trayectoria BL. Por ejemplo, un efecto fenotípico puede ser un aumento en los niveles de 6-desoxocatasterona con relación a una planta control. Un efecto fenotípico puede ser una disminución en los niveles de campestanol con relación a una planta control. Los métodos analíticos para medir los intermedios químicos, incluyendo los intermediarios en la trayectoria BL tales como por ejemplo, campestanol y 6-desoxocatasterona, se conocen en la técnica y también se describe en la presente. Un aumento o disminución pueden ser cualquier cantidad con relación a una planta control, por ejemplo, mayor a 1.2 veces, 1.5 veces, 1.8 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 50 veces, o 100 veces de aumento o disminución con relación a una planta control. En ciertos casos, un aumento en 6-desoxocatasterona puede ser mayor que 2 veces, o mayor que 3 veces, o mayor que 4 veces, o mayor que 5 veces, o mayor que 6 veces, con relación a una planta control. Las plantas .transgénicas también pueden exhibir un potencial de crecimiento aumentado, tamaño aumentado (por ejemplo, altura), rendimiento aumentado de semillas, relleno más uniforme de semillas (por ejemplo, en monocotiledóneas tales como por ejemplo, arroz) , una velocidad más rápida de crecimiento, o una tolerancia mejorada a la sequía con relación o una planta control. Por ejemplo, cuando un polipéptido descrito en la presente se expresa en una planta transgénica, la planta transgénica puede exhibir una altura que se encuentra entre aproximadamente 7% hasta aproximadamente 20% mayor (por ejemplo, entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 15%; entre aproximadamente 12% -hasta aproximadamente 18%; entre aproximadamente 8% hasta aproximadamente 18%; entre aproximadamente 15% hasta aproximadamente 20 mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. En otros casos, cuando un polipéptido descrito en la presente se expresa en una planta transgénica, la planta transgénica puede exhibir un rendimiento de semillas (número de semillas por planta) entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 95% mayor (por ejemplo, entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 20%;- entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50%; entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 70%; entre, aproximadamente 20% hasta aproximadamente 60%; entre aproximadamente 20% hasta aproximadamente 75%; entre - aproximadamente 25% hasta aproximadamente 85%; entre aproximadamente 30% hasta aproximadamente 70%; entre aproximadamente 35% hasta aproximadamente 90%; entre aproximadamente 40% hasta aproximadamente 60%; entre aproximadamente 40% hasta aproximadamente 85%; entre aproximadamente 50% hasta aproximadamente 80%; entre aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90%; entre aproximadamente 70% hasta aproximadamente 90% mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. En ciertos casos, cuando un polipéptido descrito en la presente se expresa en una planta transgénica, la planta transgénica puede exhibir un aumento en el peso de las' semillas por planta entre aproximadamente 5% hasta aproximadamente 20% ' mayor (por ejemplo, entre aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10%; entre 8% hasta aproximadamente 12%; entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 15%; entre aproximadamente 8% hasta aproximadamente 18% mayor) que una planta que no expresa el polipéptido. Sé debe observar, que los efectos fenotípicos típicamente se evalúan para significancia estadística mediante el análisis de uno o más experimentos. Se debe entender que cuando se comparan los fenotipos para valorar los efectos de un polipéptido, se considera una diferencia en los fenotipos estadísticamente significativa en p < 0.05 con una estadística paramétrica o no paramétrica adecuada, por ejemplo, la prueba Ch'i-cuadrada, la prueba t de Student, la prueba Mann-Whitney, . o la prueba F. Otros efectos fenotípicos se pueden evaluar mediante los métodos conocidos por aquellos con experiencia normal en la técnica, incluyendo mediciones de la longitud celular a tiempos específicos en el desarrollo; mediciones de la utilización BL; análisis para detección de esteróles; detección de productos o subproductos de reacción; detección de niveles de sustrato y/o producto para un paso enzimático determinado; y pruebas de respuesta a las dosis sobre sustratos enzimáticos putativos.

Métodos Los polinucleótidos y polipéptidos descritos en la presente se pueden utilizar para generar plantas que tengan un fenotipo alterado,,, por ejemplo, características fenotípicas alteradas. De esta forma, los métodos para alterar una o más de las características fenotípicas de una planta se proporcionan. Una característica fenotípica puede ser uno o más de un perfil metabólico alterado; una velocidad fotqsintética alterada; un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona; una disminución en un nivel de campestanol; un rendimiento aumentado de semillas; un peso aumentado de semillas por planta; y una altura aumentada con relación a una planta control. Un método descrito en la presente típicamente puede incluir a) .introducir en una célula vegetal un polinucleótido aislado que.-incluya una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene ' una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor ,a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 2 ó 2) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, con el fin de producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada. Las plantas resultantes se pueden evaluar para una característica fenotípica alterada utilizando ' cualesquiera métodos, incluyendo aquellos descritos en la presente. En ciertos casos, se puede alterar más de una característica fenotípica, por ejemplo, un aumento en los niveles de 6-desoxocatasterona y una disminución en campestanol.

Alteración de los niveles de expresión de la sobre- expresión de los polipéptidos DWF4 Como se describió anteriormente, los polinucleótidos, vectores recombinantes, células hospederas, y plantas transgénicas descritos en la presente se pueden manipular mediante ingeniería para proporcionar una sobre-expresión de un polipéptido de interés. La sobre-expresión, de un polipéptido se puede utilizar para alterar las características fenotípicas vegetales con relación a una planta control, por ejemplo, una planta control que no expresa polipéptidos, tal como por ejemplo, para aumentar la altura de la planta, para alterar los perfiles metabólicos, para aumentar los niveles de 6-desoxocatasterona, para disminuir el nivel de campestanol, para aumentar las velocidades fotosintéticas, o para mejorar el rendimiento de semillas, etc. Además, un polipéptido se puede sobre-expresar en combinación con la sobre-expresión de otro polipéptido, por ejemplo, otro polipéptido P5o implicado en la trayectoria biosintética BL, tal como por ejemplo,- CPD. Esta co-expresión de polipéptidos puede dar por resultado én efectos aditivos o sinérgicos sobre una actividad' bioquímica vegetal (por ejemplo, actividad enzimática) o fenotipo (por ejemplo, altura) . Los polipéptidos de fusión también se pueden emplear y típicamente incluirán un polipéptido descrito en la presente fusionado en el marco con otro polipéptido, tal como por ejemplo, un polipéptido implicado en las biosíntesis BL (por ejemplo, CPD) .

Inhibición de la expresión Alternativamente, los polinucleótidos y ' los vectores recombinantes descritos en la presente se pueden utilizar para suprimir o inhibir la expresión de una proteína P5Q endógena, tal como por ejemplo, DWF4, en una especie vegetal de interés-. . 'Se pueden utilizar varios métodos para inhibir la expresión génica en plantas. La tecnología anti-sentido es un, método bien conocido. En este método, un segmento de ácido nucleico proveniente del gen endógeno se clona y se vincula funcionalmente a un promotor de tal forma que la cadena anti-sentido del ARN se transcriba. El vector recombinante luego se transforma en plantas, como se describió anteriormente, y se produce la cadena anti-sentido del ARN. El segmento de ácido nucleico no necesita ser la secuencia total del gen endógeno que será reprimido, aunque típicamente será prácticamente idéntico al menos a una porción del gen endógeno que será reprimido. En general, se puede utilizar una mayor homología para compensar el uso de una secuencia corta. Típicamente, se utiliza una secuencia de al menos 30 nucleótidos (por ejemplo, al menos 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleótidos o más) . Las moléculas de ARN catalíticos o ribozimas también se pueden utilizar para inhibir la expresión. Las ribozimas se pueden diseñar para pares específicamente con cualquier ARN blanco virtualmente y pueden escindir la estructura .fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando funcionalmente con esto el ARN blanco. La inclusión de secuencias de ribozimas dentro de las ribozimas confiere una actividad de escisión con ARN con las mismas, aumentando con esto su actividad de supresión. Los métodos para diseñar y utilizar las ribozimas ARN específicas blanco se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. Véase, en general, WO 02/46449 y las referencias citadas en la presente. También se pueden utilizar métodos con base en la interferencia de ARN (ARNi, por sus siglas en ingles) . La interferencia de ARN es un mecanismo celular para regular la expresión de genes y la replicación de virus. Este mecanismo se proporciona mediante moléculas de ARN de pequeña interferencia de doble cadena (siARN, por sus siglas en ingles) .. Una célula responde a un ARN de doble cadena extraño (por ejemplo,' siARN) introducido en la célula al destruir todos los ARNm que contienen la misma secuencia que el siARN. El ARNi se cree que incluye los pasos tanto de inicio como efeGtor.es.. En el -paso de inicio, el dsARN de entrada se digiere en 21-23' ARNs que interfieren con pequeños nucleótidos (siARNs, por sus siglas en ingles) , qué también se denominan "ARNs guías". Los siARNs se producen cuando, la enzima Dicer, un miembro de la familia RNasa III de ribonucleasas dsARN-específieos, escinde procesivamente el dsARN (por ejemplo, introducirlo directamente o vía un transgén o virus) de una manera procesiva, dependiente de ATP. Los eventos de escisión sucesiva degradan el ARN a dµplexiones de 19-21 pares de bases (siARNs), cada uno con salientes 3' con 2-nucleótido. En el paso efector, las duplexlones • de siARN se unen a un complejo de nµcleasa para formar el complejo identificador inducido para ARN, o RISC. Un desenvolvimiento dependiente de ATP del siARN dúplex se requiere para la activación del RISC. El RISC activo dirige la transcripción homologa mediante interacciones con pares de bases y escinde el ARNm aproximadamente 12 nucleótidos provenientes del término 3' del siARN. Los- métodos para diseñar y preparar las siARNs para dirigir un ARNm blanco se conocen por aquellos con experiencia en la técnica; véase, por ejemplo, la WO 99/32619 y la WO 01/75164. .En un método de diseño, se realiza una exploración para las secuencias de A? dinucleótido de inicio con el codón de inicio AGO de la transcripción designada. . Cada secuencia A? y los 19 nucleótidos adyacentes 3' se- registran como los sitios blanco siARN potenciales. Luego se pueden seleccionar de dos a cuatro de estas secuencias, con base en parte en los siguientes criterios: 1) los, siARNs con '30-50% del contenido de GC son más activos que aquellos- con un contenido mayor de G/C; 2)' debido a que un tracto poli (T) de 4-6 nucleótidos actúa como una señal de terminación para el ARN III, se extiende a- más de 4 T's. o A' s en las secuencias blanco que- se deben evadir cuando las secuencias de diseño se expresarán a partir de un promotor pol III de ARN; 3) debido a que, en algunas regiones del ARNm pueden estar bastante estructuradas o unidas mediante proteínas reguladoras, este puede ser útil para seleccionar los sitios blanco del siARN a diferentes posiciones a lo largo de la longitud total del gen; y 4) pueden ser útil comparar los sitios blanco potenciales con la base de datos genómica adecuada (humano, ratón, rata, etc.) * y eliminar de- la • consideración cualesquiera secuencia blanco con más de 16-17 pares de bases contiguos de identidad u otras secuencias codificantes que no sean de interés. En algunas modalidades, una estructura de ARN de interferencia incluye una secuencia que se transcribe en un ARN de doble cadena, que tiene una estructura de tronco-asa. Una estructura de la porción de tronco de un ARN de doble cadena comprende una secuencia que es similar p idéntica a la secuencia codificante sentido del polipéptido de interés, y que tiene entre aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 2,500 nucleótidos de longitud. La longitud de ia secuencia que es similar o idéntica a la secuencia codificante sentido - puede ser de 10 nucleótidos hasta 500 nucleótidos, de 15, nucleótidos hasta 300 nucleótidos, de 20 nucleótidos hasta 100 nucleótidos, o de 25 nucleótidos hasta 100 nucleótidos. La otra cadena de la porción de tronco • de un ARN dé doble cadena comprende una secuencia anti-sentido del polipéptido de interés, y puede tener una longitud que sea más corta, igual a, o más larga que la longitud correspondiente de la secuencia sentido. La porción asa de un ARN de doble cadena puede ser de 10 nucleótidos hasta 5,000 nucleótidos, por ejemplo, de 15 nucleótidos hasta 1,000 nucleótidos, de 20 nucleótidos hasta 500 nucleótidos, o de 25 nucleótidos hasta 200 nucleótidos. La porción de asa del ARN puede incluir un intrón. Véase, por ejemplo, la WO 99/53050. Para preparar el siARN diseñado, entonces se puede utilizar síntesis química, transcripción in vitro, vectores de expresión de siARN, y casetes de expresión PCR.

Artículos de fabricación La invención también proporciona artículos de fabricación., Un artículo de fabricación puede incluir una planta transgénica descrita en la presente, por ejemplo, una planta transgénica en un recipiente, bolsa, olla, o maceta. Un artículo de fabricación puede incluir una o más semillas provenientes de una planta transgénica descrita en la presente. Típicamente, se acondiciona y embolsa en un material de envasado una mezcla prácticamente uniforme de semillas por medios conocidos en la técnica para formar un artículo de fabricación. Esta bolsa de semilla de preferencia tiene una etiqueta, de empaque que acompaña la bolsa, por ejemplo, una etiqueta o marca asegurada al material de envasado, una etiqueta impresa sobre el material de envasado, o una etiqueta insertada dentro de la bolsa. La etiqueta de envasado puede indicar que las plantas que crecen a partir de estas semillas son adecuadas para la elaboración de un polipéptido preseleccionado indicado. La etiqueta de envasado también puede indicar que las semillas contenidas en la misma incorporan transgenes que pueden proporcionar características fenotípicas deseadas, según, se analizó anteriormente.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Análisis de la expresión de p326:DWF4 en arroz sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas Un plásmido Ti que contiene un promotor diseñado p326 en la dirección 5' y vinculado funcionalmente a una secuencia codificante Hapl y UASpai (secuencia activante en la dirección 5' - Hapl) vinculado 'operativamente a una secuencia codificante de la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en ingles) , se introdujo en el arroz cultivar Kitaake al utilizar Agrobacterium y callos competentes de transformación. La expresión de la secuencia codificante Hapl da por resultado en la acumulación de la proteína de Hapl y GFP. . La expresión detectable de GFP , se confinó al tallo y hojas de las plantas de arroz, con menor expresión observada en tejidos de raíz. La expresión no se detectó en el meristema del retoño, flores, o semillas antes de la germinación. Una línea derivada de este caso de transformación se designó CRS-BIN1A 7. Un plásmido Ti que contiene cinco copias de UASHapi en la dirección 5' y vinculado funcionalmente a la secuencia de codificación ' génómica para una 22-a-hidroxilasa (DWF4, por sus siglas en ingles) de Arabidopsis también se introdujo en Kitaake. El ADNg fue del ecotipo WS . La activación del UAS (mediante Hapl) dio por resultado en la transcripción del ADNg de DWF4 y la acumulación de la transcripción de DWF4. T2 ?S : DWF4 líneas derivadas de líneas transgénicas independientes 17 y 36 y designadas 17-3,36-5, y 36-6, se polinizaron mediante plantas CRS-BIN1A 7 para producir las semillas Fl . . Los tres grupos de plantas Fl para la progenie 17-3, 36-5, y 36-6 se denominaron R150, R149 y R147. Las plantas Fl se probaron para la presencia de Hapl:GFP mediante fluorescencia, y para la presencia de UAS : DWF4 mediante PCR. La presencia de la transcripción de ADNg de DWF4 se confirmó mediante RT-PCR. Las semillas F2 provenientes de las plantas Fl 'designadas R150P5, R150P7, R149P2 y R149P5 se hicieron germinar y se hicieron crecer lado por lado en 5 ollas con controles negativos, según se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

Tabla 1. El pareo de las plantas para fenotipo. Cada par contiene una planta Fl que contiene p326:Hapl y UAS : DWF4 y una planta control Fl que contiene p326:Hapl o UAS:DWF4, creciendo en la misma olla.

Las mediciones de largo de la hoja, ancho de la hoja, longitud internodal, espesor del tallo,' espesor de la panícula, número de ramas, número de semillas, y peso de las semillas se utilizaron para elaborar los efectos de la actividad de DWF4 mejorada sobre el crecimiento, desarrollo y rendimiento. Las mediciones de las hojas mostraron que la vaina y limbo fueron de aproximadamente el 15% más largos que las plantas Fl que contuvieron p326:Hapl y O?S : DNF4 y la actividad DWF4 mejorada que las hojas de las •» •< - .. - 90 , plantas control, y que la longitud del primer internodo se aumentó significativamente -como resultado. La anchura del limbo de las hojas también puede haber disminuido en alguna medida, "aunque la variación en los datos realizados no mostró diferencias significativas. El efecto combinado de estos cambios inducidos por DWF4 fue de aproximadamente el 15% de aumento de altura, y él efecto sobre la longitud internodal hizo que las hojas se agruparan ligeramente hacia la parte superior de í'a vegetal. No existieron cambios evidentes en la textura de las hojas. Sin embargo, el ángulo de la hoja se aumentó en las plantas que contienen p326:Hapl y JRS : DWF4 y mostró una actividad DWF4 mejorada. Las longitudes de la vaina y del limbo también aumentaron en las plantas Fl que muestran niveles aumentados de transcripción con. DWF4 cuando crecieron por separado, y las hojas- de estas plantas fueron de color verde más oscuro. El número de cultivos sobre las plantas Fl que contienen p326:Hapl y O?S : DWF4 y que. muestran una actividad DWF4 mejorada (aproximadamente 11 cultivos) fue igual que el número de cultivos sobre las plantas control que contienen p326:Hapl únicamente o UAS : DWF4 únicamente. Sin embargo, las mediciones de diversos parámetros que se relacionan con el rendimiento de semillas revelaron diferencias consistentes. El número de semillas F2 por cultivo y por planta, y el peso de la semilla por planta, ambos se aumentaron en un 20-30% en las plantas Fl que contienen p326:Hapl y UAS : DWF4 y que muestran una actividad DWF4 mejorada. También, los pesos de las semillas se aumentaron: las semillas F2 provenientes de las plantas que contienen p326:Hapl y UAS : DWF4 y que muestran una actividad DWF4 mejorada fueron de aproximadamente 10% más pesadas que en las plantas control. Las mediciones del número de cultivos y número de semillas se to aron 95 días después del trasplante al suelo (en la recolección) . Para las mediciones del peso de las semillas, las mismas se recolectaron 95 días después del transplante al suelo y se secaron durante 14 días a 37 °C.

Todas las plantas tuvieron aproximadamente 11 cultivos: el número de cultivo permaneció sin cambio mediante la actividad DWF4 mejorada. Sin embargo, los números de las semillas por cultivo y el número de las semillas por' planta se aumentaron en un 20-30%,' y el peso por semilla se aumentó en aproximadamente 10%. La combinación de estos efectos fue un aumento en el .peso de las semillas por planta (rendimiento) de hasta aproximadamente 30%. Existe una diferencia en las semillas - por cultivo, las semillas por planta, y el peso de las semillas por semilla y peso de la semilla por planta mayor a una desviación estándar. Los datos demuestran que la expresión de una 22-a-hidroxilasa ,. . -92, , de dicotiledónea en una monocotiledónea da por resultado en semillas más pesadas. Cien semillas F2 seleccionadas aleatoriamente se pesaron de cada uno de los mismos pares de plantas y se exhibieron los pesos de las semillas más pesadas o más ligeras. Los datos revelaron que el aumento en el peso de las semillas fue más prominente en aproximadamente 30% de las semillas. En tres de cuatro pares (pares 2-4), el peso de las semillas se aumentó en- aproximadamente hasta el 40% en el más ligero de aproximadamente el 30% de las semillas de plantas que contienen niveles elevados de DWF4, con relación a las plantas control que crecen en las mismas maceras. En el otro 70% aproximadamente, el peso de las semillas aumentó en menores cantidades . En uno de los cuatro pares (par 1) , el peso de las semillas se aumentó uniformemente entre todas las clases de semillas, i Estos resultados indican que una 22-a- hidroxilasa confiere un relleno más uniforme de semillas cuando se expresa vegetativamente en una mono-cotiledónea. La anchura de la base del tallo y la anchura de la base del pañículo . también se midieron. La anchura del tallo se aumentó a aproximadamente hasta un 30% en las plantas que contienen p326:Hapl y O?S .- DWF4 con relación a las plantas control que contienen p326:Hapl únicamente o O&S -. DWF4 únicamente, mientras que la anchura del panículo se aumentó a ' aproximadamente hasta en un 20%. ,Por lo tanto, la expresión de DWF4 en arroz dio por resultado en un aumento en la altura de la planta y el- rendimiento de semillas, aunque también un aumento en el espesor del eje suficiente para soportar la altura aumentada de' la planta y el rendimiento de semillas. La observación visual indicó que las plantas no están propensas a ser plantadas alojar. Estos datos indican que la expresión vegetativa de una 22- -hidroxilasa en una 'monocotiledónea en ausencia de expresión de la hidroxilasa en inflorescencias y semillas en desarrollo,' proporciona un rendimiento aumentado de semillas. ' ' Ejemplo 2 - Análisis de la expresión p326:DWF4 en arroz sobre niveles de metabolitos Las líneas Ü?S : DWF4 , DWF4-BIH1B 16-2, 17-3 y 27-3, derivadas de las líneas transdérmicas independientes 16, 17 y 27, respectivamente, se polinizaron mediante 7 plantas CRS-BIN1A 7 para producir las semillas Fl . Los tres grupos de plantas ' Fl, denominadas R148, R150 y . R151, respectivamente, se -probaron para la presencia de Hapl:GFP mediante fluorescencia, y para la presencia de UAS : DWF4-mediante PCR. La presencia de la transcripción gADN de DWF4 se confirmó mediante RT-PCR. Las semillas F2 provenientes de las ' plantas Fl designadas R148P5, R150P7 y R151P1 se hicieron germinar y se hicieron crecer en la oscuridad durante 3 días, y luego se probaron para la presencia de p326:Hapl y UAS : IWF4. Cinco pares de segregantes de GFP (+) /DWF4 (+) y GFP (+) /DWF4 (-) , cada uno surgiendo de la misma planta Fl, se hicieron crecer lado por lado en 5 macetas, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2.

Tabla 2. Pareo de plantas. Los segregantes de GFP (+) /DWF4 (+) y. GFP (+) /DWF4 (-•) F2 se hicieron crecer lado por lado. Hapl : GFP y UAS :IWF4 significan los dos elementos del sistema' de 2 componentes.

Las plantas F2 se hicieron crecer en el invernadero. La hoja indicadora de , cada planta se recolectó aproximadamente 12 días después del inicio de la floración y dentro de los 5 'minutos de las otras hojas indicadoras (entre 5:00 pm y 5:05 pm) , congeladas en hielo seco, y se almacenaron a -80°C. Para análisis químico, estas hojas se liofilizaron, se extrajeron con metanol y diclorometano, y se dividieron en fases polares y no polares antes de la derivación y la espectrometría ásica en' cromatografía de gases (GC-MS) . Las extracciones se realizaron por duplicado o triplicado para generar muestras por replicado para -aµálisis . GC-MS . La cantidad del tejido de hojas liofiliza'das utilizadas para cada extracción se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3.

Tabla 3. Muestras utilizadas para el análisis MxP. La abreviatura T2 se refiere a cada una de las 10 hojas indicadoras utilizadas para el análisis GC- . MS. Las Columnas "1", "2" y "3" muestran la cantidad de tejido de hojas liofilizado utilizado para cada extracción, en mg. Para dos de las hojas indicadoras (R148P5 14 y R151P1 40), hubo sólo suficiente tejido para- extracciones por duplicado.

La recolección y procesamiento de datos implicó la inspección visual y comparación de cromatogramas-, análisis multivariados incluyendo análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en ingles) y análisis de agrupamiento jerárquico (HCA, por sus siglas en ingles) , y análisis experimental/control.'.' La recolección y procesamiento de datos se utilizaron para determinar las proporciones de metabolitos. Se analizaron ochenta y dos compuestos, incluyendo aminoácidos, carbohidratos, ' ácidos grasos y ácidos orgánicos. - Los compuestos analizados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4.

Tabla 4. Compuestos analizados mediante GC-MS (MxP) . ' Para los ácidos grasos, las proporciones hacen referencia al número de átomos de carbono y el número de enlaces insaturadas.

El resultado del análisis para perfil metabólico mostraron que los niveles de sacarosa libre se aumentaron en aproximadamente el 20% en 2 de las 5 plantas que contienen p326:Hapl y las plantas XJ?S : DWF4 (GFP (+) /DWF4 (+) ) con relación a los controles que contienen p326:Hapl solo (plantas GFP (+) /DWF4 (- ) ) . Las concentraciones de sacarosa en las otras 3 plantas también fueron mayores que la concentración en los controles, aunque los aumentos no fueron estadísticamente significativos. Los resultados . también mostraron que la concentración de ácido glutámico y ácido linoleico se aumentaron en las hojas indicadoras de todas- las 5 plantas F2 con relación a los controles. El aumento de ácido glutámico estuvo entre • aproximadamente 15% y aproximadamente 65%. El aumento de ácido linoleico estuvo entre aproximadamente 18% y aproximadamente 40%. La concentración de otros aminoácidos, carbohidratos, otros ácidos grasos y ácidos- -orgánicos no fueron significativamente diferentes con relación a los controles.

Ejemplo 3 - DWF4 Anti-sentidb Se llevó a cabo un experimento en el cual se vinculó funclonalmente un promotor CaMV35S con un polinucleótido DWF4 anti-sentido de Arabidopsis . La estructura se introdujo en Arabidopsis y las plantas transgénicas resultantes se encontró que exhibieron alargamiento reprimido bajo condiciones de sombra, con relación a ,una planta correspondiente que careció de la estructura. • ' ' Ejemplo 4 - Expresión de una 22- -hidroxilasa de maíz en arroz Kitaake utilizando un promotor 35S Se elaboró una estructura que tiene un ácido nucleico que codifica la ID SEQ NO: 2 vinculada funcionalmente a µn promotor CaMV35S, y se introdujo en plantas de arroz Kitaake. Las plantas T2 exhibieron una altura aumentada con relación' una planta control que carece de la estructura.

Ejemplo 5 - Expresión de una 22-a-hidroxilasa de arroz índica en Arabidopsis utilizando los promotores p326 o 35S Un clon de ADNc -(SEQ ID NO: 16) proveniente de arroz índica se identificó cuya secuencia de aminoácidos fue 69% idéntica a la secuencia de aminoácido de DNF4 de Arabidopsis . Este clon se designó' OsDWF4. La utilización e los promotores p326 y 35S para expresar OsDWF4 en Arabidopsis dio por resultado en una serie de fenotipos similares a aquellos observados cuando se expresaron en Arabidopsís p326 : DWF4 y 35S : DNF4, respectivamente. Los fenotipos incluyen el alargamiento de las hipocótilos, pecíolo e inflorescencia. Además, se introdujo 0sDWF4 en plantas semi-en nas de Arabidopsís . El fenotipo semi-enano de estas plantas resultó de la expresión de una secuencia anti-sentido de DWF4 (DWF4a/s) . La expresión de OsDWF4 en estas plantas corrigió el fenotipo semi-enano, indicando que DWF4 y OsDWF4 son ortólogos funcionales.

Identificación de homólogos DWF4 El análisis BLAST de la secuencia de DWF4 de Arabidopsis (Genbank AF044216) identificó un clon de arroz Japónica, Genbank AC104473 (locus ID AAN60994) . El clon Japónica fue 69% idéntico a aquel de DWF4 de Arabidopsis (Genbank AF044216) a nivel de aminoácido. El arroz índica SEQ ID NO: 16 se encontró que contuvo una sustitución C-a-t en la posición 539 con relación al clon de arroz Japónica Genbank AC104473. La substitución C-a-t en la posición 539 da por resultado en una leucina en la posición 180 en la secuencia índica. La secuencia de aminoácidos de DWF4 de Arabidopsis y la secuencia de aminoácidos de arroz índica fueron >85% idénticas dentro de los tres dominios principales (dominio A, dominio B y el dominio de unión heme), aunque fueron 21% idénticas en el dominio de ancla membranosa, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5 Tabla 5. Identidades de la secuencia de aminoácido. Los números describen la identidad de secuencia entre de DWF4 y OsDWF4. El dominio A es el dominio de unión con 02. El dominio B es el dominio de unión con esteroides. El dominio C tiene una función, desconocida. Los dominios A hasta C y el dominio de unión heme 'Sirven a funciones importantes para DWF4 y se conservan bastante. Las regiones ancla y articulación se conservan menos bien.

Transformación y lineas de planta transgénica La secuencia de -codificación DWF4 se vinculó funcionalmente al promotor p326 y se introdujo .'en un vector de plásmido Ti. La secuencia OsDWF4 (SEQ ID NO: 16) se vinculó funcionalmente a los promotores p326 y 35S y cada estructura se introdujo en un vector de plásmido Ti. p326 confiere una amplia expresión fuerte, a través de la mayoría de las células y tejidos excepto 'las células de la meristema apical y las flores, con una expresión algo menor en raíces. El promotor 35S confiere una expresión esencialmente constitutiva. Los vectores Ti contuvieron un marcador seleccionable para resistencia a Basta®. Las estructuras se introdujeron en plantas WS de Arabidopsis utilizando infiltración floral. Las líneas SR01370 contuvieron p326 : DWF4, las líneas .SR01334 contuvieron p326 : OsDWF4 y las líneas SR01390 y SR01392 contuvieron p35S : OsDWF4. Las plantas T2 que contienen el marcador seleccionable resistente a herbicidas y un transgén DWF4 se identificaron mediante teñido del herbicida sobre hojas y mediante PCR, respectivamente. Los segregantes T2 que contuvieron las inserciones T-ADN individuales se identificaron al estudiar las proporciones de segregación. Tabla 6.

Fenotipificación Los fenotipos de las plantas" SR01370, SR01334 y SR01390/SR01392 se observaron visualmente en la generación TI. Para las líneas que muestran posibles diferencias fenotípicas, a menos 18 plantas T2 por Ti original se analizaron al medir la longitud de la raíz a los 4 días después de la germinación (DAG," por sus siglas en ingles) y la longitud de hipocótilos, diámetro de roseta, altura la planta, longitud de silicua y peso que inicia en 13 DAG. Los segregantes tipo silvestre T2, los tipos silvestres sin transformar y otras líneas TI que contienen otros ADNc sin relacionar se utilizaron como controles. El tamaño de la célula se observó al utilizar un microscopio confocal de exploración láser Leica TCS SP2 para la formación de imagen mediante auto-fluorescencia de' clorofila que surge de las células del tallo de inflorescencia de 15 centímetros desde la punta.

Fenotipos TI . >-• Tres líneas 6 SR01370 mostraron pecíolos alargados y hojas "ligeramente enrolladas con relación a otras líneas TI que contienen- otros ADNc en 34 DAG. Estos fenotipos son característicos de los fenotipos de ADNg de DWF4, lo que sugiere que los transgénes p326 : DWF4 también se estuvieron afectando a niveles de brassinolide. Fueron evidentes fenotipos similares en 10 de las 10 líneas SR01334 independientes y en 18 de las 20 líneas SR01390 en DAG 20 y 40 respectivamente.

Fenotipos T2 p326 y 35S se expresan de manera importante en almacigos de Arabidopsis . Los transgénes DWF4 y OsDWF4 dieron por resultado en hipocótilos alargados en almacigos con T2 en comparación 'con los almacigos tipo silvestre sin transformar en la.' misma etapa de desarrollo. Las mediciones de la longitud de los hipocótilos en 10 plantas por línea en 13 DAG indicaron que los hipocótilos SR01370-2 y SR01370-5, SR01334-2 y SR01334-4, y SR01390-7/SR01392-5 de T2 fueron hasta dos veces más largos que los hipocótilos en los tipos silvestre sin .transformar, y el análisis de prueba t mostró que la -variación fue significativa al nivel 0.05 para todas las líneas., El efecto sobre los hipocótilos fue menos pronunciado para SR01370-2 y SR01370-5 que para SR01334-2 y SR01334-4,, lo que sugiere que el transgén OsDWF4 heterólogo tuvo- un efecto mayor sobre el desarrollo de hipocótilos que el gen DWF4 de Arabidopsis mismo . Para mediciones posteriores en el desarrollo, se hicieron crecer en un invernadero, 18 plantas T2 por TI y segregantes con genotipos al utilizar PCR. Se observaron pecíolos alargados y limbos de hojas ligeramente enrolladas en todas las líneas T2 que contuvieron p326: DWF4 (SR01370-1 y SR01370-2), 326: 0sDWF4 (SR01334-2 y SR01334-4) , y 35S : 0sDWF4 (SR01390-7/SR01392-5) en 21 DAG. Las mediciones indicaron que las plantas T2 que contenían cada uno de los transgénes fueron >7% mayores de diámetro que los segregantes tipo silvestre a los 4 días después del levantamiento. El- análisis de la prueba t de Student mostró que la variación fue significativa al nivel de 0.05 para algunas de las líneas (P?334-2 = 0.0467, P?33- = 0.063, P1370-1 = 0.221, 'P1370-2 = 0.0022, P?390-7 = 0.064, P1392-5 = 0.0053). Aunque la población T2 fue una población mezclada que contuvo homocigotos así como también heterocigotos, el diámetro aumentado de las plantas transgénicas DWF4 no obstante se pudo distinguir de las plantas no transgénicas. Las plantas T2 también fueron más altas que los tipos silvestre, como se muestra en la Figura 7. Las mediciones indicaron que T2 SR01370-1 y SR01370-2, SR01334-2 y SR01334-4, y SR01390-7/SR01392-5 fueron ~9% más altos que los, segregados tipo silvestre a 30 DAG (Figura 7A),. Los análisis de la prueba t de Student mostraron que la variación fue significativa al nivel de 0.05 para algunas líneas (P?33-4 = 0.0008, P?3o-2 = 0.001, P1390-7 = 0.0414, Pi392_5 = 0.00027). Considerando que estas mediciones se tomaron de una población- mezclada de homocigotos y heterocigotos, el aumento en la altura de las plantas probablemente podría ser más pronunciado en homocigotos. La microscopia confocal en los tallos de las plantas T2 que contuvieron DWF4 u OsDWF4 mostraron que las células en 15 centímetros de la corteza provenientes del ápice de retoño fueron más largas que en los controles tipo silvestre (datos no mostrados) . Las transcripciones DWF4 endógenas y brassinolide mismo acumularon altos niveles en tejido de silicua en Arabidopsis. Los promotores 35S y p326 también estimulan la fuerte expresión en las paredes de las silicuas, de esta forma las silicuas en plantas transgénicas se examinaron para observar si tuvo cualesquiera de estos aditivos sobre el crecimiento de silicuas. La silicua en el quinto nodo desde la base de la inflorescencia primaria se recolectó de cada una de las 10 plantas T2 por línea en 33 DAG, y se midió y se pesó. , Las silicuas provenientes de las plantas SR01370-1 y SR01370-2, SR01334-2 y SR01334-2, y SR01390-5 y SR01392-5 no fueron diferentes en peso de aquellas de los segregantes tipo silvestre. Sin embargo, las silicuas provenientes de plantas que contienen cada uno de los transgenes DWF4 fueron hasta ~20% más larga y conspicuamente más estrechas que las silicuas provenientes de los controles tipo silvestre, tanto en el quinto nodo sobre la inflorescencia primaria y en algún lugar sobre las inflorescencias primarias y secundarias. Estos resultados indican que la expresión de p326 : DWF4, p326 : OsDWF4, y 35S: OsDWF4 en Arabídopsis dieron por resultado en el alargamiento de las silicuas.

Complementación genética de DWF4a/s Una secuencia anti-sentido de DWF4 1.035 kb (SEQ ID NO: 5) se identificó-, correspondiendo al ancla y regiones de articulación del ADNc de DWF4 pero no el dominio A, el dominio B, el dominio C o el dominio.de unión heme. Esta secuencia consiste del 67% del ADNc de DWF4. ' La secuencia de 1.035 kb tuvo µna identidad de 39.6% con OsDWF4 al nivel del nucleótido, y se designó para que funcione con menor probabilidad como un anti-sentido hacia 0sDWF4. La secuencia DWF4 se vinculó funcionalmente a un promotor 35S en la orientación anti-sentido (35S:IWF4a/s) en un plásmido Ti. El plásmido Ti que contuvo 35S : DWF4a/s se introdujo en Arabidopsis, ' generando líneas vegetales SR01219. Véase la. Tabla 6. La línea T2 SR01219-24 se genotipificó mediante. PCR y mostró que no contuvo un T-ADN individual. Las plantas SR01219 TI y T2 mostraron una estatura reducida, ' aunque no fueron enanas. Se realizó una complementación genética mediante la introducción de 0sDWF4 en un DWF4a/s antecedente. Las plantas 35S:D¡F4a/s T3 de homocigotos para inserciones de T-ADN individual (SR01219-24-H) se transformaron con p326 : OsDWF4, generando la línea SR01557. Se utilizó PCR para confirmar la presencia de p326: 0sDWF4, utilizando cebadores de PCR que amplificaron una secuencia que gira a la secuencia p326 y la secuencia de ADNc OsDWF4. Los almacigos SR01557 Ti que muestran hipocótilos alargados en 8 DAG en la luz blanca, se seleccionaron para las condiciones a lo largo del día (LD, por sus siglas en ingles) . Estos almacigos, junto con algunos almacigos con hipocótilos cortos más comunes, se transfirieron a macetas, para genotipificar y fenotipificar. • Cuando estas plantas habían alcanzado la etapa de roseta (en 23 DAG) , mostraron limbos de hojas ligeramente enroscadas, o tuvieron la apariencia tipo silvestre. Estos datos sugieren que el fenotipo semi-enano asociado con las plantas SR01219-24-H se había corregido mediante OsDWF4, y que los hipocótilos alargados y los pecíolos de las hojas fueron el resultado de niveles elevados de OsDWF4. Se utilizó RT-PCR para examinar la expresión de la transcripción DWF4 endógena y en la transcripción OsDWF4 exógena en plantas SR01557 en 10 DAG. Para RT-PCR, se recolectó el ARN proveniente de plantas individuales en 32 DAG. Para qRT-PCR se recolectó el ARN proveniente de 200 almacigos por línea de planta en 10 DAG. Se utilizaron los plásmidos que contienen las secuencias DWF4, CPD y OsDWF4 como controles en estos experimentos. RT-PCR mostró que todas las 5 plantas DWF4a/s , OsDWF4 TI, contuvieron bajos niveles de transcripción de DWF4, en comparación con la transcripción tipo silvestre sin transformar. La qRT-PCR mostró que estos niveles de transcripción DWF4 endógenos se redujeron en >50%, indicando que el DWF4a/s de-' '1.035 kb es efectivo para reducir parcialmente los niveles DWF4 endógeno. La RT-PCR mostró que las plantas SR01557-4> SR01557-7 y SR01557-12 se estuvieron expresando 0sDWF4 a altos niveles, mientras que las plantas SR01557-2 y SR01557-3 no lo hicieron. Las plantas SR01557-4 y SR01557-7 TI dieron por resultado en fenotipos OsDWF4, mientras que- las plantas SR01557-2 y SR01557-3 TI no lo hicieron, lo que sugiere -que la transcripción de OsDWF4 fue responsable del fenotipo corregido. Los resultados PCR también mostraron que los cebadores utilizados para amplificar DWF4 no amplificaron CPD u OsDWF4, y que los cebadores utilizados para amplificar OsDWF4 no amplificaron DWF4 y CPO, indicando que los cebadores PCR son específicos para sus transcripciones respectivas. Estos resultados sugieren que una secuencia que codifica para DWF4 de Arabidopsis exhibe una actividad 22-a-hidroxilasa en arroz, - y 'puede funcionar en la biosíntesis brassinoésteroidea, por ejemplo,- al catalizar la formación de la 6-desoxocatasterona a partir del sustrato campestanol. Estos 'resultados también sugieren que una secuencia de codifica para arroz exhibe una actividad 22-a-hidroxilasa en Arabidopsis, y puede funcionar en la biosíntesis brassinoésteroidea, por ejemplo, al utilizar campestanol como un sustrato y catalizar la formación de 6-desoxocatasterona. Tomados juntos, los resultados muestran que un polipéptido de 22 a-hidroxilasa de dicotiledóneas se puede utilizar en una monocotiledónea y viceversa. Por último, los resultados también indican que estas secµencias de codificación con hidroxilasa exhiben suficiente actividad enzimática para generar altos - niveles de 6-desoxocatasterona en plantas, y que son ortólogos . funcionales .

Ejemplo 6' - Evaluación de los ''promotores YP0009, YP0104 , y YP0126 . . Transformación y líneas vegetales transgénicas Los promotores designados como YP0009, YP0104, y YP0126, cuando se utilizan como fusiones HAPl, estimulan la expresión de principalmente UAS: GFP en raíces, tallos, y hojas, respectivamente. Los promotores YP0009, YP0104, y YP0126 se vinculan funcionalmente a un ADNg de DWF4 en un vector plásmido Ti (CRS-BIN1A) .

Las estructuras se introdujeron en plantas Ws con ecotipo de Arabidopsis utilizando infiltración floral. Las líneas R01159 contuvieron las líneas YP0009:DWF4, las líneas SR01130 contuvieron las líneas YP0104: DWF4' y las líneas de SR01187 contuvieron YP0126:DWF4. Véase la Tabla 6. Los segregantes T2 que contuvieron inserciones de T-ADN individual se identificaron y se utilizaron para la fenotipificación T2. Las plantas T3 correspondientes que fueron homocigotos para inserciones individuales también se identificaron y se utilizaron para qRT-PCR (para los promotores que producen sµficientes tejidos) y la fenotipificación .

Fenotipificación Los fenotipos TI putativos se registraron y se fenotipificaron dieciocho plantas T2 por 2 casos TI por estructuras., Para las líneas que muestran fenotipos claros, también se fenotipificaron 10 plantas T3 por T2. Se utilizaron segregantes tipo silvestre como controles. Las mediciones de tamaño de roseta, altura de la planta, número de ramificaciones, peso en seco del tejido aéreo y peso de las semillas se utilizaron para valorar el efecto del transgén DWF4.

Expresión de DWF4 en el tallo En Arabidopsis, el promotor YP0104 se expresa principalmente en la epidermis y corteza del tallo. La presencia de YP0104 : DNF4 en las líneas SR1130 T2 se probó mediante PCR, y las plantas que se probaron positivamente se fenotipificaron. Se encontró una evidencia clara de la altura reducida de la planta • en' cada una de las líneas SR1130 TI proveniente de las generaciones TI hasta T3 -cada una de las dos líneas' SR1130 (SRH30-1-3 y 1130-5-6) fueron ~10% más cortas que los segregantes tipo silvestre, y el análisis de la prueba t de Student mostró que la variación fue significativa al nivel 0.05 (P1130-1-3 = 0.026, P1130-5-6 = 0.038 para las plantas' T2; P1130-1-3 = 0.038, P1130-5-6 = 0.0018 para las plantas T3) . El examen de las plantas T2 y T3 que contuvieron YP0104 : DWF4 también mostró que la densidad de las silículas sobre la inflorescencia primaria, se aumentó con relación a los controles de segregantes tipo -silvestre. Cuando el número de silículas en los 16 pentímetros distantes de las inflorescencias primarias de ' cuatro plantas T3 se determinó, se encontró que será de -11% aumentado con relación a los controles para SR113.6-1-3 ~3% aumentado para SR11236-5-6; el análisis de la prueba t mostró que alguna de esta variación fue Aignificativa- al nivel 0.05 (P1130-1-3 =0.011, P1130-5-6 = 0.38). La biomasa d l retoño y el rendimiento de semillas pareció no verse afectado por el transgén DWF4. Mientras que el promotor YP0104 es activo en la epidermis y corteza del tallo, no se expresa a niveles mensurables en las hojas o semillas.

Expresión de DWF4 en la raíz En Arabidopsis, el promotor YP0009 se expresa principalmente en la corteza y" stele de la raíz. La presencia de YP0009 : DWF4 en las líneas T2 SR1159 se examinó mediante PCR, y las plantas, .que se probaron positivamente se fenotipificaron. Aunque el promotor YP0009 es activo en raíces, utilizando YP0009 para expresar un ADNg de DWF4 no dio por resultado en ningún tipo de fenotipo visible, ya sea ni en raíces ni en' retoños.

Expresión de DWF4 en el retoño En Arabidopsis, el promotor YP0126" se expresa principalmente en la epidermis y el mesófilo del retoño y' las hojas. La presencia 'de' YP0126 : DWF4 en las líneas SR1187 T2 se examinó mediante..PCR, y se realizó qRT-PCR sobre el tejido de hojas para confirmar la presencia de la transcripción DWF4; las plantas . que se probaron positivas se fenotipificaron. Aunque el promotor YP0126 es activo en las hojas, utilizando YP0126.para expresar el ADNg de DWF4 no dio por resultado én un fenotipo visible, ya sea ni en los retoños ni en las raíces. _ ' La expresión constitutiva de DWF4 tiende a generar plantas más altas. Sin -embargo, estos resultados mostraron que un transgén YP0104 :D¡F4 'dio por resultado en plantas, más cortas, y sugiere que al utilizar YP0104 para expresar DWF4 en la epidermis y corteza del tallo, se puede reducir la altura del tallo. En comparación con YP0104, cuando se utilizó ya sea YP0009 para expresar DWF4 en las raíces, o YP0126 para expresarse en hojas, no se observó ningún fenotipo. Se pueden preferir los promotores que se expresan amplia o constitutivamente en el cuerpo de la planta.

Ejemplo 1 - Evaluación de del promotor YP0216 Transformación y líneas de plantas transgénicas YP0216 se introdujo en un plásmido Ti (CRS-BINlA) que contuvo un ADNg de DWF4. El promotor, cuando se utiliza una fusión con Hapl, estimuló la expresión de UAS : GFP principalmente en los ápices de los tallos. Las estructuras se introdujeron en las. plantas Ws con ecotipo de Arabidopsis utilizando infiltración floral. Se obtuvieron diez eventos de transformación individual, dando por resultado en las líneas denominadas SR0977. Las líneas T2 que contuvieron inserciones de T-ADN individuales se identificaron mediante análisis por segregación y las plantas T2 y T3 que fueron homocigotos para estas inserciones se identificaron y se utilizaron para fenotipificar .

Fenotipificación Las plantas provenientes de dos eventos transformación (SR0977-2 y SR0977-3) , 10 plantas T3 por evento, se utilizaron para qRT-PCR y todos los estudios del fenotipificación. Los segregantes tipo silvestre se hicieron crecer a lo largo de las plantas T2 y T3 como controles. Las medidas de la altura de la planta, número de ramificaciones, peso en seco de retoño, y peso total de las semillas se utilizaron para valorar los efectos del transgén DWF4. En Arabidopsis, el promotor YP0216 se expresa de manera importante en la epidermis y la corteza del ápice del tallo. La presencia de YP01216 en las líneas T2 de SR0977 se examinó mediante PCR, y los homocigotos T3 se examinaron para la presencia de la .transcripción mediante qRT-PCR; las plantas T3 ' que probaron positivas se fenotipificaron. Las plantas -T3 no probaron fenotipos morfológicos visibles en comparación con segregantes tipo silvestre. Las mediciones de la altura de la planta y número de ramificaciones (utilizando, plantas T3) , y. los retoños y peso de las semillas (utilizando las plantas T2 y T3) mostraron ya sea que no hubo diferencia entre las líneas transgénicas y los controles tipo silvestre, o que cualesquiera diferencias significativas fueron una característica de solo uno de los dos eventos transgénicos. Por ejemplo, el peso del retoño y los datos de peso total de las semillas mostraron que la ' diferencia entre las plantas SR0977-2-10 y los tipos silvestre que se segregaron de las mismas fue significativamente al nivel 0.05 en el análisis de la prueba t (P = '0.03 para el peso del retoño, P = 0.001 para el peso de la semilla), aunque no hubo esta diferencia en las plantas SR0.977-3-5. Por lo tanto, la variabilidad evidente entre' la población SR0977-2, aunque significativa, no fue una' característica consistente de las plantas que contuvieron transgénes YP0216: DWF4. Las medidas del número de hojas mostraron que no hubo diferencia entre las líneas transgénicas y los controles de segregante tipo silvestre. RT-PCR del, ARN proveniente de 1 centímetro apical del tallo mostró que el transgén YP0216 : DWF4 se expresó.

Ejemplo 8 - Co-expresión de DWF4 y . ANT. La expresión constitutiva .de ANT en Arabidopsis aumentó el tamaño de una planta. ANT codifica para un factor de transcripción del dominio AP2. La expresión constitutiva de DWF4 en Arabidopsis también aumentó el tamaño de una planta. Ambos polinucleótidos se expresaron en una planta individual para evaluar los efectos de la expresión combinada de DWF4 y ANT sobre el tamaño de la planta.

Transformación y líneas de plantas- transgénicas - Los promotores constitutivos 35S- y pl3879 se utilizaron para controlar la expresión génica en todos los experimentos. La expresión dé ANT utilizando el promotor pl3879 dio por resultado en plantas más grandes, probablemente al prolongar- el periodo en el cual las células que emergen de las meristemas se siguen dividiendo, aunque también provocan esterilidad en la condición de homocigotos. Un ADNg de DWF4, un clon de' ADNc de ANT designado 7098806, y una supresión ANT, 5' denominada ANT?N3 (ANTA, por sus siglas- en ingles) se utilizaron junto con 35S o pl3879. Las secuencias DWF4 y ANT se introdujeron en plantas utilizando CRS-BIN1A.. Las progenitoras que portan los trasngénes DWF4 y ANT se cruzaron para generar plantas Fl que expresan ambos genes. La línea pl3879 : DWF4 (BinD 1-11) contuvo un T-ADN individual, como se muestra' más adelante, y se utilizó como un homocigoto T3. La línea pl3879 : ÜNT (SR 102'9-6) también contuvo un T-ADN individual y se utilizó como el heterocigoto. Una planta pl3879:ANT individual se cruzó como la planta femenina con una planta pl3879 : DWF4 como la masculina. Se utilizó PCR para identificar 5 plantas Fl resultantes de la cruza que contuvo los transgénes tanto DWF4 y ANT, así como también otros 5 transgénes que contuvieron ' únicamente el trarisgén DNF4. Además, una planta tipo silvestre sin transformar se cruzó como una masculina con el mismo pl3879 : ?NT como una femenina. PCR reveló 5 plantas Fl que contuvieron únicamente el transgén ANT y otras 5 que fueron tipo silvestre (consanguíneas tipo silvestre) . Juntas, estas 20 plantas Fl se utilizaron para todas las mediciones de fenotipos.- Re-transformación Las plantas que contuvieron 35S : ANTzl y un gen NPTII para resistencia a ' kanamicina se volvieron a transformar con una estructura de T-AD? que contuvo pl3879:I F4 y un gen . PAT modificado para resistencia a herbicidas. Las plantas TI que fueron resistentes a herbicidas se seleccionaron, . y se utilizó PCR para reconfirmar la presencia del tránsgén ANT. Las plantas TI que fueron resistentes a herbicidas y positivas para PCR para NPTII se utilizaron para todas las mediciones de fenotipos .

Fenotipificación Las plantas se hicieron crecer hasta madurar. Las mediciones del tamaño de roseta, altura de la planta, peso en seco del tejido aéreo, número de ramificaciones, número de semillas, y' peso .de las semillas se utilizaron para valorar los efectos de los transgénes DWF4 y la ANT. Las plantas Fl que ' fueron PCR positivas para pl3879:AWT y pl3879 : DWF4, y las plantas TI ' PCR positivas para 35S : ANT y se contó-seleccionaron para pl3879 : DWF4, mostraron una mezcla de fenotipos. Algunas tuvieron peteólos alargados y limbos de, hojas, asemejándose a los transformantes individuales 35S y pl3879 : DWF4 , mientras que otras tuvieron rosetas grandes y hojas más redondeadas, asemejando los transformantes' individuales, pl3879 : ANT.

Las plantas Fl que contuvieron pl3879 : DWF4 y pl3879 : ANT fueron similares en estatura para las plantas, control que expresan DWF4, solo; ..sin embargo, 2 de 5 plantas fueron estériles. Estas observaciones sugirieron que las plantas Fl tuvieron características tanto de los transformantes individuales DWF4 como de los transformantes individuales ANT. Sin embargo, hubo muchas diferencias entre las plantas Fl . Por ejemplo, el número de ramificaciones varió de 22 hasta 57, posiblemente debido a la penetrancia diferencial del fenotipo DWF4 que se asocia con la ramificación aumentada. Como otro ejemplo, el peso de las semillas varió de 0 hasta 303 mg, posiblemente debido a la penetr'ancia diferencial del fenotipo ANT que se asocia con la esterilidad. Los resultados sugirieron que hubo biomasa reducida con relación a los controles ANT. Los fenotipos similares con variabilidad similar también se observaron en plantas TI que contuvieron pl387,9 : DWF4 y p35S : ANTA. . En general, tanto las plantas Fl "como las Ti mostraron elementos de los fenotipos ANT y DWF4, dando por resultado en fenotipos variables que fueron una mezcla de las características DWF4 y ANT en lugar de una suma de las mismas .

Ejemplo 9 - Evaluación de los promotores p!3819 y p32449 Una fusión de brassinolide en la tolerancia a la tensión en ' Arabidopsis se , investigó utilizando plantas transgénicas en las cuales se utilizaron los promotores pl3879 y p32449 para .expresar- el ADNc de DWF4. Las líneas de Arabidopsis (Ws, por sus siglas en ingles) que contuvieron una de las dos estructuras DWF4 se utilizaron con dos eventos de transformación independientes para cada estructura para todos los experimentos. Estas estructuras fueron p!3819 : DWF4 (BinD) y' p32449 :DWF4 (CC2) . Los promotores pl3879 y p32449 ambos se expresaron tanto en la raíz como en el retoño, especialmente en la epidermis, corteza y merístema del retoño. Todas las líneas T2 (BinD 1-11-1, BinD 3-9-1, CC2 4-2-3, y CC2 7-2-1) contuvieron inserciones de T-ADN individual. Las plantas T2 fueron probadas para progenie para identificar los homocigotos T2, y se utilizaron en todos los experimentos. Los ' segregantes T2 tipo silvestre que no contenían las inserciones de T-ADN se utilizaron como controles.' Para confirmar que los homocigotos contuvieron los , 'transgénes correctos, se utilizó PCR para genotipificar todas las cuatro, líneas.

Condiciones de crecimiento y mediciones Se sembraron semillas en macetas de 12.7 x 17.78 centímetros (5 x 7 pulgadas.) y se hicieron crecer en una cámara de crecimiento funcionando a 22°C, 16 -horas de luz/8 horas de oscuridad, y 70% de humedad relativa. Las plantas se regaron dos veces a la semana de tal forma que fuera un total de 2.5 litros de agua - por semana. Para cada tratamiento, las' plantas de 14' días de edad se transfirieron a una cámara de crecimiento ajustada a 36°C, 16 horas de luz/8 horas de. oscuridad, 70% de humedad relativa, durante 3 semanas. Para el tratamiento con frío, se transfirieron plantas de 7' días de edad en una cámara de crecimiento ajustada a 8°C, 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, 70% de humedad relativa durante 8 semanas. Para la resistencia a la sequías, el agua se retiró de los almacigos en el día 14 durante 2 semanas en condiciones de crecimiento de 22 °C, 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, y 70% de humedad relativa. Todo los almacigos de p!3819 : DWF4 y p32449 : DWF4 mostraron el alargamiento - de los pecíolos y el estrechamiento del limbo de las hojas : que fueron característicos de niveles elevados de DWF4. Tratamiento' con calor: las plantas T2 que contuvieron los transgénes D/ÑF4 mostraron sensibilidad aumentada a la resistencia al calor en comparación con los segregantes tipo silvestre. Después de 18 días a 36°C y 70% de humedad relativa, fueron todas las plantas T2 provenientes de las dos líneas p32449 : DWF4 se blanquearon y murieron por completo. Aproximadamente la mitad de las plantas provenientes de las dos pl3879 : DNF4 se blanquearon y murieron por completo. Después de 21 días en estas condiciones, murieron la totalidad de las plantas pl3879: DWF4. Todas las plantas tipo silvestre se mantuvieron verdes y vivas. Estos resultados sugieren que las plantas p32449 : DWF4 son más sensibles a la tensión de calor que las plantas pl3879: DWF4. Tratamiento en frío-: las plantas T2 que contuvieron los transgénes DWF4 no mostraron sensibilidad alterada a la resistencia al frío en comparación con los segregantes tipo silvestre. Después de 7 semanas a 8°C y 70% de humedad relativa, todas las plantas provenientes de las líneas p32449 : DWF4 independientes y dos líneas pl3879 independientes no se pudieron distinguir de los segregantes tipo silvestre. Tratamiento para 'sequía: las plantas T2 que contuvieron los transgénes DWF4 no mostraron sensibilidad alterada a la resistencia a ' la sequía en comparación con los segregantes tipo silvestre. Después de crecer durante 2 semanas sin agua y en 70% de humedad relativa, las plantas provenientes de dos líneas p32449 :IWF4 independientes y dos líneas- pl3879 independientes no se pudieron distinguir de los segregantes tipo silvestre. Además, no hubo diferencia en la velocidad de pérdida de agua cuando se utilizaron rosetas extendidas. La velocidad de pérdida de agua es una medición sensible de la respuesta de una planta a la sequía. Los resultados . indicaron que las líneas pl3819 : DNF4 y p32449 : DNF4 T2 continuaron • sin alterarse en la resistencia al frío o a la sequía con relación al tipo silvestre y no fueron más sensibles a la resistencia al calor que los segregantes tipo silvestre. p32449 : DWF4 pareció tener un mayor efecto que pl3879 : DWF4. La diferencia entre estas dos , líneas se puede explicar mediante los patrones de expresión de los dos diferentes promotores. Mientras que pl3879 y p32449 ambos se expresan en muchos tejidos y órganos, la transcripción de las secuencias vinculadas a p32449 se induce en hasta 8 veces bajo condiciones de choque térmico, mientras que la transcripción de las secuencias vinculadas a pl3879 no se puede inducir con calor. Por lo tanto es probable, que la mayor sensibilidad a la resistencia al color es un resultado de la inducibilidad térmica de las secuencias vinculadas a p32449.

Ejemplo 10 - Análisis de los intermediarios químicos de la trayectoria biosintética BL en plantas transgénicas Los niveles de los intermedios químicos en la trayectoria biosintética BL en los almacigos p326 : DWF4 se midieron utilizando espectrometría en masa cromatográfica con gases (GC-MS, por sus siglas en ingles) , y se compararon >con los niveles én almacigos control tipo silvestre sin transformar. La reacción que se catalizó mediante DWF4 se mejoró en .los almacigos p326 : DWF4 y p326: ZmDWF4, proporcionando una fuerte evidencia de que el número de semillas, relleno de semillas y fenotipos para rendimiento de semillas fueron el resultado directo de los niveles BL aumentados .

Materiales y métodos Líneas de fusión directa p326:DWF4 El ADNg de DWF4 (SEQ ID NO: 14) y un ADNc de maíz homólogo denominado Z DWF4 (SEQ ID NO: 15) cada uno se vinculó funcionalmente al promotor p326 y el terminador OCS, dando por resultado en las estructuras CR24 y CR26, respectivamente. CR24 y CR26 se transformaron en el interior del arroz utilizando una transformación suministrada por Agrobacterium ' y se recuperaron las líneas de homocigotos. Cien semillas , T4 para la línea CR24-3-6 y para la línea CR26-1-6 se esterilizaron con 20% de blanqueado y se enjuagaron cuatro veces con agua destilada estéril, y se hicieron germinar en medio MS con 1/2 resistencia suplementado con 1.5% de sacarosa. Los almacigos dé diecisiete días de edad y los almacigos control tipo silvestre sin transformar se recolectaron y se sembraron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras pulverizadas se liofilizaron durante cinco días y se embarcaron al Plant Functions Lab en RIKEN (The Institute of Physical -and Chemical Research) , Wako-shi Saitama 351-0198, Japón para la lisis de espectrometría másica en cromatografía de gases (GC-MS) . ' El peso en fresco y en seco para cada una de las muestras de almacigo se muestra en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7.

Tabla 7. Pesos de 100 almacigos utilizados para el análisis BL. Los números muestran el peso en gramos .

Medición de los intermediarios químicos en la trayectoria biosintética BL Para analizar los intermediarios brassinoesteroideos (BR, por sus siglas en ingles) endógenos la trayectoria biosintética BL, las muestras liofilizadas se extrajeron dos veces con 250 ml de metanol :CHC13 (4:1 v/v) y los intermedios BR se purificaron y midieron mediante GC-MS de acuerdo con Fujioka et al. (2002) y He et al. (2003) .

Resultados Los homocigotos de los almacigos de arroz T3 liofilizados para ADNg de DWF4 Arabidopsis o para un ADNc de maíz homólogos ( Z .DWF4) , junto con el material equivalente proveniente de un control tipo silvestre sin transformar, se ehviaron a Shozo Fujioka en RIKEN. Los datos GC-MS se muestran enseguida en la Tabla 8 Tabla 8 Tabla 8. Resultados GC-MS para tipo silvestre, almacigos CR24-3-6 y CR2-6-1-6. Los números muestran los niveles de los intermediarios de trayectoria BR en peso en fresco ng/g. CN (campestanol) y 6- DesoxoCT (6-desoxocatasterona) son el substrato y el producto de DWF4, respectivamente.

Cuando se mapearon estos datos GC-MS con relación a la trayectoria biosintética BL conocida, la disminución en los niveles de campestanol estuvieron inmediatamente en la dirección 5' del aumento en los niveles de 6-desoxocatasterona con relación a los controles tipo silvestre. Estos resultados indican la conversión de campestanol a 6-desoxocatasterona en la trayectoria de C-6 oxidación tardía se mejoró mediante los transgénes DWF4. Para las plantas CR24? 3-6 que contuvieron p326 vinculados funcionalmente al ADNg de DWF4 de Arabidopsis, fue mayor que el aumento de 2 ' veces de los niveles de 6-desoxocatasterona. También hubo una ligera disminución en los niveles de .6-desoxoteasterona y . 3-dehidro-6-desoxoteasterona, seguida por la trayectoria mediante un aumento en 6-desoxotifasterol.> - DWF4 cataliza el primer paso limitante de velocidad 'en la trayectoria biosintética BL y cataliza CPD d.el segundo, de tal forma que de por resultado en la demostración de que en las plantas p326 : DWF4, CPD se torna el paso limitante de la velocidad. Es posible que haya una conversión rápida entre los intermediarios BR en la dirección 3' de CPD, de tal forma que no se puedan observar diferencias claras en estas últimas etapas. Sin embargo, puede ser que estén implicados ciclos de retroalimentación y otros reguladores, según se propone para, los niveles otros intermediarios BR en mutantes con deficiencia BL (Hong et al., 2003, Tanabe et al. , 2005) .

Para las plantas CR26-1-6 que contienen p326 vinculadas funcionalmente al ADNc de Z DWF4, hubo ~6 veces un aumento en los niveles de 6-desoxocatasterona, y un aumento en las concentraciones de todos los intermedios BR en la dirección 3' (aproximadamente el doble con relación al tipo silvestre) . Esto significa que la conversión de campestanol a 6-desoxocatasterona en la trayectoria de C-6 oxidación tardía también se mejora por el transgén Zm.DWF4. No se observaron cambios en la primera trayectoria de C-6 oxidación en cualquiera de las' plantas p326 : DWF4 o p326: ZmDWF4. Los resultados proporcionan una evidencia directa de que a) el polipéptido DWF4 heterólogo puede estimular la trayectoria biosintética BL en una planta al mejorar el paso limitante de la velocidad individual, la conversión de campestanol a 6-desoxocatasterona en la trayectoria de C-6 oxidación tardía en el arroz. Los resultados con campestanol y 6-desoxocatasterona sugieren que se aumentan los niveles BL en las plantas de arroz con p326 : DWF4.

Sumario y análisis Las mediciones GC-MS directas de los intermediarios químicos en la trayectoria biosintética BL muestran que las plantas de arroz T3 contuvieron el promotor p326 vinculado funcionalmente al ADNg de DWF4, así como también otras plantas de arroz que contuvieron una estructura que implica un ortólogo de DWF4 de maíz, son más eficaces en la conversión de campestanol a 6-desoxocatasterona. Es decir el paso en la trayectoria biosintética BL que se cataliza mediante DWF4. Uno de los efectos del transgén DWF4 es que mejora la capacidad fotosi?tética, 'por ejemplo,- según se mide mediante la captura de C02, por las hojas indicadoras del arroz (véase más adelante) . El promotor p326 puede conducir la expresión en los tejidos fuente, y la pérdida de expresión de los genes DWF4 en estos tejidos puede dar por resultado en una conversión más eficiente de campestanol a 6-desoxocatasterona y la acumulación de BL en estos tejidos. BL no se transporta lejos en una planta, y los niveles aumentados , de BL pueden actuar de alguna manera localmente para estimular la captura de C02 y la conversión a sacarosa. Esta sacarosa se puede cargar en el floema y se puede transportar a las semillas, mejorando el relleno de las semillas y proporcionando posiblemente un estímulo adicional y todavía es conocido para la producción de más cultivos (datos no mostrados) y- más semillas. El aumento en BL también puede actuar sobre las 'paredes de las células de las hoja y hacerlas más ..capaces de expandirse bajo presión turgente. Las plantas CR24-3-6 ,y CR26-1-6 demostraron un aumento de ~2 veces hasta ~6 veces en los niveles de 6-desoxocatasterona, y un aumento de hasta ~2 veces en los niveles de los intermedios en dirección 3 ' .

' Ejemplo 11 - Evaluación de la eficiencia fotosintética de plantas transgénicas Sumario Se utilizó . LiCor ' para realizar las mediciones fotosíntesis- (PS) en hojas- indicadoras sobre plantas T3 con homocigotos que portan la estructura de fusión directa p326-DWF4 (CR24) . La velocidad PS de las plantas transgénicas fue significativamente superior en una línea que las plantas tipo silvestre a dos concentraciones de C02, 380 ppm y 760 ppm. La velocidad PS de la otra línea tendió a ser mayor con relación al control, aunque no fue superior estadística significativamente.

Materiales Y métodos Plantas que contienen las fusiones directas p326 : DWF4 El ADNg de DWF4 se vinculó funcionalmente al promotor p326 y el t rminador OCS, como en el Ejemplo 10 dando por resultado en la estructura CR24. CR24 se transformó en arroz utilizando • una transformación suministrada por Agrobacterium y se produjeron líneas de homocigotos. Las plantas T3 con homocigotos que representan cada una de las líneas CR24-3-6 y CR24-5-6 se hicieron crecer a lo largo de tipo silvestre sin transformar en invernaderos. Las plantas en etapa de floración se movieron a una cámara de crecimiento Conviron para adaptación antes de la medición LiCor. La condición de crecimiento en Conviron fue 16 horas de luz a 28 °C y 8 horas de oscuridad a 25 °C. Tres plantas de cada una de las líneas transgénicas. así como también el control se midieron con el medidor LiCor. ( Medición LiCor El intercambio de gas .-fotosintético se determinó utilizando un sistema fotosintético portátil Li-Cor 6400 (Li-Cor Inc. Lincoln, Nebraska) ajustado con una cámara para hojas de 2 por 3 centímetros y una fuente de luz LED fija (6400-02B) utilizando un arreglo de LED rojos y azules. Las curvas de' respuesta a la luz para cada muestra se determinaron a 2 diferentes, concentraciones de C02 (380 µl 1 -1 y 760' µl 1—1) y' "9 intensidvades •' de luz diferentes que varían de 0-2000 µmol .m_2s_1. Las -mediciones se realizaron en el punto medio de la hoja indicadora en la etapa de floración. El área de la hoja dentro de la cámara se estimó al multiplicar la anchura promedio de la hoja por la longitud (3. centímetros) de la cámara y esta variable se utilizó en el cálculo de la velocidad fotosintética. La temperatura de la hoja sé controló en 25 °C, la humedad de la cámara se mantuvo entre el 50-55%, y la velocidad de flujo fue constante a 500 µmol s~A Las hojas se equilibraron en la cámara y una irradiación de 1500 µmol m_2s_1. Posteriormente se registraron las velocidades fotosintéticas cuando las velocidades alcanzaron un estado estable, para cada intensidad ' de luz' determinada, con un tiempo mínimo de espera de 120s y un máximo de 200s.

Resultados Como se muestra en' la Figura 6, la línea transgénica CR24-3-6 tuvo una velocidad PS que fue superior a la de un control no transgénico a intensidades de luz de 500 µmol m"2s_1 hasta 2000 µmol pAs'1 y 380 ppm C02. La velocidad PS pareció disminuir- a 2000 µmol m~2s_1 para las plantas control pero no para las plantas CR24-3-6. La velocidad PS para - la línea CR24-5-6 también fue consistentemente superior que la velocidad para los controles a 500 hasta 2000 µmol m"2s-1 y 380 ppm C02. La velocidad PS también se midió a una concentración .de C02 de 760 ppm. Las velocidades PS de las líneas CR24-3-6 y CR24-5-6 también fueron consistentemente superiores a la velocidad PS del control no transgénico en las mismas intensidades de luz y 760 ppm de C02 (datos no mostrados) . , Estos datos indican claramente que las planta que sobre-expresan un polipéptido de C-22-a-hidroxilasa pueden tener una velocidad fotosintética aumentada en las hojas. Parece que probablemente este aumento en la fijación de C02 es al menos en parte responsable del tamaño de la planta y los fenotipos para rendimiento de semillas descritos anteriormente.

Ejemplo 12 - Análisis GC-MS de la expresión p326:DWF4 en arroz Materiales y métodos Promotor y secuencia de codificación Un plásmido Ti (CRS-BIN1A) que contuvo el promotor p326 en la dirección 5', de Hapl, y la dirección 5' de UASpapi y un secuencia que codifican para GFP, se introdujo en el arroz cultivar Kitaake al utilizar Agrobacterium y un callo competente de transformación. La estimulación del promotor dio por resultado en la acumulación de la proteína . Hapl y GFP. La expresión detectable de GFP se confinó a la raíz, tallo' y hojas de las plantas de arroz. No se puede afectar la expresión la meristema del retoño, las flores, o las semillas antes de la germinación. Un plásmido ,Ti (DF?7F4-BINlB) que contuvo cinco copias del UASHap? en -dirección 5' del ADNg de DWF4 también se introdujo en Kitaake. El ADNg provino del ecotipo WS (SEQ ID N0:14). La. activación .del UAS (mediante Hapl) dio por resultado en la transcripción del ADNg de DWF4 y la acumulación de la transcripción de DWF4.

Cruces, genotipificación y apareamiento de plantas T2 : IWF4-BINlB16-2,17-3 y 27-3 de las líneas UAS : DWF4, derivadas de las líneas transgénicas independientes 16, 17 y 27, respectivamente, se polinizaron mediante la progenie de la línea CRS-BIN1A 7 de p326:Hapl para producir las semillas Fl.. -Los tres grupos de plantas Fl denominados' R148, R150 y R151, respectivamente, se "probaron para la presencia de Hapl:GFP mediante fluorescencia, y para la presencia del TJ?S : DWF4 mediante PCR, y la presencia de la transcripción de ADNg de DNF4 se confirmó mediante RT-PCR. Las semillas F2 provenientes de las plantas Fl R148P5, R150P7 y R151P1 se hicieron germinar y se hicieron crecer en la oscuridad durante 3 días, y luego también se probaron para la presencia de p326:Hapl y ÜRS : DWF4. Cinco pares de- segregantes GFP (+) /DWF4 ( + ) y GFP (+) /DWF4 (-) , cada uno que surge de la misma planta Fl, se hicieron crecer lado por. lado en 5 macetas, según se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9.

Tabla 9. Apareamiento de plantas. Los segregantes GFP(+) /DWF4 (+) y GFP (+) /DWF4 (-) F2 se hicieron crecer lado por lado. Hapl:-GFP y UAS : DWF4 significan los dos elementos del sistema de 2 componentes.

-- Plantas que, contienen fusiones directas de p326:IWF4 - El ADNg, de DWF'4 se ' vinculó funcionalmente al promotor p326 y el terminador OCS, como en el Ejemplo 10 dando por resultado en la estructura CR24. CR24 se transformó en arroz utilizando . una transformación suministrada por Agrobacterium 'y se produjeron líneas de homocigoto. . Diez plantas T3 con homocigotos que representan cada una de las líneas CR24-3-6 y CR24-5-6 se hicieron crecer a lo largo de cinco tipos silvestres sin transformar en un invernadero.

Extracción y análisis químico de las hojas indicadoras Todas las plantas se hicieron crecer en un invernadero. Las hojas indicadoras provenientes de cada planta se recolectaron ~12 -días' después del inicio de la floración y, dentro de los 5 minutos de las otras hojas indicadoras (entre 5:00 pm y 5:05 pm) . Se recolectaron semillas en desarrollo 15 días después de la floración y 15 días después de la polinización, también dentro de 5 minutos de las otras hojas de semillas y entre 5:00 pm y 5:05 pm. Todos los tejidos se -congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C. Para análisis químicos, estas hojas se liofilizaron, se' extrajeron. con metanol y diclorometano, y se dividieron en fases polares y no polares antes de la derivación y GC-MS. Las extracciones se realizaron por duplicado o triplicado para generar muestras replicadas para análisis GC-MS. La cantidad del tejido de hojas liofiliz-adas utilizadas para cada extracción se mostrará en la Tabla 10. Los datos de recolección y procesamiento implicados en la inspección visual y comparación de cromatogramas, análisis multivariables incluyendo análisis de componentes principales (PCA) y análisis de agrupamientos jerárquico (HCA), y los análisis experimentales/control utilizados para determinar las proporciones de metabolitos. Los 82 compuestos analizados incluyeron los aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos y ácidos orgánicos, cómo se mostró anteriormente.

Tabla 10.

Tabla 10. Muestras utilizadas para el análisis MxP. La abreviatura T2 se refiere a cada una de las 10 hojas indicadoras utilizadas1 para el análisis GC-MS. Las columnas "1", . "2" y "3" muestran la cantidad de tejido de hoja .liofilizadas utilizadas para cada extracción, en mg. Para dos de las -hojas indicadoras (R148P5 14 y R151P1 40 ) ,' 'hubo únicamente bastante tejido para las extracciones por duplicado.

Resultados Se utilizó GC-MS para analizar los 82 compuestos que incluyen los aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos y ácidos orgánicos presentes en las hojas indicadoras de 5 pares de plantas de arroz F2, y en las hojas indicadoras y semillas de dos grupos de 10 plantas de arroz T3, cada una conteniendo los transgénes DWF4 activos. Los resultados MxP muestran que las Hojas de 2 hasta 5 plantas F2 (R148P5 15 y R151P1 40) contuvieron p326:Hapl y UAS : DWF4 (plantas GFP(+) /DWF4 M) ) . contuvieron un aumento de -20% en la concentración de la sacarosa libre con relación a las plantas control de segregantes' (R148P5 14 y R151P1 41 respectivamente) que contienen p326:Hapl únicamente (plantas GFP (+) /DWF4 ( + ) ) . La hojas indicadoras provenientes de las 3 distintas (R148P5 12, R150P7 19 y R150P7 20) .mostraron ligeros aumentos en los niveles de sacarosa. Aunque no fue estadísticamente significativo, las concentraciones de sacarosa, en las 3 plantas tuvieron tendencias ligeramente superiores en lugar de inferiores. Todas las 5 plantas GFP (+) /DWF4 (+) F2 mostraron niveles superiores . de ácido glutámico y ácido linoleico (C18:2) que los controles GFP (+) /DWF4 (-) . El aumento para ácido glutámico fue, .entre ~15% y ~65%, ,y, .para ácido linoleico fue entre ~l8% y -40%. Las concentraciones de los otros 79 compuestos se analizaron en las hojas indicadoras 5 GFP (+) /DWF4 (+) con tendencia a ligeramente superior o ligeramente inferior que en los controles GFP (+) /DWF4 (-) . Estos incluyen glucosa y fructosa, proveniente de la sacarosa y glutamina, que se sintetiza de ácido glutámico. El perfil metabólico de las hojas indicadoras provenientes de plantas T3 que contienen el ADNg de p326 : DWF4 como una fusión 'directa no ' mostraron aumentos estadísticamente significativos -en los niveles de sacarosa o ácido linoleico con relación á los controles tipo silvestre sin transformar; una línea T3 (CR24-3-6) fue estadísticamente superior en ácido glutámico. Perfil metabólicO de las semillas en desarrollo recolectados 15 días después de la polinización de otras plantas T3 que contuvieron el ADNg de DWF4 como una fusión directa, la estructura no mostró - diferencias estadísticamente significativas en los niveles de sacarosa, ácido glutámico o ácido linoleico con relación a los controles tipo silvestre sin transformar. No hubo tendencia en los niveles de los otros 79 compuestos. El análisis e componente principales mostró que L-treonina, L-valina, L-fenilalanina, - glicerol, L-leucina y L-lisina (Componente 1) contribuyeron en -34% de toda la variación en los compuestos de las semillas.

Sumario y análisis Al utilizar hojas indicadoras de arroz, se realizó el análisis MxP de una serie de plantas F2. La comparación de los datos MxP a partir de las plantas GFP(+) /DWF4 (+) y GFP (+) /DWF4 (- ) reveló que hubo niveles aumentados de ácido glutámico, ácido linoleico, y posiblemente sacarosa en 'las plantas que contuvieron p326:Hapl y UAS:I F4 con relación a los controles que contuvieron p326:H"apl únicamente. La invención que se- está describiendo de esta forma, será evidente para alguien con experiencia normal en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones de los materiales y métodos ' para la práctica de la invención. Estas modificaciones se considerarán dentro del alcance de la invención según se define por las siguientes reivindicaciones .

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene: (a) una identidad de secuencia aproximadamente del 85% o mayor con- la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. 2. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que corresponde a la secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2, con la condición de que el poli'péptido codificado no exhiba una identidad de ' secuencia del 93% o mayor con las secuencias de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 3. 3. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para - un polipéptido correspondiente a la secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde el polinucleótido comprende además un elemento control del promotor de - expresión amplia vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 4. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el polipéptido es efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. 5. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el , polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2. 6. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. 7. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, .caracterizado porque el polinucleótido comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 8. El polinucleótido aislado según la reivindicación 7, caracterizado porque el elemento control es un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. 9. El polinucleótido aislado según la reivindicación 8', caracterizado • porque el promotor de I expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de p326, YP0158, YP0214, YP038Q, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 10. El polinucleótido aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el promotor de expresión amplia es p326. 11. El polinucleótido aislado según la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor constitutivo es 35S. 12. Un vector recombinante caracterizado porque comprende: (i) el polinucleó/tido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y (ii) un elemento control vinculado funcionalmente al polinucleótido. 13. Un vector recombinante caracterízado porque comprende el polinucleótido según la reivindicación 3. 14. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector recombinante según la reivindicación 12. 15. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector recombinante según la reivindicación 13. 16. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende al menos un polinucleótido exógenos, al menos el polinucleótido exógenos comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido: (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, con la condición de que el polipéptido codificado no exhiba una identidad de secuencia del 93% o mayor con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID N0:1 o la SEQ ID NO: 3. 17. La planta ' transgénica según la reivindicación 16, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. 18. La planta ' transgénica según la reivindicación 16, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. 19. La planta transgénica según la reivindicación 16, caracterizada porque el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 20. La planta transgénica según la reivindicación 18, caracterizada porque el elemento control es un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. 21. La planta transgénica según la reivindicación 20, caracterizada porque el promotor de expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 22. La planta transgéníca según la reivindicación 21, caracterizada porque el -promotor de expresión amplia es p326. 23. La planta • transgénica según la reivindicación 21, caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión 'del polipéptido en el .retoño y la punta del retoño. 24. La planta . ; transgénica según la reivindicación 20, caracterizada porque la planta transgénica exhibe un fenotipo alterado con relación a una planta control. 25. La planta , • transgénica según la reivindicación 24, caracterizada porque el fenotipo alterado se selecciona de uno o .más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, una disminución en un nivel de campestanol, una .velocidad . fotosintética -aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. 26. La planta transgénica , según la reivindicación 25, caracterizada porque el perfil metabólico alterado es un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control . 27. La planta transgénica .según la • 5 reivindicación 16, caracterizada porque la planta transgénica es una planta de Brassica. 28. Lá planta transgénica según la reivindicación 16, ' caracterizada porque la planta transgénica es una monocotiledónea. 10 29. La planta \ - transgénica según la reivindicación 28, -caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo o maíz. 30. La planta transgénica ' según la 15 reivindicación 16, caracterizada porque la planta transgénica es una dicotiledónea. 31. La. planta ' transgénica según la reivindicación 16, caracterizada porque el polipéptido es • efectivo para catalizar la oxidación de campest.anol en C-22 0 para formar 6-desoxbcatastero'na. 32. Una planta transgénica, con la condición de que la planta no sea una planta Arabidopsis thaliana o Nícotíana tabácuni, caracterizada porque comprende al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno 5 comprende un ácido nucleico ' que codifica para un polipéptido: (a) que tiene una - identidad de secuencia aproximadamente el 85% o mayor1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2. 33. ' La planta transgénica - según • la reivindicación '32, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia dé aminoácido mostrada en la SEQ ID NO:2. 34. La planta transgénica según la reivindicación 32, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. 35. La planta transgénica según la reivindicación 32, caracterizada porque el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente con el ácido nucleico . que- codifica para el polipéptido. 36. La planta transgénica según la reivindicación 35, caracterizada porque el elemento control t es un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo. 37. La planta transgénica según la reivindicación 36, caracterizada porque el promotor de expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 38. La planta transgénica según la reivindicación 37, caracterizada porque promotor de expresión amplia es p326. 39. La planta transgénica según la reivindicación 36, - caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. 40. La planta -.transgénica según la reivindicación 35, caracterizada porque la planta transgénica exhibe un fenotipo alterado con relación a una planta control. 41. La planta , transgénica según la reivindicación . 40, caracterizada porque el fenotipo alterado se .selecciona de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico .alterado, un aumento én el nivel de 6-desoxocatasterona, un aumento en un nivel de campestanol, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, ,y una altura aumentada con relación a la planta control. 42. La 'planta - transgénica según la reivindicación 41, caracterizada porque el perfil metabólico alterado es un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control . 43. La planta transgénica según la reivindicación 32, caracterizada porque la planta transgénica es una monocotiledónea. 44. La planta transgénica según la reivindicación 43, caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz. • 45. La planta transgénica según la reivindicación 32, caracterizada. porque la planta transgénica es una dicotiledónea. 46. • La planta transgénica según la reivindicación 32, caracterizada porque el polipéptido es efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. 47. Una planta transgénica caracterizada porque comprende al menos un polihucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido.: (a) que tiene una identidad de s cuencia de aproximadamente, 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) co o .se muestra en la Figura 2, en donde la planta transgénica exhibe un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona con relación a una planta control. 48. La planta transgénica según la reivindicación 47, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. 49. La planta transgénica según la reivindicación 47, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada "en la SEQ ID NO: 2. 50. La planta transgénica según la reivindicación 47, caracterizada porque el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucl ico que codifica para el polipéptido. 51. La planta- transgénica según la reivindicación 50, caracterizada porque el elemento control es un promotor de, expresión amplia o un promotor constitutivo. 52. La planta , -transgénica según la reivindicación 51,' caracterizada porque promotor de expresión amplia se selecciona- del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 53. La ' planta transgénica .según la reivindicación 52, caracterizada porque el promotor de expresión amplia es p326. 54. La planta transgénica según la reivindicación 53, caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. 55. La planta transgénica según la reivindicación ' 47, caracterizada porque la planta transgénica exhibe además un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, una disminución en un nivel de campestanol, una .velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. 56. La planta transgénica según la reivindicación 55, caracterizada porque el perfil metabólico alterado es un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico _ cori relación a la planta control. 57. La planta , transgénica según la reivindicación 47 , caracterizada porque la planta transgénica es un monocotiledónea. 58. La planta transgénica según la 'reivindicación 57, caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz . 59. La planta transgénica según la reivindicación 47, caracterizada porque la planta transgénica es una dicotiledónea. 60. La planta transgénica según la reivindicación 47, caracterizada porque el polipéptido es efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. 61. Una planta transgénica caracterizada porque comprende al menos un polinucleótido ' exógeno, el polinucleótido exógeno comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido: (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde 'a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra en la Figura 2, en donde la planta transgénica exhibe una disminución en un nivel de campestanol con relación a una planta control. 62. La .planta - transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porque el polipéptido comprende lá secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. 63. La planta transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. 64. La planta transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porque el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 65. La" planta transgénica según la reivindicación 64, caracterizada, porque el elemento control es un promotor -de expresión amplia o un promotor constitutivo. 66. La planta transgénica según la reivindicación 65, caracterizada porque promotor de expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 67. La planta transgénica según la reivindicación 66, caracterizada porque el promotor de expresión amplia es p326. 68. La planta • transgénica según la reivindicación 67, caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión del polipéptido en el retoño y la punta del retoño. 69. La planta > transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porqué la planta transgénica exhibe además un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionada de uno o más del grupo que consiste de: un' perfil metabólico alterado, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, una velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. 70. La planta .transgénica según la reivindicación 69, -caracterizada porque • el perfil metabólico alterado es un .nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico ' con relación a la planta control. 71. La planta transgénica .según la reivindicación 61, caracterizada porque la planta transgénica es una monocotiledónea. 72. La planta transgénica según la reivindicación 71, caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maiz . , i . - 73. La planta transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porque la planta transgénica es una dicotiledónea. 74. La planta , transgénica según la reivindicación 61, caracterizada porque el polipéptido es efectivo para catalizar la-- oxidapión de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. 75. Una planta transgénica caracterizada porque comprende al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido: (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% d mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) como se muestra -en la Figura 2,' en donde el polinucleótido exógeno comprende además un elemento para control de expresión amplia- vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 76. a planta transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. 77. La planta transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia' mostrada en la SEQ ID NO: 2. 78. La planta ,: transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque promotor de expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 79. La planta transgénica ' según la reivindicación 78,.- caracterizada porque el promotor de expresión amplia es p326. 80. La planta transgénica según la reivindicación 79, caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión deL polipéptido en el retoño y la punta del retoño. 81. La planta transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque la planta transgénica exhibe un fenotipo . alterado con relación a una planta control seleccionada -de uno o mas ' del grupo que consiste de: un perfil metabólico 'alterado, una disminución en un nivel de campestanol, un aumento en un nivel de 6-desoxocatast'erona, un velocidad fotosintética aumentada, un rendimiento aµmentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, y una altura aumentada con relación a la planta control. 82. La planta transgénica según la reivindicación 81, caracterizada' porque el perfil metabólico alterado es un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control. - - 83. La planta ' transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque la planta transgénica es una monocotiledónea. 84. La planta transgénica según la reivindicación 83, caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz.' 85. La planta transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque la planta transgénica es una dicotiledónea. 86. La planta transgénica según la reivindicación 75, caracterizada porque el polipéptido es efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. • • 87. Una planta transgénica caracterizada porque comprende al menos un polinucleótido exógeno, el polinucleótido exógeno comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido: (a) que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o .mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde - a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2, en donde la planta - transgénica exhibe una velocidad fotosintética aumentada con relación a una planta control. 88. La planta transgénica según la reivindicación 87', caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO : 2. 89. Los planta .transgénica según la reivindicación 81, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. 90. La planta transgénica según la reivindicación 87, caracterizada porque el polinucleótido exógeno comprende además un elemento control vinculado funcionalmente al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. 91. La planta transgénica según la reivindicación 90, caracterizada porque el elemento control es un promotor de expresión amplia o un promotor constitutivo . 92. La planta transgénica según la reivindicación 91, caracterizada porque el promotor expresión amplia se selecciona del grupo que consiste de: p326, YP0158, YP0214, YP0380, PT0848, PT0633, YP0050, YP0144 y YP0190. 93. La planta transgénica según la reivindicación 92, caracterizada porque el promotor de expresión amplia es p326. 94. La planta transgénica según la reivindicación 93, caracterizada porque el promotor p326 provoca la expresión del polípéptido en el retoño y la punta del retoño. 95. La planta .transgénica según la reivindicación 87, caracterizada porque • la planta transgénica exhibe además un fenotipo alterado con relación a una planta control seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: un perfil metabólico alterado, una disminución en un nivel de campestanol, un aumento en un nivel de 6-desoxocatasterona, un rendimiento aumentado de semillas, un peso aumentado de las semillas por planta, y un altura aumentada con relación a la planta control. 96. La planta , transgénica según la reivindicación 95, caracterizada porque el perfil metabólico alterado es un nivel aumentado de sacarosa, glutamato, o ácido linoleico con relación a la planta control . 97. La planta transgénica según la reivindicación 87, caracterizada porque la planta transgénica es una monocotiledónea. 98. La planta transgénica según la reivindicación 97, caracterizada porque la monocotiledónea es arroz, trigo, pasto aromático, centeno, cebada, sorgo, o maíz . 99. La planta transgénica según la reivindicación 87, caracterizada porque la planta transgénica es µna dicotiledónea. 100. La planta transgénica según la reivindicación 87, caracterizada porque el polipéptido es efectivo para catalizar la oxidación de campestanol en C-22 para formar 6-desoxocatasterona. 101. Un método por producir una planta transgénica caracterizado porque comprende: (a) introducir el polinucleótido según la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3, en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada. 102. Una semilla ,de una planta transgénica según la reivindicación 16, 32, 47, 61, 75, ó 87. 103. Un polipéptido aislado: (a) ' que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; o (b) que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO; 4) como se muestra, en -la Figura 2, con la condición de que el polipéptid? codificado no exhiba una identidad de secuencia del 93% . o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. 104. Un método para aµmentar el nivel de uno o más metabolitos seleccionados del grupo que consiste de sacarosa, glutamato, y ácido linoleico en una planta, el método caracterizado porque cpmprende: (a) introducir . el polinucleótido según la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula . vegetal transformada, - en donde la planta transgénica exhibe un nivel aumentado de uno o más del os metabolitos. 105. Un método para aumentar el nivel de uno o más de los metabolitos seleccionados del grupo que consiste de sacarosa, glutamato, y ácido linoleico en una planta, el método caracterizado porque comprende: (a) - introducir eri una célula vegetal un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrad en la SEQ ID NO: 2 o 2) un polipéptido que comprende' una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra e? la Figura 2 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde la planta transgénica exhibe un nivel aumentado de uno o más de los metabolitos.. 106. Un, método por • aumentar un nivel de 6-desoxocatasterona en una planta, el método caracterizado porque comprende : (a) introducir el polinucleótido según la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir 'una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde la planta transgénica exhibe un nivel ' aumentado de 6-desoxocatasterona. 107. Un método para aumentar el- nivel de 6-desoxocatasterona en una planta., el método caracterizado porque comprende : (a) introducir en la célula vegetal un polinucleótido aislado que, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde" a una secuencia de consenso (SEQ ID, NO: 4) según se muestra en la Figura 2 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la . célula vegetal' transformada, en donde la planta transgénica exhibe un nivel aumentado d 6-desoxocatasterona. 108. Un método para disminuir un nivel de campestanol en una planta, el método caracterizado porque comprende : (a) introducir el polinucleótido según la reivindicación 1, reivindicación 2, ó reivindicación 3 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde la planta " transgénica exhibe un nivel disminuido de campestanol. 109.. Un método por disminuir un nivel de campestanol en una lanta, el método caracterizado porque comprende : (a) introducir en - una célula vegetal un polinucleótido aislado que -comprende una molécula de ácido nucleico que codifica 1) .un • polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la, SEQ ID NO: 2 o 2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra en la Figura 2 en una célula vegetal para producir- una célula' vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde la planta transgénica exhibe un nivel disminuido de campestanol. 110. Un método para aumentar una velocidad fotosintética de una planta, el método caracterizado porque comprende : (a) introducir el polinucleótido según la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3 en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada; y (b) prodµcir una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada, en donde' la planta transgénica exhibe una velocidad 'fotosintética aumentada. 111. Un método para aumentar una velocidad fotosintética en una planta, el método caracterizado porque comprende : (a) introducir en una célula vegetal un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para 1) µn pólipéptido que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 85% o mayor con la secuencia de. aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 2) "un polipéptido que comprende µna secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 4) según se muestra eh la Figura 2 en una célula vegetal para, producir una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de una célula vegetal transformada, en donde la planta transgénicá exhibe una velocidad-• fotosintética aumentada.