CN112725349A - 一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用，通过将DgMYM1在鸭茅中增强表达，可以提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

Description

一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用。

背景技术

鸭茅(Dactylis glomerata L.)又名果园草(Orchardgrass)、，属禾本科(Poaceae)早熟禾亚科(Festucoideae)鸭茅属(Dactylis)，是一种世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有生长速度快，生物产量高，糖分含量高，耐荫性强和适应范围广等特点。作为经济价值排名前四的多年生牧草，鸭茅对于世界温带地区草食动物肉类和乳制品生产有重要意义。除作为优良的牧草外，鸭茅也是我国林下草地和人工草地重要的优良混播禾草之一，主要适合于西部退耕还草和草场建设，对退耕还林还草和林-草复合建植等具有重要的积极意义。但鸭茅不耐旱、不耐盐的特性严重限制了其在生产上的运用。虽然针对耐旱和耐盐性状进行了多年的育种研究，但效果甚微。

锌指蛋白(zinc finger protein)是一类具有手指状结构域的转录因子，最早发现于非洲爪蟾卵母细胞中，后在人类、动植物及微生物中发现也有广泛分布。目前已在大量植物中报道有锌指蛋白，并且进行了功能鉴定。这类蛋白通过与DNA、RNA结合或与其他蛋白质的相互作用来调控下游基因的表达。植物体中的锌大量指蛋白在植物生长发育和耐逆性等方面具有重要的作用。在植物耐热方面，锌指蛋白大量参与耐热过程，提高植物耐热性，如在水稻中受热胁迫调控且在烟草中超表达后增加了其耐热性。在鹰嘴豆、辣椒等植物中也分别发现热胁迫诱导C2H2型和C3HC4锌指蛋白的表达，在牧草品质改良方面有重要利用价值。鸭茅是异化授粉牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能验证较为滞后，目前为止，对鸭茅锌指蛋白DgMYM1的研究还处于空白状态，利用DgMYM1转入鸭茅，提高其抗旱性和耐盐性具有重要理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1，利用转基因技术将DgMYM1在鸭茅中增强表达，可以针对性的提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1可编码的蛋白含365个氨基酸，其中Leu(10.4％)，Ser(9.3％)，Ile(8.5％)和Lys(8.2％)的含量最高，该蛋白不编码Pyl和Sec；其蛋白分子式：C₁₈₅₉H₂₉₄₆N₄₇₈O₅₃₉S₁₈；相对分子质量(Molecular weight)为41.1938KDa；理论等电点(Theoretical isoelectric point)为6.90；脂肪系数(Aliphatic index)为100.93；平均亲水系数(Grand average ofhydropathicity,GRAVY)为0.064；不稳定系数(instabilityindex)为50.04，为不稳定蛋白。

具体的，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

另外，以下核苷酸或氨基酸序列也在本发明的保护范围内：

1)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；

2)与序列如SEQ ID NO.1所示互补的所示的核苷酸序列；

3)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失或者添加一个/几个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列；

4)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列同源性≥90％，且功能相同的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1。

所述的表达载体是适用于大肠杆菌中表达的载体。

所述的表达载体是将鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1插入至pMD18-T载体中得到。

具体的，所述的表达载体通过以下方法构建：

以鸭茅参考基因组设计引物，提取鸭茅总RNA，以反转录合成cDNA为模板进行扩增，利用DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾，通过连接酶插入pMD18-T载体中，得到表达载体pMD18T-DgMYM1。

所述的引物为：

DgMYMF:5’-ATGACTTTAATTATTAGATGTGTT-3’；

DgMYMR:5’-TTAATTCAGAAAAATATCATC-3’。

另外，一种针对鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1的超表达载体也在本发明的范围内。

所述的超表达载体通过以下方法构建：以pMD18T-DgMYM1为模板，用引物P1226F和P1254R扩增得到目的基因，将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与载体pCAMBIA1300-35进行连接，即得超表达载体。

进一步的，引物P1226F和P1254R为：

P1226F：5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’；

P1254R：5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’。

在本发明的另一方面，还提供了所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用，通过将DgMYM1在鸭茅中增强表达，可以提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

本发明的有益效果为：

在鸭茅中过表达DgMYM1基因可以提高鸭茅抗旱性和耐盐性，促进其在边际土地或不适宜粮食作物生长的贫瘠地区或者盐碱、干旱地区应用，提高土地使用效率，为家畜饲养提供优质饲草料。

附图说明

图1是本发明DgMYM1在不同胁迫下的表达；其中柱形图顺序依次为0h，1h，3h，6h，12h，24h；

图2是本发明酵母初步验证DgMYM1功能；

图3是本发明阳性菌酶切验证；

图4是本发明转DgMYM1拟南芥阳性植株鉴定；

图5是本发明转DgMYM1拟南芥高温胁迫实验；

图6是本发明转DgMYM1拟南芥盐胁迫实验。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及表达载体的构建

实验材料为鸭茅品种‘宝兴’，种植于四川农业大学温江校区。取其幼嫩叶片为材料提取总RNA。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作参考内附说明书进行。RNA提取后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录选用TaKaRa公司的PrimeScript II 1ststrandcDNAsynthesis Kit，操作流程参考内附说明书。

以鸭茅参考基因组为模板，通过序全长设计引物(上游引物：DgMYMF:5’-ATGACTTTAATTATTAGATGTGTT-3’,下游引物：DgMYMR:5’-TTAATTCAGAAAAATATCATC-3’)以cDNA为模板进行扩增，扩增选用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行，操作流程参考内附说明书，PCR扩增体系见表1。反应条件为98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃运行10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1PCR扩增体系

紫外灯下切胶，用TaKaRa公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit回收纯化目的片段，具体操作参考内附说明书。用TaKaRa公司的DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾。完成后取上述DNA溶液4μl，加入1μl pMD18-T载体和5μlSolution(含连接酶)混匀，在16℃反应30min。反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min。将转化好的感受态细胞中加入890μlsOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功。能通过菌液PCR扩增得到目的条带进行双端测序，测序引物M13，以验证是否克隆成功。

鸭茅DgMYM1基因片段全长1,098bp，序列如SEQ ID NO.1所示，可编码的蛋白含365个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示，其中Leu(10.4％)，Ser(9.3％)，Ile(8.5％)和Lys(8.2％)的含量最高，该蛋白不编码Pyl和Sec；其蛋白分子式：C₁₈₅₉H₂₉₄₆N₄₇₈O₅₃₉S₁₈；相对分子质量(Molecular weight)为41.1938KDa；理论等电点(Theoretical isoelectric point)为6.90；脂肪系数(Aliphatic index)为100.93；平均亲水系数(Grand averageofhydropathicity,GRAVY)为0.064；不稳定系数(instabilityindex)为50.04，为不稳定蛋白。

实施例2DgMYM1功能分析

1鸭茅胁迫处理

为验证DgMYM1在不同胁迫条件下的表达变化，选取鸭茅品种‘宝兴’在16h(23℃)白天/8h(18℃)黑暗进行砂培。鸭茅幼苗长至3叶到4叶期时分别进行250mM NaCl处理，100μMABA处理，37℃热胁迫，20％聚乙二醇处理(PEG6000)，和200mM碳酸氢钠胁迫处理(NaHCO₃)，分别在0h，1h，3h，6h，12h，24h收集叶片，并于液氮中冷冻，每个样品取3个重复。

使用美基生物(广州)科技有限公司的HiPure Plant RNAmini Kit试剂盒进行总RNA提取，使用莫纳(广州)生物科技有限公司的MonScript^TMRTIII All-in-One Mix withdsDNase Kit试剂盒进行cDNA合成。荧光定量采用美国Bio-RAD公司的Bio-RAD CFX Connet进行，定量试剂盒选择普迈精医科技(北京)的MonAmp^TM

Green qPCR Mix(None ROX)试结合进行。定量引物为：

正向引物DgMYM1-F：GTGAGGGGTCAAGGTTACGATAA；

反向引物DgMYM1-R：CGCACATGGCATATACAGAGCA

以GAPDH为内参基因，正向引物GAPDH-F：TCTGACCGTTAGACTTGAGAAGG；反向引物：GAPDH-R：CTTGAGCTTACCCTCAGACTCCT，以2-^ΔΔCT法计算基因的表达水平。

如图1所示，荧光定量结果表明，DgMYM1在Sorbitol，热胁迫和盐胁迫条件下有较高水平表达。

2DgMYM1酵母表达验证

为初步鉴定DgMYM1的功能，选择前期克隆的DgMYM1片段，以Hind III和Xba I为酶切位点进行酶切，采用诺唯赞生物(南京)的ClonExpress Ultra Onestep Cloning kit试剂盒将酶切后的片段连入线性化后的pYES2酵母表达质粒。将重组pYES2-DgMYM1质粒通过Carrier DNA(Coolaber,中国)转入酿酒酵母株系(INVScI,MATahis3Δ1leu2 trp1-289ura3-52/MATαhis3Δ1leu2 trp1-289 ura3-52)，以空白pYES2质粒为对照。转化后的酵母以含20mg/mL葡萄糖的SC-Ura培养基于28℃培养48h，选取单克隆进行PCR确认，引物为：

正向引物MYM-F：ttggtaccgagctcggatccATGACTTTAATTATTAGATGTGTTAACATGTC；

反向引物MYM-R：acatgatgcggccctctagaTTAATTCAGAAAAATATCATCTAATTCAACA。

选取阳性转化酵母于含2mg/mL半乳糖的液体SC-Ura培养基培养后，150rpm离心后以10的倍数进行稀释。稀释后的酵母悬浮液分别涂布于含有3M山梨醇和1.5M NaCl的SD-Ura培养基上28℃培养。选择未添加山梨醇和NaCl的培养基涂布悬浮液于37℃培养进行热胁迫。

结果表明，DgMYM1可以提高酵母对盐胁迫、山梨醇模拟的干旱胁迫以及高温胁迫的耐受性(图2)。

实施例3转入拟南芥及功能

1过表达载体构建

目的基因扩增：根据载体pCAMBIA1300-35S的图谱设计KpnI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列为：

上游引物：P1226F:5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’(保护碱基-KpnI-扩增引物)；

下游引物：P1254R:5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’(保护碱基-XbaI-扩增引物)，使用高保真酶扩增得到目的片段，扩增体系见表2。

表2PCR扩增体系

PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min10s，30个循环；68℃延伸5min。PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳15min，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带(图3)。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

2超表达载体的构建

1)将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与同样用KpnI-XbaI酶切的载体1300-35S进行体外连接，连接体系见表3：

表3目的基因与pPic9K重组质粒连接体系

吸打混匀，离心后加入矿物油；16℃连接2h；连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。

2)连接产物的转化

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μl的感受态细胞，放

于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μl的感受态细胞(冰上操作)

c.加入10μl的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μl不含Kan+的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μl，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan+的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；37℃恒温培养箱中培养16～20h。

3拟南芥转化

1)农杆菌转化：-80℃冰箱取出感受态GV3101，冰上解冻2-3min加入3-5ul重组质粒，冰上放置5min。将EP管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800ul无抗液体LB培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h。8000rpm/min离心1min，弃上清600ul后，悬浮，涂于固体LB培养基上(含50ug/mlKan和50ug/ml利福平)，28℃培养箱倒置培养48h。挑取单克隆，使用基因特异性引物及载体通用引物PCR鉴定(引物序列及PCR程序见转基因植株阳性苗鉴定部分)

2)拟南芥种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合基质(2：1)作为拟南芥种植土壤。选择直径9cm的花盆，每盆播种50-100颗。播种以后浇水并覆膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。拟南芥室生长条件为光照强度为2000-3000lx，光照时间14h/day，湿度40-60％。

3)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。

4)去顶：移栽后每3天浇一次水，每两周添加一次营养液，约25-30天后，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

5)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.05％(500ul/L)。

6)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。

7)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

8)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

9)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

10)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。

11)转基因植株转土栽培：转基因种子在MS+潮霉素平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。具体方法如下：取阳性植株叶片进行基因组DNA的提取并使用载体植物筛选标记潮霉素基因序列引物(上游引物潮霉素F：5’-GAGCATATACGCCCGGAGTC-3’，下游引物潮霉素R：5’-GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’)进行PCR验证(图4)。PCR扩增体系如表4，PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

表4扩增体系

待T3代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行37℃高温胁迫处理14天。结果表明与野生型拟南芥对照相比，本研究所获得的转DgMYM1基因拟南芥株系耐高温能力明显高于野生型拟南芥对照(图5)，表明鸭茅DgMYM1基因的过量表达可以提高植物的耐高温能力。

待T3代转基因植物生长至4对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株于加入250mM NaCl模拟盐胁迫处理14天。结果表明，转DgMYM1基因的拟南芥耐盐性显著优于野生型拟南芥(图6)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 鸭茅锌指蛋白基因(DgMYM1)

<400> 1

atgactttaa ttattagatg tgttaacatg tcaaacaaca aaattaagat agaagagttc 60

tttattgaat ttctgaaggt ggatgataca tctggtttgg gtatttttaa tgtacttctt 120

gatgccatag agtcgtatgg cctaaatatt aatgatgtga ggggtcaagg ttacgataat 180

ggatcaaaca tgaaaggaaa aaaacaaggg gtacaaagtc gattgcttga aattaattca 240

agtgctctgt atatgccatg tgcgtgccat agtctaaatc ttaatttgtg tgatatggct 300

agttcgtgtg gtaaagctat ttcctttttt ggaattgtgc aatgcattta tgttttattt 360

tcaagttcca ctaaaagatg gaaagtgttg cttgaccata ttccaagttt gactgtgaaa 420

ggattgtcta atacacggtg ggagagtcga atcaaaagtg ttaaagctat tagatatcaa 480

gcacctcaat taaggttagc tttgttcgag gtaggtaaaa tatatgcaga tgccaagtca 540

aagactgatg caaaaaatat atttgatgct attggtagtt ttgagtatat acttggtatg 600

gtcatctggc atgacatttt atttgttgta aacacggtga gtaagaactt gcagtccgcg 660

accatgtctg ttggctctac tttgcagcaa attgaaggaa taatgatttt ttttgaaaat 720

tacagaaatg taggatttgc atctagtttg aagattgcaa aagctattgc atcagaaatg 780

ggaatagaac catcatttcc aataaaatgt agcgttacta ggaaaaagca atttgatgag 840

cctgatcacg atgaagaagt tctattagcc gagaaggcat ttgaagttaa ttatttctta 900

gtcatggttg atgttgcaaa agtctctctg caaaacagat ttgaagaact taaagtgttc 960

aaaaatatat ttggcttctt acttaactca aaagagttaa agttattgga tgatattgaa 1020

ttacgcaaaa gttgtgccaa atttgttgaa acattttctc gaagtgatgt tgaattagat 1080

gatatttttc tgaattaa 1098

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> 鸭茅锌指蛋白(DgMYM1)

<400> 2

Met Thr Leu Ile Ile Arg Cys Val Asn Met Ser Asn Asn Lys Ile Lys

1 5 10 15

Ile Glu Glu Phe Phe Ile Glu Phe Leu Lys Val Asp Asp Thr Ser Gly

20 25 30

Leu Gly Ile Phe Asn Val Leu Leu Asp Ala Ile Glu Ser Tyr Gly Leu

35 40 45

Asn Ile Asn Asp Val Arg Gly Gln Gly Tyr Asp Asn Gly Ser Asn Met

50 55 60

Lys Gly Lys Lys Gln Gly Val Gln Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Ser

65 70 75 80

Ser Ala Leu Tyr Met Pro Cys Ala Cys His Ser Leu Asn Leu Asn Leu

85 90 95

Cys Asp Met Ala Ser Ser Cys Gly Lys Ala Ile Ser Phe Phe Gly Ile

100 105 110

Val Gln Cys Ile Tyr Val Leu Phe Ser Ser Ser Thr Lys Arg Trp Lys

115 120 125

Val Leu Leu Asp His Ile Pro Ser Leu Thr Val Lys Gly Leu Ser Asn

130 135 140

Thr Arg Trp Glu Ser Arg Ile Lys Ser Val Lys Ala Ile Arg Tyr Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gln Leu Arg Leu Ala Leu Phe Glu Val Gly Lys Ile Tyr Ala

165 170 175

Asp Ala Lys Ser Lys Thr Asp Ala Lys Asn Ile Phe Asp Ala Ile Gly

180 185 190

Ser Phe Glu Tyr Ile Leu Gly Met Val Ile Trp His Asp Ile Leu Phe

195 200 205

Val Val Asn Thr Val Ser Lys Asn Leu Gln Ser Ala Thr Met Ser Val

210 215 220

Gly Ser Thr Leu Gln Gln Ile Glu Gly Ile Met Ile Phe Phe Glu Asn

225 230 235 240

Tyr Arg Asn Val Gly Phe Ala Ser Ser Leu Lys Ile Ala Lys Ala Ile

245 250 255

Ala Ser Glu Met Gly Ile Glu Pro Ser Phe Pro Ile Lys Cys Ser Val

260 265 270

Thr Arg Lys Lys Gln Phe Asp Glu Pro Asp His Asp Glu Glu Val Leu

275 280 285

Leu Ala Glu Lys Ala Phe Glu Val Asn Tyr Phe Leu Val Met Val Asp

290 295 300

Val Ala Lys Val Ser Leu Gln Asn Arg Phe Glu Glu Leu Lys Val Phe

305 310 315 320

Lys Asn Ile Phe Gly Phe Leu Leu Asn Ser Lys Glu Leu Lys Leu Leu

325 330 335

Asp Asp Ile Glu Leu Arg Lys Ser Cys Ala Lys Phe Val Glu Thr Phe

340 345 350

Ser Arg Ser Asp Val Glu Leu Asp Asp Ile Phe Leu Asn

355 360 365

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 3

atgactttaa ttattagatg tgtt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 4

ttaattcaga aaaatatcat c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 5

gtgaggggtc aaggttacga taa 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 6

cgcacatggc atatacagag ca 22

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 7

ttggtaccga gctcggatcc atgactttaa ttattagatg tgttaacatg tc 52

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 8

acatgatgcg gccctctaga ttaattcaga aaaatatcat ctaattcaac a 51

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 9

ggggtaccat gactttaatt attagatg 28

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 10

gctctagatt aattcagaaa aatatcatct 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 11

gagcatatac gcccggagtc 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificialsequence)

<400> 12

gtctccgacc tgatgcagct ctcgg 25

Claims (8)

1.一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含权利要求1所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，通过将鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1插入至pMD18-T，得到表达载体pMD18T-DgMYM1。

5.一种针对鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1的超表达载体，其特征在于，以pMD18T-DgMYM1为模板，用引物P1226F和P1254R扩增得到目的基因，将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与载体pCAMBIA1300-35进行连接，即得超表达载体。

6.根据权利要求5所述的超表达载体，其特征在于，引物P1226F和P1254R为：

P1226F：5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’；

P1254R：5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’。

7.权利要求1所述的鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将DgMYM1在鸭茅中过表达，提高鸭茅的抗旱性和耐盐性。

Images