CN118165996A - MdNAC2基因在提高苹果耐缺钾胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及到MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用。所述MdNAC2基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，MdNAC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。MdNAC2基因超表达能提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用。

Description

MdNAC2基因在提高苹果耐缺钾胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及到MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用。

背景技术

苹果是我国最重要的果品经济树种之一，主要分布在黄土高原、黄河故道、渤海以及西南高地等地区(张宏，2019)。长久以来，缺钾胁迫限制了我国土地可耕地面积的使用，降低我国果树等农产品的产量和品质，进一步制约着我国农业经济的发展进程(刘晓伟，2020)。在实际生产中，为了缓解果树缺钾胁迫，果农一般会施加大量的钾肥(KCl,K₂SO₄,KNO₃)，果树的品质虽然得到了提升，但是土壤的盐渍化却进一步恶化，其中过量KCl的危害极大。所以，找出一种可以缓解植物缺钾且最大程度减少对土壤伤害的方法变得尤为重要。

NAC转录因子是植物中一种特有的转录因子，在矮牵牛中首次发现(韩立涛，2022)，是目前为止在植物中发现最大的转录因子家族之一。NAC转录因子是一种由Nucleoprotein A和Nuclide A两个基因组成的转录酶，是Nuclomerase的靶基因，在RNA剪接、翻译和转录过程中起着重要作用。NAC转录生成的RNA在细胞内具有高度选择性，能够被酶切和甲基化，从而发挥重要作用，是细胞内重要的信号转导途径之一。在植物生长发育、生物及非生物胁迫反应中具有重要的调控作用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用。

通过转基因技术将超表达MdNAC2基因转入苹果植株中，提高苹果植株耐缺钾胁迫能力。

为实现上述技术目的，本发明所采取的技术方案是：

MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，所述MdNAC2基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，MdNAC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，MdNAC2基因超表达能提高苹果植株耐缺钾胁迫能力。

进一步的，上述方案的具体方法为：

1)MdNAC2基因的单克隆扩增；

2)构建植物超表达载体；

3)利用农杆菌介导法将植物超表达载体转入苹果植株；

4)超表达MdNAC2转基因植株功能验证。

其中，上述步骤1)MdNAC2基因的单克隆扩增，上游引物F的核苷酸序列具体如SEQID NO.3所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果在于：1)MdNAC2基因在增强苹果植株对钾离子吸收的应用，以转基因植株的形式呈现，将MdNAC2基因在待增强的苹果植株里过表达，增强苹果对钾离子吸收的能力，从而提高果树的品质和产量；2)本发明可以显著增强苹果植株对钾离子吸收的能力，无需经过长时间年限来培育果树新品种，短时间内提高植物的品质，其简单易行，操作简单，稳定性好。

附图说明

图1MdNAC2基因的单克隆扩增

其中：第1个孔是DNA Marker，后3个都是扩增的MdNAC2；

图2超表达载体MdNAC2-pBI121转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液鉴定

其中：第1个孔是DNA Marker，后16个孔是MdNAC2超表达载体MdNAC2-pBI121转入大肠杆菌DH5α感受态细胞后挑斑鉴定；

图3超表达载体MdNAC2-pBI121转入农杆菌EHA105感受态细胞，菌液鉴定

其中：第1个孔是DNA Marker，后8个孔为超表达载体MdNAC2-pBI121转入农杆菌EHA105感受态细胞后挑斑鉴定；

图4WT与超表达MdNAC2转基因苗在缺钾环境中的表型；

图5WT与超表达MdNAC2转基因苗在缺钾环境中的株高(B)、鲜重(C)、干重(D)、焦枯率(E)、净光合速率(F)、叶绿素含量(G)；

图6WT与超表达MdNAC2转基因苗在缺钾处理下，叶片的活性氧染色(A)、丙二醛含量(B)、超氧化物歧化酶含量(C)、过氧化物酶含量(D)、过氧化氢酶含量(E)；

图7WT与超表达MdNAC2转基因组植株根系的吸K⁺流速图。

具体实施方式

实施例一MdNAC2基因的单克隆扩增

(1)PCR扩增MdNAC2基因

以上游引物F和下游引物R为引物对，用如下表1中的40微升体系对MdNAC2基因进行单克隆扩增，得到MdNAC2核苷酸双链；其中，MdNAC2基因的CDS序列为：ATGGAGAGCACCGACTCGTCCGCGGGCTCACAACAGCAACGGCACCAGCAGCCGCCACCTCCGCAGCCAAACCTGCCGCCCGGGTTCCGCTTCCACCCGACGGACGAAGAGCTAGTCGTCCACTATCTCAAGAAAAAGGCCACCTCCGCTCCCCTCCCGGTTGCTATCATCGCTGAAGTCGACCTTTACAAGTTCGACCCCTGGGAGCTCCCAGCTAAGGCTACGTTTGGAGAGCAAGAGTGGTATTTTTTCAGTCCTAGGGACCGGAAGTACCCGAACGGAGCGAGACCCAATAGGGCAGCGACTTCCGGGTATTGGAAAGCGACGGGGACTGATAAGCCGGTGCTGACTTCCGGCGATACTCAGAAAGTTGGTGTGAAAAAAGCACTTGTGTTCTATGGAGGAAAACCCCCAAAAGGAATTAAAACCAATTGGATTATGCACGAGTACAGGCTTGCTGATAACAAGCCCAACAACAAGCCACCTGGGTGTGACTTGGGCAACAAGAAGAACTCCTTGAGGCTTGATGATTGGGTGCTGTGTAGAATTTACAAGAAGAACAACACGCATAGGCCGATGGATCATGAGAGGGAGGATTCCATGGAGGACATAATGGGACCATTGATGCCACCATCCATAAGTCATGTGGGCCACCATCAGAATATGAAGCTGCACTTTCCAAAATCTAATTCGAGTTATGGACCGCCTTTCATGGAAAATGACCAAATATTTTTTGATGGGATAATGAGCAGCACCGACGGATCAGCTTCTACTCATCAGCTGCAACTAAAACGGCCAATAGTTCCATCTTGGTACTGGAATAATCAGGAGGATGATCAGACGGCTGCTGATCCTTCATCAAGCAAGAGAATACAACTGCACCAATTGGACAATGGTACTAATTCTAATGGTGCTGGGATTAATGGTGGTTCTACAAATAACAATTCTAGTTCTATTACCAATCTACTTTCCCAGCTTCCACAGACGCCACCATTGCACCAACATGCAGTTCTGGGGTCACTTGGCGACGGTATATTCCGGACGCCATATCAACTGCCTGGAATGAATTGGTATTCTGAGTCCAATTTGGGATAG；

MdNAC2基因编码的氨基酸序列为MESTDSSAGSQQQRHQQPPPPQPNLPPGFRFHPTDEELVVHYLKKKATSAPLPVAIIAEVDLYKFDPWELPAKATFGEQEWYFFSPRDRKYPNGARPNRAATSGYWKATGTDKPVLTSGDTQKVGVKKALVFYGGKPPKGIKTNWIMHEYRLADNKPNNKPPGCDLGNKKNSLRLDDWVLCRIYKKNNTHRPMDHEREDSMEDIMGPLMPPSISHVGHHQNMKLHFPKSNSSYGPPFMENDQIFFDGIMSSTDGSASTHQLQLKRPIVPSWYWNNQEDDQTAADPSSSKRIQLHQLDNGTNSNGAGINGGSTNNNSSSITNLLSQLPQTPPLHQHAVLGSLGDGIFRTPYQLPGMNWYSESNLG；

上游引物F的核苷酸序列具体为：TCTAGAATGGAGAGCACCGACTC；

下游引物R的核苷酸序列具体为：GGATCCTCCCAAATTGGACTCAG。

表1

结果如图1所示。

(2)将上述PCR扩增得到的MdNAC2核苷酸双链用如下表2所示的10微升体系进行连接PMD-19-T(Simple)载体，购买于Takara公司，在16℃下过夜连接，得到连接产物。

表2

(3)连接产物转化感受态细胞：

将从-80℃超低温冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于1.5mL无菌的的离心管中，加入10微升连接产物，吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入200μL的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，摇菌结束后，取100μL菌液涂LB板(带有抗生素)，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10-12h，待长出菌斑。

(4)挑斑：在无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个上述菌斑(形状比较规则的)，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h，得到菌液。

(5)菌液鉴定：摇菌结束后用表3所示的体系进行菌液鉴定，以上述菌液为模板，选用的上游引物为载体上游引物，选用的下游引物为基因的下游引物，按照正常验证流程进行鉴定，以水为阴性对照。检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。

表3

实施例二构建植物超表达载体MdNAC2-pBI121

(1)将阳性的菌液提质粒(质粒提取方法根据试剂盒(购买自思科捷公司)步骤进行)，得到连有MdNAC2的PMD-19-T(Simple)融合质粒。

(2)将连有MdNAC2的PMD-19-T(Simple)融合质粒和pBI121空载体按照如表4所示的40微升体系进行双酶切，37℃反应2-6h。

表4

(3)目的基因与目的载体的回收和连接：将上述切取目的基因的条带进行胶回收(按试剂盒进行)，同时将目的载体的酶切条带也切下进行胶回收(按试剂盒进行)，然后表5所示的体系进行连接。

表5

(4)将表6所示的体系将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

表6

然后，将大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取20μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞于一个的1.5mL的无菌离心管中，吸取构建好的连接产物10μL，吹打混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入200μL的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，取100μL菌液涂LB板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10-12h。

(5)挑斑：无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100μLLB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个菌斑，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h。

(6)菌液鉴定：摇菌结束后用上表3所示的10μL体系进行PCR鉴定，以菌液为模板，引物为载体的上游引物，基因的下游引物，按照正常的验证流程进行鉴定，以水为阴性对照，如图2所示。检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。

(7)将阳性的菌液提质粒(质粒提取方法根据试剂盒步骤进行)，得到植物超表达载体MdNAC2-pBI121。

实施例三利用农杆菌介导法将植物超表达载体MdNAC2-pBI121转入GALA-3植株

(1)将植物超表达载体MdNAC2-pBI121转化到农杆菌EHA105中：从-80℃超低温冰箱中取出农杆菌EHA105感受态细胞，吸取20微升的农杆菌EHA105感受态细胞于一个1.5mL的无菌离心管中，吸取超表达载体MdNAC2-pBI121 5微升，加入50微升的农杆菌EHA105感受态细胞中，吹打混匀，冰浴30min，37℃热激90s，再冰浴2min，在超净工作台中将其加入200微升的LB液体培养基中，置于28℃、转速为180rpm的摇床中摇菌4h，在摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到28℃恒温培养箱中培养10-12h。

(2)农杆菌介导法将表达载体转入GALA-3植株：GALA-3植株从继代培养约30天的组培苗上剪取叶片用于遗传转化，选择组培苗顶部3-4片叶展开的幼嫩叶片，剪去叶尖和叶柄部分，将中间部位划3道伤痕，立即置于预培养基中进行预培养，无光，24℃，2天。将获得的农杆菌EHA105用YEP培养基培养皿中在摇床中以180rpm，28℃振荡培养50mL，培养4-6小时，直至OD值为0.4-0.6，用离心机以25℃，5000rpm离心5min收集菌体，用葡萄糖液体培养基将菌液悬浮起来，加入20mg乙酰丁香酮备用；然后，将预培养的叶片置于有农杆菌的液体共培养基中，晃动，每隔2min晃动几次，侵染时间大概8min左右，然后将叶块转移到无菌滤纸上吸干菌液，将表面没有菌液的叶块迅速转移至分装有共培养基的培养皿；待叶片长出转基因小芽，将小芽用扩繁培养基扩增起来；待小芽长成小苗后，放入生根培养基中生根，得到转基因植株。

实施例四超表达MdNAC2转基因植株功能验证

(1)选取20棵两个月大生根的长势一致的转基因GALA-3植株与20棵对照组非转基因GALA-3植株。

(2)用去离子水完全洗净幼苗后移栽至盛有纯蛭石的方形育苗盆(长宽为8×8cm，深为10cm)中，将两组盛有植株的育苗盆分别放入30×20cm的托盘中。

(3)对非转基因GALA-3植株幼苗浇灌完全营养液，对转基因GALA-3植株幼苗浇灌缺钾营养液，每三天浇灌一次至出现表型。

(4)表型出现后，测量对照组和转基因组植株株高、焦枯率、干重、鲜重、根细胞K⁺流速并统计分析，该试验重复三次以上。

植株表型对比照片如图4所示，WT为对照组，OE MdNAC2-13、OE MdNAC2-21、OEMdNAC2-31为MdNAC2超表达组。

结果分析：驯化后的MdNAC2超表达植株并生长7天后，进行缺钾胁迫处理，超表达MdNAC2转基因GALA-3植株表现出明显的耐缺钾胁迫的能力，而对照组的GALA-3植株长势弱，叶缘出现焦枯，叶片皱缩，这意味着MdNAC2能显著增强植物对钾离子的吸收能力。

如图5所示，对两组植株进行株高、焦枯率、干重和鲜重测定，超表达MdNAC2转基因组植株的焦枯率明显低于对照组植株，干鲜重显著高于对照组。明显的表型数据显示超表达MdNAC2转基因组植株具有较强的钾离子吸收能力。

如图6所示，为了验证MdNAC2介导的苹果植株响应缺钾胁迫的机制，我们对超表达MdNAC2株系在缺钾胁迫下的氧化损伤程度进行了研究。采用硝基四氮唑蓝(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)染色法测定O₂ ^-和H₂O₂。结果表明，与野生型苹果植株相比，OE MdNAC2株系在缺钾胁迫下的有害效应减弱，O₂ ^-和H₂O₂的积累量显著降低。丙二醛(MDA)含量的测定数据也支持了染色结果，与野生型相比，OE MdNAC2株系的平均MDA含量从24.6U/g下降到10.1U/g。同时测定了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。结果表明，与野生型相比，OE MdNAC2系SOD、POD和CAT的平均活性分别提高了0.57倍、2.4-6.1倍和0.52倍。上述数据表明，超表达MdNAC2可能通过提高抗氧化酶活性来增强苹果植株对缺钾胁迫的抗性。

在缺钾环境中，植物自身会通过渗透调节来抵抗胁迫，植物体内重新建立渗透平衡，如图7所示，对两组植株进行根细胞K⁺流速测定，超表达MdNAC2转基因组植株根系相对于对照组吸K⁺流速更快，说明MdNAC2基因促进根系对钾离子的吸收能力。

综上所述，MdNAC2转基因GALA-3植株具有更优秀的钾离子吸收能力。

Claims (5)

1.MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，其特征在于：所述MdNAC2基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，MdNAC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，其特征在于：MdNAC2基因超表达能提高苹果植株耐缺钾胁迫能力。

3.如权利要求1所述的MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，其特征在于：通过转基因技术将超表达MdNAC2基因转入苹果植株中，提高苹果植株耐缺钾胁迫能力。

4.如权利要求3所述的MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)MdNAC2基因的单克隆扩增；

2)构建植物超表达载体；

3)利用农杆菌介导法将植物超表达载体转入苹果植株；

4)超表达MdNAC2转基因植株功能验证。

5.如权利要求4所述的MdNAC2基因在提高苹果植株耐缺钾胁迫能力中的应用，其特征在于：所述步骤1)MdNAC2基因的单克隆扩增，上游引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。